PDL1 x IL-6R

摘要：过继免疫治疗使用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞是一种新的治疗范式，它使用一类新的治疗“药物”在某些迄今为止难以治疗的B细胞恶性肿瘤患者中产生完全且持久的缓解。CAR T细胞源自患者自身的免疫细胞，这些细胞在体外通过基因工程改造，带有能够结合特定目标并在目标结合时传递激活信号的CAR。CAR激活细胞毒性T细胞以有效、重复和持久的方式破坏和消除识别的癌细胞。然而，各种障碍限制了CAR T细胞在其他类型的癌症或其他疾病中的广泛应用。目前的挑战包括设计最优的CAR、积极穿透肿瘤病变，并在不诱导对健康组织产生毒性的情况下维持T细胞的抗肿瘤激活。本章回顾了CAR的代际、增强CAR T细胞效力和选择性的策略，以及为日益增多的患者建立高效的制造流程。 1.原型嵌合抗原受体（CAR，T-Body，免疫受体） 在20世纪80年代中期，Steven A. Rosenberg（美国国立卫生研究院）将从黑色素瘤活检中分离并大量体外扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重新注入黑色素瘤患者体内时，患者T细胞识别和有效摧毁癌细胞的能力变得显而易见。这些以及随后的发展促使了采用自体免疫细胞治疗肿瘤患者的概念，这些免疫细胞有能力在大量患者中诱导肿瘤退缩和长期缓解。这些扩增的TILs被认为对特定肿瘤抗原具有特异性，并具有迁移能力以进入肿瘤病变；然而，抗原特异性大多仍然未知。 接下来的几年中，为了给患者的T细胞提供明确的靶向特异性，人们付出了巨大的努力；与T细胞受体（TCR）链或重组嵌合抗原受体（CAR）的遗传工程化，证明是成功的策略之一。与TCR不同，CAR是一个复合的、单多肽链跨膜受体，它在目标识别时提供靶向特异性和T细胞激活能力。原型CAR由四个主要结构域模块化组成：在细胞外末端是用于目标识别的单链可变区（scFv）抗体，一个连接到跨膜结构域的间隔区，以及主要来自TCR/CD3ζ或Fcε受体I（FcεRI）的细胞内信号传导结构域，有或没有连接的共刺激结构域（图1）。目标细胞表面的同源抗原的参与启动了CAR工程化免疫细胞的激活，导致持久的T细胞反应。每个CAR结构域都有独特的功能，并对重定向的T细胞激活产生影响；对于每个特定应用，CAR设计需要进行一些调整，以提供优化的靶向和T细胞激活，如下文详细描述。 图1 嵌合抗原受体（CARs）的世界在不断增长。第一代CAR在细胞外域（外域）中拥有抗原结合和间隔基团，在跨膜域中，在细胞内域（内域）中拥有来自CD3ζ或FcεRI γ链的激活基团。第二代CAR除了拥有一个共刺激域之外，第三代CAR在内域中拥有两个共刺激域。第四代CAR（“TRUCK”，“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”）由第二代或第三代CAR组成，该CAR在CAR信号传导后诱导转基因蛋白的表达。虽然在规范设计中描绘，但已经工程化了大量CAR变体，每种变体都针对不同的应用进行了优化。 原型CAR的基本设计最初由Zelig Eshhar及其同事（魏茨曼科学研究所）提出，他们展示了一个模块化复合受体，最初命名为“T-Body”或“免疫受体”，具有用于结合的抗体衍生结合域和用于T细胞激活的TCR信号域，为工程化T细胞提供了特异性识别和激活。在随后的几年中，引入了许多修改，允许靶向广泛的抗原，并通过各种细胞内结构域发送信号，以启动和重定向定义的免疫细胞功能（表1）。 表 1 CAR构建模块及其替代模块。 EMA（欧洲药品管理局）批准。其他使用其他宿主细胞和不同CAR设计的应用程序也在早期临床试验中越来越多地被研究。 规范的CAR由抗体衍生的结合域、间隔区、跨膜域和细胞内主要及共刺激信号域模块化组成。每个结构域可以通过不同的模块构建，这些模块影响不同的变量，并最终影响T细胞的激活和性能。 CAR工程化的细胞毒性T细胞重定向至癌细胞是该技术研究最多的应用；自体抗CD19 CAR T细胞的过继转移成为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个基因工程细胞疗法；随后，欧洲药品管理局（EMA）也批准了。使用其他宿主细胞和不同CAR设计的其他应用也越来越多地在早期临床试验中研究。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.1.结合域 抗原结合域传统上由来自小鼠或人类单克隆抗体的单链可变区（scFv）组成。通过短柔性连接子（通常是(Gly4Ser)3肽）将重链（H）和轻链（L）抗体链的可变（V）区域连接起来，形成VH-linker-VL或VL-linker-VH的顺序。甘氨酸残基提供了灵活性，以允许VH和VL正确折叠形成抗原结合口袋，而丝氨酸则为连接子提供了一些溶解性。VH和VL链的空间位置和相互作用可以显著影响亲和力、特异性和溶解性。足够高的结合亲和力对于诱导T细胞激活至关重要；然而，存在一个亲和力上限，超过该上限CAR介导的T细胞激活不会改善，但会导致激活诱导的细胞死亡（AICD）。在CAR的背景下，一些scFvs通过张力信号独立于抗原参与诱导AICD、耗竭和T细胞的终端分化。除了亲和力和细胞表面的抗原密度外，目标表位在抗原内的位置也很重要；通常，靶向膜近端表位比靶向膜远端表位诱导更强的T细胞激活。 通过使用抗体进行靶向，CAR介导的识别是MHC独立的。这在靶向MHC-肽处理和呈递机制有缺陷的肿瘤时是有益的。此外，通过抗体识别目标，还可以识别传统T细胞看不见的抗原，如碳水化合物、脂质或抗原的结构变体。规范的CAR识别目标细胞表面的抗原；也可以通过使用特异性针对定义的MHC-肽复合物的抗体，工程化MHC-肽识别CAR，使其能够感知由MHC呈递的细胞内抗原。例如，一个scFv识别HLA-A2背景下的NY-ESO-1肽的CAR提供了与相应TCR类似的TCR样识别目标。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.2.间隔区 原型CAR经常在抗原结合域和跨膜域之间包含一个“间隔区”，以便接近目标抗原；连接的铰链区提供了一定的灵活性。间隔区的类型和长度对于最佳目标结合和信号传递至关重要。间隔区并非必需，因为有些CAR在scFv直接融合到跨膜域时是活跃的，而其他CAR只有在具有一定长度的间隔区时才活跃。间隔区通常来源于IgG1或IgG4恒定域或来自细胞外CD28、CD4或CD8（图2）。一般的想法是，间隔区在工程化T细胞和相应目标细胞之间提供最佳距离，以允许与目标细胞形成有效的接触区。基于TCR-MHC相互作用的知识，人们普遍认为CAR-目标相互作用需要在T细胞和目标细胞之间创建约15纳米的距离，以最佳形成接触区。因此，针对膜近端表位需要较长的间隔区，而较小的间隔区对更远离膜的表位是最佳选择；通过使用不同长度的间隔区可以轻松调整距离。在这个背景下，IgG衍生的间隔区具有可以通过结合一个、两个或三个CH1-CH2-CH3部分来调整长度的优势。IgG1衍生的间隔区还有利于CAR分子的稳定；然而，它可能与髓系细胞上的Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，介导CAR T细胞和髓系细胞的“非肿瘤”激活。这可以通过删除间隔区内的IgG1 CH2域或通过删除IgG1 Fc受体结合部分内的Asn297糖基化位点来预防。类似的修改也可以引入到IgG4间隔区。 图 2 第二代CAR设计的变体。由于模块化组成，可以使用各种替代域来构建CAR，其中一些示例性地列出。各个组分的变化允许调节CAR的结合和信号传导，最终调节细胞功能、代谢和工程化T细胞的抗肿瘤活性。其他变体旨在提高结合亲和力、目标的可及性、信号强度和细胞膜上的持久性等。最后，安全预防措施导致CAR设计中进一步的修改。 2.3.跨膜区 典型CAR的跨膜区来源于如CD3ζ、CD4、CD8α、CD28或OX40等类型1跨膜蛋白，由20-23个疏水性氨基酸组成，富含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸（图2）。带有CD3ζ跨膜域的CAR似乎比其他CAR更有效地整合到TCR/CD3复合体中，因此在表达和信号传导方面更为稳健；带有CD28跨膜区域的CAR似乎同样稳定。另一方面，带有CD8α铰链和跨膜域的CAR不易于AICD；然而，它们通过减少促炎细胞因子的释放来介导较少的T细胞激活。 2.4.细胞内信号传导域 “第一代”CAR完全通过主要信号传导域（信号-1）进行信号传导。TCR/CD3ζ细胞内链含有三个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs），FcεRI γ链含有一个ITAM，这些在磷酸化后作为下游信号蛋白的特定适配器。因此，CAR利用内源性TCR信号机制来启动T细胞激活事件的级联。下游激酶如Lck或Fyn也可以作为CAR介导的T细胞激活的主要信号，等等（图2）。CAR信号传导域本身足以与下游激酶结合并启动有效的激活级联，因为CAR在TCR敲除细胞和非T细胞如NK细胞中也是功能性的。然而，仅有主要信号的CAR不足以激活以允许长期持久；这样的CAR T细胞迅速进入凋亡。根据“双信号假说”，静息T细胞还需要一个共刺激信号以持续激活。这就是将主要信号与共刺激信号（信号-2），如CD28或4-1BB（CD137），结合在“第二代”CAR中的理由。也在临床前和临床上探索带有替代共刺激域的CAR，如OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、CD2和CD244。为了方便下游激酶的接近，CD28通常位于膜近端位置，随后是远端位置的CD3ζ；OX40和4-1BB在膜远端和近端位置都活跃。与第一代CAR相比，第二代CAR T细胞在细胞因子释放、扩增和抗肿瘤活性方面显示出稳健和持久的反应。 CAR介导的共刺激以不同的方式影响T细胞效应功能、存活、持久性和代谢。例如，4-1BB CAR T细胞在患者血液中的持久性超过6个月，而CD28 CAR T细胞在3个月之后大多无法检测到。经过重复刺激后，CD28 CAR T细胞重新编程为CD45RO+ CCR7−效应记忆细胞，这些细胞随后需要OX40来延长持久性并避免快速耗竭；4-1BB CAR T细胞主要转化为CD45RO+ CCR7+中央记忆细胞，并在外围血液中长期持久。CD28 CAR信号激活PI3K/Akt/mTOR途径，刺激有氧糖酵解，增加葡萄糖摄取和ATP生成，而4-1BB CAR信号激活Wnt/β-catenin途径和脂肪酸氧化，增加代谢和线粒体呼吸链能力。典型的Wnt/β-catenin有利于中央记忆细胞的形成和T细胞的长期存活，而CD28诱导的PI3K/Akt信号维持效应细胞的即时响应。在高剂量下，CD28和4-1BB CAR T细胞都能在临床前模型中根除大型已建立的肿瘤；在低剂量下，CD28 CAR T细胞比4-1BB CAR T细胞表现出更大的耗竭程度，结果是4-1BB CAR T细胞在长期内更有效地根除大型肿瘤负荷。另一方面，带有4-1BB CAR的T细胞仍然对肿瘤介导的通过TGF-β的抑制敏感，这对CD28 CAR T细胞来说较少见。因此，选择CAR设计的标准取决于多个参数，包括T细胞持久性、抗抑制能力、共刺激和共抑制配体的模式、肿瘤细胞上的抗原密度、T细胞上的CAR密度等。 “第三代”CAR结合两个共刺激域以及主要激活信号。联合共刺激的好处只在少数情况下得到证明，例如，通过CAR提供CD28-OX40共刺激对T细胞在终端成熟中的进展有益。 3.TRUCK：“第四代”CAR T细胞 CAR T细胞可以用来按需将转基因蛋白输送到预定的、靶向的组织。因此，CAR T细胞被设计成带有CAR诱导表达盒的额外“有效载荷”。所谓的“第四代”CAR T细胞，即TRUCKs（“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”），旨在在靶向组织中沉积分泌型转基因蛋白，以实现治疗有效浓度（图3）。“有效载荷”的表达受NFAT6-IL-2最小启动子的控制，该启动子在CAR信号传导时被激活；有效载荷可以是转基因编码的任何蛋白或肽。这种策略特别有趣，因为它结合了重定向CAR T细胞攻击和局部沉积的生物活性蛋白的作用，同时避免了系统毒性。只要CAR T细胞保持激活状态，TRUCKs就会沉积转基因产物，例如，IL-12或IL-18作为转基因免疫调节剂，以特定方式塑造靶向肿瘤环境，而不引起系统毒性。累积的TRUCK产生的IL-12在CAR靶向的肿瘤组织中招募天然免疫细胞，如NK细胞和巨噬细胞，在那里反过来启动二次抗肿瘤免疫反应。IL-12 TRUCKs抵抗Treg细胞的抑制，并显示出增加的细胞因子释放和扩增。当快速进展的肿瘤积累抗原丢失的癌细胞，导致对CAR T细胞不可见的肿瘤复发时，这种策略特别有趣。释放IL-18的TRUCKs将CAR T细胞转化为T-bet高FoxO1低效应细胞，抵抗耗竭并显示出对大型已建立肿瘤的优越细胞毒性。IL-18 CAR T细胞治疗改变了整个肿瘤免疫细胞景观，特别是通过增加CD206− M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，减少抑制细胞如Tregs、抑制性CD103+ DCs和M2型巨噬细胞。其他例子包括释放过氧化氢酶以保护T细胞免受过氧化压力介导的抑制和释放肝素酶以改善T细胞通过肿瘤基质的穿透。 图 3 第四代CAR T细胞（“TRUCKs”）。在抗原结合时，第二代或第三代CAR诱导表达一种转基因蛋白，该蛋白在细胞内作用、整合到膜中或由CAR T细胞释放。释放的转基因蛋白旨在改变肿瘤环境、重塑肿瘤组织或吸引二次免疫反应。CAR T细胞被诱导仅在CAR与其靶标结合时释放蛋白质，从而将“有效载荷”在预定义的交付点作为“TRUCK”进行交付。这种CAR T细胞被理解为“活体工厂”，用于精确和持续地交付治疗性细胞产品。 所谓的“装甲CAR”通过产生4-1BB配体提供增加的共刺激通过刺激4-1BB途径。工程化的T细胞被设计为分泌Toll样受体（TLR）配体，可以刺激T细胞和抗原呈递细胞上的TLR途径，然后可以激活一组T细胞进行广泛的抗肿瘤攻击。靶向Muc16ecto（即黏蛋白-16（CA-125）的膜保留残余物）并分泌IL-12的CAR T细胞正在临床试验中评估（NCT02498912）。IL-15 TRUCK细胞显示出改善的扩增和抗肿瘤活性，但在未受控制的扩增情况下需要自杀基因，由于其白血病潜力。“装甲”CAR通过与CAR共表达IL-7受体-α链来恢复对IL-7的反应性，并促进Th1反应。类似地，在IL-4水平增加的前列腺癌中，共表达IL-4结合/IL-7信号传导受体提高了抗PSCA CAR T细胞的抗肿瘤活性。另一方面，CAR T细胞上共表达的显性负性TGF-β DNRII受体可以在TGF-β存在的情况下与TGF-β竞争，以改善T细胞的抗肿瘤活性。也可以设想提供细胞因子或细胞因子受体之外的应用，如输送可溶性HVEM外域，以靶向肿瘤血管，以维持肿瘤穿透。 4.具有双重特异性、组合抗原识别和条件性CAR的CAR T细胞 原型CAR通过一个scFv将特异性重定向到一个抗原；多种原因要求具有多重特异性的CAR：(1)肿瘤病变在可靶向抗原方面可能是异质的，或在肿瘤进展过程中丢失抗原；(2)靶向癌细胞和肿瘤基质或血管可能有益或需要增加治疗效果。将两种或更多CAR T细胞产品应用于癌症患者基本上是可行的，尽管需要在GMP条件下制造两种细胞产品。例如，通过顺序输注应用CD19和CD22 CAR T细胞目前正在评估治疗难治性B-ALL的试验中（NCT03620058）。或者，T细胞被设计为表达两个CAR，即所谓的双顺反子CAR，每个CAR针对不同的抗原（图4）。通过灵活的连接子将两个scFv相互连接，设计出具有双重特异性的CAR。这种串联排列的双特异性CAR（“串联CAR”，“Tan-CAR”）或环状结构，针对两种不同的抗原，并能够在结合任一抗原时提供T细胞激活（“或”门控）；具有其中一种相应抗原的目标细胞仍然被识别。除了两个连接的scFv外，双抗体、二合一抗体和双变量域抗体也可以用来设计具有两种特异性的CAR。三特异性CAR包含单价和/或多价CAR结构的组合，以针对三种抗原，进一步扩大靶向特异性。一个例子是设计了一种双特异性CAR，将针对CD20和CD19的scFv连接起来，旨在减轻在接受CD19 CAR T细胞治疗后经常发生的B细胞白血病/淋巴瘤的复发。CD19− CD20+白血病细胞的复发旨在通过CD20-CD19双特异性CAR T细胞得到控制。双特异性CAR中scFv的顺序取决于特定抗原中目标表位的空间可及性。CD20-CD19 CAR对CD19和CD20都具有相同的结合能力，并重定向T细胞激活，而CD19-CD20 CAR则效率要低得多。其他双特异性CAR的例子是针对CD19和CD123治疗B-ALL或CD19共靶向CD22、ROR1和免疫球蛋白κ轻链（Igκ）。多特异性CAR T细胞目前正在早期临床试验中评估。通过双顺反子表达盒设计了同时具有CD19和CD22 CAR的T细胞，正在进行治疗高风险B-ALL或干细胞移植后复发的试验（NCT03289455）。具有CD19和CD22特异性的双价CAR正在评估治疗B-ALL或B细胞淋巴瘤（NCT03241940, NCT03233854, NCT03330691, NCT03448393, NCT03019055）。目前正在进行的II期试验中评估了针对BCMA两个表位的双特异性CAR（NCT03758417）。 图4 基于逻辑门控的CAR介导的T细胞激活，以证明在肿瘤靶向中的选择性。共表达两种CAR，每种CAR在与相应的目标抗原结合时都能完全激活T细胞；双特异性CAR（串联CAR，Tan-CAR）也是如此。在这种情况下，通过表达抗原A或B或两者的细胞激活T细胞（"OR"门控）。为了仅通过同时表达A和B抗原的细胞激活CAR T细胞，识别A的CAR仅通过CD3ζ提供基本激活，这不足以实现完全和持续的激活，而识别B的CAR提供共刺激；通过两种CAR的同时信号传导诱导T细胞完全激活（"AND"门控）。识别抗原A的synNotch CAR驱动转录并表达第二种CAR，该CAR在识别抗原B时驱动T细胞完全激活。具有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR在其识别的抗原B结合时阻止通过激活CAR的信号传导。当抗原B不存在时，CAR可以在结合抗原A时激活T细胞（"A-not-B"门控）。 当结合两种抗原时，双特异性CAR比单特异性CAR具有更高的亲和力，理论上稳定了突触并改善了T细胞对低抗原水平目标细胞的反应。这种情况可以用来只将CAR T细胞重定向到表达两种抗原而不是一种的细胞（图4）。这种“与”门控的抗原模式旨在提高对癌细胞的靶向选择性，同时保留健康细胞。两个共表达的抗原被两个共表达的CAR识别，每个CAR识别特定的抗原，并分别提供主要或共刺激信号。这样，只有同时结合两种抗原才提供完全T细胞激活所需的两个信号；结合一种抗原是不足够的。组合抗原识别的例子是，通过CD3ζ CAR靶向ErbB2和通过CD28 CAR靶向Muc1，或通过CD3ζ CAR靶向间皮素和通过CD28 CAR靶向叶酸受体-α。靶向CD13和TIM3的双特异性和分裂CAR T细胞在临床前模型中根除患者衍生的急性髓性白血病细胞，减少了对骨髓和外周髓性细胞的毒性。 通过异二聚体化两个多肽链，可以加强两个CAR上的初级和共刺激信号的组合；一个链由细胞外和跨膜以及初级信号传导部分组成，第二个链提供共刺激信号传导部分，并通过添加“二聚体化剂”与第一个链相连。CAR在二聚体化剂允许异二聚体化和功能性CAR形成之前保持沉默。通过滴定二聚体化剂剂量可以微调T细胞活性；撤除二聚体化剂终止CAR信号。只有当每个CAR信号单独不足以驱动T细胞激活时，才能通过组合抗原识别实现清晰的“开-关”T细胞激活。由于预先激活的T细胞中的CD3ζ信号可能重新诱导T细胞反应，因此需要调整信号或降低结合亲和力以实现平衡的激活阈值。 可调CAR的另一种策略基于合成Notch（synNotch）受体。Notch由一个细胞外受体、一个跨膜域和一个细胞内转录调节器组成，激活后介导内部域的蛋白水解，释放细胞内转录调节器。这些特性用于控制与Notch受体不同特异性的真正CAR的转录。优点在于Notch受体的抗原识别基于逻辑“与”门控，并以空间定义的方式控制CAR T细胞功能。在CD19结合后，CD19特异性synNotch受体释放转录效应域Gal4-VP64或TetR-VP64以诱导抗间皮素CAR的表达。只有当在靶向组织中同时识别synNotch配体和CAR配体时，T细胞才被激活。另一个例子是通过CAR靶向ROR1和通过Notch受体靶向EpCAM或B7-H3。虽然CAR的“开开关”决定了靶向癌细胞的选择性，但这种策略可能受到诱导足够水平的CAR表达和在没有Notch信号进一步发生时衰减CAR所需的时间的限制。 工程化T细胞的TCR特异性也可以用来提供更复杂的识别轮廓。带有γδ TCR的T细胞识别肿瘤细胞特有的磷酸化抗原；转基因表达GD2特异性CAR和共刺激域只会在γδ TCR和CAR同时结合它们相应的抗原时提供完全的T细胞激活；由于缺乏γδ TCR激活，不会攻击GD2+的健康细胞。 虽然许多可靶向的抗原既表达于健康细胞也表达于癌细胞，但有些抗原仅由健康细胞表达，而癌细胞缺乏表达。在这种情况下，结合共同抗原“A”但在结合健康细胞上的抗原“B”时阻断，将阻止CAR T细胞激活对抗健康细胞（图4）。带有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR只要结合其相应的抗原“B”，就阻止通过激活性CAR的信号传导。结合缺乏抗原“B”的“A”癌细胞允许CAR T细胞激活，因为缺乏通过抑制性CAR的信号传导（“A非B”门控）。 5.具有植入多重抗原特异性的通用CAR 目前，原型CAR具有一个确定的抗原特异性；改变特异性需要用新的CAR工程化T细胞。在这种情况下，开发了一种“通用”CAR，它识别一种抗体，该抗体转而提供癌症特异性（图5）。例如，抗癌抗体的免疫球蛋白Fc区域被具有CD16作为结合域的CAR结合。CD16 CAR T细胞结合抗癌抗体，从而获得对癌细胞的特异性。或者，CAR结合至与抗癌靶向抗体相关联的蛋白质表位。具有荧光素异硫氰酸酯（FITC）特异性CAR的T细胞识别FITC标记的叶酸，该叶酸与叶酸受体阳性癌细胞结合。也可以设想将其他表位与桥接抗体相关联，如亲和素。同时添加不同特异性的抗体，允许将相同的CAR T细胞产品（“UniCAR”）重定向至多种抗原，无需重新制造CAR T细胞。该策略的优点是同时使用不同的抗体靶向广泛的抗原，同时只应用一种制造的CAR T细胞产品。实际的特异性由应用的抗体混合物在治疗足够浓度下定义。随着应用的抗体的短半衰期，此外，意外的不良事件在抗体撤除后很快就会有限。从机制上讲，有效的肿瘤控制需要CAR T细胞和连接抗体都渗透到肿瘤病变中；目前尚不清楚这是否适用于晚期实体瘤。也尚未解决“通用”CAR T细胞是否能够建立对癌症抗原的持久免疫记忆，这被认为是长期控制癌症所需的。 图 5 “通用”CAR的概念。T细胞表达一种特异性针对标签的CAR，该标签与连接分子相连，最好是天然抗体、单链抗体(scFv)或双特异性T细胞导向抗体(BiTE)，这些分子能够识别肿瘤细胞上的目标抗原。通过添加不同的连接分子，无需工程化新的CAR T细胞，就可以为T细胞配备不同的特异性。这被认为在将CAR T细胞应用于患者后也是可行的；注入针对不同肿瘤抗原的抗体，为CAR T细胞提供不同的特异性。 6.转换抑制信号为激活信号的Switch CAR 在肿瘤病变中，重定向的T细胞攻击通常以各种方式受到抑制；抑制性配体如程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）和PD-L2与激活的T细胞表达的程序性细胞死亡-1（PD-1）结合。一种结合这种抑制性配体但向工程化T细胞传递激活信号的CAR，不仅可以与抑制性受体竞争结合，还可以通过提供激活信号克服抑制（图6a）。理想情况下，PD-L1:CD28 “开关”CAR在工程化T细胞中克服PD-1介导的抑制信号。特别是，一个具有PD-1细胞外域结合PD-L1和CD28细胞内信号传导域的CAR，将抑制信号转换为激活信号，导致ERK磷酸化增加，促炎细胞因子释放，T细胞扩增和目标细胞的细胞溶解。由TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）的外域与CD28共刺激域融合而成的嵌合受体，在结合TIGIT配体CD155时增强T细胞功能。鉴于肿瘤组织提供的大量抑制信号，确定需要克服的“关键”抑制因素以维持有效的T细胞反应仍然是一个挑战。 图 6 开关CAR和抑制性CAR（iCAR）。(a) 开关CAR与生理性T细胞抑制性受体的配体结合，但为工程化T细胞提供激活信号。(b) 抑制性CAR在与抗原结合后，通过ITIM信号向工程化T细胞提供负信号。抑制信号压倒了通过TCR或共表达的激活CAR的激活。 7.抑制性CAR：iCARs 虽然原型CAR向工程化T细胞提供激活信号，但具有抑制信号的CAR旨在在结合健康细胞时抑制CAR T细胞激活。理想情况下，抑制性CAR通过在面对健康组织时覆盖激活CAR信号来减轻非肿瘤毒性。与激活性、肿瘤特异性CAR共表达的具有优势抑制信号的CAR，识别健康细胞；从而CAR T细胞只在结合癌细胞时激活，抑制性CAR不结合健康细胞（图6b）。这种抑制性CAR提供PD-1或CTLA-4信号，并覆盖癌症特异性CAR的激活信号。 8.异体CAR T细胞和CAR NK细胞 到目前为止，CAR T细胞治疗是一种通过体外制造患者自己的T细胞的个性化治疗。这不仅繁琐、成本密集和耗时，而且在患者晚期疾病无法提供足够或足够活跃的T细胞进行CAR工程化时通常也不适用。在这种情况下，异体“现成的”CAR T细胞将为广泛的患者群体带来好处。为了避免移植物抗宿主病（GvHD），需要删除内源性的αβ TCR和HLA分子，这可以通过锌指核酸酶或CRISPR/Cas技术实现。随后清除剩余的TCRαβ T细胞，通过污染的异体TCR+细胞降低GvHD风险。T细胞通过转录激活样效应核酸酶（TALENs）技术在TCRα和CD52位点进行基因编辑，用于治疗无法生产自体CAR T细胞的患者的儿童CD19+ ALL。CD52存在于患者的恶性B细胞上，需要从CAR T细胞中删除，以允许消除恶性淋巴细胞，同时保留注入的CD52阴性CAR T细胞。对于工程化异体CAR T细胞，CRISPR导向RNA和Cas9目前由病毒载体编码以实现组成性表达；当前的研究旨在短暂提供基因编辑工具，而不持久的载体，以最小化非目标编辑。 针对BCMA治疗多发性骨髓瘤的异体CAR T细胞，通过BCMA CAR和基因编辑技术进行了改造，以限制TCR介导的免疫反应。通过将CD20模拟表位整合到CAR的细胞外域，使CAR T细胞能够通过利妥昔单抗消除，从而提供了异体BCMA CAR T细胞的安全性。 关于使用异体效应细胞，NK细胞也可以用于诱导有效的抗肿瘤反应，因为它们具有细胞毒性潜力和分泌促炎细胞因子。除了使用异体细胞，使用NK细胞进行癌症的过继细胞治疗有很强的生物学理由；NK细胞表现出广泛的抑制性和激活性受体库，以识别外来、感染或恶性细胞。两种信号的平衡最终诱导或阻断细胞毒性CD56dim NK细胞释放细胞毒性颗粒以杀死目标细胞。虽然可能存在广泛的NK细胞亚群多样性，基于激活和抑制受体的库，但通过CAR工程化NK细胞将为特定癌细胞提供预定的特异性。原型CAR具有CD28-CD3ζ信号也在NK细胞中活跃；具有NK细胞2DS2和DAP12信号蛋白的CAR产生了更强的抗肿瘤活性。为NK细胞工程化的CAR通常包含DAP10或DAP12用于激活，单独或与CD3ζ一起。具有NKG2D作为结合物和DAP10-CD3ζ用于激活的CAR有效地激活了小鼠模型中针对骨肉瘤的原代NK细胞。CD3ζ在NK细胞中作为激活域优于DAP10，而DAP12优于CD3ζ。 9.制造CAR T细胞用于临床应用 对于临床应用，CAR T细胞产品是根据良好生产规范（GMP）规则，使用预期接受患者的自体T细胞制造的（图7）。在大多数情况下，通过白细胞分离术收集血液，分离T细胞，通过病毒感染或电穿孔进行基因工程改造，并扩增到临床相关的数量。大多数临床试验使用通过γ-逆转录病毒或慢病毒基因转移修饰的T细胞；基于转座子的载体，如Sleeping Beauty和PiggyBac，越来越多地应用于临床，其好处是避免了成本和时间密集型的病毒生产。病毒和转座子介导的基因转移程序旨在永久性地修改患者的T细胞以表达CAR；一些试验使用通过RNA电穿孔修饰的T细胞进行短暂的CAR表达。在永久性基因改造后，插入突变和随后成熟T细胞的致癌转化的风险似乎很低，到目前为止在这方面还没有报告致癌事件。一个需要注意的问题是，通过慢病毒转移，CAR基因插入到Tet2位点导致T细胞的克隆扩增，然而，它们自发地收缩了。然而，白细胞分离产品中污染的恶性细胞也可能意外地被CAR改造，存在重新输注给患者后通过CAR介导的肿瘤促进的风险。 图7 CAR T细胞制造和患者治疗时间表。(a) 通过白细胞分离术从患者体内收集T细胞，并在体外处理以获得最终的CAR T细胞产品，包括T细胞工程化以携带CAR、扩增至临床相关数量，以及最终的质量控制程序（QC）。在输注CAR T细胞产品之前，患者需接受非清髓性淋巴细胞减少（“预处理”），以促进CAR T细胞的植入和体内扩增。随后需要院内护理以管理潜在的副作用，如CRS或神经毒性。(b) 体外CAR T细胞制造过程通常从白细胞分离产品开始，并涉及多个后续生产步骤，包括T细胞分离和激活、基因工程、CAR T细胞扩增、制剂、CAR T细胞产品的冷冻保存，以及最终的质量控制以供释放。整个过程可以手动运行，或在监督下（半）自动化进行。 经过基因改造后，CAR T细胞在细胞因子存在的情况下在体外广泛扩增到临床相关的细胞数量；目前使用手动处理的摇动反应器或袋子以及完全自动化和监督处理设备。自动化的目标是允许以高再现性和质量进行生产，并从越来越多的患者中并行生产细胞，并缩短静脉到静脉的时间。 最适合CAR治疗的T细胞群体被认为是具有急性炎症特征的原始或年轻中央记忆细胞。在IL-2存在下扩增CAR T细胞优先触发效应T细胞，而IL-7或IL-2加IL-15扩增具有持续细胞因子释放和抗肿瘤活性能力的中央记忆T细胞。添加IL-21使CAR T细胞保持较少分化状态。刺激方式不仅决定了扩增CAR T细胞的产量，还决定了代谢依赖性；IL-15增加氧化代谢以及肉碱棕榈酰转移酶，这是脂肪酸氧化的限速步骤。IL-7通过STAT5和Akt激活增加Glut1，并诱导甘油运输和甘油三酯合成，从而改善T细胞持久性和存活。在体外扩增期间抑制Akt触发具有高水平脂肪酸氧化的中央记忆表型，最终改善CAR T细胞的抗肿瘤活性。CD45RO+ CD62L+记忆CAR T细胞比更高级分化阶段的效应T细胞提供更持久的抗肿瘤反应，使富含CD62L的CAR T细胞成为进一步探索的有吸引力的选择。 因此，中央记忆CAR T细胞在临床应用中似乎更优越，因为响应的患者没有累积具有早期记忆和耗竭特征的T细胞，而非响应的患者则累积了。最终产品中工程化细胞的活性可能影响治疗效果。然而，基于制造的细胞产品的活性对CAR T细胞治疗结果的首次回顾性分析表明，当患者接受70-80%活性的产品与至少80%活性的产品相比，CD19 CAR T细胞扩增或患者存活没有差异的证据。 制造T细胞产品是一种个性化方法，当前程序有一些显著的限制： 一些癌症患者淋巴细胞减少或具有低数量的原始T细胞，导致生产延迟或失败，如在为儿科患者生产时所经历的。 生产过程耗时，这对急性或晚期疾病的患者不利。 由于疾病，患者的T细胞可能功能失调，如CLL和一些实体瘤所报告的，导致产品反应率低。 在某些情况下，工程化异体T细胞可能是另一种策略。在接受造血干细胞移植的患者中，使用移植的异体T细胞制造CAR T细胞产品。这样的异体CD19特异性CAR T细胞诱导了部分和完全缓解；然而，一些患者遭受了GvHD。病毒抗原特异性、部分HLA匹配的供体T细胞缺乏异体反应性，并且通过CAR工程化，显示出抗淋巴瘤活性。NK细胞以其MHC独立活性也是第三方供体细胞CAR工程化的来源；然而，它们在患者中表现出较差的持久性。 10.通过CAR T细胞的过继治疗在血液学恶性肿瘤中诱导持久缓解 过继转移CAR T细胞的治疗效果取决于多个参数，包括CAR设计、CAR信号传导、结合亲和力、目标细胞上的抗原数量、目标抗原表位的空间可及性、T细胞的成熟阶段、CAR T细胞的持久性和扩增、患者免疫系统的预处理等。目前的努力旨在优化特定疾病的状况；一些治疗方案已在CAR T细胞治疗恶性疾病的方面证明成功，特别是B细胞白血病/淋巴瘤；少数试验旨在治疗实体癌。 在迄今为止难以治疗的B细胞白血病和淋巴瘤的治疗中，使用“第二代”抗CD19 CAR T细胞的早期临床试验实现了完全且持久的缓解；使用“第一代”CAR T细胞的治疗大多失败，因为CAR T细胞从循环中迅速清除。目前，近600项早期阶段的CAR T细胞试验正在进行临床探索，主要由学术中心进行（截至2020年初，中国有268项，美国有227项，欧洲有67项）。用于治疗儿童B-ALL（Kymriah™，tisagenlecleucel，诺华）和成人大B细胞淋巴瘤（Yescarta™，axicabtagene ciloleucel，Kite-Gilead）的抗CD19 CAR T细胞已获得FDA和EMA的批准；其他将很快跟进。 CAR T细胞治疗的标准程序从患者的白细胞分离开始，分离T细胞，体外基因工程改造相应的CAR，CAR T细胞扩增，以及在非清髓性淋巴细胞减少和IL-2支持后，通过静脉输注将最终的细胞产品重新给患者（图7）。由于CAR T细胞的持久性对临床效果至关重要，目前在试验中使用的CAR具有一个或两个共刺激内域，其中大多数提供CD28或4-1BB共刺激。在持久性方面，4-1BB共刺激的CAR T细胞似乎优于CD28 CAR T细胞，在循环中持续4年以上，而CD28 CAR T细胞持续30天。由于CD19 CAR T细胞不区分健康和恶性B细胞，只要CD19 CAR T细胞持续存在，患者就会经历持久的B细胞耗竭。尽管B细胞耗竭在临床上是可管理的，但这种情况要求在靶向恶性B细胞时更具选择性。最近，Fcμ（IgM）受体被确定为治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）时可能更具肿瘤选择性的目标，由于目标表达水平较低，因此大多数健康B细胞免于被淘汰。目前也在探索其他替代靶标。 在缓解期间，大多数接受4-1BB CAR T细胞治疗的白血病/淋巴瘤患者没有接受进一步的癌症特异性治疗；接受CD28 CAR治疗的患者经常接受异体干细胞移植，这似乎是有益的，因为CD28 CAR T细胞的持久性不如4-1BB CAR T细胞。需要进一步探索以确定长期内更成功的策略。 迄今为止，患有DLBCL、CLL、B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）和滤泡性淋巴瘤的患者已通过CD19 CAR T细胞成功治疗。值得注意的是，接受CD19 CAR T细胞治疗的多发性骨髓瘤患者也经历了缓解，尽管通过流式细胞术评估，骨髓瘤细胞是CD19low或CD19阴性。目前也在探索用于治疗B细胞恶性肿瘤的其他替代靶标，包括CD20、CD22、Igκ轻链、ROR-1和CD30。 由于缺乏标准化的试验设计、CAR组成、靶向抗原、预处理等方面，很难比较各种试验中CAR T细胞治疗的成功。然而，越来越明显的是，CAR T细胞剂量和淋巴细胞减少的程度或淋巴细胞减少方案对于允许广泛的T细胞扩增、持久性和最终治疗效果至关重要。应用后对CAR T细胞的重复再刺激可能改善它们在长期内的持久性和抗肿瘤效果。这是使用病毒特异性T细胞进行CAR植入的合理性，它们在接触病毒抗原时通过TCR重复再刺激；例如，Epstein-Barr病毒（EBV）特异性T细胞通过CAR工程化，并被EBV感染的细胞触发扩增。事实上，EBV特异性CAR T细胞的表现优于没有病毒特异性的CAR T细胞。 11.治疗实体癌的CAR T细胞面临的挑战 虽然血液学恶性肿瘤的治疗越来越成功，但实体癌的治疗仍然具有挑战性（表2）。作为“活药”的CAR T细胞基本上非常适合治疗实体癌，特别是由于T细胞固有的迁移和组织穿透能力，穿透血脑屏障，并在几乎所有组织中积累，包括睾丸和眼睛等特权组织，因此特别适合消除（微）转移。然而，大多数实体肿瘤具有大量策略，以非常有效的方式对抗CAR T细胞的迁移、渗透和激活。其中，改变的趋化因子环境损害了CAR T细胞向肿瘤的迁移；肿瘤内皮细胞上丢失了一些粘附因子，妨碍了T细胞的渗透。通过局部沉积TNF-α可以对抗后者，它增加了血管粘附分子，如血管细胞粘附蛋白-1和内皮细胞上的细胞间粘附分子-2。靶向血管内皮生长因子（VEGF）受体-2或阻断迁移抑制因子如内皮素B受体也改善了内皮细胞粘附和/或T细胞的跨内皮迁移。在T细胞上下调的趋化因子受体被重新表达，如CXCR2（CXCL1受体），以便于靶向黑色素瘤或CCR2b用于靶向神经母细胞瘤。 表 2 CAR T细胞疗法面临众多挑战。 为了绕过迁移障碍，CAR T细胞被瘤内植入或分别注入胸膜或腹膜以治疗间皮瘤和卵巢癌。通过内窥镜将抗CEA CAR T细胞应用于肝转移；抗c-Met CAR T细胞被注入乳腺癌转移。一旦进入肿瘤病变，CAR T细胞需要突破基质细胞和细胞外基质的障碍，才能接近癌细胞以执行它们的细胞毒性攻击。通过基因工程释放的肝素酶在基质中降解肝素硫酸蛋白多糖，改善T细胞的渗透；需要高水平的IFN-γ来消除基质细胞并根除大型已建立的肿瘤病变。通过直接针对基质细胞的CAR T细胞特异性针对成纤维细胞激活蛋白（FAP），一种参与细胞外基质重塑的丝氨酸蛋白酶，整体抗肿瘤活性得到改善。 许多过程使肿瘤病变对重定向的CAR T细胞产生敌意，使它们变成耗竭状态或进入凋亡。调节性T（Treg）细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关M2型巨噬细胞释放抑制性细胞因子，如IL-4、IL-10、白血病抑制因子（LIF）和TGF-β。MDSCs和巨噬细胞降低肿瘤内色氨酸水平；基质细胞释放吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和犬尿氨酸，抑制T细胞效应功能并剥夺组织中的葡萄糖和其他营养物质。严重的酸中毒也对抗肿瘤活性的CAR T细胞产生反作用。由于MDSCs释放的精氨酸酶，低精氨酸水平抑制CD3ζ表达和TCR信号传导。 12.CAR T细胞治疗与毒性相关 作为“活药”的CAR T细胞治疗在一些试验中取得了显著的治疗效果；然而，CAR T细胞在初始应用后的几天甚至几周内可能导致严重的副作用，需要重症监护干预，甚至可能致命。大多数毒性是由于CAR T细胞的特殊生物学特性，其他与CAR T细胞相关的毒性目前尚未完全理解。从机制上讲，主要毒性是(1)由于大量T细胞激活、细胞因子释放和肿瘤溶解引起的全身毒性，以及(2)由于CAR T细胞与健康组织相互作用引起的特异性毒性（“靶上非肿瘤”毒性）。 12.1.系统性毒性 细胞因子释放综合征（CRS）：大量CAR T细胞与目标细胞的结合导致大量细胞因子释放，血清中促炎细胞因子（包括IFN-γ和TNF-α、IL-10和IL-6）的水平异常高，这本身会导致其他免疫细胞的交叉激活，以及进一步的细胞因子释放，直至达到有毒水平。这些毒性被称为细胞因子释放综合征（CRS），临床上伴有高烧、不适、疲劳、肌肉痛、恶心、厌食、心动过速、低血压、毛细血管渗漏、心脏功能障碍、肾功能损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。CRS常与血管渗漏综合征（VLS）一起出现，与巨噬细胞激活综合征（MAS）和巨噬细胞激活密切相关，临床上类似于噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）。CRS的风险与T细胞激活和扩增有关，这可能与总体肿瘤负荷相关，但并非绝对。为了避免CRS，需要在肿瘤负荷高的患者中使用较低剂量的CAR T细胞，这是一个需要通过精确定义治疗窗口来解决的悖论，通过调整T细胞激活、细胞因子释放和抗肿瘤活性。 CRS的早期诊断和临床管理通过新建立的评分系统和治疗指南得到便利。C反应蛋白，即由肝细胞在IL-6水平增加时释放的蛋白质，目前作为CRS发作和严重程度的实验室标志物；成人的预测标志物还包括可溶性gp130（sgp130）、IFN-γ和IL-1Rα的增加，在儿科患者中，IFN-γ、IL-13和MIP1α的增加。目前CRS的治疗基于阻断IL-6/IL-6受体信号轴，通过阻断抗体如抗IL-6受体抗体tocilizumab或抗IL-6抗体siltuximab，这似乎不会干扰CAR T细胞的疗效。短期系统性皮质类固醇治疗也能迅速逆转CRS，且不影响最初的抗肿瘤反应；然而，它可能在长期内损害CAR T细胞反应。在CRS期间中和促炎细胞因子有助于减轻CRS的严重程度。在CRS期间，活化的单核细胞和/或巨噬细胞释放高水平的IL-1；通过IL-1受体拮抗剂中和可以改善临床模型中的CRS和神经毒性。通过给予lenzilumab抗体中和巨噬细胞-单核细胞激活细胞因子GM-CSF，降低了CRS的风险。通过阻断酪氨酸羟化酶减少儿茶酚胺，降低了小鼠模型中的细胞因子水平，暗示了临床干预的途径。 与CAR T细胞相关的HLH/MAS通常与CRS症状一起出现，伴有铁蛋白和肝酶血清水平升高、噬血细胞现象、细胞减少、肺水肿、脾肿大、肾功能衰竭和NK细胞丢失。治疗包括使用依托泊苷或阿糖胞苷进行系统性化疗，如果与神经毒性相关，也可以鞘内应用；在这种情况下，IL-6/IL-6R阻断大多无效。 神经毒性（ICANS）：CAR T细胞治疗相关的神经毒性现在被称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。神经系统效应包括失语症、幻觉、混乱、谵妄、表达性失语症、肌阵挛、谵妄、癫痫发作和脑水肿。这种神经毒性发生在大约40%的患者中，是可逆的，并且在CD19 CAR T细胞治疗期间频繁发生；其他CAR T细胞也可以引起神经毒性，指向由于活化CAR T细胞的浸润导致的弥漫性但暂时性脑病。神经毒性的机制尚不清楚，但与破坏血脑屏障和脑脊液中细胞因子水平增加有关。如果与CRS一起治疗，用IL-6阻断和类固醇治疗可以成功。 12.2.“靶上非肿瘤”毒性 由于大多数靶向抗原也由健康细胞表达，CAR T细胞治疗与攻击健康组织的风险相关，导致巨大的“靶上非肿瘤”毒性。治疗B细胞白血病的CD19靶向CAR T细胞也消除了健康的B细胞；持久的B细胞耗竭需要免疫球蛋白替代和抗生素及抗真菌保护，这在临床上是可管理的。当目标抗原由重要组织表达时，毒性更严重。在一项针对肾癌患者的碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞治疗试验中，患者由于胆管上皮细胞上碳酸酐酶IX水平较低而出现肝毒性；通过预先给予阻断抗体，可以减少“非肿瘤”毒性的严重程度。避免“靶上非肿瘤”毒性的策略目前旨在增加肿瘤选择性，并以空间和时间的方式限制CAR活性。T细胞给药的替代途径可能是避免通过血液系统分布大量CAR T细胞的选项。通过内窥镜或胸膜内或腹膜内应用局部CAR T细胞给药，在肿瘤部位提供高剂量的CAR T细胞，并在一定程度上避免了非肿瘤毒性。然而，这种应用是有限的，因为在大多数情况下，肿瘤病变无法接触或肿瘤广泛扩散。 12.3.“靶外非肿瘤”毒性 大多数过去工程化的CAR在细胞外部分包含IgG1 CH2CH3结构域作为间隔区，这可能会与Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，从而激活NK细胞和巨噬细胞等先天细胞。尽管到目前为止在临床上并不突出，但理论上可以通过删除IgG1 CH2结构域或突变FcγR结合位点内的Asn297来减少风险。替代间隔区包括IgG4 Fc结构域或细胞外CD8结构域。 第三代曲妥珠单抗衍生的CAR T细胞靶向ErB2导致可能由于急性呼吸窘迫综合征和CRS导致的致命的心肺衰竭。同样，在用EGFR变体3特异性CAR T细胞和CEA特异性CAR T细胞治疗时记录了肺水肿，而没有直接证据表明CAR T细胞攻击肺上皮。由于使用针对同一目标的不同表位或传递不同信号的CAR可能产生显著不同的毒性，因此毒性概况更加复杂，例如，使用来自FRP5抗体的第二代ErB2 CAR的T细胞在肉瘤患者中并未诱导靶外非肿瘤毒性。 12.4.改善CRS的策略 基本上，当CRS在临床上显著时，需要对CAR T细胞进行下调或去激活；瞬时CAR表达、“关闭开关”和“自杀开关”是常用工具。 当存在严重CAR T细胞相关毒性的重大风险时，瞬时CAR表达可能有益。RNA转移产生瞬时表达的CAR。CAR在T细胞表面存在数天，并在目标细胞结合时介导有效的T细胞激活，然而，随着RNA降解和T细胞扩增时RNA稀释，CAR表达会下降。这种RNA修饰的T细胞在试验中显示出一些虽短暂但有效的效果。然而，由于CAR T细胞迅速清除，其缺点是短期效果。 然而，永久性修改的CAR T细胞需要在毒性不受控制的情况下主动消除这些细胞的策略。大剂量脉冲治疗类固醇在应用碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞后停止了自身免疫。虽然这是非选择性地清除激活的T细胞，但可以通过特定靶向更有选择性地消除CAR T细胞。CAR结合域基本上也可以通过抗独特型抗体进行靶向，以诱导CAR T细胞的溶解性消除。通过给予识别细胞外CAR结构域中整合的表位的消耗性、FDA批准的抗体，也可以实现CAR T细胞的消耗。例子包括使用利妥昔单抗来消耗具有CD20表位或模拟表位的CAR T细胞，或使用西妥昔单抗来消耗具有EGFR表位的CAR T细胞。是否能够迅速实现足够的CAR T细胞清除以逆转正在进行的CRS，还有待在临床情况下证明。 诱导凋亡的CAR T细胞消除似乎是这种情况下更快速的解决方案。转基因脲酶-9（Cas9）与FKBP1A相连，在系统应用原本惰性的小分子AP1903后，会在工程化CAR T细胞中诱导凋亡，该分子促进二聚体化和激活诱导性Cas9（iCas9）。这种策略是有效的，因为供体T细胞介导的GvHD可以在实验系统中通过iCas9介导的T细胞凋亡在一小时内停止。 与其消除CAR T细胞，不如通过整合模块控制细胞表面的CAR。CAR被设计为融合蛋白，整合了一个自切割降解结构域，该结构域被可以被特定蛋白酶抑制剂特异性阻断的蛋白酶反向调节。在蛋白酶存在的情况下，产生的CAR融合蛋白从连接的降解结构域分离并表达在细胞表面；抑制蛋白酶导致CAR降解和缺乏表面表达。 CAR也可以通过添加酪氨酸激酶抑制剂dasatinib来降低其表达或调节其信号强度，该抑制剂可以迅速且可逆地阻断Lck激活；从而在小鼠模型中减少CRS的严重程度。该策略的好处是，只要存在dasatinib，CAR T细胞的信号强度就会减弱，但不会被清除；然而，该策略仍需临床验证。 需要进一步开发以降低细胞因子介导毒性风险的CAR。调节信号强度的一个关键是CAR共刺激。CD28-ζ CAR更快地诱导T细胞激活，并诱导更高的细胞因子释放、扩增和随后的耗竭，而4-1BB-ζ CAR则驱动较少的急性扩增，但具有较低的细胞因子水平，因此与严重CRS的风险较低。因此，4-1BB-ζ CAR可能更适用于肿瘤负荷和抗原密度高的患者，而CD28-ζ CAR可能需要用于肿瘤负荷低的情况。 降低CAR介导的T细胞激活的其他策略，例如，修改CD8跨膜和铰链区域，从而降低ICANS或高于1级CRS的风险。作为一种替代策略，“通用”CAR允许通过调整将CAR T细胞与目标细胞链接的适配器分子来动态控制T细胞激活。 13.CAR T细胞治疗的挑战 在过去的几年里，临床试验正致力于将CAR T细胞治疗确立为治疗几种类型的B细胞白血病和淋巴瘤；然而，在治疗其他恶性疾病的方面，仍然存在重大障碍。 13.1.如何选择最佳的肿瘤选择性抗原作为靶标？ 在CAR T细胞治疗中，肿瘤靶向的选择性对于长期兼容性至关重要。大多数可靶向的肿瘤相关抗原并不具有肿瘤选择性，这增加了CAR T细胞疗法中诱导靶上非肿瘤毒性的风险。肿瘤特异性的表面蛋白突变或肿瘤相关糖基化变体如Muc1或Muc16是罕见的。然而，有些抗原虽然由健康组织表达，但似乎是安全的靶标。例如，癌胚抗原（CEA，CD66e）严格表达在胃肠道和肺部健康上皮的腔面，而在癌细胞上以去极化方式表达。系统性应用CEA特异性CAR T细胞（NCT01212887, NCT02349724）和通过肝动脉输注局部给药的抗CEA CAR T细胞（NCT01373047）在减缓肿瘤进展的同时，并未诱发治疗相关结肠炎。其他如ErB2等抗原可能在高表达ErB2的肿瘤细胞被选择性靶向时是合适的靶标，同时保留中低表达的健康细胞。 为了增加肿瘤选择性，优先考虑靶向一组抗原模式而不是单一特定抗原。技术上，在同一T细胞中共表达两种具有不同特异性的CAR，以在两种CAR同时结合它们相应的抗原时仅诱导完全的T细胞激活；一种CAR提供主要信号，另一种CAR提供共刺激信号，从而仅在存在两种抗原的情况下补充完全T细胞激活所需的信号。该策略需要一个弱的主要信号，以避免在存在一种抗原的情况下进行一些基本的CAR T细胞激活，以及一个强的共刺激信号以驱动完全的T细胞激活。 为了在结合健康细胞时阻断CAR T细胞激活，与激活性CAR共表达具有细胞内PD-1或CTLA-4信号传导的抑制性CAR（iCAR）。iCAR识别健康细胞上存在但在癌细胞上不存在的抗原。因此，仅在结合缺乏iCAR识别的抗原的目标细胞时才发生CAR T细胞激活。 有些抗原在癌细胞上的表达水平高于健康细胞；“亲和力调节”CAR结合域可能有助于区分这两种组织。虽然在临床前模型中证明了可行性，但癌细胞可能通过下调相应抗原来逃避监视。亲和力调节的治疗窗口狭窄，因为增加亲和力可能导致识别健康细胞，如GD2特异性CAR在实验模型中诱发致命性脑炎。 13.2.如何优化CAR结构？ 目前临床评估中的大多数CAR基于近二十年前设计的原型CAR结构。临床前研究表明，对于每种抗原，特定CAR需要针对目标抗原表位、结合亲和力、间隔区长度以及信号传导和跨膜结构域等进行优化。由于各组分之间复杂的依赖性，目前无法预测特定抗原的最佳CAR组成。例如，结合亲和力和目标表位的位置为靶向高抗原负载的癌细胞同时保留低抗原负载的健康细胞提供了狭窄的亲和力窗口。 13.3.如何在CAR T细胞治疗后建立长期癌症控制？ 尽管在儿童B-ALL中可以高频率诱导完全缓解，但约40%的白血病患者在持续存在CAR T细胞的情况下仍然复发。多种原因导致复发频率高，包括整个CD19分子的丢失或表达缺乏目标外显子2的CD19异构体，从而使其对CAR T细胞不可见。在CD19 CAR治疗后，B-ALL的两个案例中通过转换为CD19阴性的髓系谱系丢失CD19。在这种情况下，靶向对癌细胞存活至关重要的抗原将是一个理想的策略。由于这样的抗原通常不可用，通过双特异性CAR共靶向第二种抗原（例如CD20或CD22）可能会增加对白血病细胞的治疗压力。在实体瘤中这种情况更为重要，因为它们在抗原表达上通常表现出深刻的异质性；在初始肿瘤消退后的早期肿瘤复发可能是由于选择抗原丢失的癌细胞。这些癌细胞可能以抗原非依赖性方式被先天免疫细胞反应识别和消除。为了吸引和激活先天细胞并启动更广泛的免疫反应，CAR T细胞在实验模型中被赋予了诱导释放转基因IL-12的能力，使抗肿瘤攻击更有效。有一些迹象表明，结合抗原依赖性和非依赖性免疫反应可能在长期内控制肿瘤。 13.4.哪种T细胞亚群提供长期肿瘤控制？ 临床前模型表明，具有增强扩增能力和长期持久性的原始或早期中央记忆T细胞是过继治疗最合适的细胞。沿着这条线，CD62L+记忆T细胞似乎表现出优越的性能。发现中央记忆干细胞（TSCMs），这是CD62L+中央记忆T细胞库的一部分，具有非凡的扩增潜力，激发了对这些细胞进行过继细胞治疗的探索。人们对识别和调节干细胞样T细胞形成和维持的因素和调控网络越来越感兴趣，因为这些细胞在过继转移到患者后似乎对长期治疗效果至关重要。另一种策略是基于预测性地诱导T细胞成熟。例如，4-1BB共刺激在年轻T细胞中启动中央记忆T细胞反应，这与CD28 CAR T细胞表现出更短暂的效应细胞反应形成对比。另一方面，更成熟的阶段的细胞在大多数肿瘤所在的外围显示出优先积累。然而，这些细胞需要不同的共刺激信号，即优先迁移到外围的CCR7− T细胞从联合CD28-OX40共刺激中受益。特定T细胞亚群的功能能力也可以通过与激酶抑制剂的联合治疗来调节；ibrutinib，一种布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，降低了PD-1和CAR T细胞的耗竭，从而增加了持久性和抗肿瘤活性。 13.5.如何使CAR T细胞制造适应日益增长的患者数量？ 目前，大多数CAR T细胞由专门的GMP设施生产，冷冻并运送到患者的医院。生产越来越多的细胞产品将使当前程序达到极限，特别是当及时需要数千个自体细胞产品时。在医院内（半）自动化、完全控制和完全封闭系统的分散制造是解决这种情况的首选概念之一。这也将需要在制造过程中高度标准化，并避免血液和细胞产品运输中的复杂物流。作为另一种概念，一个高度专业化的、集中的生产设施，具有多个并行的自动化制造过程，可能作为患者细胞产品的区域供应商。 另一个限制是由患者自体T细胞治疗的需要设定的；对于每位患者来说，“通用”供体将使治疗在多个方面更容易。一个包含不同工程化CAR的“通用”供体T细胞产品库将在临床应用中提供更大的灵活性，根据患者的具体情况。此外，扩大生产规模将使更多的患者能够使用CAR T细胞产品。正在努力生成可以应用于众多患者的这种“通用”T细胞。这需要使CAR T细胞对宿主免疫细胞“隐形”，缺乏对患者健康组织的异体反应性，同时保留CAR介导的抗肿瘤活性。在这种情况下，通过基因组编辑技术获得的MHC缺陷、CAR修饰的病毒特异性T细胞和TCRα敲除T细胞，目前正在开发作为“现成的”或“第三方”细胞产品，GvHD风险低。CAR基因插入TCRα位点一步实现CAR的遗传工程和TCR表达的废除。编辑MHC I类以防止宿主识别和排斥供体T细胞可能通过NK细胞诱导消除，并不防止MHC II类介导的排斥。然而，目前探索的所有基因编辑程序在某种程度上都容易受到非目标修饰的影响，因此与意外的突变风险相关。该领域发展迅速，首次使用异体CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤和实体瘤的试验已经启动。 13.6.如何平衡CAR T细胞的疗效和副作用？ 目前，一些CAR T细胞治疗与高风险的严重副作用相关，可能需要重症监护住院治疗。尽管各种CAR T细胞协议和治疗程序不同，并且没有在比较性的临床环境中进行评估，但一些临床管理规则变得明显。例如，CRS的早期诊断、分级和临床管理将标准化，建立共识的治疗方案。在毒性不受控制的情况下，可以通过各种手段选择性地和迅速地消除CAR T细胞。通过添加二聚体化剂AP1903二聚体化转基因诱导的脲酶-9（iCasp9），在30分钟内消除超过90%的T细胞。或者，通过给予针对CAR结构域或共表达表位的抗体，诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）清除循环中的CAR T细胞。免疫介导的CAR T细胞消除的缺陷仍然是，癌症患者的潜在功能障碍免疫系统可能通过ADCC消除CAR T细胞的能力有限。 13.7.我们是否需要针对每种癌症类型的特定预处理？ 在大多数试验中，患者在过继T细胞治疗前接受非清髓性淋巴细胞减少，使用氟达拉滨和环磷酰胺；这种预处理的理由是暂时提供“空间”和细胞因子，以实现转移的CAR T细胞在体内的充分扩增。淋巴细胞减少还通过免疫调节提供抗肿瘤效果，因为它耗尽抑制细胞，并在肿瘤破坏时释放肿瘤相关抗原到免疫系统。尽管目前的预处理方案基本上是有效的，但基本方案可能需要针对每种癌症实体进行调整。例如，用于治疗Her2+肿瘤的调节方案通过应用nab-紫杉醇来耗尽间质性基质，并促进Her2呈递，并通过应用环磷酰胺耗尽Treg和MDSC，用于胆道和胰腺癌的修改。另一方面，预处理在CAR T细胞治疗的背景下可能具有高度毒性，通过诱导脑水肿和神经系统毒性，特别是在最近的一项试验（NCT02535364）中观察到的氟达拉滨治疗后。 13.8.如何激活免疫网络以诱导广泛的炎症性抗肿瘤反应？ CAR T细胞作为“活药”，越来越成为在目标器官产生和释放生物活性化合物的“活工厂”。使用CAR T细胞作为工厂的合理性基于实验肿瘤模型的证据，即宿主免疫系统在肿瘤排斥中起着重要且必要的作用，这使得在目标肿瘤组织内产生免疫刺激性条件成为必要。释放IL-12的CAR T细胞（IL-12 TRUCKs）可以通过吸引和激活M1型巨噬细胞来在肿瘤组织中诱发免疫反应，这些巨噬细胞可以消除CAR T细胞未能识别的癌细胞。其他具有特定影响局部免疫环境的细胞因子也可以使用；释放IL-18的CAR T细胞增加了肿瘤相关CD206+ M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，并减少了如Treg细胞、CD103+树突细胞和M2型巨噬细胞等抑制细胞。目前正在试验中探索使用靶向PD-1的检查点阻断，以激活CAR T细胞和浸润性淋巴细胞（NCT02650999）；其他检查点的阻断或组合，以重新激活肿瘤内源性免疫细胞，同样值得进行临床探索。 14.CAR T细胞用于其他疾病的治疗 将T细胞激活重定向的CAR不仅限于靶向癌细胞，还可以用于靶向任何由目标抗原定义的细胞。通过抗Dsg3 CAR靶向记忆B细胞的CAR T细胞被设计用来消除导致天疱疮病理的细胞。通过识别MHC呈递的自身抗原的CAR T细胞靶向自反应性T细胞。CAR被工程化以靶向病毒感染的细胞，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒和HIV感染的细胞。源自Dectin-1的CAR T细胞被用于破坏真菌Aspergillus的发芽。实验模型暗示，CAR重定向的Treg细胞可用于促进自身免疫疾病如结肠炎、过敏性哮喘和移植物抗宿主病的免疫耐受治疗，通过靶向HLA。最近，通过识别心脏成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CAR T细胞靶向心脏纤维化，该蛋白在心肌损伤重塑时由心脏成纤维细胞高度表达。采用FAP特异性CAR的T细胞过继转移减少了心脏纤维化并恢复了小鼠的损伤后功能。该报告暗示CAR T细胞作为“活药”，在治疗目前疗法非常有限的心脏病中消除激活的心脏成纤维细胞。CAR T细胞用于治疗非恶性疾病其他应用的临床前开发正在进行中。 要点 采用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞的过继细胞治疗在某些血液学恶性肿瘤中取得了显著的治疗效果；然而，在其他疾病中的治疗效力仍然有限。 CAR是由结合域、跨膜域和细胞内信号传导域组成的模块化、重组的跨膜分子，用以激活工程化细胞。最佳分子设计需要通过变化组成域在每种情况下探索。 原型CAR设计可以通过使用各种靶向和信号传导元件进行修改，使CAR更加通用。此外，各种免疫细胞可以通过CAR重定向，提供方便的治疗细胞。 CAR T细胞治疗经常与毒性相关，这些毒性可以通过同时进行的治疗、改变CAR设计和靶向替代抗原来减少靶上非肿瘤毒性来减轻。 通过共同激活广泛的免疫反应、共同靶向肿瘤基质、癌症干细胞和其他与肿瘤相关的结构，可以提高CAR工程化免疫细胞的抗肿瘤效力。 生产CAR T细胞产品仍然具有挑战性，为所有患者提供个性化治疗；正在努力为广泛的患者群体制造异体细胞产品“现成”。 下章预告：抗体关键特性的改进 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 第八章：抗体偶联药物 第九章：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 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摘要：Antibody-Drug Conjugates (ADCs) 代表了一类创新的强效抗癌化合物，它们在血液学恶性肿瘤和实体瘤的治疗中被广泛使用。与传统的基于化疗药物的治疗方法不同，后者主要与适度的特异性和治疗效果相关，构成 ADC 的三个关键组成部分（通过化学连接子与细胞毒性药物结合的单克隆抗体）在靶向杀死癌细胞方面取得了显著的改进，同时在减少系统性副作用方面也有所改善，这些副作用是由非肿瘤毒性引起的，从而保护了健康组织。基于它们的有益作用机制，迄今为止已有 15 种 ADC 获得了市场批准，包括美国食品药品监督管理局（FDA）、欧洲药品管理局（EMA）和/或其他国际政府机构的批准，用于临床肿瘤学，并且有数百种正在进行临床前和临床阶段的评估。在这里，我们的目标是提供一个全面的概述，围绕 ADC 治疗策略的关键特征，包括它们的结构和靶向属性、作用机制、肿瘤微环境的作用，并回顾临床肿瘤学中批准的 ADC，提供关于它们的毒性概况、临床表现和在新型组合疗法中的使用的讨论。最后，我们简要回顾了 ADC 在其他病理背景下的应用，并提供了有关 ADC 制造和分析表征的关键信息。 1.引言 癌症是一种多阶段的进展过程，它将正常健康细胞转变为恶性病变（Cooper, 2000）。它是全球死亡的主要原因，2020年造成近1000万人死亡，是治疗最具挑战性的疾病之一。传统治疗策略包括化疗、放疗、免疫疗法和手术，其中化疗是治疗各种癌症的主要方法。尽管通过小分子细胞毒性药物取得了显著的成就，但它们存在一些限制其疗效的缺点，包括治疗指数低和高非肿瘤效应。通常，化疗的低效性在患者中引起了高发生率的严重副作用，主要是由于化疗药物对快速分裂的正常细胞的非特异性作用。因此，该领域的热门话题之一是发现具有增强治疗效果的新化学剂，并优先消除肿瘤衍生细胞，而不损害身体本身。在免疫疗法领域，已有几种单克隆抗体（mAbs）获得临床批准，因为它们通过选择性靶向癌细胞并通过激活直接和/或间接杀伤机制，在血液学恶性肿瘤和实体瘤中显示出治疗益处。然而，包括组织可及性、药代动力学差和与免疫系统的弱相互作用在内的问题，导致了开发更新、更安全、更有效的靶向疗法的需求。1907年，德国诺贝尔奖得主保罗·埃尔利希提出了可能存在能够选择性靶向病原体微生物（如细菌）而不损害正常细胞的化合物的概念，这一概念在历史上被称为“魔法子弹”。从他的假设出发，一种创新的治疗方式，即抗体药物偶联物（ADC），在肿瘤学领域应运而生，并在40年前首次用于治疗晚期癌症患者。ADCs 是一类新兴的药物化合物，它们结合了抗癌药物（通常称为有效载荷）的效力和单克隆抗体对肿瘤部位的特异性，从而结合了化疗和免疫疗法。它们由三个部分组成，一个单克隆抗体，一个有机间隔物和一个细胞毒性药物。理想情况下，它们利用单克隆抗体的靶向能力，将通过稳定连接子与单克隆抗体结合的细胞毒性剂带到癌细胞或肿瘤微环境（TME）的细胞组分，在那里它可以发挥其抗肿瘤活性并导致细胞死亡。与传统化疗相比，这种策略提供了包括更好的药物耐受性、即使在低浓度下也具有细胞毒性、血液中和溶酶体中的稳定性、减少的非靶向效应和系统毒性在内的多项优势，所有这些特点都有助于扩大其治疗潜力。从2000年美国食品药品监督管理局（FDA）批准的第一个ADC开始，并考虑到单克隆抗体、连接子和有效载荷技术的不断发展，到2023年4月，已有13种不同的ADC获得FDA批准用于实体和血液学恶性肿瘤的临床使用，为靶向癌症治疗的新时代奠定了基础。此外，一些研究已经探讨了ADC在非肿瘤学背景下的潜在用途，包括感染和自身免疫性疾病，显示出有希望的结果，表明ADC的使用可能扩展到各种疾病。在这篇综述中，我们的目标是总结ADCs的当前知识，并解决一些关于它们的分子属性、它们与肿瘤团块和TME的相互作用、它们的临床使用、毒性和癌症治疗中的联合方案的关键点。最后，我们将提供ADC在其他疾病中的当前研究的概述，并解决它们在生产和表征中的主要挑战和限制。 2.ADCs由通过连接子连接到细胞毒性有效载荷的抗体组成 2.1.抗体构成指导ADCs到目标细胞的框架 ADC是一个具有药理活性的合成分子，包括三个部分：一个选择性的单克隆抗体，一个稳定的连接子，和一个强大的细胞毒性药物（图1）。它们共同确保了肿瘤特异性靶向和通过创造一个具有增强治疗效果的“新”化合物来有效地消除恶性细胞。 图1 抗体药物偶联物（ADC）的模块化组件示意图。ADC由单克隆抗体（蓝色）、连接子（蓝线）和细胞毒性药物（灰/红色）组成。在这张图中，左侧的代表性ADC具有4的药物-抗体比率。右侧简要描述了每个模块的基本功能。 2.1.1.全尺寸抗体最常用作ADCs框架 抗体（Ab）或免疫球蛋白（Ig）是由浆细胞产生的Y形糖蛋白，具有固有的选择性结合其靶标的能力。在肿瘤学中使用的几种抗体，在与它们的靶标抗原相互作用时，具有通过调节与生存相关的途径和/或激活强大的免疫效应功能来影响肿瘤团块的生物学活性的能力，通过三种主要机制：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC），其中结合的Ab的Fc部分被自然杀伤（NK）细胞Fc受体识别并激活溶细胞因子的释放，补体依赖性细胞毒性（CDC），其中Fc区域与C1q的相互作用触发补体系统的经典途径导致细胞溶解和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），这是一种依赖于活跃的巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的机制。同样，ADC中的肿瘤靶向抗体应该是单克隆的，并确保高目标特异性和结合亲和力，血浆中长半衰期，最小的免疫原性结合低交叉反应，并允许有效的内化以及诱导直接/间接杀伤效应。根据它们的重链恒定区域的氨基酸序列，人类Igs被分类为5种同型或类别（IgM, IgG, IgA, IgE, 和 IgD），其中IgG是在血清中最丰富的。基于进一步的氨基酸变化，这种同型可以细分为4个亚型（IgG1, IgG2, IgG3, 和 IgG4）。IgG1由抗体的N-末端部分的可变重（VH）和轻（VL）域，轻链恒定区域（CL）的C-域，重链恒定区域（CH1, CH2, CH3）和CH1和CH2域之间的铰链区组成。迄今为止，其骨架是最常用于ADC制剂的，因为它的血清半衰期（约21天），高Fcγ受体亲和力，从而具有强大的Fc依赖途径的免疫激活，以及更强的补体激活。除了这些间接细胞毒性机制外，IgG1基础的mAb在与恶性细胞上特定抗原的相互作用中，也可以通过阻断与癌细胞增殖、转移和侵袭性相关的途径来发挥直接杀伤效应。至于其他亚型，IgG2在对抗细菌荚膜多糖的反应中起作用，但表现出低Fcγ受体亲和力，低血浆浓度，并倾向于形成可能导致聚集和ADC无效性的共价二聚体。IgG3保护身体免受一系列细胞内细菌、寄生虫和病毒的侵害。它们是效应功能的强效介质，包括增强的ADCC和CDC反应，但它们也是循环半衰期最短的亚型，限制了它们作为ADCs的适用性。IgG4亚型具有与IgG1和IgG2相似的半衰期，但在触发C1q相关途径方面的效率较低，因为它对吞噬细胞上的Fc受体只有中间亲和力。然而，诱导较弱的免疫反应的能力导致与IgG1骨架相比更有利的安全性概况，使IgG4 ADCs适用于不希望抗体介导的细胞毒性的情况下。 2.1.2.抗体片段代表了ADC策略中的一个新颖和创新的方法 越来越多的研究对全尺寸IgG结构在实体癌治疗中的使用提出了质疑，并指出了一些关键限制，特别是在其大小方面。作为ADC合成中最常用的IgG1相当大（150 kDa），它可能阻碍药物在肿瘤团块中的分布，从而对ADC药代动力学和治疗效果产生负面影响。尽管这个问题可能在肿瘤相关的渗漏性血管中找到部分解决方案，这些血管仍然允许由于保留和渗透效应（EPR）而获得足够的药理效益，但其效率和化合物在肿瘤中的微观分布取决于许多因素，如ADC制剂以及团块的分子和细胞特征。与框架大小相关的其他问题包括系统性积累和减慢的非靶向清除率。由于这些限制，研究人员正在寻找自然抗体的“小型化”版本（也称为抗体片段），作为新的更小的药物偶联替代品，以扩大ADC治疗效益。这些片段是通过完整尺寸抗体的蛋白水解裂解或重组蛋白工程产生的，主要通过VH和VL区域保留完整尺寸IgG的结合能力。它们呈现了缺乏CH2域和Fc区域的工程框架，包括三种不同的配方：Fab格式，一个约50 kDa的结构，其中VL和VH分别与CL和CH1结合，并通过链间的二硫键连接，单链可变片段（scFv），一个约27 kDa的结构，其中VH通过短肽链连接到VL，以及二聚体，一个非共价约55 kDa的二聚体scFv，由VH和VL区域通过小肽链连接。此外，通过CHε4域二聚化的scFv组成的小型免疫蛋白（SIPs）是一种针对纤维连接蛋白和其他血管抗原开发的片段化格式。通过保留完整尺寸抗体的靶向能力并结合更小和动态的格式，抗体片段有潜力克服完整尺寸Ig结构的一些主要缺点，并可能代表实体瘤治疗中的一个创新。迄今为止，有希望的数据显示了稳定性、肿瘤靶向和渗透性以及表位可及性的显著改善，特别是在通过传统的基于IgG的ADC难以到达的癌症中。此外，较小的格式应该更能被身体耐受，并产生较少的副作用，主要是因为它们不显示由与Fc受体和靶向免疫细胞的相互作用引起的交叉反应。如果这些好处应该在更大程度上进行评估，可以发现显著的弱点。例如，由于它们的较小尺寸和缺乏Fc域，没有它它们无法触发新生儿Fc受体救援途径，抗体片段被更快地降解，可能不会在体内停留足够长的时间以发挥足够的抗肿瘤活性。从这个角度来看，一个解决方案可能是通过施用更高和/或更频繁的剂量来控制剂量方案以实现治疗效果，但对这些格式在临床上的行为知之甚少，正在进行广泛的努力以提高它们的可行性。此外，缺乏Fc域严重限制了激活免疫系统的可能性，从而失去了抗击肿瘤进展的重要伙伴。除了这些配方，目前正在探索基于非抗体的框架。尽管必须仔细考虑Ab部分的性质，选择连接子和有效载荷同样重要，以创建最合适的治疗性ADC。 2.2.连接子是通过化学键将抗体与有效载荷连接起来的序列 在ADC策略的发展中，连接子代表了确保单克隆抗体与细胞毒性有效载荷之间桥梁的技术。它们是ADC中最可修改的部分，并影响其生物物理和功能属性，如稳定性、效力、效力和毒性。连接子的两个主要目的是防止细胞毒性药物在血液循环中过早释放，并确保其在目标部位有效释放。根据有效载荷的释放机制，连接子可以广泛地分为两类：可切割和不可切割。最近在连接子化学方面的进展，包括目前未在临床ADC中使用的配方，如双正交、光响应和Fe(II)-可切割连接子。 2.2.1.可切割连接子在ADC中用途广泛 可切割连接子在ADC合成中最常用，并设计为响应血液、肿瘤细胞和TME生态位之间发生的环境条件变化（pH、氧化还原电位、GSH浓度或酶活性）而与细胞毒性药物分离。它们在生理条件下是稳定的，并且在ADC被肿瘤细胞内化后迅速切割，以确保选择性释放细胞毒性制剂。此外，这些连接子通常在TME中被切割，因为它的酸性更高和氧化应激更大，使它们成为影响大实体团块的最常用制剂，这些团块几乎无法通过完整尺寸抗体渗透。可切割连接子通常分为化学（腙键和二硫键）和酶（肽键和葡萄糖醛酸）切割连接子。腙键连接子是主要用于血液学恶性肿瘤的酸敏感连接子的例子。它们通常在血液循环的生理pH范围内是稳定的，并在肿瘤细胞的内质网和溶酶体（pH 4.8–6.2）的酸性微环境中发生水解。类似地，基于二硫键的连接子在血液碱性环境中是稳定的，但有效载荷的释放对谷胱甘肽（GSH）敏感，这是一种代谢物，其浓度在癌细胞的细胞质中要高得多。然而，这两种连接子都引起了人们对它们非靶向细胞毒性的关注。肽键确保ADC在循环中保持完整，并在与溶酶体蛋白酶（如通常在几种肿瘤细胞类型中过表达的组织蛋白酶B）相互作用时释放细胞毒性药物，与化学连接子相比，肽连接子与改善的血清稳定性和抗癌活性相关。此外，基于葡萄糖醛酸键的连接子，另一种类型的酶敏感化学桥，通常用于ADC设计，并依赖于β-葡萄糖醛酸酶的切割，其水平通常在肿瘤细胞微环境中很高。 2.2.2.非可切割连接子避免了非特异性有效载荷的释放 非可切割连接子包括马来酰亚胺己酰（MC）和4-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸盐（MCC）结构，由不经过酶降解而分裂的化学结构组成。它们对常规化学物质不活跃，但允许在单克隆抗体被溶酶体完全代谢后释放细胞毒性药物。通过这种方式，它们将有毒有效载荷释放到肿瘤靶细胞中，而不损害正常健康细胞。由于它们的化学合成，这些连接子提供了比可切割替代品更低的毒性和更长的血浆半衰期等一些优势。另一方面，它们的局限性主要与它们的作用机制有关，因为它们强烈依赖于有效的细胞内运输和具有高表达和内化抗原的细胞成分。 2.3.有效载荷由针对肿瘤细胞的强效细胞毒性药物组成 如上所述，连接子作为将单克隆抗体与有效载荷（细胞毒性药物）连接起来的间隔物，必须在肿瘤部位释放以适当发挥其药理效应。为了适合作为ADC中的有效载荷，化学物质理想地应具有低分子量和免疫原性，血液中和内质网/溶酶体途径中的高稳定性，以及高细胞毒性。由于静脉给药表明只有非常小部分的ADC到达肿瘤（0.1%–2%），它们的有效载荷必须比化疗中使用的药物（作为游离小分子）有效100至1000倍。鉴于ADC策略的目标是实现强效的细胞毒性活性，设计这些化合物的过程中要考虑的一个重要属性是药物-抗体比率（DAR），这是一个指示平均数量的化学分子与单克隆抗体结合的值。对于基于赖氨酸侧链酰胺化或主要基于半胱氨酸中间链二硫键还原的当前偶联方法，常见的DAR值范围从0（最低值）到8（最高值）。然而，体内实验表明，高DAR值与抗体药代动力学呈负相关。尽管低DAR意味着装载的药物分子数量较少，因此治疗效果较低，但值得注意的是，平均DAR为2至4的ADC与具有更高DAR的ADC相比，具有更大的抗癌活性/效力，可能是因为后者与相应平均偶联的对应物相比，在体内更快地被清除。如今，细胞毒性有效载荷通常作为DNA损伤剂或微管抑制剂起作用，但正在研究的新型潜在药物包括B细胞淋巴瘤-超大（Bcl-xL）抗凋亡蛋白抑制剂、RNA和烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）抑制剂，以及carmaphycins，即蛋白酶体活性抑制剂。 2.3.1.DNA损伤药物作为交联剂、烷化剂和拓扑异构酶抑制剂 通过损伤DNA诱导细胞死亡的现有药物可以在皮摩尔浓度下起作用，并影响增殖和非增殖细胞，因此它们可能通过影响肿瘤起始细胞来有助于消融肿瘤团块。从机制上看，这些化学物质以不同的方式改变双螺旋，例如，通过诱导单/双链断裂、DNA小沟的烷基化和交叉链接，或通过抑制拓扑异构酶I/II从而复制。其中一些包括鹅膏素（天然由ciclic八肽组成，通过抑制RNA聚合酶II的作用并破坏RNA和蛋白质合成）、卡利奇霉素（DNA相互作用的抗肿瘤抗生素，通过引起DNA双链断裂并抑制复制）、二卡霉素（天然DNA小沟烷化分子）和吡咯并苯并二氮卓（高效率的DNA小沟交叉链接剂）。另外两种在第一代ADC中使用的药物值得一提，即喜树碱（DNA拓扑异构酶I抑制剂在复制泡沫）和阿霉素（通过插入DNA并产生自由基来损伤DNA的抗生素分子）。 2.3.2.微管靶向剂阻止有丝分裂引线形成和细胞周期 微管抑制剂通过结合微管亚基在G2/M细胞周期阶段阻止肿瘤细胞的快速增殖，导致细胞通过凋亡死亡。这类包括美登木素和奥瑞他汀，一类微管抑制细胞毒素，使细胞在中期停止。奥瑞他汀衍生物单甲基奥瑞他汀E（MMAE）和毒性较低的F（MMAF）常用作ADC设计中的有效载荷，并通过阻断微管蛋白聚合发挥作用，从而扰乱微管生长并导致细胞周期停止。详细查看机制，微管形成涉及在细胞质中将αβ-微管蛋白异二聚体成核或组装成微管种子。由于奥瑞他汀通过干扰β亚基上的GTP水解，导致微管过度和持续生长，它们失去了在有丝分裂后期缩短和分离姐妹染色单体的能力，导致细胞在有丝分裂中期冻结。 2.4.ADC治疗策略的发展经历了三代化合物 在过去的几年里，ADC发展路径将十几种针对各种血液学和实体恶性肿瘤的ADC带入市场。一般来说，这些ADC根据单克隆抗体的类型、连接子的化学性质、作用机制以及DAR和偶联方法的关系被分为三代（第一代、第二代和第三代）。作为对新型治疗策略的首次尝试，第一代ADC引起了患者的急性不良反应，如血液毒性和发病率，主要是由于单克隆抗体骨架、连接子化学和目标非特异性而非药物本身。最初，这些生物制剂使用小鼠来源的和后来的嵌合单克隆抗体，通过不稳定的连接子与化疗中可用的一些效力较弱的药物偶联。不幸的是，给药后，这些单克隆抗体被身体识别为非自身，并不可避免地通过形成抗小鼠抗体（HAMA）引发免疫反应，经常导致严重的免疫原性问题。此外，酸敏感连接子的化学性质在血液pH下相当不稳定，导致了有效载荷的不受控制的释放，如卡利奇霉素、二卡霉素和阿霉素，其效力无论如何都太低，无法导致癌细胞死亡。在这种情况下，随机赖氨酸的随机偶联不允许控制DAR，并导致含有未偶联、部分偶联和过度偶联单克隆抗体的异质混合物，这些混合物的比例未知，这负面影响了ADC的效力，限制了肿瘤渗透，并导致治疗窗口狭窄。此外，即使抗原缺乏肿瘤特异性表达，也被选择，导致严重的系统性非靶向效应。正如预期的那样，基于第一代ADC的限制，第二代ADC提供了一些旨在提高化合物效力并大幅减少非靶向毒性的实施。为了尽可能限制与单克隆抗体骨架相关的潜在副作用，优先选择人源化单克隆抗体而不是小鼠来源或嵌合单克隆抗体，因为它们在给药后引起的免疫反应较低。 2.5.与特定肿瘤相关靶标的结合触发ADCs的内化和细胞毒性 2.5.1.选择正确的靶向抗原对ADCs的杀伤至关重要 考虑到ADC的优势之一是能够将强效的细胞毒性药物特异性地传递给癌细胞，选择靶标抗原必须是开发这种策略的首要考虑因素。为了最大限度地利用ADC的治疗指数，理想的抗原应该是细胞表面结构（如蛋白质、糖蛋白或异常的神经节苷脂），在肿瘤细胞上高度或主要表达，与健康、正常细胞相比，或者至少在恶性、疾病相关细胞上丰富。理想情况下，目标蛋白应该是肿瘤特异性抗原（TSAs），这些抗原仅存在于癌细胞类型上，和/或肿瘤相关抗原（TAAs），这些蛋白在肿瘤中高度过表达，但在正常组织中罕见或很少存在。除了这一特征外，抗原的表位应该理想地面对外细胞矩阵（而不是内部位置），以确保更容易的可及性和与ADC的相互作用，后者从血管扩散出来。此外，为了避免不良的系统性副作用和安全问题，目标抗原应该是锚定在膜上的蛋白，而不是分泌到血液循环中。如果情况不是这样，ADC将促进肿瘤外的不希望的结合，从而减少对恶性细胞的抗癌效果。然而，在ADC相互作用后，最佳抗原应确保抗原-ADC复合物适当地内化到内质网/溶酶体途径中，导致药物释放，最终产生细胞毒性。值得注意的是，内化过程的速度和效率严格取决于目标的性质、表位的类型，以及与ADC偶联的有效载荷。最后，由于肿瘤团块及其周围的微环境（TME）紧密耦合并不断相互交流，TME组分已被作为新型潜在ADC靶标（见下文）。 2.5.2.ADCs的作用机制需要内化以发挥抗肿瘤细胞毒性 存在一个针对癌症细胞类型特异性存在或在癌变过程中高度过表达的抗原的单克隆抗体是ADC策略的一个基本要求。考虑到这一点，ADC的作用机制非常简单，并允许对疾病进行治疗以及强大的靶向细胞毒性（图2）。给药后，通常通过静脉注射以保持药物功能，ADC的单克隆抗体部分与癌细胞上的目标抗原结合，抗原-ADC复合物通过受体介导的内吞作用内化后，新形成的早期内质体成熟为晚期内质体，最终与溶酶体融合。在这个细胞隔间中，酸性或氧化还原条件与蛋白酶（组织蛋白酶B、血浆酶等）的存在相结合，允许细胞毒性有效载荷从其单克隆抗体载体上脱离，药物随后扩散到细胞内，并通过攻击DNA结构或微管蛋白聚合导致细胞死亡。值得注意的是，广泛用于ADC合成的IgG亚型可以通过与新生儿Fc受体（FcRn）的相互作用从内质网/溶酶体降解途径中挽救出来，并通过细胞外回收，FcRn是一种参与调节IgG周转的IgG受体。因此，这种FcRn介导的穿过细胞外空间的转运，虽然只涉及内部化的ADC-复合物的一小部分，但可能增强ADC的清除，从而减少其治疗指数。另一方面，如果小分子能够穿透细胞膜，它可以部分地扩散回细胞外矩阵，并进入邻近的细胞，无论抗原的表达水平如何，造成“旁观者效应”。这种现象，通过改变TME组分，如新血管内皮细胞和/或癌症相关成纤维细胞（CAFs），可能进一步增强ADC的杀伤效果，特别是在具有高度异质性目标表达的癌症病变中。此外，ADC的治疗策略涉及其他杀伤机制，以确保对癌症的效力。在几个背景下，已经显示单克隆抗体与其特定靶标的相互作用可以直接导致抗原受体刺激触发的下游信号通路的强大抑制。当载体的Fab片段与恶性细胞上的目标表位结合时，同一单克隆抗体的Fc部分可以与NK细胞和巨噬细胞上的FcR相互作用，分别触发ADCC和ADCP，以及补体系统的C1q组分，触发CDC。 图2 ADC策略的作用机制。图中指示了该过程的主要步骤。基本上，在ADC与癌细胞表面的靶标相互作用（步骤1）后，该复合物经历受体介导的内吞作用，并进入内质网/溶酶体途径，直到有效载荷在细胞质中释放（步骤2、3a和4）。然后，药物可以通过损害细胞核中的DNA结构或扰乱有丝分裂融合蛋白聚合（步骤5），发挥其杀伤活性，导致细胞通过凋亡死亡。一部分ADC在内质网/溶酶体途径的早期与FcRn受体结合，并被运输出细胞（步骤2a和3b）。 2.6.TME为ADC策略提供了新的潜在靶标 大多数处于临床前和临床开发阶段的ADC靶向主要位于癌块上的TAAs或TSAs。与血液学恶性肿瘤相比，实体瘤生长在一个复杂且动态的实体中，称为肿瘤微环境（TME），其组成可以根据肿瘤类型而有很大差异。TME的关键特征通常包括丰富的细胞外基质、基质细胞（例如，癌症相关成纤维细胞，CAFs）、新的和异常的血管以及免疫细胞，后者能够渗透到肿瘤团块中并发挥促进和抑制肿瘤的功能。特别是在肿瘤生长的早期阶段，癌细胞和TME组分之间存在双向和复杂的相互作用，通过释放可溶性因子促进肿瘤团块的生存、其局部侵袭和随后的转移扩散。从这个意义上说，TME通过一个新血管生成程序支持肿瘤的基本需求，该程序清除代谢废物，并且最重要的是，恢复向团块供应氧气和营养物质。鉴于这两个实体之间的密切关系，TME相关抗原（TMAs），即在TME内非恶性细胞上失调的蛋白质，为实体瘤的治疗提供了新的潜在靶标，因为它们与传统的肿瘤抗原不同。主要的TMAs包括趋化因子和细胞因子、转录因子、代谢酶和检查点分子。它们的优点在于它们在内皮细胞、基质细胞和免疫细胞上的过表达，而在健康组织中很少或非常低，以及它们在输注到血液中时更容易被ADCs接近，特别是存在于新血管或基质细胞上的抗原。此外，由于TME组分与癌细胞不同，它们不易受到由DNA修复机制无效引起的耐药机制的影响。针对这些抗原的制剂的开发不仅削弱了肿瘤团块，而且还提供了调节TME本身的机会，使其不那么免疫耐受，更容易被肿瘤消融。临床前和临床证据表明，属于肿瘤细胞外基质和新血管的细胞类型/因子可能是新的ADC靶标抗原的有价值的选择。例如，针对基质细胞的ADC可能通过改变肿瘤微环境中生长因子的浓度来引起细胞死亡，或者通过结合新血管上的抗原来诱导缺氧和营养缺乏。在这方面，值得一提的是“结合位点屏障”（BSB）的效果，这是一种发生在mAb和血管附近细胞群之间的现象，使部分ADC停留在它们附近，减少了Ab进入肿瘤团块的渗透。然而，大多数TMAs已在免疫系统的细胞上被识别，靶向它们提供了一种创新的抗癌治疗方法，通过促进效应细胞增殖、抗癌细胞因子/趋化因子的产生和总体生存，创造一个新的免疫敌对肿瘤微环境，减少新的血管生成。迄今为止，一些被新型ADCs靶向的TMAs包括CD74，一种由ADC STRO-001靶向的MHC类II分子伴侣，目前处于B细胞恶性肿瘤治疗的I期（NCT03424603）和CCR7，一种趋化因子受体，由新型ADC JBH492靶向，在非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病患者中（NCT04240704）。此外，Camidanlumab tesirine，也称为ADCT-301，是一种用于治疗经典霍奇金淋巴瘤（cHL）和非HL的I/II期ADC（NCT02432235），CD276，一种在病理性血管生成过程中过表达的免疫检查点，是不同ADCs在晚期实体瘤中的有趣候选靶标（NCT04145622, NCT03729596 和 NCT03595059）。 2.7.癌症创造了不同的方式来逃避ADCs的有效性 癌症的一个众所周知的特征是它们能够克服治疗方法的有效性，使它们易受到各种耐药机制的影响。恶性细胞发展出的逃避机制可以分为抗原的下调/上调、药物外排泵的存在、溶酶体功能的缺陷，以及参与细胞周期进展和凋亡调节的信号通路的失调。在这种情况下，观察到抗原水平与brentuximab vedotin的ADC治疗效果之间的关联，其多次治疗周期与CD30下调相关，从而导致肿瘤对MMAE的更强耐药性。在另一项研究中，癌细胞系JIMT1-TM在反复给药后对药物产生了长期耐药性，因为HER2蛋白的水平下降。然而，血液中CD33抗原的上调限制了gemtuzumab ozogamicin对骨髓的渗透，表明高水平的CD33仍然对治疗产生负面影响，并可能减少药物暴露。另一个不可忽视的耐药机制依赖于称为ABC转运体的跨膜蛋白家族。这些跨膜蛋白作为药物外排泵，导致各种化学物质，包括用作有效载荷的化学物质，从癌细胞中排泄出来，使癌细胞对治疗产生耐药性或至少不那么易感。在AML细胞中观察到了这种机制，其中ABC家族成员MDR1的过表达使它们对gemtuzumab ozogamicin产生耐药性和在乳腺癌细胞中，TDM-1的周期性给药诱导ABCC1转运体水平的增加。另一种逃避机制涉及溶酶体酸化。给药ADC并内化后，溶酶体内的酸性水解酶切割连接子，随后将细胞毒性剂释放到癌细胞的细胞质中。然而，在持续治疗下，恶性细胞可能通过改变溶酶体隔间pH值来破坏这一过程，从而减缓其蛋白酶的代谢活性，这一过程已在对长期T-DM1耐药的HER2阳性乳腺癌克隆中得到证实。尽管如此，参与细胞周期调节的信号通路的扰动和凋亡调节的改变也可能调节肿瘤细胞对ADC的敏感性。在对T-DM1耐药的HER2阳性乳腺癌细胞中，观察到周期蛋白B水平的增加，这是一种需要G2/M细胞周期转换的蛋白质。这种在蛋白水平上的上调可能会通过改变对ADC治疗的敏感性来影响细胞周期动态。此外，在AML细胞中，与gemtuzumab ozogamicin的较低效力相关的PI3K/Akt通路的激活，以及与曲妥珠单抗低效力相关的PTEN通路的缺失。值得注意的是，在同一种血液肿瘤中，抗凋亡BCL-2和BCL-X家族成员的过表达在对gemtuzumab ozogamicin的敏感性中起作用。 2.8.临床批准用于治疗血液学和实体恶性肿瘤的ADCs ADC策略代表了一种高度成功的癌症治疗替代方案。通过利用各种连接子和化学替代品将所选择的单克隆抗体在位点输送药物，与仅基于单克隆抗体的治疗和传统化疗相比，这是一种创新发展。如前所述，尽管ADC的开发在药物安全性、效力和靶向性方面仍然具有挑战性，但新技术的开发以及新靶点和组分的识别，使得ADC在临床肿瘤学中的应用激增。迄今为止，已有数百种ADC处于临床试验中，其中15种已获得FDA、欧洲药品管理局（EMA）和/或其他政府机构的批准，并投放市场，用于治疗血液学恶性肿瘤和实体瘤。在过去的23年中，以下ADC已开发用于治疗血液学肿瘤：Gemtuzumab ozogamicin（Mylotarg®）、Brentuximab vedotin（Adcetris®）、Inotuzumab ozogamicin（Besponsa®）、Polatuzumab vedotin（Polivy®）、Belantamab mafodotin（Blenrep®）、Loncastuximab tesirine（Zynlonta®）和Moxetumomab pasudotox（Lumoxiti®），后者使用免疫毒素而非化疗药物作为有效载荷。目前批准用于实体瘤治疗的ADC包括Ado-trastuzumab emtansine（Kadcyla®）、Fam-trastuzumab deruxtecan（Enhertu®）、Enfortumab vedotin（Padcev®）、Sacituzumab govitecan（Trodelvy®）、Tisotumab vedotin-tftv（Tivdak®）、Mirvetuximab soravtansine（ELAHERE®）、Disitamab vedotin（Aidixi®）和Cetuximab sarotalocan（Akalux®）。下面提供了每种药物的简要描述，关键特征列在表1中。此外，补充表1提供了正在研究用于癌症治疗的新型ADC的招募临床试验。 2.8.1.血液学恶性肿瘤 2.8.1.1.Gemtuzumab ozogamicin Gemtuzumab ozogamicin（Mylotarg®; Pfizer）是第一个开发并由FDA在2000年批准，EMA在2018年批准的ADC。作为第一代ADC，它基于人源化抗CD33 IgG4抗体，通过腙键可切割连接子与DNA相互作用剂calicheamicin（或ozogamicin）相连，连接子与表面赖氨酸相连（平均DAR 2–3）。它被指示用于治疗复发/难治性急性髓性白血病（AML），尽管它在2010年被撤回，但在2017年以较低剂量重新批准，因为患者遭受了严重的毒性问题，可能由于剂量较高。给药后，Mylotarg与AML细胞上的CD33跨膜糖蛋白结合，内化后，通过其连接子的水解释放calicheamicin的前体。药物的活性形式通过与DNA结合并破坏其构象来发挥细胞毒性作用，导致细胞周期停止和细胞死亡。值得注意的是，calicheamicin的疏水性质使得它能够杀伤TME中CD33靶抗原阴性的细胞。 2.8.1.2.Brentiximab vedotin Brentiximab vedotin（Adcetris®; Seagen, Takeda Pharma）于2011年获得FDA批准，2012年获得EMA批准，作为系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）的单药治疗，并于2018年与化疗联合用于复发/难治性霍奇金淋巴瘤（HL）。它由一个靶向癌细胞上的CD30的嵌合IgG1组成，CD30是肿瘤坏死因子受体家族的细胞膜蛋白，通过蛋白酶可切割连接子与MMAE（DAR等于4）半胱氨酸结合。与其靶标相互作用后，Adcetris通过依赖clathrin的内吞作用进入内质网/溶酶体途径，其中其连接子被酸性水解酶切割以在细胞质中释放MMAE。药物通过干扰微管蛋白聚合诱导凋亡和细胞死亡。像calicheamicin一样，MMAE利用旁观者杀伤效应对邻近的CD30阴性细胞发挥其细胞毒性作用，这表明Adcetris在体内异质性淋巴瘤中的效力可能与此效应有关。 2.8.1.3.Inotuzumab ozogamicin Inotuzumab ozogamicin（Besponsa®; Pfizer）于2017年获得FDA和EMA批准。它靶向CD22，这是一种在急性淋巴细胞性白血病（ALL）的复发/难治性B细胞前体上表达的抗原。它由一个人源化IgG4 mAb与calicheamicin通过酸性可切割连接子连接到赖氨酸残基上组成。它的DAR范围为5到7。从机制上看，它的工作原理与gemtuzumab ozogamicin相似，因为它基于相同的抗体骨架并装载了相同的药物。 2.8.1.4.Polatuzumab vedotin Polatuzumab vedotin（Polivy®; Genentech）包含一个人源化IgG1抗CD79b，B细胞受体的一个组成部分，通过与brentiximab vedotin合成中使用的相同的有机桥与MMAE结合。偶联方法是通过THIOMAB系统利用工程化半胱氨酸，DAR为3.5。Polivy的临床使用已在2019年获得FDA批准，在2020年获得EMA批准，用于治疗成人复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL），与苯达莫司汀和利妥昔单抗（抗CD20 mAb）联合使用。给药后，这种药物被内化到癌细胞中，并被蛋白水解切割以释放MMAE，MMAE通过抑制微管蛋白聚合引起凋亡细胞死亡。 2.8.1.5.Belantamab mafodotin Belantamab mafodotin（Blenrep®; GlaxoSmithKline）于2020年获得FDA和EMA批准，用于治疗难治性/复发性多发性骨髓瘤（MM），但在2022年被撤回，因为它没有达到FDA标准（https://www.myeloma.org/news-events/withdrawal-blenrep-us-market）。这种ADC的单克隆抗体部分是独特的，因为它由一个人源化Fc-afucosylated IgG1组成，这种修饰增强了ADC的结合和细胞毒性。从单克隆抗体骨架出发，一个半胱氨酸结合的非可切割连接子将单克隆抗体与细胞毒性有效载荷MMAF桥接。它的DAR是4。Blenrep的靶标是B细胞成熟抗原（BCMA），这是肿瘤坏死因子受体家族的一个成员，在成熟的B淋巴细胞和浆细胞中过表达。与其他ADC一样，BCMA靶向内化ADC并降解单克隆抗体以在细胞质中释放MMAF，MMAF是一种微管抑制剂，它阻断癌细胞周期进展并通过凋亡导致它们死亡。 2.8.1.6.Loncastuximab tesirine Loncastuximab tesirine（Zynlonta®；ADC Therapeutics）针对的是CD19蛋白，这是一种在所有B细胞谱系中常见的跨膜蛋白。它在2021年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的加速批准，并在2022年获得欧洲药品管理局（EMA）的批准，用于治疗经过两线或以上系统治疗后复发/难治性B细胞淋巴瘤。这包括未另行规定的弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、由低级别淋巴瘤演变而来的DLBCL，以及高级别B细胞淋巴瘤。 该药物由一个人源化IgG1单克隆抗体与SG3199（一种二聚体PBD（吡咯并苯并二氮卓）烷化剂）通过酶促可切割连接子连接而成，药物-抗体比率（DAR）为2-3。SG3199以其强大的细胞毒性而闻名，在皮摩尔级别上展现效果，使其成为目前ADC中使用的药物中最有毒的一种。这种高水平的效力允许有效靶向并杀死表达CD19的癌细胞。 其作用机制涉及SG3199有效载荷与DNA的不可逆结合，创建一个强烈的加成物，抑制DNA合成，最终导致细胞死亡。这种精确的靶向和有效载荷的强大细胞毒性作用使Zynlonta成为治疗某些类型的B细胞淋巴瘤患者的宝贵治疗选择，这些患者对标准治疗没有反应或在标准治疗后复发。 截至目前，Loncastuximab tesirine是唯一获准作为单药治疗复发/难治性DLBCL的抗CD19 ADC，突显了它在为这一患者群体提供额外治疗选择方面的重要性。 2.8.1.7.Moxetumomab pasudotox Moxetumomab pasudotox (Lumoxiti®; AstraZeneca) 并不被广泛认为是ADC，因为它的有效载荷是由Pseudomonas aeruginosa外毒素A片段PE38组成的。然而，由于它使用基于单克隆抗体的相同靶向机制，我们仍然希望将其视为ADC生物复合家族的一部分。它在2018年获得FDA批准，用于治疗至少接受过两次系统治疗的难治性/复发性毛细胞白血病（HCL）患者。它在2021年获得欧盟市场授权。Lumoxiti基于抗CD22小鼠IgG1单克隆抗体，携带一个可切割连接子，连接到免疫毒素PE38。相互作用、内化和切割后，PE38被释放到细胞质中，通过阻断翻译和诱导细胞凋亡发挥作用。 2.8.2.实体瘤 2.8.2.1.基于曲妥珠单抗的ADCs 自1997年FDA批准利妥昔单抗用于治疗非霍奇金淋巴瘤（Leget and Czuczman, 1998）以来，已研究并批准了几种单克隆抗体在临床肿瘤学中的应用。考虑到构成已批准ADC框架的单克隆抗体，曲妥珠单抗是一个在联合疗法或单独使用中的抗癌分子的例子，也代表了两种ADC制剂的载体模式。曲妥珠单抗（Herceptin®）是一种人源化IgG1单克隆抗体，与HER2的细胞外结构域结合，HER2是20%的乳腺癌（BC）患者中上调的酪氨酸激酶受体，阻止其同源二聚体形成，从而阻断其细胞内信号传导。由于其在细胞生长、存活和分化中的作用，HER2+乳腺癌往往比HER2阴性肿瘤更具侵略性地生长和扩散。曲妥珠单抗于1998年获得FDA批准用于治疗HER2+ BC。它提高了总生存率（OS）和无进展生存率（PFS），但其使用也与心脏毒性的风险相关，如左心室射血分数（LVEF）下降和充血性心力衰竭。在美国，它被批准用于HER2+ BC的辅助治疗（与蒽环类药物和紫杉醇），以及用于转移性HER2+ BC的单药治疗或与化疗药物、酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）和免疫疗法联合使用。它也用于HER2+胃癌的联合治疗方案。曲妥珠单抗通过静脉输液给药，剂量方案可以根据肿瘤生长阶段进行调整。如今，曲妥珠单抗骨架已被用于合成两种FDA和EMA批准的ADC，ado-trastuzumab emtansine（T-DM1, Kadcyla®; Genentech）和fam-trastuzumab deruxtecan（T-Dxd, Enhertu®, Daiichi Sankyo, Astrazeneca），它们在二线/三线治疗中提高了OS，目前分别用于治疗HER2+早期/转移性和HER2+低度BC。 2.8.2.1.1.Ado-trastuzumab emtansine Ado-trastuzumab emtansine (Kadcyla®; Genentech) 基于人源化IgG1与emtansine通过连接到赖氨酸残基的不可切割连接子相连。它的平均DAR为3.5。与HER2抗原相互作用后，Kadcyla通过内吞作用内化并到达溶酶体，在那里IgG1被完全蛋白水解降解。随后，含DM1的代谢产物lysine-MCC-DM1被释放到细胞质中，破坏微管网络并导致细胞死亡。有趣的是，lysine-MCC-DM1与DM1具有类似的毒性，但由于其在中性pH下的电荷，无法通过旁观者杀伤效应发挥其药理作用。T-DM1在2013年获得FDA批准，用于治疗晚期HER2+ BC，基于EMILIA临床试验（III期）的数据。这项研究评估了与卡培他滨和拉帕替尼相比，T-DM1在之前接受过曲妥珠单抗和紫杉醇化疗的HER2+ BC患者中的疗效。基于911名入选患者的结果显示，T-DM1的使用在客观反应率（ORR）（43.6% 对比 30.8%）、中位PFS（9.6个月对比 6.4个月；p < 0.001）和中位OS（29.9对比 25.9个月，p < 0.001）方面取得了改善，中位随访时间为47.8个月（Blackwell et al., 2012; Diéras et al., 2017）。几年后，KATHERINE临床试验（III期）的积极结果建立了T-DM1作为早期HER2+ BC患者的辅助疗法的新用途，这些患者在新辅助治疗（紫杉醇和曲妥珠单抗）后仍有残留疾病。在符合标准的1486名患者中，接受T-DM1治疗的患者与单独接受曲妥珠单抗治疗的对照组患者相比，3年无侵袭性疾病生存率（IDFS）显著提高了50%（88.3%对比 77%，p < 0.001）。从这两项研究收集的数据中，T-DM1与化疗药物和单独曲妥珠单抗在HER2+早期或转移性BC中相比显示出更强的治疗效果，可能是因为这种ADC保留了曲妥珠单抗的抗肿瘤功能，并增加了新的细胞毒性效应。值得注意的是，T-DM1的优越效益与可管理的副作用相关，大多数为1或2级，因为只有一小部分入选患者报告了肝酶天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）升高和血小板减少症。 2.8.2.1.2.Fam-trastuzumab deruxtecan Fam-trastuzumab Deruxtecan (Enhertu®; Daiichi Sankyo) 是FDA批准的第二种HER2靶向ADC药物。T-Dxd在2019年获得FDA批准，在2021年获得EMA批准，用于治疗不可切除或转移性HER2+乳腺癌（在患者接受过两种或更多抗HER2治疗后）、非小细胞肺癌，以及局部晚期或转移性HER2+胃癌或胃食管结合部腺癌，在基于曲妥珠单抗的治疗后。它由携带Dxd的人源化IgG1单克隆抗体组成，Dxd是一种比SN-38更有效的DNA拓扑异构酶I抑制剂，通过酶促可切割连接子作为细胞毒性有效载荷。它的DAR为7或8。在HER2-Enhertu复合物内化和切割后，Dxd阻断DNA拓扑异构酶I，这是一种在转录过程中控制和改变DNA拓扑状态的酶，导致细胞死亡。与具有相同靶标的Kadcyla相比，Enhertu在新的半胱氨酸偶联肽连接子、更高的DAR和药物的细胞毒性方面有多项改进，药物更强效且疏水性更强，以增加对邻近细胞的旁观者杀伤效应。这对于将细胞毒性活性扩展到HER2水平低或异质性的细胞至关重要。从这个意义上说，T-Dxd通过旁观者杀伤效应实现了更好的治疗反应，因此在对T-DM1耐药的肿瘤中具有更大的细胞毒性。 2019年，基于单臂DESTINY-Breast01试验（II期）的积极结果，T-Dxd获得FDA加速批准。在这项研究中，纳入了184名接受过包括T-DM1在内的两种或以上治疗线治疗的HER2+转移性乳腺癌女性患者，以测试T-Dxd的疗效。有趣的是，60.9%的患者显示出客观反应，中位持续时间和中位反应时间分别为16.4个月和14.8个月，中位反应时间为1.6个月（95% CI）。此外，DESTINY-Breast 03试验（III期）评估了T-Dxd和T-DM1的疗效，该试验纳入了524名曾接受曲妥珠单抗和紫杉醇治疗的HER2+转移性乳腺癌患者。随机化数据显示T-Dxd在客观反应率（ORR）（79.9%对比34.2%）、无进展生存期（PFS）（未达到对比6.8个月，p < 0.001）和总生存期（OS）（94.1%对比85.9%）方面具有优越的疗效。总体而言，接受T-Dxd治疗的患者中观察到的最常见3级或以上不良效应包括血液毒性、恶心和疲劳。值得注意的是，T-Dxd治疗还与肺毒性相关，特别是间质性肺病（ILD），这是一组需要谨慎管理的呼吸系统疾病，可能导致治疗中断。最后，DESTINY-Breast04试验评估了577名接受过转移性环境中先前化疗或在完成辅助化疗后6个月内复发的低HER2+转移性乳腺癌患者使用T-Dxd与医生选择的化疗方案。这项研究的结果显示，T-Dxd的使用导致中位无进展生存期（9.9个月对比5.1个月）和总生存期（23.4个月对比16.8个月）显著长于纳入患者的药物治疗。 2.8.2.2.恩福妥珠单抗vedotin 恩福妥珠单抗vedotin（Padcev®; Astellas Pharma US, Seagen）是一种完全人源化的IgG1，通过半胱氨酸残基上的蛋白酶可切割连接子与微管抑制剂MMAE结合，DAR为3.8。它靶向nectin-4，这是一种参与包括细胞粘附、增殖和迁移在内的多个细胞信号传导途径的跨膜蛋白，并且在多种恶性肿瘤中过表达。2019年，Padcev获得FDA批准，用于接受含铂治疗和PD-1或PD-L1抑制剂后的局部晚期或转移性尿路上皮癌，并在2022年获得欧盟范围内的市场批准。 2.8.2.3.萨奎珠单抗govitecan 萨奎珠单抗govitecan（Trodelvy®; Gilead Sciences）是一种ADC，由靶向肿瘤相关钙信号转导蛋白2（TROP2）的人源化IgG1 mAb组成，TROP2是一种跨膜糖蛋白，参与细胞自我更新、增殖、侵袭和存活，并在细胞内钙信号传导中发挥重要作用。它在大多数实体瘤中普遍过表达，包括三阴性乳腺癌（TNBC）。该mAb将恶性细胞与SN-38（一种DNA拓扑异构酶I抑制剂，导致DNA断裂，最终导致细胞死亡）结合起来。IgG1和有效载荷通过酸敏感可切割连接子与半胱氨酸残基结合，DAR在7到8之间。Trodelvy在2020年获得FDA批准，在2021年获得EMA批准，用于治疗至少接受过两次先前治疗的局部晚期或转移性TNBC患者，以及在接受含铂治疗和PD-1或PD-L1抑制剂后的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者。 2.8.2.4.提索单抗vedotin-tftv 提索单抗vedotin-tftv（Tivdak®; Seagen）由完全人源化的IgG1、酶促可切割连接子、MMAE作为有效载荷，以及DAR等于4组成。它靶向组织因子（TF），这是一种与癌症转移和侵袭性相关的膜蛋白，在多种实体瘤中高度表达。作为市场上最新的ADC，它在2021年获得FDA批准，用于治疗在化疗期间或之后病情进展的复发/难治性转移性宫颈癌患者。 2.8.2.5.米尔维替珠单抗soravtansine 米尔维替珠单抗soravtansine（ELAHERE®; ImmunoGen）在2022年获得FDA批准，用于治疗成年患者Folate Receptor α（FRα）阳性、铂类药物耐药的上皮性卵巢癌，这些患者之前已接受过1-3次系统治疗。它靶向FRα，这是叶酸受体家族的成员，多种上皮源性癌细胞过表达。它由通过可切割连接子结合到DM4的嵌合mAb组成，DM4是一种强大的微管靶向剂，属于美登木素类。与其他ADC一样，该药物在内化进入癌细胞后发挥其细胞毒性效应，通过阻断它们的有丝分裂融合形成导致它们死亡。 2.8.2.6.迪西他单抗vedotin 迪西他单抗vedotin（Aidixi®; RemeGen）在2021年获得中国国家药品监督管理局（NMPA）批准，作为HER2表达的局部晚期或转移性尿路上皮癌（mUC）患者的二线治疗，这些患者之前已接受过含铂化疗，并批准用于接受过至少两次系统化疗方案的HER2过表达的局部晚期或转移性胃癌患者。它通过可切割连接子结合到人源化mAb，传递HER2+癌细胞MMAE（DAR等于4）。有趣的是，Aidixi在临床前实验和动物模型中显示出比其他HER2+靶向ADC更高的特异性抗原活性和更强的肿瘤活性。 2.8.2.7.西妥昔单抗sarotalocan 西妥昔单抗sarotalocan（Akalux®; Rakuten Medical）在2020年获得日本药品和医疗器械管理局（PMDA）批准。它由特异性靶向表皮生长因子受体（EGFR）的嵌合IgG1 mAb组成，EGFR的激活涉及细胞增殖、血管生成以及侵袭/转移。Akalux的结合不是与小分子，而是与一种称为700DX的光激活近红外染料（DAR 1.3–3.8）。在这种情况下，我们也希望将其视为ADC，因为它对癌细胞的作用机制。在与ADC-EGFR相互作用后，这种ADC通过抑制EGFR信号传导途径，并通过700DX染料的激光激活实现高效的抗癌效果。通过这种方式，恶性细胞被靶向并迅速消除，而周围的健康细胞则被保留。它已被批准用于治疗不可切除的局部晚期或复发性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）。 2.9.ADC的治疗策略揭示了挑战和局限性，并可结合在组合方案中 2.9.1.有效载荷是ADCs毒性的主要原因 在过去20年中，ADCs在治疗血液学恶性肿瘤和实体瘤方面取得了显著成果，并在临床肿瘤学领域成为有效的替代方案。尽管它们被设计为通过靶向选择性细胞群来释放细胞毒性药物，但大量临床试验表明，ADCs并非没有不良反应，有时会导致传统化疗常见的毒性。通常情况下，相当比例的患者遭受各种毒性，有时（或致命）严重到需要减少剂量或中断治疗，治疗延迟和支持性药物治疗。构成ADC的每个部分在这些化合物被人体服用时都可能导致重大副作用。即使mAbs的性质负责中度/重度免疫原性副作用，特别是在使用小鼠和嵌合mAb框架的ADC制剂中，毒性概况的主要表现高度依赖于有效载荷的类型。大多数在临床上使用的ADCs装载有微管抑制剂或DNA相互作用剂，它们在纳摩尔或皮摩尔浓度范围内发挥细胞毒性作用，并且在未偶联形式下具有高度毒性。不幸的是，由于只有很小一部分ADCs到达目标，并且一部分有效载荷过早释放，很大一部分剂量实际上可以自由与许多非目标健康细胞相互作用并引起非常规的系统性或局部副作用。非靶向毒性与连接子密切相关。不可切割连接子在血浆中表现出更大的稳定性，并且ADCs被人体更好地耐受。然而，在大多数在临床上使用的ADCs中，尤其是用于实体瘤的ADCs中，更倾向于使用可切割连接子，因为它们显示出更多的好处，可能由于旁观者副作用。这种出细胞毒性有两个方面。一方面，它可能将治疗效果扩展到肿瘤微环境中的抗原阴性细胞，扩展到对ADCs不太可及的肿瘤团块核心细胞，以及抗原表达低/异质性的细胞。另一方面，由于传统小分子药物的非特异性效应，正常细胞也可能遭受严重损害，可能带来不可预测的后果。其他限制与ADCs的药代动力学特性有关。快速清除和聚集是可能对这些化合物的治疗活性产生负面影响的两个重要方面。为了解决并发症并提高ADC的体内兼容性，可以通过糖基化或PEG化对mAb组分和连接子进行化学修饰。虽然前者在这个平台上没有详细研究，但后者允许克服一些缺点。PEG化涉及将聚乙二醇（PEG）添加到特定的氨基酸残基上。一般来说，已经显示出使用PEG作为连接子可以改善ADCs的溶解性并减少聚集，通过增强稳定性和在体内的分布来改善它们的药代动力学。 2.9.2.ADCs的临床表现包括主要毒性 由于ADCs旨在限制它们对健康组织的暴露，它们与相当可管理的毒性相关，其中恶心、呕吐、腹泻和疲劳是最频繁的。不幸的是，几项临床试验提供的大量数据也突出了严重毒性（3级或更高）的存在，包括周围神经病变和血液毒性，通常是剂量限制性的。周围神经病变包括刺痛、四肢疼痛、麻木，很少伴有肌无力，通常与携带可切割连接子结合微管抑制剂的ADCs（即所有装载有MMAE的ADCs）和携带DM4的Mirvetuximab soravtansine相关。由于可切割连接子与药物过早释放相关，并且这些化合物阻断微管蛋白聚合，这种常见副作用并不意外，因为微管蛋白在轴突运输中深度参与，这是神经生长和成熟的重要过程。血液学副作用包括贫血、中性粒细胞减少、血小板减少、白细胞减少，主要是由于ADCs通过非靶向Fc受体介导的吸收进入免疫细胞，其中中性粒细胞减少是ADCs单药治疗中最主要的毒性。此外，与药物类别相关的主要剂量限制毒性包括肝毒性（对于MMAF、DM1和calicheamicin）、皮肤毒性（对于MMAE和PBD）和眼科毒性（对于MMAF和DM4）。值得注意的是，角膜毒性的机制尚未解决，但在使用Belantamab mafotodin、Trastuzumab emtansine和Mirvetuximab soravtansine治疗的患者中有相当比例的患者出现，所有这些都装载有微管抑制剂。其他相关的临床表现包括在给予Sacituzumab govitecan和Trastuzumab deruxtecan时的胃肠道副作用，这两种ADC用于治疗装载有拓扑异构酶抑制剂的乳腺癌，以及duocarmycin和PBD的浆膜渗出，后者在Loncastuzimab tesirine制剂中负责肾病毒性。此外，Trastuzumab emtansine和Trastuzumab deruxtecan，这两种均针对HER2+乳腺癌，与增加间质性肺病（ILD）/肺炎的风险相关，必须通过剂量调整和支持性护理建议仔细管理，以避免致命结果。与其他基于小分子和免疫疗法的策略一样，ADCs显示出一些需要仔细解决的挑战，以提高它们的效力并减少系统性副作用。正在采取各种方法在临床上深入对抗副作用的表现形式，其中许多方法侧重于个体。正在大力努力在早期识别可能存在潜在致命毒性的患者，并为他们提供支持性措施，如剂量和时间表调整。对患者病史和先前治疗、合并症或遗传概况的调查，包括药物遗传学分析以识别关键基因中的SNPs或潜在突变，无疑将在确定最佳策略以提高ADCs的耐受性和效力方面发挥关键作用。 2.9.1.ADCs可以用于组合疗法 除了将ADCs作为单药治疗使用外，最近的临床前和临床研究还集中在ADCs与化学免疫疗法的组合上。理想情况下，ADCs与抗血管生成剂的联合给药，即破坏新血管以促进ADCs渗透到肿瘤微环境的药物，或促进免疫监视的免疫调节药物，应该在没有或有限的严重毒性和安全问题的情况下放大身体对肿瘤团块及其TME的抗肿瘤反应。关于ADC与化疗的组合，有希望的数据包括Brentuximab vedotin和CHP（环磷酰胺、阿霉素和泼尼松）以及Polatuzumab vedotin和Rituximab-CHP在CD30+外周T细胞淋巴瘤和DLBCL中的组合疗法。同样，基于Trastuzumab emtansine和选择性抗HER2酪氨酸激酶抑制剂（TKI）tucatinib的组合疗法在转移性乳腺癌中取得了显著的益处，以及与Mirvetuximab soravtansine联合给予的bevacizumab，该mAb针对血管内皮生长因子（VEGF），在卵巢癌的临床前模型中获得了类似的益处。最近在几种类型的癌症中探索了使用ADCs和免疫治疗剂的组合方法。免疫检查点抑制剂（ICIs）是增强抗肿瘤免疫反应的免疫疗法，通过将耗尽的T细胞转化为激活的T细胞，并绕过导致肿瘤从免疫系统中逃逸的途径。针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白1/其配体（PD-1/PD-L1）轴的ICIs在几种恶性肿瘤中显示出强大的临床活性，但只有少数患者通过单药治疗获得长期益处。 从这个角度来看，ADCs可以发挥作用，通过增加T细胞渗透到肿瘤微环境（TME）中，诱导肿瘤特异性适应性免疫，增强抗肿瘤免疫反应，而免疫检查点抑制剂（ICIs）则能活化耗尽的T细胞。因此，ICIs与针对HER2的曲妥珠单抗emtansine联合治疗PD-L1+、HER2+晚期乳腺癌的组合疗法取得了令人鼓舞的结果。 2.10.ADC策略在非肿瘤学适应症中的应用 近年来，研究小组已经研究了ADCs在非肿瘤学背景下的使用，主要关注于治疗细菌感染和自身免疫疾病。Tvilum等人通过开发一种抗体-抗生素偶联物（AAC），即将针对细菌的抗体与抗微生物分子丝裂霉素C偶联，用于治疗由金黄色葡萄球菌引起的植入物相关生物膜感染，这是假体关节感染中最常见的致病因子。在另一项研究中，O'Leary等人提出了开发一种抗体-杀菌剂偶联物（ABC），即将抗体与一种抗微生物肽偶联，通过与P. aeruginosa的细胞表面结合发挥作用，为ADC针对细菌感染的活性提供了另一个有趣的例子。关于炎症性疾病，Yasunaga等人开发了一种针对IL-7受体（IL-7R）的ADC，与MMAE偶联，并表明ADC介导的IL-7R免疫调节，其上调是自身免疫病理机制中的常见机制，可以特异性地耗尽自身免疫性关节炎小鼠模型炎症部位的IL-7R阳性细胞，并终止疾病进展。同年，Lee等人在类风湿性关节炎（RA）模型中证明了TCZ-ALD的免疫抑制效果，TCZ-ALD是一种针对IL-6受体（IL-6R）的ADC，与小分子阿伦磷酸盐偶联。TCZ-ALD阻断了IL-6R活性和巨噬细胞在RA症状和关节炎症表现中的活性。几年后，Gillard等人通过单次给予CD45-ADC和骨髓移植，实现了致病活性T细胞的免疫重置，这在自身免疫疾病的小鼠模型中产生了显著的疾病修饰效果。此外，一些研究还探讨了ADCs在心血管疾病和肾脏疾病中的应用，突出了这种治疗策略在其他病理条件下的潜在应用。 2.11.ADCs制造中的挑战和解决方案 2.11.1.工艺开发包括几个步骤 公司在ADCs制造中的主要目标是生产一种纯净且无生物负荷的化合物，用于人体临床使用是安全的。由于ADC的制剂由具有多个偶联位点的mAbs混合物和小有机分子组成，因此在这些化合物的开发中需要几个分析步骤，并必须克服几个挑战。总的来说，ADCs的生产可以分为三个步骤：抗体的生产、药物-连接子复合物的合成和偶联以形成最终的ADC。偶联步骤具有根本重要性，因为它决定了生物分子的治疗效力。传统的基于赖氨酸侧链或还原半胱氨酸的偶联方法导致异质性ADC制剂，其安全性和治疗效果难以预测。为了克服这一关键限制，最近开发了位点选择性偶联方法。通过这种方式，一定数量的药物分子不断结合到mAbs的选定位点上，从而获得更均匀的混合物，提高了批次间一致性和治疗效果。在偶联步骤之后，ADC进行纯化并填充到无菌瓶中，整个过程都遵循当前良好生产规范（cGMP）的无菌生产线。在整个开发过程中控制质量。生产需要一个生物制造环境，允许安全处理敏感结构，如各种粉末和化学品、纯化的mAbs和高效药物，以最小化生产各个阶段可能发生的潜在污染和损失。为确保产品的纯度和无菌性，合成和生物偶联反应在无菌室和条件下进行，并根据cGMP标准定期记录仪器准确性。为了减少使用危险物质的潜在污染和暴露，每个实验步骤都通过为人员和操作员提供深入的专业知识和专用设备来实现。此外，ADC的生产通常涉及多个部门/服务，从这个意义上说，必须确保极低温度的供应链和安全的包装，以减少长期储存和运输过程中可能的变化、损坏和泄漏。考虑到所涉及的复杂性和流程数量，ADCs的生产相当繁琐、耗时且经济上昂贵。需要大量的资本投资来覆盖从实验设计、新药的发明和开发到产品创新、差异化和安全监控的众多步骤，所有这些都需要使成品药物在市场上可行（www.cbo.gov）。为了克服这些障碍，合同开发和制造组织（CDMOs），为制药行业提供药物开发和制造服务的公司，正在转向一次性技术（SUTs）和自动化端到端系统。SUTs是无菌的一次性物品，由各种塑料制成，其中大多数可以像它们的不锈钢对应物一样使用，无需在使用后进行消毒和回收。因此，这些技术通过降低交叉污染的风险、更好地确保无菌性、允许在整个过程中更具灵活性，以及最重要的是提高成本效率和减少上市时间，比传统可重复使用系统提供了显著的优势。在这些方面，技术的持续改进和主要生物制药公司对广泛研究计划的投资将推动ADC市场的增长（2022年6月估值约为70亿美元，但预计到2030年将达到224亿美元（www.researchandmarkets.com），并增加新的医疗领域中可用的基于ADC的疗法数量。 2.11.2.分析表征策略 ADCs生产的另一个挑战是评估它们的生化属性，以获得安全有效的产品。在生产过程中必须仔细控制的ADC的关键质量属性包括确定药物-抗体比率（DAR）和药物分布、残留未偶联物种，特别是mAb和载荷方面，以及评估最终制剂中的尺寸和电荷变体。如今，各种体外仪器和技术被单独或组合使用，以进行全面的ADC分析表征，包括光谱、色谱和质谱方法。 2.11.2.1.确定纯度 化合物的纯度是任何生物制药制造过程中的一个基本目标。用于评估ADC制剂纯度的一种技术是尺寸排除色谱法结合紫外检测（SEC-UV），该方法通过尺寸（在某些情况下是分子量）分离分子，用于分级大型大分子，如蛋白质（例如mAbs）或蛋白质复合物。在ADC合成中，按尺寸分离大分子允许从潜在的片段、聚集体和颗粒中纯化mAb，这是影响最终ADC效力及其在给患者服用时安全性的三个不良物种。通常，将SEC与多角度激光光散射（SEC-MALS）结合使用，为生物制药应用提供了一些优势。在MALS检测中，激光束通过含有目标分子的样品溶液，根据分子的尺寸，在特定角度测量散射光的强度。与SEC本身相比，SEC-MALS需要高纯度柱，但通过增加检测制剂中杂质的灵敏度，提供了额外的信息。其他用于确定聚集或片段存在的技术包括动态光散射（DLS）、沉降速度分析超速离心（SV-AUC），以及毛细管电泳结合十二烷基硫酸钠分析（CE-SDS），这是一种在生物制药工业中常用的宝贵方法，用于mAbs和ADC制剂，以确定批次一致性和整体蛋白纯度。此外，ADC制剂中可能存在各种残留物种，可能对患者构成潜在安全风险，是必须仔细评估的关键质量属性。这些未偶联形式的水平可以通过测量分子上的电荷来监测。由于mAb和载荷之间的生物偶联反应可以显著改变新形成的ADC的静电剖面，因此基于电荷的分离技术，如离子交换色谱法（IEC）、等电聚焦电泳（IEF）和毛细管等电聚焦（cIEF），可以提供有关电荷异质性、药物分布模式和整体制剂质量的信息。迄今为止，成像毛细管等电聚焦（iCIEF）被认为是生物制药质量控制中的一种强大方法，因为它可以根据各个变体的等电点（pI）定量分离样品。因此，iCIEF可以用来根据mAb及其偶联形式的不同pI，快速测量ADC混合物中游离mAb的含量。然而，这种检测的缺点是偶联物不能与反应中间体和其他杂质区分开来，它只能用于导致电荷和净pI发生显著变化的偶联化学。 2.11.2.2.确定DAR和药物分布 ADC制造过程中最热门的话题之一是实现生物偶联反应，从而合成均匀混合物，从而控制DAR和载荷。已使用各种分析方法来确定这些参数，包括紫外/可见光谱（UV/Vis）、疏水作用色谱（HIC）、反相液相色谱（RPLC）和质谱（MS）。至于MS，其在ADC表征中的广泛使用在其他作品中讨论。UV/Vis光谱法相对于其他技术来说，测量DAR相对容易，尽管它需要mAb和载荷之间足够不同的吸收剖面以及载荷上的UV/Vis色团。在液相色谱方法中，HIC和RPLC通常用于测量平均DAR和药物分布。HIC是一种允许基于它们在疏水性上的差异来确定物种分布的方法，并且独特地保留了ADCs的天然结构和活性。由于分析是在温和的非变性条件下进行的，ADCs可以在其天然构象中被研究，这是一个优势，因为纯化色谱物种允许它们在后续分析中进一步表征。这种方法通常用于分析半胱氨酸偶联ADC和其他位点特异性偶联，但不能应用于赖氨酸偶联获得的ADC，因为这些制剂的更大异质性使色谱分离复杂化。然而，HIC需要大量的起始材料，对随机偶联ADCs的效率低，并且不能从半胱氨酸偶联ADCs中分离位置异构体，也不能确定药物偶联到链H或L。RPLC方法也根据混合物组分的疏水性进行分离，但这种方法需要蛋白质变性，导致一些ADCs分布和某些DAR物种的信息丢失。 图3 肿瘤靶向ADCs概览。利用血液循环，ADCs到达肿瘤微环境（TME），其中由癌症相关成纤维细胞（CAFs）和其他细胞类型组成，并与在其表面暴露肿瘤相关/特异性抗原的恶性细胞相互作用。除了它们的经典作用机制外，ADCs还可以增强对肿瘤团块的积极反应。为此，ADCs的疏水性有效载荷可能通过细胞膜扩散，通过旁观者杀伤效应（黑色箭头）诱导邻近抗原阴性细胞的杀伤，和/或ADCs抗体的Fc片段可能通过参与免疫系统（如补体系统、巨噬细胞和NK细胞）的免疫效应机制，引发抗肿瘤免疫（ADCC、CDC和ADCP）。所有这些机制共同旨在通过凋亡诱导肿瘤团块的细胞组分死亡。 2.12.结论和展望 如今，ADC代表了一种坚实的策略，用于治疗不同类型的恶性肿瘤。ADC的设计提供了一个特殊的机遇，能够选择性地将有效的抗肿瘤化学物质输送到目标细胞并将其消灭，而不会带来严重的非靶向毒性效应。ADC的主要优势在于其作用机制，因为它提供了克服传统基于小分子疗法的一些主要限制的潜力，如低治疗指数和高非肿瘤毒性。通过旁观者效应，在肿瘤团块和肿瘤微环境中杀死邻近的抗原阴性细胞，以及通过mAb-抗原相互作用和免疫细胞激活分别潜在激活直接和间接抗癌机制，为它们在临床上的使用提供了理由（图3）。在这种情况下，值得注意的是，作为单药治疗时ADC活性相关的益处可能会遇到由于肿瘤来源的耐药机制和主要由ADC的载荷引起的一些可管理的和少数严重不良反应而导致的一致的临床限制。尽管迄今为止已取得了有希望的结果，ADC技术仍在研究之中，并且在不同肿瘤背景下的药代动力学特性和生物效力方面存在一些限制。为了开发更适合的ADC一代，这一领域的未来前景基于现有技术的优化，特别是新方法学的发现。因此，科学家们正在积极探索新开发的mAbs的验证、合成更少免疫原性和更稳定连接子以及发现更有效载荷的深刻改进，并且类似的进展也集中在开发更合适的制剂以及识别新的靶标抗原上。鉴于TME在实体肿瘤进展和扩散中的中心作用，针对在基质细胞、血管和最重要的TME内免疫细胞中上调的新候选者进行靶向，可能会导致对肿瘤逃逸机制和代谢功能障碍的更大抑制，以实现持久的治疗效应。此外，与不同药物类别的组合疗法已经显示出协同和有希望的结果，通过增强ADC的抗癌效力和治疗指数，用于治疗血液学和实体肿瘤。基于这些观察，所有这些努力旨在开发新一代ADC，无疑将在药学特性、治疗效果和安全性方面显示出显著改进，这些改进不仅在肿瘤学领域，而且在其他病理条件下都是如此。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2024年中期业绩 和铂医药（股票代码：02142.HK），一家专注于肿瘤及免疫性疾病创新药研发及商业化的全球化生物医药公司，今日公布截至2024年6月30日的中期业绩。 王劲松博士 和铂医药创始人 董事长兼首席执行官 2024上半年，和铂医药实现持续盈利，展示出公司在直面市场挑战时强大的应变与适应能力。我们的全球化运营战略正在不断为未来的业务增长开辟新的途径，优异的业绩表现进一步证实了公司基于和铂医疗和诺纳生物的双引擎战略的可行性。我们将持续发挥核心创新力，带动可持续增长，释放公司创新引擎的巨大潜力。 2024上半年，公司整体收入约1.68亿元人民币（约2,370万美元），盈利约992万元人民币（约140万美元），现金储备充盈，约合13亿元人民币（约1.83亿美元）。 和铂医药：强大的差异化产品管线 公司拥有强大而多元化的产品管线，专注于肿瘤免疫、炎症及免疫学疾病的潜在差异化候选药物开发，核心产品包括HBM9161、HBM4003、HBM9378和HBM1020。公司计划每年至少提交一项IND申请。 巴托利单抗（HBM9161）是一种新型全人源抗FcRn单克隆抗体，有望成为针对多种自身免疫性疾病的重磅疗法。2023年6月，中国国家药品监督管理局（NMPA）受理了巴托利单抗治疗全身型重症肌无力（gMG）的生物制品许可申请（BLA），而在2023年12月，公司自愿计划纳入更多长期安全性数据并于2024年6月重新递交BLA，该BLA已于2024年7月成功被NMPA受理。根据截至2023年11月的开放标签扩展临床试验数据，巴托利单抗在疾病长期管理中展现出持续的有效性和安全性。其临床结果已于2024年3月发表在国际权威期刊《美国医学会杂志：神经病学》（JAMA Neurology）。 巴托利单抗于2021年获得中国国家药品监督管理局授予的“突破性治疗认证”，并于同年7月完成针对中国全身型重症肌无力患者的概念验证研究。2023年3月，公司宣布其III期临床试验取得积极研究结果。 2022年10月，和铂医药与石药集团全资子公司恩必普药业有限公司达成协议，在大中华区共同开发巴托利单抗。公司相信，与石药集团的合作能进一步提升巴托利单抗的市场潜力，有效推进其临床开发，从而实现巴托利单抗在大中华区的价值最大化。 普鲁苏拜单抗（HBM4003）是一款针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的下一代全人源抗体，是公司基于HCAb Harbour Mice®平台开发的首款自有抗体分子。作为全球首个进入临床开发阶段的全人源重链抗CTLA-4抗体，普鲁苏拜单抗相较传统CTLA-4抗体具有更优异的性能，包括显著的Treg清除机制和优化的药代动力学（PK）特性及安全性。普鲁苏拜单抗通过增强的ADCC（抗体依赖的细胞毒性）活性提升选择性清除肿瘤内Treg细胞的能力，因而有望打破肿瘤免疫疗法的免疫抑制屏障，克服当前CTLA-4疗法的疗效及毒性瓶颈，成为肿瘤免疫疗法领域的核心产品。 公司持续推进普鲁苏拜单抗针对多种实体瘤的全球开发计划。在针对晚期实体瘤的单药治疗试验以及联合PD-1抑制剂针对黑色素瘤、神经内分泌肿瘤（NEN）和肝细胞癌（HCC）的试验中，公司已获得疗效及安全性积极数据。2024年1月，普鲁苏拜单抗联合PD-1抑制剂治疗晚期结直肠癌的受试者开始入组。 HBM9378是一款靶向胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）的全人源单克隆抗体，由H2L2 Harbour Mice®平台产生，通过阻断TSLP与其受体之间的相互作用来抑制TSLP介导的信号通路。TSLP在DC细胞成熟，Th2细胞极化以及炎性反应方面发挥重要作用，特别是在过敏性气道炎症导致的哮喘方面。与同类靶向TSLP的产品相比，HBM9378具有全人抗体序列，免疫原性风险更低，生物利用度更高，其较长的半衰期优化设计和出色的理化性质使得HBM9378在给药剂量及制剂方面拥有潜在优势。 公司与科伦博泰生物合作，已将HBM9387推进至临床研发阶段。2022年2月，HBM9378获得NMPA批准针对重度哮喘患者的IND申请，在中国启动I期临床试验，并已于2023年10月完成该项试验，目前正在启动II期临床试验。与此同时，针对第二个适应症——慢性阻塞性肺疾病（COPD）的IND申请也正在准备中。 HBM1020是一款临床阶段全球首创靶向B7H7/HHLA2的全人源单克隆抗体，基于Harbour Mice®平台而开发。作为新近发现的B7家族成员之一，B7H7/HHLA2在多瘤种中独立于PD-L1表达，展示出区别于PD-L1的另一种免疫逃逸机制。HBM1020是全球首个进入临床阶段靶向B7H7/HHLA2的产品，凭借其出色的产品设计和靶向特性，有望在实体瘤治疗领域发挥巨大潜力，特别是在PD-L1低表达和PD-(L)1耐药患者中。公司已于2023年5月在美国启动HBM1020的I期临床试验，目前已完成多个剂量水平的试验，其最新进展将于2024年欧洲肿瘤内科学会（ESMO）年会上公布。 随着在肿瘤免疫和免疫学疾病领域的不断深入，基于差异化的抗体开发思路，公司在更多元化的疾病领域持续探索和开发创新且极具挑战性的疗法。 在肿瘤学领域，除了HBM1022 (CCR8)、HBM9014 (一款LIFR靶向疗法) 等单抗项目，还有由HBICE®平台产生的具有新颖设计和差异化机制的双特异性抗体，如HBM7020 (BCMAxCD3)、HBM9027 (PD-L1xCD40)、HBM7022 (CLDN18.2xCD3)、HBM7004 (B7H4xCD3)等。此外，基于Harbour Mice®平台和偶联技术 (XDC) 平台的优势，公司正在探索更多样化的肿瘤治疗模式，已产生了包括HBM9033 (MSLN靶向ADC) 和其他处于早期阶段的多个ADC/RDC项目。 在炎症和免疫学领域，公司建立了强大的临床前研究管线，包括针对2型炎症通路以及其他炎症与免疫性疾病的双特异性和多特异性抗体项目。 诺纳生物：高效驱动价值创造 作为创新抗体平台技术的开拓者和领导者，公司通过加速推进诺纳生物提供Idea to IND（I to ITM）完整服务，不断赋能行业创新者。诺纳生物利用灵活的商业模式和强大的内部研发能力，进一步放大公司及其合作伙伴的互补优势，将平台价值最大化。为了充分发挥独特的平台技术价值，诺纳生物不断探索平台技术应用场景的可拓展性，持续输出影响力。公司已与超过25家行业领导者建立了合作伙伴关系，以持续扩大其在中国和全球的合作网络。 2024年2月，诺纳生物与专注于通过调节免疫系统来开发下一代抗肿瘤疗法的生物技术公司Boostimmune签订合作协议。此次合作旨在利用诺纳生物专有的H2L2 Harbour Mice®抗体平台开发针对创新靶点的抗体偶联药物。 2024年5月，诺纳生物与阿斯利康就临床前单克隆抗体项目达成许可协议，加速肿瘤靶向疗法的开发。根据协议，诺纳生物在交易完成后将获得1900万美元首付款，并有权获得1000万美元可预期的近期里程碑付款，以及高达5.75亿美元开发、监管及商业里程碑付款和基于净销售额的分级特许权使用费。此外，如果阿斯利康行使选择权，诺纳生物将进一步获得相关付款。 2024年7月，诺纳生物宣布与新型聚合物递送平台公司Alaya.bio签订合作协议。双方将基于各自优势，通过精准靶向和原位重编程细胞，以简化CAR-T细胞疗法的开发、生产和给药方式。 诺纳生物持续优化、升级和发展其技术，已建立了强大的抗体发现平台、蛋白质工程平台、偶联技术平台、HCAb-CAR筛选平台，和以mRNA编码靶基因作为免疫原的递送技术平台。利用这一系列抗体技术平台，公司将向全球范围内更新颖、更具挑战性的药物靶点迈进。 关于和铂医药 和铂医药（股票代码：02142.HK）是一家专注于肿瘤及免疫性疾病领域创新药研发及商业化的全球化生物制药企业。公司通过自主研发、联合开发及多元化的合作模式快速拓展创新药研发管线。 抗体技术平台Harbour Mice®可生成双重、双轻链（H2L2）和仅重链（HCAb）形式的全人源单克隆抗体。基于HCAb抗体平台开发的免疫细胞衔接器（HBICE®）能够实现传统药物联合疗法无法达到的抗肿瘤疗效。Harbour Mice®，HBICE®与单B细胞克隆筛选平台共同组成了和铂的下一代创新治疗性抗体研发引擎。 更多信息，请访问： www.harbourbiomed.com