RAC1

引言 GTP酶及其调节因子作为分子开关，在许多细胞生命活动以及疾病特别癌症和发育疾病中，发挥着关键作用【1】。这些蛋白大多数属于小GTP酶的Ras超家族，包括Ras、Rho、Rab、Arf和Ran家族。选择性靶向这些蛋白质可能成为疾病治疗的有效策略【2】。然而，由于GTP酶中核苷酸的结合亲和力较高，并且缺乏变构位点，曾被认为是“不可成药”的靶点。 近日，美国加州大学旧金山分校的Kevan M. Shokat团队在Cell期刊发表题为Targeting Ras-, Rho-, and Rab-family GTPases via a conserved cryptic pocket（通过一个保守的隐秘口袋靶向 Ras-、Rho- 和 Rab- 家族 GTP 酶）的文章。研究发现，在K-Ras的switch II区域存在一个隐秘的变构口袋，这个口袋在其他Ras、Rho和Rab家族的GTP酶中也存在。这一发现为靶向GTP酶的抑制剂优化和开发带来了新的希望。 最近，在K-Ras中发现的隐秘变构switch II口袋（SII口袋）推动了针对K-Ras（G12C）突变癌症的治疗药物开发，如LUMAKRAS和Krazati【3】。此外，其他候选药物如GDC6036也在临床试验中取得了良好结果【4】。然而，目前K-Ras的可成药性仍然是一个特殊案例，其他GTP酶是否能够以类似方式被靶向尚不明确。 靶向Ras家族GTP酶 首先，研究人员发现，K-Ras（G12C）抑制剂不仅可以有效靶向K-Ras本身，还能靶向H-Ras（G12C）和N-Ras（G12C）。这些抑制剂通过与SII口袋结合发挥作用，前提是存在合适的配体。同时，他们在a3螺旋上发现了几个关键残基，这些残基与SII口袋中的配体结合密切相关。尽管这些残基在不同小GTP酶中保守性较低，但SII口袋及a3螺旋上的基团对口袋形状和抑制剂的结合至关重要。研究还发现，一些K-Ras（G12C）抑制剂对N-Ras（G12C）驱动的肿瘤具有潜在的治疗效果。Ras超家族GTP酶及其亚家族的序列存在差异。实验显示，RalA（G23C）和Rap1A（G12C）在与SII口袋抑制剂的共价结合方面表现出不同的动力学特征。RalA（G23C）与MRTX1257或divarasib结合的速度较快，且具有较高的热稳定性。突变型Rap1A（G12C, L96F）与抑制剂的结合速度显著提高。其他GTP酶如Rit1和M-Ras也能被SII口袋抑制剂有效靶向，但Rheb的靶向效果较差。为了验证MRTX1257对RalA（G23C）的结合是否类似于对K-Ras（G12C），研究人员分析了RalA（G23C）、GDP和MRTX1257的复合物。结果显示，GDP和MRTX1257的结合显著提高了RalA（G23C）的结构稳定性。进一步研究表明，MRTX1257和divarasib能有效抑制RalA（G23C）和Rap1A（G12C, L96F），并且divarasib与RalA和Rap1A的结合是可逆的，这表明开发靶向GTP酶的可逆抑制剂是可行的。此外，研究还考察了一种新型三联体抑制剂（包括K-Ras（G12C）、化学配体和亲环蛋白A（CypA））。通过对新配体RMC-4998的晶体结构分析，发现K-Ras的关键残基可以与CypA形成氢键，促进配体结合。进一步研究表明，RMC-6291能够有效靶向其他具有高度序列同源性的Ras家族GTP酶。 靶向其他GTP酶 接下来，研究人员探讨了K-Ras（G12C）抑制剂通过SII口袋靶向Rho和Rab家族GTP酶的潜力。结果显示，尽管RhoA和Rac1，以及Rab1A和Rab5C的靶向效果不错，但与Ras家族GTP酶相比，这些抑制剂在Rho和Rab家族中的效果较差，这可能与α3螺旋上的残基差异有关。特别是，divarasib对Rac1（G12C）的靶向较为迅速，但SII口袋中特定残基的变异显著影响了靶向效果。实验还发现，divarasib没有显著提高Rac1的热稳定性，并且其靶向效果受核苷酸状态的影响。此外，MRTX1257和divarasib同样是Rab家族GTP酶Rab1A（S20C）和Rab5C（S30C）的有效共价配体。进一步研究表明，MRTX1257和divarasib能完全靶向Rab1A（S20C），而对Rab5C（S30C）的靶向效果则较差。研究结果还显示，优化后的K-Ras（G12C）配体在靶向Rho和Rab GTP酶方面的效果仍需改进。此外，对双突变体Rac1（G12C, K96H）的功能实验显示，divarasib可以有效减少Rac1与PAK1的结合。 GTP酶抑制剂的开发 最后，研究人员利用分子动力学（MD）和量子力学（QM）模拟，设计并测试了22种新化合物，旨在开发靶向不同GTP酶（如Rac1、Rab1A和Rab5C）的选择性配体。通过比较SII口袋的结合构象和标记动力学，他们发现化合物11在Rac1（G12C）和Rab1A（S20C）中的表现优异，其靶向速度约为divarasib的两倍。研究还显示，甲基萘作为C7取代基可以优化对Rab5C（S30C）的靶向速度。此外，不同GTP酶对C2位置取代基的敏感性也有所不同。扩展后的化合物库同样能够有效靶向K-Ras（G12C），显示出进一步开发的潜力。这些发现为设计选择性配体提供了重要的指导。 综上所述，该研究发现GTP酶家族中SII口袋的关键结构是保守的，这使得靶向多种GTP酶成为可能，并为开发GTP酶的可逆抑制剂提供了新的机会。 模式图（Credit: Cell） 参考文献 1. Vetter, I.R., and Wittinghofer, A. (2001). The Guanine Nucleotide-Binding Switch in Three Dimensions. Science 294, 1299-1304. https://doi.org/10.1126/science.1062023. 2. Rojas, A.M., Fuentes, G., Rausell, A., and Valencia, A. (2012). The Ras Protein Superfamily: Evolutionary Tree and Role of Conserved Amino Acids. J. Cell Biol. 196, 189-201. https://doi.org/10.1083/jcb.201103008. 3. Kim, D., Xue, J.Y., and Lito, P. (2020). Targeting KRAS(G12C): From Inhibitory Mechanism to Modulation of Antitumor Effects in Patients. Cell 183,850-859. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.044. 4. Sacher, A., LoRusso, P., Patel, M.R., Miller, W.H., Garralda, E., Forster, M.D., Santoro, A., Falcon, A., Kim, T.W., Paz-Ares, L., et al. (2023). GO42144 Investigator and Study Group. Single-Agent Divarasib (GDC-6036) in Solid Tumors with a KRAS G12C Mutation. N. Engl. J. Med.389, 710-721. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2303810. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.08.017 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

除K-Ras 以外的许多小 GTP 酶均存在已成药 Switch II 口袋，但具体的药物开发却研究有限。哈佛医学院研究人员通过 X 射线或 HDX-MS 对配体结合的H-Ras、RalA 和 Rab1A 进行表征。在体外和细胞中证实了Switch II 口袋抑制剂对多种 GTP 酶功能的抑制。Switch II 口袋抑制剂类似物还显示出对 Ras、Rho 和 Rab  GTP 酶的抑制。详细分析了关键残基的组成和保守性的显著差异为这个以前无法成药的家族的许多成员开发优化的抑制剂提供了潜力。 1. 背景介绍 GTP 酶与其调节因子和效应子一起，充当控制许多基本细胞过程的分子开关。这些蛋白质中的大多数属于小 GTP 酶的 Ras 超家族，其中包括 Ras、Rho、Rab、Arf 和 Ran GTP酶。Ras GTP 酶参与增殖和迁移，其异常调节与癌症和发育疾病有关，称为 RASopathies。Rho GTP 酶，包括 RhoA、Rac1 和 Cdc42，控制细胞骨架组织和细胞运动基础肌动蛋白动力学的许多方面。Rab GTP 酶是最大的亚家族，协调囊泡运输。Arf GTP 酶也严重参与运输途径，Ran GTP 酶专门协调核运输。 然而，此类分子成药的例子非常有限，并且与 ATP 结合蛋白不同，GTP 酶仍然被广泛认为是“不可成药”的靶标。这是由于与激酶相比，GTP 酶中核苷酸的超强结合亲和力，并且 apo 蛋白中没有明显的变构位点。直到在 K-Ras 中发现的隐蔽变构口袋(Switch II，[SII]口袋)挑战了这种范式，并使靶向 K-Ras（G12C） 抑制剂得以快速开发,包括FDA 批准的药物 LUMAKRAS (sotorasib)和Krazati(adagrasib)用于治疗非小细胞肺癌还有正在进行临床试验的抑制剂 GDC6036(divarasib)。然而，到目前为止，K-Ras 仍然是一个独特的案例，目前尚不清楚其他 GTP 酶是否可以以类似的方式靶向。 在此，研究人员系统地绘制了各种 GTP 酶家族成员的 SII 口袋，并基于此设计出靶向小 G 蛋白酶的抑制剂。 2.K-Ras抑制剂可靶向H-Ras和 N-Ras 自从在 K-Ras 的 SII 区发现变构隐蔽口袋以来，几种 SII 口袋抑制剂已被优化以靶向 K-Ras（G12C）。SII 口袋不存在于 apo 结构中，并且在合适的配体存在下向外移动生成灵活的 SII 区域。除了 SII 环外，在 α3 螺旋上还发现了几个与 SII 口袋配体结合的关键残基，包括 H95、Y96 和 Q99（图 1A）。这些残基可能对形成 SII 口袋做出了相当大的贡献。然而，它们在小 GTP 酶中的保守性较差，这可能对靶向 K-Ras 以外的其他 GTP 酶构成重大挑战。 图 1K-Ras（G12C）、H-Ras（G12C） 和 N-Ras（G12C） 的 SII 口袋共价抑制作用 为了研究其他小 GTP 酶是否也表现出可靶向的 SII 口袋，首先转向 K-Ras 旁系同源物 H-Ras 和 N-Ras，它们在 SII 口袋中表现出序列同源性，但在位置 95 上不同（H-Ras 中的 Q95 和 N-Ras 中的 L95）。探索了十种不同的 SII 口袋抑制剂，这些抑制剂已优化为靶向 K-Ras（G12C）（图 1B-1E）。结果发现一些抑制剂对 K-Ras（G12C） 的选择性高于 H-Ras（G12C） 和 N-Ras（G12C）（例如，ARS1620 或 adagrasib），而其他抑制剂对每个 Ras 旁系同源物表现出非常有效的抑制，在 5 分钟内完全被共价修饰（例如，sotorasib、JDQ443、ASP2453）。 图 1K-Ras（G12C）、H-Ras（G12C） 和 N-Ras（G12C） 的 SII 口袋共价抑制作用 为了研究残基 L95 的差异如何影响 SII 口袋抑制剂的结合姿势，解析了 sotorasib 结合的 H-Ras（G12C） 的晶体结构（图 1F）。Q95 残基位于 sotorasib 结合口袋附近，这导致结合姿势在更接近 SII 环时发生轻微变化（图 1G）。这表明 SII 环在 SII 配体存在下保持柔韧性，与 α3 环上的残基相比，SII 环对口袋形状和配体调节可能不太重要。 图 1K-Ras（G12C）、H-Ras（G12C） 和 N-Ras（G12C） 的 SII 口袋共价抑制作用 Sotorasib 抑制 SOS 介导的交换，并显著降低 N-Ras(G12C) 和 H-Ras(G12C) 中 EDTA 介导的交换速率。在 EDTA 存在下，未结合配体的 N-Ras(G12C) 表现出 BODIPY-GDP 荧光的快速增加，然后迅速降低。 细胞内活性研究发现，sotorasib (2) 和 JDQ443 (7) 对 Ras 旁系同源物 K-Ras(G12C) 和 N-Ras(G12C) 的细胞抑制作用等效，而 MRTX1257 (4) 和 divarasib (8) 对 K-Ras(G12C) 的抑制作用比 N-Ras（G12C） 的细胞效力更高(图 1I-K)。还表征了 pERK 的抑制作用，发现 sotorasib 对 N-Ras(G12C) 细胞中 pERK 的抑制效力高于 K-Ras(G12C) 细胞。这些数据表明，一些 K-Ras(G12C) 抑制剂可能也是治疗 N-Ras(G12C)驱动的肿瘤的合适候选分子。 图 1K-Ras（G12C）、H-Ras（G12C） 和 N-Ras（G12C） 的 SII 口袋共价抑制作用 3. 抑制剂可靶向 Ras 家族 GTP 酶 Ras 超家族分为五个主要家族(Ras、Rho、Rab、Ran 和 Arf GTP 酶)，包括 150 多个成员（图 2A-B）。Ras 家族进一步分为六个亚家族（Ras、Ral、Rap、Rad、Rheb 和 Rit）。与 Ras 旁系同源基因不同，这些 GTP 酶的残基与 K-Ras(Y96) 相当。当测试 RalA(G23C) 与不同 SII 口袋抑制剂的共价结合时（图 2C），发现 12 小时后大多数抑制剂完全共价修饰。标记后的蛋白质质量对应于 RalA (G23C) 和相应的共价配体之间的加合物（图 2D ）。结合的动力学研究表明，RalA (G23C) 在与 MRTX1257 或 divarasib 完全结合几分钟后表现出特别快速的标记（图 2E）。与 Ras 旁系同源基因类似，发现共价标记的 RalA （G23C） 的热稳定性显着增加（图 2F）。Rap1A （G12C） 表现出相似的整体序列同源性，也表现出与所需共价加合物相对应的一系列配体的完全共价修饰。动力学测试显示（图 2G-H), 与 RalA、Rap1A (G12C) 、Rit1 (G47C) 、M-Ras (G22C)和Rheb (R15C) 均被标记。总之，MRTX1257 和 divarasib 可有效地共价标记 GDP 结合形式的RalA 和 Rap1A 的 。 图 2 共价靶向Ras 家族 GTP 酶 为了验证MRTX1257与 K-Ras(G12C)相似地结合 RalA(G23C)，通过氢-氘交换液相色谱-MS(LC-MS) （HDX-MS） 分析了共价加合物。该方法已广泛用于分析 K-Ras 中 SII 口袋接合的动力学分析。HDX-MS 分析酰胺氢的交换速率，酰胺氢是蛋白质中二级结构元件稳定性的替代物。形成 RalA(G23C)⋅GDP⋅ MRTX1257 加合物的大片区域氘掺入量显著降低（图 3A）。对应于 SII(68-74)、螺旋 α2(80-85)和螺旋 α3(102-112) 显示出显著的保护作用。通过将核苷酸交换测定适应 Rap1A GEF（RAPGEF5 来测试双突变体 Rap1A（G12C、L96F） 的功能抑制（图 3B）。 图 3Ras 家族 GTP 酶的细胞靶向 接下来，使用过表达RalA(WT)和 RalA(G23C) 的 EGFP 标记（图 3C），并使用基于捕获活性 GTP 结合的 RalA G-LISA 测定测试它们的细胞活性（图 3D）。RalA （WT） 的过表达增加了活性 RalA 的量，但发现对 MRTX1257浓度的增加不敏感。RalA (G23C) 的过表达进一步提高了活性 RalA 的量，这表明这种突变亚型是显性激活的。与 MRTX1257 孵育后，RalA （G23C） 的活性以剂量依赖性方式降低，表明该 GTP 酶的细胞抑制。用 divarasib 处理细胞可有效抑制活性 Rap1A （G12C， L96F）（图 3E）。使用 RalA(WT)、Rap1A(WT) 和 RhoA(WT) 进行了表面等离子体共振(SPR)亲和力测定，发现divarasib 与 RalA(WT) 和 Rap1A(WT) 的可逆结合，但不能检测到与 RhoA(WT) 的结合，它与 K-Ras 的序列同源性较低，被用作阴性对照（图 S2F-S2H）。这些数据表明，开发 Ras 旁系同源物以外的 GTP 酶的可逆抑制剂可能是可行的。 图 S2其他 Ras 家族 GTP 酶和 GTP 结合的 Ras 家族 GTP 酶的共价结合和可逆结合 4. Ras 家族 GTP 酶与 RMC-6291结合 除了使用结构相关的 SII 口袋抑制剂（如化合物 1-10）靶向 K-Ras（G12C） 外，最近还报道了一种替代策略，该策略基于化学配体 K-Ras（G12C） 和免疫亲环蛋白 A （CypA） 之间形成的三复合物来标记 K-Ras（G12C）。由于三复合物抑制剂策略依赖于 SIIP 结合剂的不同分子识别决定因素，包括识别与 GTP 状态的增强结合。那该策略是否可以扩展适用于引入半胱氨酸的 GTP 酶化学靶向的化学物质? 最近报道了配体 RMC-4998 的广泛表征，包括 K-Ras(G12C):RMC-4998:CypA(PDB:8G9P) 的晶体结构。发现对该三重复合物的形成最关键的 K-Ras 残基是 C12、G13、E31、D33、P34、I36、E37、A59 和 Y64。其中带负电荷的残基 E31 、 D33 和 E37 与 CypA 上的残基形成氢键，而其他残基被发现对促进配体结合很重要（图 4A）。值得注意的是，这些残基中的大多数与上面探讨的参与 SII 配体结合的残基正交，因此可以提供一种有吸引力的替代方法来靶向 Ras 家族 GTP 酶。作者试图测试在列出的残基中具有高序列同源性的 Ras 家族 GTP 酶的细胞参与机会，并鉴定了 M-Ras、R-Ras1 和 Rheb。M-Ras 和 R-Ras1 的 E31 和 Y64 等效残基不同，并且都在 31 位上是天冬氨酸，在 64 位为苯丙氨酸。Rheb 在 G13 和 E31 等效残基中有所不同，并且在两个位置都是丝氨酸（图 4B）。对于所有四种测试的 GTP 酶，发现在抑制剂存在下 G12C 突变体形式的带偏移，与凝胶迁移率降低的共价复合物的形成一致（图 4C-4F）。这表明三复合物抑制剂 RMC-6291 也能够靶向 K-Ras 以外的 GTP 酶，并且可能是其他 SII 口袋配体的有吸引力的替代品。而测试较低序列同源性的 Rab 和 Rho GTP 酶 （Rac1(G12C) 和 Rab1A(S20C)） 的突变体时，则无法检测到带转移。 图 4Ras 家族 GTP 酶的细胞靶向 RMC6291 5. 靶向 Rho 家族和 Rab 家族 GTP 酶 为了测试通过 SII 口袋参与靶向 Rho（RhoA 和 Rac1） 和 Rab （Rab1A 和 Rab5C）家族 GTP 酶的潜力，作者重组表达了这些家族的几个广泛研究的成员。有趣的是，K-Ras(Y96) 和 K-Ras(Q99) 等效位置在 Rho 和 Rab GTP 酶中都是高度保守的，这表明在上述所选实例上的结果对于这些家族的其他成员可能具有代表性和可推广性。 大多数 Rho 和 Rab GTP 酶在相当于 K-Ras（Y96） 的位置上含有色氨酸，在相当于 K-Ras（Q99） 的位置上含有谷氨酸。基于 MS 的药物筛选显示，Rac1 （G12C） 和 RhoA （G14C） 被 MRTX1257 和 divarasib有效共价标记(图 5A-C)。SII口袋中残基的排列显示，Y96 与 Rac1 SII 口袋的匹配性不如 W96，这表明所有三种芳香族氨基酸(Y、F[如,RalA] 和 W)在这个位置都具有良好的耐受性（图 5D）。将 Q100 引入 Rac1(G12C) 中产生双突变体 Rac1 (G12C，E100Q)，显著加速共价修饰。将 H96 引入 Rac1(G12C， K96H)，有更显著的效果，修饰活性与 Ras 家族 GTP 酶 RalA(G23C)、Rap1A(G12C， L96F) 和 M-Ras（G22C） 相似。这一发现加强了这种残基作为选择性过滤器在 SII 口袋抑制剂设计中的重要性和潜力。最后，测试癌症激活突变之一的 Rac1 （G12C， P29S），发现这种突变对 SII 口袋标记影响很小（图 5D）。 图 5靶向 Rho 家族和 Rab 家族 GTP 酶 通过差示扫描荧光实验，发现了 Rac1(G12C)⋅GDP⋅divarasib与 Rac1(G12C)⋅GDP 相比没有表现出更高的温度稳定性(图 S3 A-E）。进一步发现载有 GTP 类似物 GTPγS 的 GTP 酶可以与 divarasib 进行共价标记，尽管它是不完整的。在无核苷酸状态下，divarasib 不能有效地标记 GTP 酶。 图 S3.Rac1 靶向的进一步表征 与测试的 Rho GTP 酶类似，MRTX1257 和 divarasib 也是 Rab GTP 酶 Rab1A（S20C） 和 Rab5C（S30C） 最有效的共价配体（图 5E -G）。最后,测试了 Rab1A（S20C，E108Q） 以研究在 SII 口袋中引入第二个突变是否可以像 Rho GTP 酶一样增强结合。事实上，Rab1A （S20C，E108Q） 表现出比 Rab1A （S20C） 更快的标记动力学，并且 Rab1A （WT） 没有进行标记（图 5H）。 图 5靶向 Rho 家族和 Rab 家族 GTP 酶 通过 HDX LC-MS （HDX-MS） 分析了 Rab1A（S20C、E108Q）⋅GDP⋅MRTX1257 加合物，发现该化合物在 SII 口袋附近的残基 48 和 112 处诱导的交换增加（图 5I）。此外，可以引入二级突变以divarasib加速结合(图5J-K）。 总之,结果表明，与 Ras 家族成员相比，现有的 K-Ras（G12C） 抑制剂与靶向测试的 Rho 和 Rab GTP 酶的 SII 口袋的匹配性较差，需要进一步通过药物化学进行优化。。 图 5靶向 Rho 家族和 Rab 家族 GTP 酶 6. 优化抑制剂支架的开发 作者试图探索 Rac1 (G12C) 、Rab1A (S20C) 和 Rab5C(S30C 的新化学空间。为了解释 SII 口袋的高度动态性质，使用了分子动力学 （MD） 模拟来预测 MRTX1257 和 divarasib 的新型类似物的最佳结合姿势，并应用量子力学 （QM） 计算化学弹头的反应性（图 S5A-S5D）。作者设计了12个新的配体以最大限度地提高结合口袋内的相互作用，并预测了每个配体的最低能量构象（图 6A-C）。对所有的22个化合物进行共价标记的配体活性筛选（图 6D-F）。化合物 11 对 Rac1 （G12C） 和 Rab1A （S20C） 的标记速度更快，化合物 14 对 Rab5C （S30C） 的标记速度更快。 图 6Rab 和 Rho GTP 酶的配体优化 结合计算建模和新类似物的测试，对 SII 口袋配体的结构-活性关系 （SAR） 有了更好的理解，这可以指导进一步优化:在Rac1(G12C)筛选中，化合物 8 和 11 表现出最快的标记速率（图 6D）。化合物 11 能够标记 Rac1 (G12C) 的速度比 divarasib 快约 2 倍（8)。对于 Rac 5C(S30 C)，甲基萘是最佳的 C7 取代基 （4 和 14），导致最快的标记速率，可能是通过建模建议的更好的可逆结合亲和力（图 6F）。同时，观察到这三种 GTP 酶之间的 C2 位置存在非常不同的 SAR。首先，一个相对灵活的 C2 取代基 （21） 优于两个相对刚性的 C2 取代基（20 和 22）。其次，C2 位（ 6 和 19）位置的氢在 Rac1 （G12C） 中相对耐受性良好，但在 Rac1A （G20C） 和 Rac5C （S30C） 中降低标记率。综上所述，这些结果表明 K-Ras（G12C） 优化配体 divarasib 和 MRTX1257 的初始优化以靶向 Rab 和 Rho GTP 酶，并为选择性靶向这些蛋白的下一代优化配体提供了设计考虑。 7. 结束语 本研究仍然偏向于针对 K-Ras（G12C） 优化的化学空间。新的化学空间和发现其他 GTP 酶的新型可逆高亲和力骨架需要协调一致的药物化学运动。 参考：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00908-5 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

引言 多能干细胞(pluripotent stem cells, PSCs)因其能够分化为多种类型的体细胞而成为再生医学、疾病模型构建和药物筛选等领域的研究热点。多能干细胞的状态可分为幼稚态(naive state)和致敏态(primed state)，其中幼稚态多能干细胞(nPSCs)具有更强的增殖能力和分化潜能，尤其是在分化为胚外组织时表现更为显著。这使得nPSCs在研究早期胚胎发育及相关疾病的病理机制方面具有重要价值。 然而，在体内环境中，nPSCs的存在时间极为短暂，通常仅出现在胚泡(pre-implantation blastocyst)阶段，随后便迅速转变为致敏态。为了更好地利用nPSCs进行科学研究，研究人员致力于在体外环境中逆转和维持这些细胞的幼稚态。然而，现有的逆转方法主要依赖于化学小分子和基因工程，这些方法通常操作复杂、成本高昂，且存在潜在的安全风险。因此，开发一种简单、高效且安全的方法来实现nPSCs的体外逆转和维持，成为干细胞研究领域的重要课题。 胚泡的几何特征在早期胚胎发育中起着至关重要的作用。研究表明，胚泡上胚层(epiblast, Epi)与滋养外胚层(trophectoderm, TE)的界面处呈现出独特的曲率，这种曲率可能对细胞的机械感知、信号传导以及细胞命运决定产生深远影响。在胚泡的这一界面上，nPSCs表现出紧密的顶端细胞间接触，这种接触由周围TE层的细胞张力所引发。因此，研究人员推测，通过在体外培养基底上再现这种特定的几何微环境，或许能够通过物理手段逆转和维持PSCs的幼稚态。 基于这一假设，研究团队设计并制造了一种模仿胚泡几何特征的微结构基底（blastocyst motif substrate, BMS），并通过一系列时空相关分析，验证了这一基底在诱导和维持小鼠及人类多能干细胞幼稚态中的有效性。相关研究发表于8月12日的Nature Materials上“Substrates mimicking the blastocyst geometry revert pluripotent stem cell to naivety”。研究发现，BMS基底上的微结构单元不仅可以显著增强细胞间的E-钙黏蛋白（E-cadherin）/RAC1信号传导，还能激活机械敏感的核转导因子YAP，进而促进多能性基因的组蛋白修饰。这一系列作用机制最终显著提高了多能性转录因子NANOG的表达，并且即使在细胞从基底上移除后，这些效应仍然得以保持。 通过该研究，研究人员不仅为nPSCs的体外逆转和维持提供了一种全新的物理方法，也为干细胞在再生医学、疾病模型构建和药物筛选等领域的应用开辟了新的前景。这一成果为开发更加高效、可扩展的干细胞培养基底提供了理论基础和实践依据，并有望推动干细胞技术的进一步发展。 目前，大多数逆转PSCs的方法主要依赖化学小分子或基因工程技术。这些方法通常耗时费力、成本高昂，并且在安全性上存在潜在风险。因此，研究人员希望通过开发一种基于物理特征的培养基底，以便能够更简单、安全地逆转PSCs并维持其幼稚态。 在胚胎发育早期，胚泡上胚层（epiblast, Epi）和滋养外胚层（trophectoderm, TE）之间的界面呈现出独特的几何曲率，这一曲率特征可能对细胞命运的决定产生深远影响。研究人员设想，模仿这种几何特征的微结构基底或能通过物理手段有效地将PSCs逆转至幼稚态。 为验证这一假设，研究团队设计并制造了胚泡图案基底（BMS），并通过一系列的实验技术对其效果进行了详细研究。研究方法包括以下几个步骤： 胚泡几何特征的分析：研究团队首先通过分析小鼠胚泡在E4.25至E4.50发育阶段的几何特征，确定了Epi的高度、宽度以及Epi-TE界面的曲率范围（BSCR）。BSCR被定义为15至62 mm-1的曲率范围，这是研究中用于设计BMS的关键参数。 基于胚泡几何特征设计BMS，并通过细致的计算和分类方法对BMS上的微结构单元进行分析和分类（Credit: Nature Materials） 胚泡几何特征的确定： 展示了小鼠胚泡在E4.25至E4.50发育阶段的几何特征，特别是上胚层(epiblast, Epi)与滋养外胚层(trophectoderm, TE)界面的曲率范围（BSCR）。研究团队通过对胚泡几何特征的计算，确定了Epi层的高度、宽度以及Epi-TE界面的曲率范围，得出BSCR为15至62 mm^-1。 基底微结构的设计与分类： 基于上述几何特征，研究团队设计了包含不同曲率的微结构单元(motifs)的BMS。图中展示了如何通过计算分析每个微结构单元的曲率值，并将这些曲率值按照凹面、平面和凸面进行分类。每个点的曲率被分为三类：凸面（曲率值≤-2.5 mm^-1）、平面（-2.5 mm^-1 < 曲率值 < 2.5 mm^-1）和凹面（曲率值≥2.5 mm^-1）。BSCR+区域（即曲率值在BSCR范围内的区域）主要集中在凹面部分。 微结构的分布分析： 图中还展示了BMS表面不同曲率的分布情况，显示了BSCR+区域在BMS上的比例约为8%。通过对BMS表面不同曲率区域的统计分析，发现凹面区域中包含较高比例的BSCR+点，这意味着凹面区域的微结构更有可能包含在BSCR范围内，从而对PSCs的幼稚态逆转产生影响。 时空相关分析： 图中最后展示了将BMS表面拓扑图与时间分辨的细胞图像进行叠加分析的结果。通过这种分析方法，研究团队能够追踪细胞在不同微结构区域内的分布和行为变化，从而进一步了解BSCR+区域在细胞逆转过程中的作用。 BMS的设计与制造：基于上述几何特征，研究团队设计了包含多个随机变化微结构单元的BMS，这些微结构单元被称为“motifs”。BMS通过电火花加工（Electrical Discharge Machining, EDM）在金属模具表面创建微结构，随后利用注塑成型技术将这些微结构转移至聚苯乙烯基底上，从而形成目标BMS。 细胞培养与分析：研究人员将小鼠和人类的PSCs培养在BMS上，并与传统平面基底上的细胞进行对比。他们通过时间分辨的显微镜成像技术，结合基底的几何特征信息，分析了不同曲率的微结构对PSCs的影响。此外，研究团队还利用荧光标记和定量PCR等分子生物学技术检测了细胞中多能性标志物（如NANOG、STELLA）的表达水平。 细胞信号传导的研究：为探讨BSCR在PSCs逆转过程中的机制作用，研究团队进一步分析了细胞间的信号传导情况，特别是E-钙黏蛋白（E-cadherin）/RAC1信号传导以及机械敏感核转导因子YAP的激活情况。 研究结果显示，培养在BMS上的PSCs表现出了显著的幼稚态逆转特征。 幼稚态多能干细胞的比例显著增加 在BSCR+区域（曲率范围为15-62 mm-1）内，PSCs显示出更高的NANOG和STELLA表达水平，且幼稚态多能干细胞的比例显著增加。这表明，BSCR+区域内的微结构能够有效促进PSCs向幼稚态的逆转。 细胞信号传导的增强 研究表明，BSCR+区域内的PSCs表现出更强的E-钙黏蛋白（E-cadherin）/RAC1信号传导。这种信号传导不仅增强了细胞间的粘附力，还通过激活机械敏感的核转导因子YAP，进一步推动了多能性基因的组蛋白修饰（如H3K27me3和H3K4me3的变化）。这些组蛋白修饰最终导致了NANOG等多能性转录因子的表达水平显著提高，并且这种效应在细胞从基底上移除后仍然能够持续数天。 BMS基底通过BSCR区域有效促进PSCs的幼稚态逆转（Credit: Nature Materials） 多能性标志物的表达水平： 图a展示了在不同基底（包括传统平面基底和BMS基底）上培养的多能干细胞（PSCs）中，多个幼稚态多能性标志物（如NANOG、STELLA、OCT4、SSEA1）的表达水平。研究结果显示，在BMS基底上培养的PSCs，其NANOG和STELLA等幼稚态标志物的表达水平显著高于在传统平面基底上培养的PSCs。相反，ZIC2（一种致敏态标志物）的表达在BMS基底上显著降低，这表明BMS基底能够有效促进PSCs的幼稚态逆转。 幼稚态多能干细胞的分布： 图b展示了在BMS基底上培养的PSCs中，幼稚态细胞（标记为NANOG高表达和STELLA高表达细胞）的空间分布情况。结果显示，在BMS的凹面区域（特别是包含BSCR+区域的凹面）中，幼稚态细胞的比例显著高于其他区域，表明BSCR+区域在促进PSCs逆转至幼稚态方面具有重要作用。 BSCR对幼稚态逆转的影响： 图c和d进一步量化了在不同类型微结构（凸面、平面和凹面）以及不同BSCR计数（BSCR-low、BSCR-med、BSCR-hi）区域内，幼稚态细胞的比例。结果表明，随着BSCR计数的增加，幼稚态细胞的比例显著升高，尤其是在凹面区域内。这表明，BSCR在诱导PSCs逆转至幼稚态中起到了关键作用。 BSCR计数与幼稚态的相关性： 图e和f进一步分析了不同BSCR计数（即在特定微结构区域内，符合BSCR曲率范围的方向数量）与幼稚态细胞比例之间的关系。研究发现，随着BSCR计数的增加，NANOG高表达和STELLA高表达的幼稚态细胞比例也随之显著提高。这一结果进一步支持了BSCR是影响PSCs逆转至幼稚态的重要几何参数。 细胞迁移和分布的变化 实验还发现，在BSCR+区域内的PSCs，其细胞迁移距离较短，并且在基底上的分布更为均匀，显示出对这一特定几何环境的依赖性。相反，在BSCR-区域或传统平面基底上的PSCs则表现出较高的细胞迁移性和更低的幼稚态比例。 BSCR区域如何在体外实验中诱导PSCs原位逆转至幼稚态（Credit: Nature Materials） 早期细胞与BMS的相互作用： 图a-d展示了在细胞接种到BMS基底上9小时后的早期相互作用。研究结果表明，PSCs在BSCR+区域（即符合BSCR曲率范围的区域）内随机分布，且与BSCR-区域相比，细胞密度、NANOG表达水平以及细胞大小没有显著差异。这表明在早期阶段，BSCR+和BSCR-区域的PSCs没有表现出显著的表型差异。 幼稚态标志物的动态变化：图e展示了PSCs在不同基底（传统平面基底和BMS基底）上NANOG-GFP表达的动态变化。研究结果显示，在BSCR+区域内，NANOG-GFP信号在细胞接种后的21小时内逐渐增加，表明BSCR+区域能够有效诱导PSCs向幼稚态逆转。此外，实验还通过追踪单个细胞的迁移路径，确认了幼稚态逆转是在BSCR+区域内原位发生的，而不是由于远距离迁移导致的。 细胞迁移与幼稚态逆转的关系： 图f通过追踪细胞的迁移路径，进一步分析了BSCR+和BSCR-区域内PSCs的迁移行为。结果显示，从BSCR+区域向BSCR-区域的细胞迁移事件较为罕见，而大多数细胞在BSCR+区域内保持稳定。这一结果支持了PSCs的幼稚态逆转主要发生在BSCR+区域，而不是通过细胞迁移实现的。 幼稚态逆转的时间依赖性：实验通过时间分辨的成像技术，追踪了PSCs在BMS基底上数天内的动态变化。结果显示，BSCR+区域内的幼稚态细胞比例在接种后第1天和第3天显著增加，并且与BSCR-区域相比，幼稚态细胞的比例保持较高。这表明BSCR+区域不仅能够迅速诱导PSCs的幼稚态逆转，还能够在一定时间内维持这一状态。 物理特征对细胞命运的决定性作用 通过将PSCs培养在不同形状的微结构基底上，研究进一步验证了BSCR的关键作用。即使在非对称的微结构（如微沟槽）上，只要具备BSCR特征，也能有效诱导PSCs的幼稚态逆转。这说明，BSCR是决定细胞命运的几何参数，其对细胞命运的影响独立于微结构的具体形状。 这项研究通过模仿胚泡的几何特征，成功开发了一种新型的干细胞培养基底，为干细胞研究和应用提供了新的工具和方法。与现有的化学或基因操作方法相比，BMS基底不仅设计简单，成本低廉，且能够在更短时间内有效诱导PSCs逆转至幼稚态。更重要的是，这一基底设计的理念具有广泛的适用性，不仅可以应用于小鼠PSCs，还为未来人类PSCs的逆转提供了潜在的解决方案。 未来，这一研究成果有望在再生医学、疾病模型构建、药物筛选以及个性化医疗等领域得到广泛应用。例如，通过使用BMS基底，可以更加高效地生成具备高发育潜能的多能干细胞，这将为器官再生、基因治疗以及干细胞移植等技术的发展提供重要支持。此外，研究还可以进一步扩展这一基底的应用范围，探索其在其他类型干细胞上的效果，并优化基底的设计以适应不同的研究需求。 总之，该研究通过结合胚泡几何特征和现代生物技术，开创了一种全新的干细胞培养方法，为科学家们提供了更为高效和安全的实验工具。随着研究的深入和技术的不断完善，这一成果必将推动干细胞技术的发展，为人类健康带来更多福祉。 参考文献 Xu X, Wang W, Liu Y, Bäckemo J, Heuchel M, Wang W, Nie Y, Iqbal I, Kratz K, Lendlein A, Ma N. Substrates mimicking the blastocyst geometry revert pluripotent stem cell to naivety. Nat Mater. 2024 Aug 12. doi: 10.1038/s41563-024-01971-4. Epub ahead of print. PMID: 39134648. https://www.nature.com/articles/s41563-024-01971-4 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述