NY-ESO-1 x TYR

摘要:信使RNA（mRNA）癌症疫苗的研发已经通过应用个性化的癌症抗原、mRNA的结构优化，以及开发替代的RNA基表达载体和高效的靶向递送载体，逐渐克服了众多挑战。目前，编码肿瘤相关抗原（TAAs）、肿瘤特异性抗原（TSAs）或免疫调节剂的各种癌症疫苗正在进行临床试验。在本文中，我们总结了mRNA的优化以及RNA基表达载体在癌症疫苗中的出现。我们首先回顾了最先进的靶向脂质纳米颗粒（LNPs）的进步和应用，然后介绍了mRNA癌症疫苗的主要分类和临床应用。总的来说，mRNA疫苗正在成为癌症免疫治疗的中心焦点，提供解决癌症治疗中多个挑战的潜力，无论是作为单一疗法还是与当前癌症治疗的组合使用。 1.介绍 肿瘤学领域最近通过引入基于mRNA的肿瘤疫苗取得了重大进展，标志着癌症免疫治疗的新时代。这些疫苗利用mRNA的多功能性来激发针对癌症的强烈免疫反应，通过编码肿瘤抗原来实现。这种方法促使免疫系统识别并消除表达这些抗原的癌细胞。mRNA疫苗的一个关键优势是其卓越的安全特性。与基于DNA的治疗方法不同，mRNA疫苗不会整合到宿主基因组中，从而消除了插入突变的风险。此外，mRNA同时编码多个抗原的能力提高了疫苗的效力，并为个性化疫苗的开发铺平了道路。mRNA表达的短暂性质确保了抗原刺激是暂时的，有效地降低了慢性炎症或自身免疫反应的可能性。此外，mRNA疫苗的快速设计和合成能力使人们能够迅速应对不断演变的肿瘤学挑战，包括根据个体患者的特定肿瘤特征定制疫苗，标志着向个性化癌症治疗迈出了重要一步。尽管mRNA癌症疫苗显示出相当的前景，但其更广泛的应用受到几个挑战的阻碍。这些挑战包括mRNA固有的不稳定性、需要高效和有针对性的递送系统以及肿瘤细胞可能的免疫耐受和逃避。这些挑战是当前研究工作的重点。因此，优化mRNA序列以实现最大的蛋白质表达、确保mRNA稳定性以及增强递送方法以实现最佳的细胞摄取和抗原呈递是正在进行研究的关键领域。针对2019冠状病毒病（COVID-19）的mRNA疫苗的成功开发通过全面优化mRNA结构克服了技术瓶颈。这一成就是通过对mRNA的每个方面进行重新设计和增强，从而提高其稳定性和表达效率而实现的。此外，多种mRNA递送系统的进步促进了mRNA分子的高效和靶向递送。mRNA癌症疫苗也从所有这些进展中受益，随着临床试验的进展，mRNA癌症疫苗正在成为抗击癌症的有希望的工具。本综述深入探讨了mRNA疫苗在肿瘤学领域的开发和应用。我们全面总结了mRNA癌症疫苗的开发历史，突出了抗原表达载体的结构优化以增强mRNA稳定性和翻译效率。此外，我们还讨论了其他基于RNA的抗原表达载体在癌症疫苗开发中的应用和未来前景。我们介绍了用于mRNA疫苗的LNP递送系统，强调了靶向策略。我们还阐明了各种类型的mRNA癌症疫苗及其目前的发展状态。预计mRNA疫苗将克服癌症治疗中的各种挑战，并成为癌症免疫治疗的主要方式。 2.mRNA癌症疫苗作为一种创新治疗方法的概念 随着两种COVID-19疫苗的应用，mRNA疫苗的流行度显著上升，标志着它们的发展和公众认可的一个关键时刻。然而，mRNA疫苗的研究和开发早在COVID-19大流行之前就已经开始了。这一旅程始于体外合成mRNA及其在体内表达的成功（表1）。在20世纪90年代初，人们开始努力开发用于预防肿瘤的mRNA疫苗。Martinon F.等人的一项里程碑式研究表明，使用包裹在脂质体中的mRNA编码流感病毒核蛋白（NP），在小鼠中诱导产生抗流感细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），展示了首次使用mRNA刺激体内抗原特异性免疫反应。Boczkowski等人通过将编码肿瘤抗原的mRNA转染到树突细胞中，进一步推动了这项研究，导致在体外和体内产生CTLs。这项研究在展示mRNA诱导抗肿瘤免疫反应的潜力方面具有关键意义。然而，早期的mRNA分子由于不稳定性和低表达效率而面临限制。未修饰的mRNA最初因其高免疫原性而闻名，通过toll样受体（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9）激活先天免疫反应。随后将修饰的核苷（如m5C、m6A、m5U、s2U和伪尿嘧啶）纳入mRNA配方中显著降低了它们的免疫原性，完全用伪尿嘧啶替代尿嘧啶提高了mRNA的稳定性和翻译效率。做出这些突破性发现的科学家Katalin Karikó博士和Drew Weissman博士因其关于核苷碱基修饰的发现，使COVID-19有效的mRNA疫苗的开发成为可能，被授予2023年诺贝尔生理学或医学奖。 表1. mRNA疫苗开发中的最新里程碑事件 对siRNA的脂质体传递的研究为LNP系统的进展提供了宝贵的见解。自那以后，LNPs已被验证为体内mRNA传递的有效载体，在各种预防性和治疗性疫苗策略中。COVID-19大流行凸显了mRNA技术的巨大潜力，为mRNA基础癌症疫苗的开发提供了宝贵的见解。此外，个性化新抗原疫苗的出现为患有各种恶性肿瘤的患者带来了实质性的临床益处。mRNA-4157与pembrolizumab联合进入黑色素瘤患者的III期临床试验，代表了个性化mRNA癌症疫苗领域的一个重大里程碑。当前对mRNA癌症疫苗的研究主要集中在消除mRNA的免疫原性和不稳定性、开发高效和有针对性的mRNA递送系统，以及推进个性化mRNA癌症疫苗的开发。本文的后续部分将对这些关键方面进行更全面的探讨。 3.用于抗原表达的RNA基载体 3.1.体外转录mRNA的设计策略 体外转录（IVT）mRNA的结构，反映真核mRNA，包括5'帽、编码蛋白质的开放阅读框（ORF）、5'和3'非翻译区（UTRs）以及3'聚（A）尾。每个mRNA片段的结构复杂性显著影响翻译效率、属性和免疫原性，使优化对mRNA技术的效力至关重要。对于IVT mRNA，5'帽结构（m7GpppN）对稳定性和翻译效率至关重要。形成帽的两种主要方法是天花病毒capping酶（VCE）介导的capping和共转录capping。VCE capping提供特异性，但成本更高，复杂性更大，而共转录capping更简单但效果较差。最近的进步包括使用VCE在5'端引入GTP类似物，创建修饰的mRNA。此外，将T7 RNA聚合酶与VCE整合简化了帽修饰mRNA合成，减少了对昂贵类似物的需求。持续的帽类似物优化显著提高了mRNA稳定性和转录，增强了其研究和应用潜力（表2）。此外，最近的一项研究表明，随着年龄的增长，mRNA帽中的cap1向cap2转变，减少了RIG-I受体激活并增加了mRNA稳定性。纳入cap2可能减少免疫原性并延长mRNA寿命。 表2. 不同代的 mRNA 帽类似物 mRNA的5'非翻译区（UTR），对基因表达调控至关重要，可以优化以提高翻译效率。例如，调整AUG密码子位置或纳入非结构化序列可以提高翻译效率。较短的5' UTR，大约17个核苷酸，也有助于减少变异性和翻译问题。与5' UTR类似，3' UTR也包含几个调控元件，在调节mRNA稳定性、亚细胞定位和翻译效率方面也起着关键作用。关键策略包括避免miRNA结合位点，消除腺嘌呤/尿嘧啶富集元件，并最小化其长度。尽管设计最佳UTRs存在挑战，但自然UTRs，如BNT162b2 COVID-19疫苗中使用的人类α-珠蛋白mRNA的5' UTR，通常因其证明的基因表达效率而更受青睐。然而，UTRs对不同类型的细胞影响不同，需要针对特定目标细胞进行定制优化。高通量筛选（HTS）技术和遗传算法的快速发展，有助于从细胞或病毒基因组中识别出潜在的优化序列，这些序列来自5' UTR和3' UTR的多样化库。 mRNA中编码序列（CDS）的优化对于有效的基因表达至关重要。常见的策略包括将宿主细胞中罕见的密码子替换为更普遍的同义密码子。2005年，Karikó等人通过纳入前文提到的修饰核苷，解决了mRNA高免疫原性和低蛋白表达的挑战。此外，GC含量和mRNA二级结构等因素显著影响mRNA翻译。然而，尽管这些优化策略有效，但在充分发挥mRNA序列潜力以达到最佳性能方面仍有局限性。在精准医学领域，开发mRNA设计算法是一个有前景的方法，以克服这些挑战。这些算法专注于识别具有稳定二级结构、增强翻译效率和优化密码子的mRNA序列，预计将大大促进基于mRNA的技术发展。我们在这里列出了一些，以及它们的特点和优缺点（表3）。 表3. mRNA设计算法。 聚腺苷酸尾，以长重复的聚腺苷酸序列为特征，在防御mRNA免受酶解乙酰化和降解方面发挥着关键作用，从而增强其稳定性和翻译效率。在聚腺苷酸序列之间加入短序列或硫代磷酸已被证明可以进一步提高稳定性。例如，BNT162b2的聚腺苷酸尾序列包括30A + 10GCAUAUGACU + 70A的结构。此外，最近的一项研究表明，含有20%胞嘧啶的聚腺苷酸尾可以保护mRNA免受去乙酰化酶活性的影响，并显著提高mRNA的翻译效率和半衰期。 mRNA结构的优化策略可以协同使用，以增强蛋白质生产。mRNA疫苗的进步强调了需要一个普遍标准化的mRNA设计和筛选协议。全面的筛选和精确定制的针对特定目标的序列有望在未来的mRNA设计中实现多样化的增强。这种方法使个性化适应特定细胞类型和独特的微环境，从而最大化每个mRNA转录本的蛋白质合成效率。 3.2.其他基于RNA的抗原表达载体 mRNA目前的不稳定性在其作为治疗剂的应用中提出了重大限制，促使最近的研究专注于探索替代的RNA载体。除了线性mRNA，其他几种类型的RNA载体迅速发展（图1）。其中一种有前景的载体是自我复制的RNA（saRNA），它来源于病毒并携带RNA聚合酶序列。这种saRNA表现出自我复制和翻译能力，使其能够以最小的量引发可检测的保护性免疫反应。这一特性表明saRNA可以有效地应用于癌症疫苗。几项探索这种潜力的临床前研究已经在进行中。例如，一项比较研究表明，针对人乳头瘤病毒（HPV）的saRNA与未修饰和修饰的非复制mRNA相比，显示出更强的抗肿瘤效果。然而，目前尚不清楚RNA聚合酶在体内是否会引发免疫反应。 图1. 在 mRNA 癌症疫苗中使用的不同类型的 RNA 表达载体 此外，saRNA的较大尺寸可能为现有递送系统带来新的挑战。解决这个问题的一个潜在策略是将编码RNA聚合酶的序列与目标蛋白的序列在空间上分离。 环状RNA（circRNA），由于其共价环状结构，由于其对RNase的抗性，提供了比mRNA更高的稳定性。这一特性为RNA疫苗提供了独特的优势。Qu等人开发的circRNA疫苗平台已显示出对多种COVID-19变体的保护效果，为基于circRNA的癌症疫苗的开发提供了宝贵的见解。研究表明，编码抗原或细胞因子的circRNA分子在抑制肿瘤方面比mRNA疫苗更有效。此外，Amaya等人强调了circRNA作为佐剂在增强抗肿瘤效果中的作用。然而，这些效果背后的确切机制尚未完全理解。在最近的一项研究中，Huang等人表明，肿瘤特异性circRNA circFAM53B通过表达特定肽段启动抗肿瘤免疫，强调了circRNA在免疫疗法中的潜力。 尽管取得了这些进展，circRNA合成仍然存在挑战，包括次优的环化效率和酶等试剂的高成本。尽管如此，circRNA作为一种有前景的基于RNA的治疗剂和疫苗类别，具有重要的未来潜力。 最近的一项进展涉及将短双链RNA（dsRNA）与单链mRNA杂交，形成树状、梳状结构，既作为抗原表达载体，又作为免疫佐剂。这种方法允许通过操纵dsRNA的长度、序列和数量，精确控制mRNA疫苗中的免疫刺激强度。这种梳状RNA设计适用于正在开发的多种mRNA疫苗，预计将显著提高其效力和安全性。 mRNA疗法的一个关键组成部分是递送系统。常见的递送系统包括精蛋白、脂质复合体（LPX）、脂多聚复合体（LPP）、病毒样颗粒（VLPs）、树突细胞和脂质纳米颗粒（LNPs）。由于LNP技术在当前应用中最先进的地位，本综述主要关注LNP技术的应用。 LNPs通常由阳离子或可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质组成。阳离子或可电离脂质在酸性条件下带正电荷，通过静电相互作用与带负电荷的mRNA结合。在内体中，这些脂质质子化，有助于mRNA逃逸以进行细胞质中的抗原表达。胆固醇提高LNP稳定性，帮助内吞作用和内体逃逸，而磷脂促进mRNA封装和稳定性，聚乙二醇化防止体内蛋白-LNP相互作用。 最初为递送siRNA而开发的LNP技术已经适应于mRNA封装和递送。虽然提供了高效的mRNA包装和生物相容性，但大多数LNPs在给药后在肝脏中积累，可能导致肝毒性。当前LNP-mRNA癌症疫苗的重点是针对选择性mRNA递送到特定器官或细胞的靶向策略。 LNP靶向的最新进展包括被动或主动方法到肿瘤。有效的抗肿瘤免疫取决于将编码抗原的mRNA递送到抗原呈递细胞（APCs），设计用于靶向免疫细胞的LNP预计将增强抗肿瘤反应并最小化全身副作用。作为被动靶向方法，靠近淋巴结的皮下注射在多项研究中证明是有效的。然而，皮下给药的LNPs也可以在肝脏和脾脏等器官中积累，可能影响疫苗的效力和安全性。 LNP脂质结构的修饰是另一种靶向策略，因为LNPs自然地在体内与血浆蛋白相互作用，形成“蛋白冠”，改变它们与细胞和器官的相互作用。临床前研究表明，这些修饰可以显著影响mRNA递送和LNP靶向。例如，脂质113-O12B特别靶向淋巴结，并被大量树突细胞和巨噬细胞摄取，诱导强大的免疫反应，并且当与抗PD1抗体结合时，实现了40%的完全肿瘤缓解率。然而，体内筛选有局限性，包括动物使用的伦理问题和体外筛选无法准确预测体内递送效率。 调节LNPs的内部和/或外部电荷对于靶向至关重要。为组织特异性mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑开发的SORT纳米颗粒与血清蛋白相互作用，这些血清蛋白结合到目标器官细胞上的受体，允许选择性器官靶向。然而，依赖于内源性患者蛋白进行靶向可能导致脱靶效应和个体间变异。 LNPs的被动靶向因其简单性和广泛适用性而受欢迎，但缺乏特异性。主动靶向虽然更具体和高效，但涉及更高的成本和潜在的免疫原性风险。因此，靶向LNPs在mRNA递送中代表了一个有前景的途径，未来的研究需要优化被动和主动策略，以提高LNP在mRNA和药物递送中的性能和安全性。 4.mRNA癌症疫苗的分类 4.1.编码病毒抗原的mRNA基础癌症疫苗 针对病毒抗原的mRNA基础癌症疫苗的开发是一个新兴领域。这些疫苗特别适用于与病毒相关的恶性肿瘤，如人乳头瘤病毒（HPV）、乙型肝炎（HBV）、Epstein-Barr（EBV）和HIV，它们与宫颈癌、肝癌和鼻咽癌等有关。传统的针对这些病毒的疫苗主要是预防性的。然而，基于mRNA的疫苗提供了一种治疗性方法，通过刺激身体的免疫系统识别和攻击表达这些病毒抗原的细胞。例如，最近的一项研究表明，一种信使RNA-HPV治疗性疫苗（mHTV）在小鼠和非人灵长类动物中显示出强大的免疫原性和抗肿瘤效果，使mHTV成为HPV有希望的治疗性和预防性疫苗。 mRNA疫苗平台的灵活性在个性化医学中特别有价值。根据个体患者的病毒抗原档案定制疫苗可以解决病毒癌基因不断演变带来的挑战，提供更有效的治疗方法。HIV以其快速变异和多样性而闻名，在疫苗开发中提出了重大挑战。基于mRNA的HIV疫苗在小鼠和灵长类动物中诱导了体液和细胞免疫反应，恒河猴在接受初免和加强疫苗后SHIV暴露减少了79%。最近针对HIV的mRNA疫苗eOD-GT8 60mer的I期临床试验显示良好的安全性，并在97%的参与者（35/36）中诱导了广泛的中和抗体（bnAbs），证明了mRNA疫苗在HIV预防中的潜力。此外，mRNA疫苗为慢性病毒感染如HBV提供了一种新方法。目前正在进行针对乙型肝炎病毒相关肝细胞癌（HCC）的治疗性mRNA疫苗（NCT05738447）的临床试验。 EBV与多种癌症有关，包括鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤和胃癌。EBV的复杂性质及其与宿主免疫系统的相互作用为疫苗开发带来了重大挑战。特别是，EBV在宿主细胞内的潜伏使免疫系统难以检测和根除。迄今为止，尚未有针对EBV感染的疫苗获批，针对EBV的mRNA疫苗的开发仍处于临床前阶段，尽管它们显示出了有希望的潜力。 尽管mRNA疫苗有潜力预防与癌症相关的病毒感染，但针对癌症相关病毒的疫苗主要仍处于临床前阶段。这是由于病毒突变、免疫逃逸和长期感染引起的免疫耐受等挑战。未来的研究需要集中克服这些障碍，开发更有效的针对这些病毒的mRNA疫苗。 4.2.编码肿瘤抗原的mRNA疫苗 4.2.1.肿瘤相关抗原（TAAs） TAAs是一类在肿瘤中比正常组织表达水平显著更高的抗原。这种过度表达使它们成为癌症疫苗的主要靶点。这些疫苗可以根据个体TAAs定制，与传统疗法如化疗或放疗相比，提供增强的效力和减少的副作用。这种个性化方法标志着肿瘤学的重大进步，呈现出更有针对性的、针对特定患者的治疗策略。一些已知的TAAs列在表4中。 表4. 不同癌症类型研究充分的肿瘤相关抗原(TAA)列表。 尽管TAAs有潜力，但针对TAAs的mRNA疫苗也有局限性。作为非突变自身抗原，TAAs可能导致临床免疫治疗中T细胞反应差和免疫耐受。此外，TAA在正常细胞中的表达可能导致附带损伤。这些疫苗在TAAs表达水平低或发生突变的癌症中也可能效果较差。克服这些局限性的策略包括将癌症抗原与免疫刺激性分子共递送，增强肿瘤微环境中的免疫激活，并将疫苗与传统治疗如化疗或放疗结合使用。BNT111针对四种常见的TAAs（NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶、TPTE），在超过90%的皮肤黑色素瘤患者中，BNT111诱导了对这些抗原的新的和增强的免疫反应（I期临床试验，NCT02410733）。正在进行的II期试验（BNT111-01，NCT04526899）将BNT111与Cemiplimab（由Regeneron Inc.制造的抗PD1抗体）结合使用，用于对抗PD-1疗法无反应的晚期不可切除III期或IV期黑色素瘤患者。 在编码TAAs的mRNA疫苗中，应优先考虑仅在肿瘤细胞中表达的TAAs，最小化在正常细胞中的表达。全面研究TAAs在肿瘤和正常组织中的表达模式对于确定更安全、更有效的靶点至关重要。 4.2.2.肿瘤特异性抗原（TSAs） 肿瘤特异性抗原（TSAs）是与正常细胞相比，在癌细胞中独特表达或显著过度表达的蛋白质或肽片段。这些抗原来源于各种致癌过程，包括突变、异常基因表达和翻译后修饰。新抗原通过主要组织相容性复合体（MHC）分子呈现在癌细胞表面。这些新抗原在正常组织中不存在，使它们成为免疫治疗策略的理想靶点。它们对个体肿瘤的独特性避免了与靶向共享肿瘤抗原时常伴随的耐受性和自身免疫问题。2014年，Tran等人成功地使用针对ERBB2IP特异性的CD4+细胞治疗了一名胆管癌患者，实现了完全肿瘤消退，展示了TSAs在诱导抗肿瘤反应中的潜力。他们还在10名胃肠道肿瘤患者中的9名中发现了基因突变，这表明肿瘤异质性的广泛存在，即使在同一肿瘤类型中，不同患者之间的TSAs也各不相同。开发个性化的mRNA疫苗涉及通过先进的测序和生物信息学方法识别和选择新抗原。下一代测序（NGS）、高通量筛选和机器学习算法通过识别个体肿瘤基因外显子中的突变和异常转录/翻译事件，促进了TSA预测。 个性化mRNA新抗原疫苗的临床潜力得到了其诱导强大和特异性免疫反应的能力的支持。早期临床试验已经显示出有希望的结果，有证据表明疫苗诱导的T细胞反应和潜在的临床益处（表5）。Ugur Sahin等人确定了13名黑色素瘤患者最有可能引发免疫反应的突变，并开发了编码多达10种新抗原的mRNA。临床试验表明，在13名患者中，有8名在接种疫苗后一年内没有复发，剩下的5名中有2名经历了肿瘤缩小，其中1名在接受PD-1抗体治疗时实现了完全缓解。mRNA-4157和BNT122是正在进行临床试验的两种典型的个性化mRNA疫苗。mRNA-4157编码34种针对个体患者肿瘤DNA中独特突变的抗原，正在进行黑色素瘤、非小细胞肺癌和其他实体瘤的临床试验。测试mRNA-4157与帕博利珠单抗（默克公司制造的抗PD1）联合用于头颈鳞状细胞癌患者的临床试验显示，总响应率为50%，疾病控制率为90%。两项IIb期临床试验结合mRNA-4157和帕博利珠单抗用于高危黑色素瘤患者，分别降低了44%和49%的复发或死亡风险，表明治疗时间更长时效益更明显。mRNA-4157和帕博利珠单抗的联合疗法已进入III期临床试验（NCT05933577），标志着它是第一个达到这一阶段的mRNA癌症疫苗。 表5. 已发布结果的代表性 mRNA 疫苗临床试验 个性化的mRNA疫苗为目前免疫疗法抵抗的癌症提供了有希望的治疗方法，如胰腺导管腺癌（PDAC），它对免疫检查点抑制剂（ICIs）表现出抵抗性。胰腺癌中新抗原的丰富使基于新抗原的mRNA疫苗成为一种可行的治疗策略。BNT122利用mRNA在PDAC患者中表达20种新抗原。当与化疗和免疫检查点疗法结合使用时，BNT122显示出在减缓PDAC患者复发方面的潜力，随后将进行一项随访的全球随机试验（IMCODE 003，BNT122）。 TSA mRNA疫苗代表了一种高度个性化的方法，为每个人的肿瘤抗原量身定制每种疫苗。结合免疫检查点抑制剂，这些疫苗为长期以来对医学科学具有挑战性的疾病治疗提供了新的途径。 4.3.编码免疫调节因子的mRNA 肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特征包括T细胞浸润有限或存在大量免疫抑制细胞，这有助于对抗目前的治疗方法。细胞因子对调节免疫细胞间的细胞间通信至关重要，能够有效地转导免疫信号，并协调针对目标抗原的强大免疫反应。通过mRNA传递细胞因子、共刺激配体或其他免疫调节因子可以有效重塑TME并增强肿瘤对各种免疫疗法的敏感性。 创新方法包括使用纳米粒子将编码肿瘤抑制因子p53的mRNA传递到肝癌细胞，并结合抗PD-1单克隆抗体。这一策略已显示出在调节TME和实现抗肿瘤效果方面的有效性。此外，以前的研究利用编码caTLR4和共刺激配体CD70和CD40L的mRNA来刺激APCs中的免疫反应。随后在T细胞功能上的增强已被证明可以有效对抗肿瘤，并抑制小鼠早期可切除乳腺癌的病变。mRNA-2752是一种编码三种免疫调节因子的mRNA疫苗，目前正在进行I期和II期临床试验，以评估其安全性和耐受性，无论是作为单独治疗还是与固定剂量的durvalumab（由AstraZeneca Inc.制造的抗PDL1抗体）联合用于晚期恶性肿瘤患者。 5.结论和未来展望 COVID-19疫苗的成功部署显著加快了mRNA技术在肿瘤学中的进展。利用创新的RNA基载体和靶向策略，正在开发新的mRNA疫苗平台以针对广泛的肿瘤抗原。值得注意的是，个性化mRNA疫苗在癌症治疗中取得了显著的突破。这些疫苗在临床试验中显示出增强的潜力，特别是与传统治疗，包括ICI和传统治疗方法结合使用时。 尽管发展全面，mRNA癌症疫苗仍面临多重挑战。进一步的研究对于完善这些疫苗的开发和应用至关重要。疫苗设计、递送技术和快速识别肿瘤新抗原的持续改进是关键，使mRNA疫苗成为个性化癌症治疗中的有希望的工具。

2024医美与器械创新前沿华西论坛，与您共探药企转型之道，解锁消费医疗市场新机遇。10月12日，成都等您来！ 肿瘤免疫治疗旨在激活宿主的抗肿瘤免疫，形成肿瘤抑制微环境，最终实现消除肿瘤，提高患者的整体生存率。肿瘤疫苗是一种很有前途的抗肿瘤免疫治疗手段。针对肿瘤相关抗原（TAAs）或肿瘤特异性抗原（TSAs）的疫苗可以特异性攻击和摧毁这些抗原高水平表达的恶性肿瘤细胞，并通过免疫记忆实现持续的肿瘤杀伤。因此，与其他类型的免疫治疗相比，癌症疫苗理论上可以提供特异、安全和耐受性良好的治疗效果。 基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，mRNA疫苗比传统疫苗有许多优点：与某些病毒疫苗不同，mRNA不会整合到基因组中，从而避免了对插入突变的担忧；mRNA疫苗可以以无细胞的方式制造，从而实现快速、经济、高效的生产。此外，单个mRNA疫苗可以编码多种抗原，增强针对适应性病原体的免疫反应，并能够以单一配方针对多种微生物或病毒变体。 mRNA疫苗是一类重要的癌症疫苗，能够编码和表达TAA、TSA及其相关细胞因子。mRNA癌症疫苗可以刺激体液免疫和细胞免疫，提高这些疫苗对不同疾病和患者的适应性。目前，多种mRNA癌症疫苗正在临床中进行开发，为癌症免疫治疗带来新的曙光。 1 mRNA疫苗制备策略 体外转录（IVT）mRNA模拟内源性mRNA的结构，有五个部分，从5ʹ到3ʹ包括：5ʹcap，5ʹ非翻译区（UTR），一个编码抗原的开放阅读框，3ʹUTR和一个PolyA尾。 与天然真核mRNAs一样，5′端帽结构包含一个7-甲基鸟苷核苷，5′端结构会在空间上保护mRNA不被核酸外切酶降解，并与翻译起始因子蛋白协同工作，招募核糖体以启动翻译。PolyA尾的长度间接调节mRNA翻译和半衰期。 编码区两侧的5′和3′UTR调节mRNA翻译、半衰期和亚细胞定位，来自高表达基因（如α-和β-珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的首选。此外，UTR可根据细胞类型进行优化，如通过去除3′UTR中的miRNA结合位点和富含AU的区域，将mRNA降解降至最低。 mRNA疫苗的开放阅读框是最关键的组成部分，尽管开放阅读框不像非编码区那样具有可塑性，但可以通过优化密码子，从而在不改变蛋白质序列的情况下增加翻译。例如，CureVac AG公司发现人类mRNA密码子很少在第三位有A或U，从而用G或C替换开放阅读框第三位的A或U。并将此优化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV，目前正处于III期试验阶段。 为了最大化翻译，mRNA序列通常包含修饰的核苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷类似物。修饰核苷的使用，特别是修饰尿苷，阻止了模式识别受体的识别，保证了翻译过程产生足够水平的蛋白质。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修饰。另一种避免模式识别受体检测的策略，由CureVac首创，使用序列工程化和密码子优化，通过提高疫苗mRNA的GC含量来消耗尿苷。 除了mRNA序列的改进外，在简化mRNA生产方面也取得了重大进展。临床上使用的合成mRNA通过使用噬菌体RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）从DNA质粒在体外转录。另外，使用CleanCap的共转录封盖技术，简化了纯化步骤。 2 mRNA递送系统 由于mRNA较大（104–106Da）且带负电，因此无法通过细胞膜的阴离子脂质双层。此外，在体内，它会被先天免疫系统的细胞吞噬，并被核酸酶降解。因此，体内应用需要使用mRNA递送载体，该载体转染免疫细胞而不会引起毒性或不必要的免疫原性。目前，已经为此开发了许多基于创新材料的解决方案。 01 脂质纳米颗粒（LNP） 脂质纳米颗粒是临床上最先进的mRNA载体。截至2021年6月，所有正在研制或批准临床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP为mRNA递送提供了许多好处，包括制剂简单、模块化、生物相容性和较大的mRNA有效载荷容量。除RNA药物外，LNP通常包括四种成分，可电离脂质、胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇化脂质，它们共同封装和保护脆弱的mRNA。 可电离脂质与mRNA在酸性缓冲液中形成纳米颗粒，使脂质带正电荷并吸引RNA。此外，它们在内涵体的酸性环境中带正电荷，这促进了它们与内涵体膜的融合，将其释放到细胞质中。 DODAP和DODMA是第一种用于RNA输送的可电离脂质。通过设计提高DODMA的功效，产生了DLin-MC3-DMA。这是第一个FDA批准的药物制剂中使用的可电离脂质：siRNA药物patisiran（Onpattro）。除了有效且安全地递送siRNA外，DLin-MC3-DMA还用于mRNA的递送。 目前，学术界和工业界的许多团体使用组合反应方案来合成潜在的传递材料，这种方法产生了许多有效的脂质，包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102（用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273）和ALC-0315（用于辉瑞疫苗BNT162b2）。 除了寻求提高疗效外，人们越来越关注提高药物的特异性，特别是对疫苗和免疫疗法的特异性。含有多环金刚烷尾的脂质11-A-M58，和含有环咪唑头的脂质93-O17S59，已被设计用于体内靶向T细胞。尽管机制尚不清楚，但这些脂质的环状基团对于靶向T细胞至关重要。 尽管电离脂质可以说是LNP最重要的成分，但其他三种脂质成分（胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质）也促进了纳米粒子的形成和功能。胆固醇是一种天然存在的脂质，它通过填充脂质之间的空隙来增强纳米颗粒的稳定性，并有助于在摄取到细胞的过程中与内涵体膜融合。 辅助脂质通过促进有助于膜与内涵体融合的脂质相变来调节纳米颗粒的流动性并增强功效。最佳辅助脂质的选择取决于可电离脂质材料和RNA载体。例如，对于类脂质材料，饱和辅助脂质（如DSPC）最适合传递短RNA（如siRNA），而不饱和脂质（如DOPE）最适合传递mRNA 。DSPC已被用于FDA批准的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。 LNPs的聚乙二醇化脂质成分由聚乙二醇（PEG）与锚定脂质（如DMPE或DMG）结合而成。亲水性PEG可以稳定LNP，通过限制脂质融合调节纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用增加纳米颗粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂质。 02 聚合物和聚合物纳米颗粒 尽管临床进展不如LNP，但聚合物具有与脂质相似的优势，能够有效传递mRNA。阳离子聚合物将核酸浓缩成具有不同形状和大小的复合物，可通过内吞作用进入细胞。 聚乙烯亚胺是研究最广泛的核酸传递聚合物。尽管其功效卓越，但由于其高电荷密度，其毒性限制了应用。此外，已经开发出几种毒性较小的可生物降解聚合物。例如，聚（β-氨基酯）在mRNA传递方面表现出色，尤其是对肺。 最近开发出了一种新型的含脂聚合物，称为电荷改变可释放转运体（CARTs），它能有效地靶向T细胞，操纵T细胞是非常困难的，因此，CART 是一种极具吸引力的传递材料，在mRNA疫苗和基因治疗领域具有巨大潜力。 03 其他递送系统 除了脂质和聚合物载体外，肽也可以将mRNA传递到细胞中，这要归功于其主链和侧链中的阳离子或两亲胺基（例如精氨酸），这些阳离子或两亲胺基与mRNA静电结合并形成纳米复合物。例如，含有重复的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的膜融合细胞穿透肽。 富含精氨酸的鱼精蛋白肽在中性pH下带正电荷，也可以浓缩mRNA并促进其传递。鱼精蛋白与mRNA复合物激活识别单链mRNA的Toll样受体（TLR7，TLR8）通路，因此，它还可以作为疫苗或免疫治疗应用的佐剂。CureVac AG正在评估一种含有鱼精蛋白的递送平台RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小细胞肺癌的临床试验。 最后，基于角鲨烯阳离子纳米乳液也可以传递mRNA，这些纳米乳剂由油性角鲨烯核组成。一些角鲨烯制剂，如诺华的MF59，在FDA批准的流感疫苗中用作佐剂。MF59使注射部位的细胞分泌趋化因子，从而招募抗原呈递细胞，诱导单核细胞分化为树突状细胞，并增强抗原呈递细胞对抗原的摄取。角鲨烯基阳离子纳米乳剂从内涵体逃逸并将mRNA输送到细胞质中的机制尚不清楚。 3 mRNA疫苗的免疫作用 在注射mRNA癌症疫苗后，mRNA编码的蛋白质由核糖体合成，然后翻译后修饰以产生正确折叠的功能蛋白质，并呈现给免疫系统。该过程类似于RNA病毒感染和连续诱导保护性免疫反应的自然过程。外源mRNA进入细胞质导致与内源性mRNA类似的反应。 01 诱导先天免疫反应 宿主免疫系统通过PRRs检测病原体相关分子模式（PAMP）激活固有免疫反应。注射疫苗后，mRNA和传递系统成分将通过一系列PRR识别为外源性物质，导致Toll样受体（TLR）的激活，例如主要在抗原呈递细胞（APC）上表达的TLR3、TLR7和TLR8。外源性IVT mRNA可被细胞膜、内体以及细胞质中的各种PRR识别，并在刺激内源性免疫反应中发挥作用。 IVT mRNA的免疫原性主要由TLR7和TLR8介导。TLR7由B细胞、巨噬细胞和树突状细胞表达，并介导识别单链RNA（ssRNA）的过程。在细胞质中，其他一些PRR可以感应不同类型的RNA，例如dsRNA和ssRNA。 在非免疫细胞中，细胞质维甲酸诱导基因I样受体（RLR）和黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）感应外源mRNA并调节细胞因子和趋化因子的产生，导致天然免疫细胞募集到mRNA注射部位。 02 诱导适应性免疫反应 mRNA疫苗接种后，编码的蛋白质将被翻译并呈递给免疫系统，并刺激适应性免疫。mRNA编码的蛋白质通过内吞或吞噬作用被APC吸收，它们可能形成吞噬小泡或含有抗原蛋白的内体，抗原蛋白通过树突状细胞上的主要组织相容性复合体呈递。 mRNA癌症疫苗通常编码在癌细胞上表达的TAA。这些TAA可进一步分为组织分化抗原（如MART-1）、肿瘤生殖系抗原（如NY-ESO-1或MAGE-3）、肿瘤细胞过表达的正常蛋白（如EGFR、MUC1、Her2/neu）、病毒蛋白（如EBV、HPV）和肿瘤特异性突变抗原（如MUM-1、β-catenin或CDK4）。此外，体细胞突变可能产生新抗原表位，码新抗原的mRNA疫苗被认为是最佳的候选癌症疫苗。 除了诱导T细胞免疫外，mRNA疫苗还诱导中和抗体。滤泡辅助性T细胞（Tfh）不仅对生发中心的发育至关重要，而且还驱动免疫球蛋白样转化、亲和力成熟和持久的B细胞记忆反应。这些细胞可以被mRNA疫苗激活，产生足够数量有效和持久的中和抗体。 4 mRNA癌症疫苗的临床开发 基于IVT mRNA的疫苗正在逐步开发，用于多种肿瘤治疗。目前，mRNA癌症疫苗根据最终产品类型可以分为编码TAA、TSA、细胞因子和抗体的癌症疫苗。 01 编码TAAs 的mRNA疫苗 在多项临床试验中，NY-ESO-1、酪氨酸酶、MAGE-A3、MAGE-C2和TPTE已被用作黑色素瘤mRNA疫苗的TAA。 BNT111是一种BioNTech FixVac平台开发癌症疫苗，该平台利用TAA的固定组合，旨在触发针对癌症的强大而精确的免疫反应。2021年底，FDA批准了BNT111快速通道资格，这是一种治疗晚期黑色素瘤的新型癌症免疫疗法，目前BNT111正在两项临床试验中进行研究。一项I期试验（NCT02410733）的中期分析报告表明，BNT111是有效的免疫疗法。随后的II期试验（NCT04526899）研究BNT111单独或与抗PD-1抗体cemiplimab联合的安全性和有效性。 CV9201和CV9202是两种针对非小细胞肺癌中表达的靶抗原的mRNA疫苗。临床试验（NCT00923312、NCT01915524、NCT03164772）表明，这两种疫苗耐受性良好，治疗后可以检测到免疫反应，从而支持在非小细胞肺癌中的进一步临床研究。 02 编码TSA的mRNA疫苗 编码多种突变抗原的mRNA疫苗是治疗突变诱发的恶性肿瘤的理想疫苗，这种类型的癌症疫苗进行的临床试验最多。随着下一代测序技术的发展，可以生产编码突变抗原的个性化mRNA癌症疫苗，这种个性化的癌症疫苗具有非常诱人的前景。 两种个性化mRNA癌症疫苗目前正在进行二期临床试验，即Moderna的mRNA-4157和BioNTech的BNT122（RO7198457）。mRNA-4157在单个mRNA分子上特异性筛选和编码20-34个新抗原，这取决于患者的癌症突变。一期试验（NCT03313778）的中期数据表明，mRNA-4157单药治疗或与PD-1抑制剂Keytruda联合治疗在所有测试剂量下都具有良好的耐受性，并引发新抗原特异性T细胞反应。该疫苗目前正在黑色素瘤患者进行二期临床试验（NCT03897881）。 BioNTech 的BNT122已经探索了与PD-L1抗体联合治疗的有效性和安全性，在黑色素瘤、非小细胞肺癌和大肠癌的II期临床试验已于2021上半年启动。 03 mRNA编码免疫刺激剂 理论上，mRNA癌症疫苗可以编码任何蛋白质，包括免疫刺激剂，其可以重塑肿瘤免疫微环境（TIME），克服肿瘤免疫耐受，这已成为mRNA肿瘤疫苗研究的一个重要方向。 在过去几年中，已经进行了编码细胞因子的mRNAs癌症疫苗的临床试验。目前，临床试验中只有七种候选产品，它们属于Moderna和BioNTech。2017年，Moderna开发了第一个表达mRNA编码的免疫刺激剂（mRNA-2416），其编码OX40L，一项1期临床试验（NCT03323398）评估了mRNA-2416单独和与durvalumab联合的安全性和耐受性。 已有的数据表明，mRNA-2416单药在所有剂量水平下都是可耐受的，没有报告剂量限制毒性，大多数相关不良事件为1级或2级。更重要的是，在PD-L1上调的时间内观察到广泛的促炎活性和有益的变化。目前，mRNA-2416瘤内注射已进入晚期卵巢癌的临床II期试验。 另一种mRNA疫苗mRNA-2752编码OX40L/IL23/IL36γ，早期的临床结果表明，mRNA-2752与抗PD-L1抗体durvalumab联合使用，在所有剂量下都具有良好的耐受性，并显示出抗肿瘤活性的迹象。 此外，BioNTech还开发了编码IL-12sc、IL-15sushi、GM-CSF和IFNα的BNT131，其作为单一疗法或与cemiplimab联合用于晚期实体瘤患者。 — 小结 — 几十年来，mRNA设计和核酸递送技术的进步，加上新抗原靶点的发现，使得mRNA疫苗成为对抗癌症的有力工具。mRNA疫苗的优势体现在mRNA癌症疫苗具有同时编码多种抗原的能力，以及非整合、高度降解和无插入突变潜力。IVT产生的mRNA不含细胞和致病性病毒成分，没有感染的可能性；在正在进行的临床试验中测试的大多数mRNA疫苗通常耐受性良好，注射部位特异性免疫反应很少。 快速生产是mRNA癌症疫苗的另一个优势，并且mRNA制造技术的成熟允许在短时间内生产新型疫苗。最近新抗原的发现和鉴定促进了个性化疫苗治疗的发展。BioNTech和Moderna进行的几项临床研究表明，在一些治疗多发性实体瘤的临床试验中，使用个性化疫苗具有强大的抗肿瘤免疫，开创了治疗性肿瘤疫苗的新时代。我们有理由认为，mRNA疗法将可能改变现代医学的疫苗接种方法以及癌症免疫疗法。 参考文献： 1. mRNA Vaccines: The Dawn of a New Era of Cancer Immunotherapy. Front Immunol.2022; 13: 887125. 2. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat RevDrug Discov. 2021 Aug 25 : 1–22. 3. Recent advances in mRNA vaccine technology. Curr Opin Immunol. 2020 Aug;65:14-20. 同写意媒体矩阵，欢迎关注↓↓↓

BioNTech今天公布其进行中的mRNA癌症疫苗BNT111的2期临床试验积极顶线数据。分析显示，试验达成主要终点，BNT111与再生元（Regeneron）PD-1抑制剂Libtayo（cemiplimab）联合疗法能够显著改善无法切除的晚期黑色素瘤患者的总缓解率（ORR）。公司预定继续进行试验，以进一步评估尚未成熟的次要终点。 这次所公布的BNT111-01试验是一项开放标签的随机试验，旨在检视BNT111与cemiplimab各自作为单药或联合疗法，用以治疗复发、无法切除的III与IV期黑色素瘤患者的疗效与安全性，这些患者对PD-1或PD-L1疗法耐药。共有184位患者入组，接受为期最多24个月的治疗。 分析显示该试验达到主要疗效终点，与相似患者群体的历史对照组相比，接受BNT111联合cemiplimab治疗患者的ORR有统计学显著改善。两个随机单药治疗组均表现出临床活性，且cemiplimab单药组的ORR与过往接受PD-1、PD-L1或CTLA-4靶向治疗的历史结果一致。 联合疗法展现良好的耐受性与安全性，并且与之前的临床试验结果一致。 BNT111正是一种利用FixVac技术平台制造的即用型治疗性疫苗。它能编码4种非突变的肿瘤相关抗原，分别是NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE。这些抗原在超过90%的皮肤黑色素瘤中表达。美国FDA在2021年授予BNT111快速通道资格。 FixVac技术平台简介（图片来源：BioNTech官网） BioNTech的FixVac技术平台利用mRNA表达共享的肿瘤相关抗原，它们可以靶向抗原呈递细胞，激活抗原特异性T细胞反应。该平台的一个优势在于可以提前生成疫苗并保存起来，可以马上给患者使用。 BioNTech在新闻稿中指出，这次公布的数据为其提供了三个方面的概念验证：首先，验证了该公司十年来改进的mRNA癌症疫苗技术，采用尿苷mRNA化学成分和非编码主链，旨在优化翻译性能，并使用专有脂质体配方进行递送。其次，这次试验结果验证了其专有FixVac平台在肿瘤抗原选择上的计算方法。第三，这也是对BioNTech将旗下疗法（在本例中为BNT111）与现有免疫检查点疗法联合的协同治疗策略的验证。 BioNTech在肿瘤领域有广泛布局，肿瘤治疗性疫苗又是其重点之一。一方面，BioNTech与Moderna一样，都布局了个性化的新抗原mRNA疫苗（BNT122、mRNA-4157），另一方面，BioNTech也在积极开发固定抗原的肿瘤mRNA疫苗，包括HPV疫苗BNT113、黑色素瘤疫苗BNT111。在临床策略上，BioNTech的个性化新抗原疫苗主要用于早期肿瘤的辅助治疗，用于防止术后复发，固定抗原疫苗则用于晚期肿瘤的治疗。 小派提示 mRNA在癌症治疗领域的突破性进展，不仅优化了疫苗技术的翻译性能，还通过精准抗原选择与协同治疗策略展现了未来广阔的应用前景。派真生物一站式CRO&CDMO服务平台，可为您提供全面的基因递送载体和个性化定制服务。我们的产品线涵盖腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体和mRNA服务；多种现货mRNA和mRNA-LNP为您的癌症基因治疗研究提供全方位的支持，详情欢迎后台留言或点击文末“阅读原文”了解详情。 转自：RNAScript 关于派真生物