HSPA5

摘要：癌细胞对化疗药物的耐药性大大降低了癌症患者的治疗效果，化疗引起的毒副作用也严重影响了患者的生活质量。茶中主要活性成分表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）与顺铂、5-FU、多柔比星和紫杉醇的联合使用，增强了它们对肿瘤的增敏效果，并对抗了癌细胞的耐药性。这些效应似乎通过多种机制介导，包括对抗癌症干细胞介导的药物耐药性、增强药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡，以及阻断血管生成。此外，EGCG可以通过其抗炎和抗氧化作用，抑制化疗引起的一系列不良反应，如胃肠功能紊乱、肾毒性和心脏毒性，从而改善患者的生活质量。然而，EGCG的生物利用度低、脱靶效应以及与某些化疗药物的反应性限制了其临床应用。EGCG和化疗药物的纳米改性不仅增强了抗肿瘤活性，还延长了荷瘤小鼠的生存时间，并具有低毒性的优势。因此，本综述旨在讨论EGCG与化疗药物联合治疗癌症的现状和挑战。总体而言，EGCG是一个有前景的化疗辅助剂。 1.引言 恶性肿瘤的发病率和死亡率持续上升，已成为对人类生命健康的主要威胁。恶性肿瘤的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，其中化疗在恶性肿瘤治疗中发挥着关键作用。然而，肿瘤细胞常常产生耐药性，使得通过化疗彻底杀死所有肿瘤细胞变得困难，限制了治愈率。目前，现有的癌症化疗药物不仅价格昂贵，还会改变多个信号通路组分的表达水平，从而不可避免地带来不同程度的副作用。这些副作用的产生与化疗药物的剂量和个体对药物的敏感性有关。化疗药物在抑制或杀死肿瘤细胞的同时，也对其正常组织造成一定的损伤。化疗的常见副作用包括胃肠功能紊乱、心脏毒性、神经病变、血管毒性等。这些副作用严重影响了肿瘤治疗效果和患者的生活质量。一些植物化学物质被报道具有化疗增敏作用，并能减少化疗引起的毒性副作用的发展。表儿茶素没食子酸酯（EGCG）就是其中之一。 EGCG是绿茶中最重要的活性成分之一，约占儿茶素化合物的50-60%。EGCG清除自由基，减少氧化损伤，对正常细胞和组织无毒性，但对肿瘤预防和治疗有积极作用。此外，EGCG还被报道能够对抗癌细胞干细胞的耐药性，增强化疗药物的敏感性，从而减少药物用量，缓解胃肠道功能紊乱和肾毒性等副作用，并降低肿瘤引起的恶病质发生率和发展。 尽管EGCG在癌症预防和治疗方面显示出了强大的优势，但其疗效与一线化疗药物相比仍有一定差距，作为单一抗癌药物开发的可能性有限。然而，当EGCG作为辅助化疗药物用于治疗肿瘤时，它们表现出强烈的化疗增敏作用，并减轻化疗副作用（图1），因此有望作为化疗辅助药物使用。本文综述了EGCG与化疗药物联合增强抗癌效果的现状和挑战，并为包含EGCG的组合策略在肿瘤治疗中的发展提供了参考。 图1. EGCG 在辅助化疗中的优势 2.增强化疗效果  单独的EGCG具有强大的抗癌活性，当与化疗药物（5-氟尿嘧啶、塞来昔布、顺铂、多柔比星、他莫昔芬）联合使用时，其协同治疗效果得到放大。这些作用机制包括减少癌细胞干细胞的药物抗性、增强化疗药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡、抑制血管生成，以及诱导抗炎和促氧化效应（图2）。我们将在下面简要阐述这些机制。 图2. EGCG与化疗药物联合作用增强抗肿瘤效果的机制 2.1. 减少癌细胞干细胞的药物抗性 在肿瘤组织的细胞群中，癌细胞干细胞（CSCs）数量较少，但在肿瘤抗性和复发过程中起着重要作用。CSCs通过不对称分裂维持自我更新和多向分化潜能，导致肿瘤细胞继续增殖，并促进肿瘤异质性和多样性的形成。因此，靶向CSCs是预防癌症和克服药物抗性的重要策略。在针对CSCs的研究中，发现EGCG对CSCs药物抗性有积极影响。EGCG单独使用时已显示出对CSCs生长和干性的强烈抑制作用。当EGCG与其他化疗药物联合对抗CSCs时，联合的肿瘤抑制效果比单一作用效果更显著（图2）。这些效应主要是EGCG通过减少CSCs的干性和降低细胞内流出泵活性来降低CSCs对化疗药物的抗性。 集落和球状体形成能力被用作实验指标，以测试CSCs的干性能力。低浓度的EGCG（5μM）未能抑制胰腺导管腺癌的集落和球状体形成，但当与PDE3A抑制剂曲前列醇联合使用时，它降低了FOXO3和CD44蛋白水平，并上调了cGMP表达，导致CSCs形成集落和球状体的能力显著降低。肿瘤抗性通常由增加的细胞内药物流出介导，由膜转运蛋白介导。作为最大的细胞内转运蛋白基因家族，ABC超家族已被报道参与肿瘤的多药耐药性。EGCG可以通过抑制CSC膜上的转运蛋白（ABCC2和ABCG2等）的活性和表达，增加CSCs中的药物浓度，减少药物从细胞中泵出的量，并增强抗癌药物对CSCs的杀伤效果（图2）。在头颈癌、胆管癌和鼻咽癌等癌症的CSCs中发现了这一点。在胶质瘤CSCs中，尽管EGCG对ABCG2表达没有影响，但EGCG下调了另一种膜转运蛋白P-糖蛋白（P-gp），减少了肿瘤细胞的球状体形成和迁移能力，最终增强了化疗药物替莫唑胺对CSCs的杀伤。 除了影响膜转运蛋白的表达外，EGCG还可以通过调节miRNAs的表达来保护CSCs。5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的药物耐药性结直肠癌细胞比亲本细胞具有更强的球状体形成能力。低剂量EGCG与5-FU联合使用抑制了多个自我更新驱动途径，包括Notch和Bmi1、Ezh2和Suz12，通过上调关键肿瘤抑制miRNAs（miR-34a、miR-145和miR-200c）的表达，从而增强了耐药性结直肠癌细胞的凋亡并抑制了球状体形成。在动物实验中，EGCG与5-FU或顺铂的联合使用也可以减少小鼠中各种CSCs的肿瘤体积和重量，如结直肠癌、头颈癌和鼻咽癌。 2.2. 提高药物敏感性 EGCG与化疗药物的结合可以显著降低化疗药物的IC50值（表1），同时减少药物剂量也能显著增强效果。三氧化二砷（ATO）是治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）的有效化疗药物，长期使用可能导致严重的副作用和癌细胞耐药性。EGCG与ATO的结合有效降低了抑制APL HL-60细胞和U937细胞所需的ATO浓度。EGCG增强了三苯氧胺和顺铂在胶质瘤细胞中的增敏效果，并抑制了端粒酶的表达。它还可以通过抑制核酸修复酶ERCC1/XPF的活性，增强各种癌细胞对顺铂的敏感性。EGCG和吉西他滨的结合增强了胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性，促进了凋亡，并显著抑制了移植肿瘤的生长。 EGCG可以通过多种途径增强化疗药物的增敏效果，包括促进药物摄取相关蛋白的表达和抑制药物在细胞内的翻译或流出（图2）。铜转运蛋白1（CTR1）是一种跨膜溶质载体转运蛋白，之前已被证明可以增加顺铂的细胞摄取和敏感性。EGCG在卵巢和肺癌细胞中上调了CTR1的转录和翻译水平，并抑制了癌细胞中顺铂介导的CTR1降解。羰基还原酶1（CBR1）将抗肿瘤药物柔红霉素和阿霉素转化为柔红霉素醇（DNROL）和阿霉素醇（DOXOL），这些新产生的醇代谢产物不仅具有低抗肿瘤活性，还会引起心脏毒性和心肌细胞损伤。EGCG还直接结合肝脏中的CBR1，增加癌细胞中柔红霉素的积累，增强抗肿瘤活性，同时减少DNROL诱导的心脏毒性（图3）。EGCG和萝卜硫素的联合治疗通过时间和剂量依赖性地降低细胞活性并增强顺铂诱导的凋亡和G2/M期阻滞，增强了顺铂在顺铂敏感和顺铂耐药卵巢癌细胞中的疗效。 图3. EGCG 提高癌细胞对多柔比星的化疗敏感性。EGCG 通过抑制 CBR1 和 P-gp 的活性，减少柔红霉素和多柔比星的转化和外排，从而增强抗肿瘤活性并降低心脏毒性。 EGCG可以抑制结直肠癌和肺癌中多药耐药蛋白1（MRP1/MDR1）的活性，并抑制化疗药物从癌细胞中的流出，从而促进细胞内积累。EGCG下调MDR1及其蛋白产物P-gp，减少肝癌细胞中多柔比星（DOX）的流出泵活性（图3）。DOX和EGCG的结合使口腔癌细胞中的DOX浓度增加了51%，并与单独使用DOX相比，增加了肿瘤细胞的凋亡率。进一步研究表明，EGCG通过协同抑制MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路，抑制DOX诱导的P-gp过度表达。在EGCG-三苯氧胺联合测定中，P-gp和乳腺癌耐药蛋白显著受到抑制，增强了乳腺癌细胞对三苯氧胺的敏感性。 2.3. 诱导细胞周期停滞 EGCG和顺铂的联合治疗通过降低多种细胞周期相关基因（cyclin A2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E1）的mRNA表达水平，并增加细胞周期抑制因子p21和DR5的表达（图2），诱导细胞在G1期停滞，并增强胆道癌和非小细胞肺癌（NSCLC）中的凋亡。EGCG衍生物不仅可以增强EGCG的稳定性和生物利用度，还可以促进NSCLC细胞的凋亡，并在与顺铂联合使用时抑制小鼠肿瘤的生长。 EGCG和DOX的结合抑制了肿瘤中磷酸化NF-κB和MDM2的表达，并上调了p53，从而显著抑制了膀胱癌细胞（T24和SW780）的增殖，增强了DOX对癌细胞的凋亡诱导效果，并降低了膀胱癌细胞的迁移能力。EGCG和曲司他丁A的结合通过上调p16表达促进淋巴瘤细胞在G1期停滞，从而减少细胞增殖。与vorinostat单独使用相比，EGCG的联合治疗上调了p21、p27、caspases（3、7和9）和Bax，并抑制了cdk2、cdk4、cyclin A、NF-κB和Bcl2的活性，从而显著降低了黑色素瘤细胞的增殖并促进了它们的凋亡。 2.4. 诱导凋亡 EGCG和顺铂的结合抑制了头颈鳞状细胞癌的形成并增强了细胞凋亡。EGCG减轻了化疗药物吉非替尼诱导的CYP1A1/CYB1B1、EGFR、cyclin D1、p-Akt（Ser473）和survivin在转录和翻译水平上的表达增加，并增强了p-p53（Ser15）的表达（图2），从而增强了吉非替尼对苯并[a]芘诱导肺癌的治疗效果。EGCG还降低了EGFR的磷酸化水平，抑制了乳腺癌细胞中的AKT信号，并增强了雷洛昔芬诱导的癌细胞凋亡。此外，EGCG与三苯氧胺在小鼠中的结合通过抑制mTOR和EGFR的表达，减少了肿瘤体积71%和肿瘤重量80%。EGCG和博来霉素的结合显著促进了Mia Paca-2胰腺癌细胞的凋亡。EGCG和丁酸钠的结合也在结肠癌细胞中诱导了细胞周期停滞、凋亡和DNA损伤。 EGCG与紫杉醇（例如，紫杉醇和多西他赛）的结合上调了p53和caspase-3，增加了前列腺癌细胞的凋亡率，并使肿瘤携带小鼠的无病生存率提高到90%。EGCG与5-FU的结合可以通过抑制葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的表达来阻断5-FU的流出，激活NF-κB信号，增强miR-155-5p的表达水平，并进一步抑制靶基因MRP1的表达。5-FU的积累导致caspase-3和PARP激活，Bcl-2降低和Bad增加，最终导致结肠癌细胞的凋亡。EGCG和阿霉素的结合也下调了bcl-2并增加了bax和caspase-3的表达，从而促进了食管癌细胞的凋亡。EGCG结合GRP78并将其从活性单体转化为非活性二聚体和寡聚体，干扰了抗凋亡GRP78-caspase-7复合体的形成，导致依托泊苷、紫杉醇和长春新碱诱导的癌细胞凋亡增加。EGCG和ATO的结合显著诱导了HL-60细胞的线粒体依赖性凋亡，凋亡细胞占总死亡细胞的70%以上。 NS-398和化疗药物塞来昔布都是环氧化酶-2（COX-2）抑制剂，EGCG和NS-398的联合治疗促进了前列腺癌细胞（LNCaP、PC-3和CWR22Rnu1）中Bax、pro-caspase-6和pro-caspase-9以及裂解的PARP的表达，并降低了前列腺特异性抗原和IGF-I水平，从而诱导凋亡并抑制小鼠肿瘤的生长。单独的EGCG或塞来昔布都没有诱导PC-9肺癌细胞中DNA损伤基因GADD153的表达，而联合治疗通过ERK信号通路上调了GADD153，从而促进了肺癌细胞的凋亡。 肝源性生长因子（HDGF）是一种分泌的肝素结合生长因子，调节肿瘤侵袭和转移，并促进血管生成。EGCG和顺铂的结合可以破坏线粒体膜电位，并通过下调HDGF上调caspase-3和caspase-9，从而诱导NSCLC细胞凋亡（图2）。EGCG还通过下调Axl和Tyro 3的表达抑制顺铂耐药肺癌细胞的增殖。此外，EGCG可以通过抑制hsa-miR-98-5p的表达并进一步上调p53，增强顺铂对NSCLC细胞的治疗效果。 2.5. 抑制血管生成 EGCG显著抑制了semaxanib诱导的内皮素过度表达，并抑制了肿瘤血管生成，为解决对抗VEGF疗法的抗性提供了新策略。EGCG治疗导致微血管密度、微血管周细胞覆盖指数和胶原IV表达降低；血管灌注和通透性的短暂增加；间质液压力和缺氧降低。在顺铂诱导的血管正常化期间共同给予顺铂，显著降低了在肿瘤组织中诱导效果所需的顺铂药物浓度（1.8 μg/g组织对比0.8 μg/g组织，P < 0.01），并抑制了移植肺肿瘤的生长。使用聚乙二醇（PEG）偶联的EGCG（PEG-EGCG）作为载体制备的载药胶束纳米复合物（SU-MNC），也能特异性地抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖。 2.6. 抗炎和促氧化效应 EGCG与塞来昔布联合使用，降低了胰岛癌细胞（Colo357）中IL-6、IL-8、VEGF和MMP-2的表达，并减弱了塞来昔布诱导的COX-2表达增加，减少了细胞炎症水平。这种组合在偶氮甲烷加硫酸葡聚糖钠诱导的结肠癌发生模型中也显示出类似的抗炎效应。核因子E2相关因子2（Nrf2）是一个重要的细胞保护性转录因子，在抗氧化和解毒过程中发挥关键作用。激活Nrf2-Keap1通路诱导相II酶的表达，并通过ARE信号通路阻止癌症发展。EGCG和顺铂的组合通过上调Nrf2/HO-1表达增强了凋亡，从而抑制了宫颈癌和乳腺癌的发展。此外，EGCG和顺铂的组合可以促进各种卵巢癌细胞系中H2O2的表达，加剧氧化应激以放大顺铂的毒性，从而抑制卵巢癌细胞的生长。 3.减少化疗副作用  长期化疗药物的使用除了药物抗性外，还可能导致某些有毒副作用（如胃肠疾病、心脏毒性、肾毒性、耳毒性、神经毒性等），从而限制了药物的有效性和治疗效果。EGCG不仅作为出色的辅助化疗增强剂，而且在减少化疗药物用量和增强抗肿瘤治疗效果的同时，减轻了化疗药物引起的有毒副作用。 3.1. 胃肠疾病 化疗引起恶心、呕吐、食欲减退等副作用，主要是由于药物或辐射对胃肠道细胞的损伤，导致胃肠道粘膜炎症。EGCG通过减少氧化损伤，改善了小鼠中伊立替康引起的胃肠副作用。接受同期放疗的不可切除III期NSCLC患者经常发生食管炎，这可能导致治疗中断并影响肿瘤治疗。在一项包括24名AJCC IIIA（6名）和IIIB（18名）期患者的研究中，化疗（顺铂和依托泊苷）与放疗（中位剂量64 Gy）同时进行。经过EGCG治疗（平均治疗持续时间34.8天，建议EGCG浓度440 μmol/L），在24名患者中有22名观察到食管炎显著回归至0/1级。 3.2.心脏毒性 阿霉素诱导的活性氧物种产生是心肌病的主要原因，也是限制其临床使用的主要副作用[68,69]。EGCG可以通过靶向结合抑制CBR1活性，进一步减少DOX的乙醇代谢产物DOXOL的产生，并减少DOXOL在心肌细胞中的损伤。EGCG还通过清除活性氧（ROS）和增强心肌细胞中Ca2+瞬态的幅度来减轻DOX诱导的心脏毒性。EGCG和DOX的联合给药显著抑制了肿瘤生长，同时减少了心肌Ca2+超载和乳酸脱氢酶释放，减轻了心肌细胞凋亡，从而降低了DOX的心脏毒性。与DOX和EGCG共载的多离子复合胶束增强了联合药物的稳定性，胶束核心中的EGCG除了抑制P-gp表达和逆转癌细胞的多药耐药性外，还保护心肌细胞免受DOX介导的心脏毒性。 3.3.肾毒性 顺铂诱导的肾毒性与肾脏中氧化应激和炎症细胞因子的增加有关。Nrf2和HO-1表达水平降低，顺铂处理的大鼠中NF-κB和4-羟基壬醛水平显著增加。EGCG逆转了这些顺铂介导的变化，并增强了肾脏抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）和谷胱甘肽的活性，从而减少肾脏氧化应激和炎症反应，并改善顺铂诱导的肾毒性。另一方面，EGCG减轻了顺铂诱导的线粒体氧化/硝化应激、线粒体电子传递链活性和线粒体抗氧化防御酶活性的线粒体损伤，并减少了肾小管细胞中线粒体ROS的产生，而PAS染色显示EGCG改善了顺铂诱导的肾脏结构损伤，如小管扩张、小管形成、颗粒空泡变性和小管细胞坏死。EGCG和CoQ10的多剂量组合也通过改善肾脏氧化/硝化状态、炎症和凋亡减轻了顺铂介导的肾毒性的发展。 3.4.耳毒性 除了肾毒性外，耳毒性是限制顺铂在临床实践中进一步使用的另一种有毒副作用。顺铂的耳毒性基于对耳蜗外毛细胞、螺旋神经节和血管纹的损害，包括不仅由药物本身引起的内外部环境的变化，还包括其激活caspase途径引起的凋亡。在大鼠中口服EGCG减轻了顺铂诱导的听力损失，减少了耳蜗基底区外毛细胞的丢失，并减少了氧化应激和凋亡标志物。它还保护了与内毛细胞相关的血管纹和螺旋韧带中的Na+/K+腺苷三磷酸酶（ATPase）α1的丢失以及与丝带突触相关的。体外研究发现，顺铂通过ROS/MAPK途径激活STAT1，降低磷酸化STAT3水平并减少p-STAT3/p-STAT1水平，从而诱导耳蜗炎症和凋亡。相比之下，EGCG通过抑制STAT1表达和保护p-STAT3，增加p-STAT3/p-STAT1比例，并调节bcl-2等促生存因子的表达，促进耳蜗细胞存活。 3.5.神经毒性 神经毒性通常与使用基于铂的药物、长春碱和紫杉醇类药物有关。EGCG对大鼠顺铂诱导的神经毒性的保护机制包括下调炎症因子TNF-α和IL-6的表达以减少大脑皮层的炎症负荷；激活抗氧化Nrf2/HO-1通路以减少NF-κB表达；下调与凋亡相关的蛋白Bax和caspase-3并增加抗凋亡因子Bcl-2的表达以减少大脑皮层的凋亡；最后，上调脑源性神经营养因子和乙酰胆碱酯酶并抑制乙酰胆碱表达以保护大脑皮层免受顺铂诱导的神经化学紊乱。 3.6.肺纤维化 博来霉素是一种诱导DNA损伤的化疗药物，长期使用可能导致肺纤维化的发展。EGCG显著下调了博来霉素诱导的炎症因子NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达水平，增加了抗氧化调节因子Nrf2的表达，并促进了体内氧化还原动态平衡，同时减少羟脯氨酸和胶原蛋白的合成和积累，从而改善了博来霉素诱导的肺纤维化。另一方面，EGCG还促进了博来霉素诱导的糖结合物恢复正常水平，并增加了基质降解溶酶体酶的活性。电子显微镜的超微结构观察还发现EGCG促进了肺泡II型细胞的空泡化和核收缩，并减少了胶原蛋白沉积。 4.辅助化疗的限制  尽管EGCG已经显示出与化疗药物的强烈辅助作用，增强了化疗效果，但EGCG和某些化疗药物也存在一定的拮抗作用，降低了化疗效果。硼替佐米是一种用于治疗多发性骨髓瘤的临床蛋白酶体抑制剂。由于硼替佐米的硼酸成分可以与EGCG的儿茶酚反应形成环状硼酸酯（图4），EGCG与硼酸基抗癌药物如硼替佐米的组合可能导致药物失活。由于它们的共同特征，任何含有儿茶酚或间苯二酚结构的化合物都不应与硼酸基药物同时服用。在EGCG与舒尼替尼联合使用的研究中，口服EGCG也被发现降低了舒尼替尼的生物利用度。EGCG还被报道通过减少丁酸诱导的癌细胞分化，降低了丁酸对结肠癌细胞的治疗效果。因此，需要进一步研究EGCG与不同化疗药物之间的相互作用，并确定临床上合适的组合治疗策略。 图4. 硼替佐米与 EGCG 的相互作用。A). 硼替佐米和 EGCG 的化学结构。B). 硼替佐米与 EGCG 的结合模式。C). 在酸性条件下，硼替佐米、EGCG 和 Fe3+ 纳米材料可以重新释放。 EGCG的口服生物利用度低也是限制其进一步应用的原因之一。大多数细胞实验中使用的EGCG浓度为10-100 μM，而口服3克脱咖啡因绿茶后的最大血药浓度(Cmax)为0.7 μM，增加剂量至4.5克并未显著增加Cmax值，表明存在饱和现象。在大多数研究中，EGCG只有在动物或人类胃消化后达到20-100 μM或更高浓度时才有效。例如，在前列腺癌患者的临床试验中，患者在手术前3-6周服用EGCG（800毫克/天），结果显示组织中无法检测到EGCG的存在。因此，如果要在临床试验中观察到体外实验的结果，就需要考虑儿茶素的生物利用度。这是因为EGCG在口服给药能达到的低生理浓度下的生理效应将非常有限。特别重要的是提高EGCG的稳定性和生物利用度。 5.纳米改性增强化疗效果  近年来，微囊化和纳米囊化技术作为提高EGCG稳定性和生物利用度的技术手段受到了广泛关注[87]。EGCG与化疗药物结合，通过纳米材料包封的组合药物的缓慢释放和靶向研究已经相当深入（表2）。EGCG与化疗药物的纳米改性不仅发挥其自身的抗肿瘤效应，减轻化疗的有毒副作用，还通过引入纳米材料增强了组合物的稳定性，减缓释放，并增强了药物动力学参数。它还具有低毒性、肿瘤靶向和定位成像能力的优势（图5）。其中，EGCG与DOX的组合是研究最深入的儿茶素相关二元组合策略。 图5. 包裹化疗药物和 EGCG 的纳米材料的多重有益效应 5.1.聚合物纳米粒子 通过抗乳腺癌药物赫赛汀与EGCG和PEG的自组装形成的胶束纳米复合物Herceptin-MNC，在肿瘤中的积累比游离赫赛汀多2.3倍，赫赛汀-MNC的血液半衰期比后者高29倍，而赫赛汀-MNC在肝脏、肾脏和肺部的积累速率比游离赫赛汀低1倍，表明基于EGCG的组合疗法比单一化疗药物具有更好的抗癌效果。使用PEG偶联的EGCG（PEG-EGCG）作为载体形成SU-MNCs，与口服/静脉注射舒尼替尼相比，在人类肾细胞癌异种移植小鼠中产生了更强的抗癌效果（更强的抗血管生成、诱导凋亡和抑制肿瘤增殖效果）和更低的毒性（图5）。DOX和EGCG之间的高效相互作用在PEG-EGCG胶束纳米复合物中实现了DOX的88%药物载荷，提高了DOX的循环稳定性和肿瘤靶向性，同时减少了DOX剂量依赖性副作用。 海藻酸具有对P选择素的强亲和力，诱导凋亡并抑制癌细胞增殖；透明质酸（HA）通过范德华力和氢键与癌细胞膜表面糖蛋白CD44结合。d-α-生育酚PEG琥珀酸酯（TPGS）通过阻断ATP结合位点并防止P-gp ATPase水解ATP来抑制ATPase活性。使用上述三种组分装载EGCG和DOX的纳米药物靶向胃癌治疗，比EGCG/DOX组合疗法显示出更好的抗肿瘤效果。装载EGCG/DOX的NPs的IC50为200/4 mg/L，是EGCG/DOX组合溶液（400/8 mg/L）的一半，纳米药物中DOX的细胞摄取率为60.42% ± 1.56%，远大于裸药中Dox的摄取率（28.62% ± 0.97%）。然而，将EGCG和多西他赛封装在TPGS偶联的透明质酸和海藻酸基纳米粒子中，纳米粒子通过靶向识别CD44和P选择素配体内化进入前列腺癌细胞，诱导G2/M期细胞周期停滞。进一步研究表明，纳米粒子比EGCG和多西他赛的组合显著更多地抑制肿瘤生长（53%对比31%），并且对非靶向器官无毒性。由HA-EGCG/顺铂偶联制成的胶束纳米复合物，其中HA暴露在表面，有效地传递到过度表达CD44的癌细胞，增加了纳米复合物在卵巢癌中的积累并延长了血液循环时间。通过铂纳米粒子和EGCG的pH可逆硼酸酯反应制备的基于酚的肿瘤渗透纳米框架（EGPt-NF），不仅诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡和缓解肿瘤缺氧，还有效促进了树突细胞的成熟并下调癌细胞中的PD-L1，从而显著抑制了小鼠肿瘤的生长和转移。 光热疗法在控制药物释放、减少多药耐药和提高疗效方面具有很高的应用潜力，是抗癌治疗的有希望的策略。由叶酸（FA）、多巴胺（DPA）、DOX和EGCG开发的双重药物输送系统DOX-EGCG/DPA-FA NPs，在近红外光（NIR）组中DOX的细胞摄取率是游离DOX组和无NIR照射的对照组的三到六倍。DOX-EGCG/DPA-FA NPs通过抑制肿瘤生长和血管生成，增强乳腺癌细胞中的凋亡和坏死，提高了60%的乳腺癌小鼠存活70天以上，从而提高了治疗效果。由氧化铁、靛青绿和葡萄糖氧化酶合成的磁性光热剂（ICGOx@IO）装载了DOX和EGCG，最终开发了纳米药物ICGOx@IO-Dox-EGCG-PPP，结合化学-光热-饥饿疗法几乎消除了小鼠的肿瘤，并显著减少了Dox诱导的心脏毒性。 5.2.金属纳米粒子 甲氨蝶呤（MTX）和DOX与含有EGCG的花状金纳米簇通过半胱氨酸桥结合，形成了有效的药物输送系统（Au-Cys-MTX/DOX NCs），纳米复合物在体外和体内都显示出良好的抗肿瘤活性，因为MTX的引入为纳米药物提供了良好的靶向。由EGCG、铁离子和DOX自组装而成的纳米粒子与单独的DOX相比，肿瘤体积减少了66%，转移结节减少了73.7%，表明药物输送系统显著抑制了肿瘤的生长和转移，而铁离子作为磁共振成像（MRI）的优秀对比剂，为药物输送系统的准确定位提供了潜力。 使用Fe3+与多酚的配位将DOX和EGCG自组装成FDEP NPs，增加了药物在血液中的循环时间和其在肿瘤内的积累。FDEP NPs的循环半衰期是单独DOX的36倍以上。FDEP30 NPs对小鼠肿瘤形成的肿瘤生长抑制率为74.38%，显著高于DOX + EGCG（44.13%）。末端脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）对肿瘤切片的染色显示，FDEP30 NPs和DOX + EGCG的凋亡/坏死率分别为45.06%和27.9%。有趣的是，FDEP NPs在显著降低CBR1活性、减轻DOXOL产生和随后的心脏毒性的同时，抑制了肿瘤生长并促进了凋亡。 包括DOX、EGCG、Fe3+和HA的自组装纳米反应器，可以穿透血脑屏障靶向胶质母细胞瘤并抑制肿瘤生长，从而延长了携带肿瘤的小鼠的生存时间。尽管以前的研究报告称EGCG可以与硼替佐米复合以抵消后者的抗肿瘤效应，但最近的研究显示这种拮抗效应可以通过纳米技术逆转。由EGCG、硼替佐米和Fe3+组成的纳米药物可以促进纳米粒子在肿瘤部位的释放，由于肿瘤微环境的弱酸性，具有低毒性和肿瘤定位功能，并最终显著抑制了MDA-MB-231细胞携带肿瘤的小鼠的肿瘤生长（图4）。 由EGCG与5-羟基多巴胺修饰的顺铂(IV)前药(Pt–OH)、含多酚链段的嵌段共聚物(PEG-b-PPOH)复合制备的有机纳米治疗药物(PTCG NPs)，设计用于使纳米粒子聚乙二醇化，从而延长纳米粒子的循环时间，抑制蛋白吸附，并增强所获纳米药物在肿瘤中的积累（图5）。由于Fe3+与多酚基团之间的强配位作用，PTCG NPs中Pt–OH和EGCG的载药比例可以精确调节至治疗水平，从而实现协同效应。此外，纳米粒子可以掺杂钆离子(Gd3+)，借助MRI功能监测纳米药物的递送和释放行为，赋予纳米药物诊断能力。在低pH环境下，活性药物通过亚胺连接键的断裂和Pt–OH激活为顺铂，在HepG2细胞内化后有效释放。生成的顺铂通过级联反应提高细胞内H2O2水平，由Fe3+催化产生有毒的活性氧(ROS)，从而通过化学动力疗法增强疗效。 5.3.其他类型的纳米粒子 通过将生物相容性的介孔硅纳米粒子与天然多酚涂层结合，并装载抗肿瘤药物DOX，开发的给药系统MSN-Dox@EGCg-Apt，旨在在酸性环境或细胞内GSH的刺激下向肿瘤病灶释放药物；该系统允许实时荧光追踪，对正常细胞无毒，即使在500 μg/mL的高浓度下也不影响CEM、Ramos和K562细胞的活性。在PLGA-酪蛋白核壳中包裹紫杉醇与EGCG的纳米药物表现出比游离紫杉醇更长的循环时间、更好的可用性，并且没有器官毒性。该纳米药物降低了紫杉醇诱导的P-gp表达，增加了对紫杉醇耐药的MDA-MB-231细胞的紫杉醇敏感性，诱导凋亡，抑制NF-κB激活，并下调与血管生成、肿瘤转移和存活相关的关键基因。多酚胶体球(CSs)是由EGCG在水溶液中分子凝聚自组装而成，但在有机溶剂中分解并在水溶液中重新组装。重新组装的CSs/DOX的最大包封率和载药率达到90%和44%，该纳米药物可以逆转肿瘤细胞的耐药性，增强对乳腺癌的治疗效果。重要的是，单次生产运行产生了37.3克多酚CSs，为重组纳米药物的规模化应用奠定了基础。基于EGCG和熊果酸的纳米载体系统可以靶向EpCAM释放至肝细胞癌，可以增加CD4+和CD8+ T细胞的激活及其在肿瘤组织中的免疫浸润，从而产生显著的协同抗肿瘤治疗效果。 总之，EGCG和化疗药物的纳米化可以显著增强抗肿瘤治疗的效果，但在考虑EGCG和化疗药物的纳米组装时，需要精心设计纳米药物的形状、大小和靶向策略。形状和大小是纳米粒子的重要参数，球形颗粒最为常见。直径大于5 μm的颗粒在静脉注射后会引起肺部毛细血管栓塞。直径大于0.2 μm的颗粒不能通过过滤方法进行灭菌。网状内皮系统更快地清除大颗粒，并且不能通过血管外渗逃离血管系统。直径小于5 nm的颗粒可以被肾脏过滤迅速清除。纳米药物的靶向策略包括主动靶向和被动靶向。被动靶向在很大程度上依赖于肿瘤生物学(血管和渗漏性)和药物载体属性(循环时间、孔隙性和大小)。而主动靶向依赖于配体-受体结合，这提高了对目标部位的选择性积累。例如，可以向纳米粒子中添加HA或FA，以增强纳米药物的靶向，利用肿瘤细胞中CD44和叶酸受体的高表达。此外，向纳米粒子中添加金属离子(Fe3+, Gd3+)可以使纳米药物的递送和释放通过MRI检测。尽管基于EGCG和化疗药物的纳米药物很有前景，但目前还缺乏体内安全性研究，大多数现有研究集中在细胞和小鼠实验上。这些实验结果是否能够在临床环境中复制还有待进一步探索。纳米材料的质量稳定性和储存条件也需要进一步研究。 6.结论和未来展望  体外和体内实验表明，EGCG可以与多种化疗药物（如5-FU、顺铂、多柔比星、紫杉醇和他莫昔芬）联合使用，增强抗肿瘤治疗效果。这些作用机制包括减少CSCs的药物抗性、增强药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡、减少细胞自噬调节、阻断血管生成以抑制癌细胞侵袭和转移、抑制炎症和调节氧化应激。此外，EGCG可以减少化疗药物引起的胃肠疾病、心脏毒性、肾毒性、耳毒性、神经毒性和肺纤维化的发生率。但需要注意的是，EGCG可以与某些化疗药物（硼替佐米和舒尼替尼）结合，降低化疗效果。尽管EGCG可以通过多种方式增强化疗药物的治疗效应，但目前对EGCG的作用机制和进一步的药物学优化研究还不足。此外，由于基本上没有研究报告EGCG和化疗药物在临床治疗中一起使用，EGCG辅助化疗的概念应该在可能性/展望和临床验证方面得到更多关注。同时，考虑到EGCG的生物利用度低，我们探索了将纳米技术应用于EGCG化疗药物策略以增强化疗效果的可能性。共载EGCG和化疗药物的纳米粒子增强了药物的药代动力学和循环时间，增加了肿瘤细胞中药物的浓度，显著抑制了肿瘤的生长和转移，对非靶向器官表现出低毒性，并最终显著延长了小鼠的生存时间。总之，EGCG是化疗的良好辅助剂；利用纳米技术双重载药EGCG和化疗药物进行靶向肿瘤治疗，提高了EGCG的临床应用价值，突出了EGCG治疗策略作为有前景的研究方向。

摘要:凋亡是一种程序化和受控的细胞死亡形式，它占生物加工过程中细胞死亡的大多数。细胞死亡影响培养的寿命和产品质量；它是由生物反应器内细胞经历的多种压力引发的。了解导致凋亡的因素以及开发能够保护细胞的策略对于稳健的生物加工开发至关重要。本综述旨在：a) 从生物加工的角度探讨凋亡；b) 描述重要的凋亡机制，并将它们与生物反应器中遇到的最相关的压力联系起来；c) 讨论设计操作条件以避免细胞死亡；d) 聚焦于工业相关的细胞系；以及 e) 提出包括细胞工程和基于模型的生物加工优化在内的抗凋亡策略。此外，还强调了凋亡在从克隆筛选到生产规模的质量设计生物加工开发中的重要性。 1.引言 在快速增长和竞争激烈的生物制剂市场中，生物加工优化至关重要。一个优化的生物加工将涉及高产细胞培养和最小的凋亡压力。培养活性对于确定培养寿命至关重要，通常由活性截止点决定，超过该点产品质量将受到影响。存在三种主要的细胞死亡途径：坏死、自噬和凋亡。据报道，凋亡是所有工业相关细胞系中死亡的主要原因，在中华仓鼠卵巢（CHO）细胞中占细胞死亡的80%和TB/C3杂交瘤细胞培养中的90%。阐明凋亡及其构成机制对于提高培养寿命和产品滴度，同时保持高产品质量至关重要。本综述着重于与凋亡相关的生物加工开发挑战，通过：a) 介绍凋亡细胞死亡的主要机制；b) 检查各种生物加工变量和操作条件对凋亡压力的影响；c) 确定影响生物加工的压力；以及d) 讨论两种方法——细胞系工程和凋亡建模——作为传统基于实验的方法的替代，用于最佳操作设计（图1）。 图1. 凋亡的生物过程策略：a) 传统方法，基于实验优化培养条件，b) 细胞系工程方法，旨在产生抗凋亡细胞系，以及 c) 虚拟方法，将生物学机制整合到数学模型中，以实现基于模型的优化。 2.细胞死亡的生物学 2.1.凋亡的生物学 在凋亡中，内部和/或外部刺激引发一系列高度控制的反应，最终导致细胞死亡。参与凋亡的两组最重要的蛋白质，半胱天冬酶和Bcl-2（B细胞淋巴瘤2）家族蛋白，参与所有凋亡细胞死亡途径。半胱天冬酶是依赖半胱氨酸的内切蛋白酶，催化肽键的断裂。大多数半胱天冬酶以单体形式产生，活性很小或没有活性，通常称为前半胱天冬酶或酶原。激活后，它们同源二聚体形成生物活性蛋白。在小鼠或人类细胞中已报告有14种半胱天冬酶（编号1至14），对生物加工很重要。此外，还在小鼠或人类以外的哺乳动物细胞基因组中鉴定出四种其他半胱天冬酶（编号15至18），其中半胱天冬酶16是一个假基因（不翻译）。大多数半胱天冬酶可以根据其作用分为三组：a) 起始半胱天冬酶（半胱天冬酶8和9）；b) 执行者半胱天冬酶（半胱天冬酶3、6和7）；c) 参与炎症的半胱天冬酶（半胱天冬酶1、4、5、11和12L）。半胱天冬酶-2没有被分类，因为它与起始和执行者半胱天冬酶共享结构元素，是半胱天冬酶3和8的已知底物，也可以通过激活细胞色素C释放来触发凋亡体的形成。半胱天冬酶-2也可以被p53的下游靶标激活。半胱天冬酶-10的作用尚未完全阐明，它由半胱天冬酶-6激活，以及半胱天冬酶12S和14也仍未分类。半胱天冬酶级联反应一旦被触发，就会自我催化，如图2所示。 图2. 凋亡途径概述。已确定的五条主要途径包括：(1) 由外部刺激激活的外源性途径；(2) 由Bax通道促进的MOMP激活的内源性途径（Taylor等人，2008年）；(3) DNA损伤诱导的依赖caspase-2的途径；(4) 由Granzyme B诱导的途径，其中该分子作为caspase-3的诱导剂；以及 (5)由Granzyme A诱导的途径，其中不涉及任何caspases - Granzyme A诱导一种DNase，该酶诱导DNA片段化和细胞死亡。 Bcl-2家族蛋白（图2）在凋亡调节中起着重要作用，具有促进和抑制凋亡的活性，可以分为三个亚组。抗凋亡组包括Bcl-2、Bcl-xL（B细胞淋巴瘤超大）、Bcl-W（Bcl-2样蛋白2）、Mcl-1（诱导髓样白血病细胞分化蛋白）、Bcl2A1（Bcl-2相关蛋白A1）和Bcl-B（与Boo蛋白氨基酸序列相似的Bcl-2样蛋白）。这些蛋白有四个Bcl-2同源结构域（BH1、BH2、BH3和BH4）。除了Bcl2A1，所有其他成员都有跨膜结构域，通常与细胞、核或线粒体膜相关联。第二组由Bax（Bcl-2相关蛋白X）、Bak（Bcl-2同源拮抗剂杀手）和Bok（Bcl-2相关卵巢杀手）组成，缺乏BH4结构域。最后，第三组只有BH3结构域，由Bik（Bcl-2相互作用杀手）、Hrk（Harakiri）、Bim（Bcl-2样蛋白11）、Bad（Bcl-2相关死亡促进因子）、Bid（BH3相互作用域死亡激动剂）、PUMA（p53上调凋亡调节因子）、NOXA（Phorbol-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯诱导蛋白1）和Bmf（Bcl-2修饰因子）组成。BH4缺乏和仅有BH3结构域的蛋白在过表达时是促凋亡的。 已确定五种主要的凋亡途径，其中提出了多种途径。外源途径（通常称为类型I）由细胞外部刺激触发。死亡配体（如FasL或肿瘤坏死因子α，TNFα）与细胞膜上的受体结合，触发半胱天冬酶-8的激活，从而启动凋亡（图2）。内源途径（通常称为类型II或线粒体途径）由内部刺激（代谢或缺氧压力）激活，也可以由内质网应激触发。凋亡类型II触发的内部刺激促进半胱天冬酶和Bcl-2家族的促凋亡成员的激活（图2），通过Bax通道导致线粒体外膜通透性（MOMP）增加。Bax激活SMAC（线粒体来源的第二种半胱天冬酶激活剂），抑制XIAP（X连锁凋亡抑制蛋白）的抗凋亡活性。反过来，MOMP导致细胞色素C的释放，这诱导了凋亡体的形成，由七个半胱天冬酶-9单元组成的复合体。半胱天冬酶-9将触发一个执行者半胱天冬酶（3或7），确保过程的连续性。Bcl-2家族的抗凋亡成员（例如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1）能够通过抑制其促凋亡对应物的活性来抑制凋亡。在这个过程中，外源途径的激活也可以通过半胱天冬酶-8激活Bid发生。相反，外源途径作为内源途径的下游效应可能在p53激活CD95时发生。第三种途径依赖于半胱天冬酶-2的存在，它可以在持续DNA损伤时被肿瘤抑制基因p53激活。凋亡也可以通过Granzyme B直接激活半胱天冬酶-3触发。最后，由Granzyme A促进的DNA片段化也可以导致凋亡。对CHO细胞的蛋白质组学研究表明，内源途径是培养中最重要的凋亡驱动因素。它可以直接与生物反应器的操作条件联系起来，使其在生物加工中很重要，因为它可以被营养物质缺乏、过量蛋白质生产、温度或pH变化和高渗透压等触发。 凋亡的调节是通过蛋白质-蛋白质相互作用实现的，可能涉及第三个蛋白质作为介导。没有介导的蛋白质-蛋白质相互作用的例子包括Bax蛋白的BH3结构域产生四聚体，在线粒体膜上形成通道，或Bcl-2抑制Bax通道形成。相比之下，Bcl-2或Bcl-xL与半胱天冬酶-8之间的相互作用需要BAP31（Bcl-2相关蛋白31）的介导。内源途径导致由线粒体膜上的Bax通道或钙离子引起的线粒体外膜通透性（MOMP）。MOMP反过来会导致许多促凋亡分子的释放，如细胞色素C。如图2所示，半胱天冬酶-3在凋亡中起着重要作用，可以由起始半胱天冬酶8和9或Granzyme-B激活。一旦激活，它会反激活上游半胱天冬酶以确保过程的连续性。半胱天冬酶-3也是CAD（半胱天冬酶激活的DNase）的激活剂，它在增殖细胞中与其抑制剂形成复合体。当半胱天冬酶-3过表达时，该复合体会被切割，CAD降解染色体DNA，当聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）被半胱天冬酶-3（或7）抑制时也会发生这种情况。在晚期凋亡期间，半胱天冬酶-3作为细胞骨架重组和解聚诱导剂，导致凋亡小体的形成。尽管半胱天冬酶-3被认为是凋亡中必不可少的，但已经表明不表达半胱天冬酶-3的人类MCF-7乳腺癌细胞仍然可以经历凋亡。实际上，已经鉴定出一种由Granzyme A介导的半胱天冬酶独立途径，其中Granzyme A诱导DNA片段化导致细胞死亡。 在凋亡过程中，细胞的几种结构特征会发生变化：许多细胞骨架成分被降解导致膜泡形成；核层被破坏导致核膜塌陷、DNA片段化和染色质浓缩；形成含有完整细胞器的凋亡小体，随后被巨噬细胞降解；线粒体膨胀和伸长。尽管这些特征中的一些可以通过光学显微镜观察到，但这种技术不如流式细胞仪准确，流式细胞仪通常更受青睐用于凋亡监测。流式细胞仪已被用于分析DNA、RNA、线粒体膜电位和细胞膜完整性，两种染料的组合，荧光素-Annexin V和7-氨基放线菌素D（7AAD），已用于区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞。在某些条件下，凋亡可以逆转，如在多种细胞系中去除凋亡刺激后报道的那样。还有人提出DNA损伤诱导p53（一种肿瘤抑制基因），反过来同时诱导DNA修复、细胞周期停滞和凋亡停滞。此外，即使在由促凋亡蛋白诱导DNA损伤后，晚期凋亡也可能是可逆的。Anastasis（希腊语意为“复活”）被提议为细胞“复活”过程的名称。建议的逆转机制需要一组几种蛋白质，逆转凋亡后观察到一些遗传变化，包括染色体畸变和数量。 2.2.其他形式的细胞死亡 尽管凋亡是哺乳动物细胞培养中主要的细胞死亡形式，其他机制，特别是在细胞培养后期，也可能有所贡献。这些包括自噬和坏死性凋亡，下面简要描述（图3）。自噬是一种将细胞质物质运送到溶酶体进行降解的细胞死亡形式。尽管自噬被认为是一种细胞存活机制，但最近的研究表明自噬可以促进细胞死亡。在自噬过程中，隔离膜形成，通常位于线粒体/内质网接触区域。Beclin-1和液泡蛋白分选34（VPS34）促进隔离膜的成核；几个细胞器可能被招募到这种生长膜的内侧，包括线粒体、高尔基体和内质网。蛋白质轻链3（LC3）通过一组自噬相关蛋白（ATG）附着在隔离膜上。LC3将促进识别自噬体，然后与溶酶体融合以破坏细胞成分。这种细胞死亡形式最初由Hwang和Lee在葡萄糖和谷氨酰胺缺乏时在CHO细胞培养中观察到。自噬可能通过ATG5激活半胱天冬酶-8触发外源途径的凋亡。有趣的是，抗凋亡蛋白Bcl-2也是Beclin-1的抑制剂。虽然这种相互作用阻止了自噬，但它并不抑制Bcl-2的抗凋亡作用。BH3-only蛋白抑制Bcl-2/Beclin-1相互作用，从而促进自噬。一个例外是BIM，它将Beclin-1错误定位到动力蛋白轻链1（DLC1），阻止自噬。自噬也可能在凋亡的终末阶段通过Beclin-1切割被半胱天冬酶-3抑制，如图3A所述。另一种越来越受关注的细胞死亡形式是坏死性凋亡。当死亡受体被配体激活时，受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）被激活。这种蛋白反过来激活RIPK3，触发坏死性凋亡。由这些（RIPK1和RIPK3）和其他蛋白质形成的复合体称为坏死体，已知它能抑制糖原分解和谷氨酰胺分解，最终减少能量代谢。细胞内ATP总体减少导致坏死性凋亡死亡。这条途径不仅与半胱天冬酶无关，而且还受到半胱天冬酶的抑制；半胱天冬酶-8抑制RIPK1和RIPK3的相互作用，从而防止坏死性凋亡，如图3B所述。 图3. 其他细胞死亡机制。细胞培养中发生的其他形式的细胞死亡包括自噬（A）和坏死（B）。 总之，细胞死亡，特别是凋亡，在生物加工中具有显著影响，影响细胞活性、生产力和产品质量。上游工艺开发应考虑凋亡监测和尽可能避免凋亡的策略开发，而不是试图逆转它。这需要深入了解跨尺度的相关促凋亡压力以及如何最小化这些压力。这是下一节的范围。 3.生物加工开发过程中的凋亡压力 3.1.不同尺度上的凋亡 上游工艺开发的第一步是选择一个合适的克隆，通常基于生长和生产力。虽然克隆选择发生在微升级别，但在生物加工开发过程中，规模将逐渐增加到立方米级别的生物反应器。在这些步骤中，凋亡压力的性质不同，它们对生长和生产力的影响也不同。为了实现最佳操作条件，重要的是准确识别相关压力及其原因，理解细胞响应机制，并在生物加工开发的各个阶段消除/逆转凋亡（图4）。在摇瓶或微孔板尺度上，由于不进行搅拌，运输是由于扩散和轨道混合，凋亡压力主要由克隆选择中使用的有毒试剂所主导。两种广泛使用的试剂是无谷氨酰胺培养基用于谷氨酰胺合成酶（GS）基础选择和甲氨蝶呤（MTX），如果使用二氢叶酸（DHFR）系统。MTX也是一种已知的凋亡诱导剂，能刺激PUMA。当生长速率和生产力成为克隆选择的关键标准时，确保pH值、温度、营养物质耗竭和渗透压不抑制生长或触发凋亡变得至关重要。即使在小规模上，扩散足以确保均匀环境，由于计划维护/取样任务在孵化器外进行，除非采用自动化系统，否则可能会发生压力温度波动。随着规模的增加，扩散不再能够维持有效的物质运输，宏观环境变得越来越不均匀，需要混合系统，这是剪切应力的来源。与规模放大相关的另一个问题是提供足够的氧气。在大型生物反应器中，这通常是通过从底部通气来实现的，这可能会产生额外的剪切应力。相比之下，大规模的温度控制不是一个主要问题。由于生物加工开发包括不同的操作模式，必须注意考虑与规模相关的效应。为了最小化放大问题，从克隆选择阶段就使用微型搅拌罐系统。 图4. 不同尺度的凋亡应激。上游生物过程开发识别重要的流程和生物反应器参数以及各个生物过程尺度上的相关凋亡应激和途径。 3.2.生物反应器中的凋亡压力 本节讨论与生物反应器相关的压力，如缺氧、剪切、营养物质缺乏、温度、pH值、渗透压和蛋白质错误折叠，将与每种特定压力相关的细胞生物学联系到产品质量、生物加工变量和操作条件。重要的是要提到，不同压力的影响可能因使用的培养系统而异。灌注系统，例如，允许营养物质的供应和副产品的去除，减少代谢压力。然而，由于实现了更高的细胞密度，培养粘度的相应增加导致pH值、渗透压和剪切应力的增加，这些在分批培养中观察到的。 3.2.1.缺氧压力 氧气在哺乳动物细胞代谢中至关重要，是需氧能量代谢中的最终电子受体。在缺乏氧气的情况下，采用厌氧代谢进行能量生产，导致有毒代谢产物的产生，最终导致细胞周期停滞和凋亡。因此，能量消耗减少，分泌生存因子，如低氧诱导因子（HIFs），在调节细胞对缺氧的反应中起着关键作用。HIFs是具有α（O2-labile）和β（稳定）亚基的异二聚体蛋白。在正常氧水平下，α亚基通过脯氨酰羟化酶（PHDs）在两个保守的脯氨酸残基上羟化，标记HIFα进行蛋白酶体破坏。在缺氧条件下，PHDs活性降低，HIFα不被抑制，诱导缺氧反应基因。事实上，PHDs已被提议作为负责HIF对氧浓度反应的氧气传感器。对缺氧诱导的凋亡的反应可以根据线粒体感知的氧水平重新编程，导致产生活性氧（ROS），降低PHDs。确保氧气不是限制因素在生物反应器设计和放大中至关重要。氧传递系数（kL）和气泡表面积（a）的乘积，通常表示为kLa，用作衡量通气效率的指标。kLa与混合引起的能量耗散率成正比；确保高kLa和低剪切应力环境可能具有挑战性，特别是在哺乳动物细胞培养中实现的越来越高的细胞密度。关于氧气对哺乳动物细胞培养影响的文献综述见表1。 在摇瓶和控制生物反应器中的CHO细胞研究表明，与摇瓶培养不同，生物反应器培养没有经历缺氧，缺氧导致蛋白质表达减少。在50L生物反应器中也获得了类似的结果，其中溶解氧从60%降低到15%的空气饱和度导致寿命减少和蛋白质运输，从而影响生产力和滴度。尽管通过补充金属离子可以维持活力和生产水平，但这种策略对产品质量的影响没有报告。这将特别有趣，因为已经证明金属离子在糖基化中起着重要作用。尽管在CHO细胞生物学中起着重要作用，但缺氧本身不会导致死亡，除非氧分压降低到零或其他因素参与。即使当氧分压降低到2x10-4巴，细胞生长停止，也可能不会观察到细胞死亡。然而，当缺氧与pH值6-6.5结合时，会观察到时间和pH依赖的细胞毒性效应。在这些条件下，由于pH（独立于氧水平）导致的葡萄糖消耗和乳酸产生减少，并且在两种压力结合下ATP水平降低了85%，而单独任一压力对能量产生没有影响。在GS-NS0培养中观察到类似的效应，在缺氧12小时后，细胞周期在G2期（9小时）停止，随后是G1和S期的停止，并且mAb生产停止。报道了降低能量密集型过程（如DNA合成）和激活能量产生和氧气输送过程。这些研究表明，缺氧压力效应的某些方面在细胞系间是保守的。在产品质量方面，血清自由培养的CC9C10杂交瘤细胞中观察到缺氧的负面影响，其中观察到IgG1糖基化的不足。作者推测，糖基化不足可能是由于UDP-Gal核苷糖供体的可用性降低。还观察到增加的抗氧化酶活性，为活性氧提供了证据。总之，缺氧诱导的生长停滞似乎是细胞系独立的，对于低于1%的缺氧水平。需要更多的研究来完全阐明缺氧对产品质量的影响，这也将有助于在工艺开发过程中的质量设计。 3.2.2.剪切应力 剪切应力是由搅拌器和挡板产生的，它们被用来在生物反应器内实现均匀性，或者通过通气产生，这可能会产生剪切应力，直接导致细胞破裂，因为气泡在上升到气液界面时破裂。与通气相关的剪切应力随着气泡直径的减小而增加。使用表面活性剂，如Poloxamer F68，显著降低了细胞与气泡之间的表面张力，减少了剪切对培养活性的影响。然而，重要的是要确保消泡剂不影响细胞生长和产品质量，并且它们可以在下游处理中有效去除。剪切应力影响的其他培养参数包括单克隆抗体（mAb）生产、葡萄糖消耗和乳酸产生，这些参数以不受规模影响的方式受到影响。关于生物反应器内部剪切应力的流体动力学来源的详细概述，包括湍流、边界层和碰撞效应，见其他地方。一般来说，在大多数培养时间内，生物反应器内部经历的剪切应力水平低于诱导凋亡所需的水平。此外，抵抗力和可容忍的压力水平取决于细胞系、几何形状和操作条件。表2总结了剪切应力在工业相关细胞系中的影响。 CHO细胞可以耐受比Sp2/0细胞更高的剪切应力水平，然后才会观察到对生长或生产力的负面影响。随着工艺的放大，混合系统的设计必须确保细胞不会长时间暴露在高水平的压力下，据估计（在搅拌器周围经历的）仅发生在生物反应器体积的约5%或在良好混合反应器中的5%时间内。反应器的不均匀性和长时间暴露在高剪切下会以剂量和时间依赖性的方式影响细胞培养。在HDP1杂交瘤中，暴露于60 Pa（600 dyne/cm2）45分钟后观察到活性下降50%，而在20 Pa（200 dyne/cm2）下观察到类似的减少需要2小时。类似地，CRL-8018杂交瘤在暴露于50 dyne/cm2下10分钟后活性下降50%，在30分钟后下降80%。挡板是剪切应力的另一个来源，因为它们通过增加能量耗散率5倍。尽管从理论上讲，挡板可以被消除，但它们在防止涡流形成方面至关重要，涡流是剪切相关细胞死亡的主要原因。挡板的数量和位置体现了防止涡流和产生剪切应力之间的权衡。在设计混合系统时，应保持低能量耗散率；能量耗散率约为2-3x105 W/m3（>700 rpm）会在CHO细胞中诱导凋亡，而能量耗散率为1x108-1x109 W/m3会导致CHO细胞破裂。这些值在存在气相的情况下可能会改变，这将促进涡流、气泡夹带和气泡破裂，从而增强剪切应力，因此必须降低搅拌速率。事实上，当消除2L生物反应器中的气相空间时，CHO细胞在600 rpm下搅拌没有经历显著损伤，这与Mollet等人的估计一致。有趣的是，这些结果与高速搅拌下搅拌器设计和分布器位置无关，而在搅拌速率较慢时，分布器的位置起着更重要的作用。 已经假设细胞抵抗剪切应力的能力随着特定细胞系的培养历史而变化，而在T型瓶或低搅拌spinner flasks（低水平流体应力）中培养的杂交瘤比在高搅拌下培养的杂交瘤对剪切更敏感。然而，野生型和Bcl-2缺陷CHO细胞对剪切的抵抗力被发现与它们之前在T型瓶或悬浮培养中的培养无关。这一观察归因于细胞暴露于剪切时Bcl-2表达的丧失。还报告了基因表达损失，其中在5L生物反应器中培养的CHO细胞显示出较低的F-肌动蛋白表达水平，导致细胞骨架较弱。相反，Perani等人观察到Bcl-2确实在三个几何不同的系统中培养的NS1衍生的小鼠杂交瘤中提供了凋亡保护。这些不同的发现表明，剪切应力抵抗力是细胞系特定的。 3.2.3.营养物质/代谢物压力 限制生长的营养物质是细胞系和克隆特定的；确定它们对于设计合适的培养基和补充培养基进行分批和连续培养至关重要。几项研究已经检查了营养物质和代谢物对细胞生理学的影响，如表3所总结的。生长限制性营养物质的耗尽导致生长停滞，最终导致凋亡，这也由有毒代谢物的存在引起。葡萄糖作为重要的碳源，在调节凋亡方面至关重要，但其重要性可能更多的是调节性的而不是营养性的，这已通过使用GS-NS0细胞的研究建议，其中葡萄糖调节并延长了静止期，以及调节DNA修复和转录。此外，葡萄糖可以通过快速提供ATP来防止或延迟凋亡。除了主要的碳源（通常是哺乳动物细胞的葡萄糖），氨基酸非常重要，不仅作为蛋白质生产的构建块，还作为三羧酸（TCA）循环中间体的前体。 了解细胞系和克隆特定的氨基酸代谢使能够确定培养过程中必需营养物质的代谢转变，应避免这些转变，因为它们可能会影响生长、生产力和产品质量，导致制定适应所用细胞系/克隆特定需求的培养基和喂养策略。如果代谢发生变化，纠正措施可能不会产生预期的效果。在氨基酸中，谷氨酰胺已被证明与CHO培养中的乳酸代谢转变相关，从而也影响培养pH。包括任何代谢转变信息的详细代谢分析对于理解这些观察至关重要。 除了糖或氨基酸之外的其他必需营养物质包括蛋白质，如胰岛素和转铁蛋白，其撤除导致CHO细胞凋亡，以及磷，添加到高细胞密度NS0培养中成功防止活性损失，增加mAb滴度和抑制凋亡。另一组必需分子是脂质。当营养物质耗尽时，某些细胞系能够通过合成三酰甘油和形成脂滴来维持活性。目前对这种现象的了解不足，但已经表明在完全营养物质耗尽的情况下，CHO细胞能够通过β-氧化脂肪酸生存，这需要脂滴生物生成。 随着细胞的生长和营养物质的代谢，它们产生副产品，这些副产品变得有毒并导致凋亡。两个重要的有毒代谢物是乳酸和氨，分别是葡萄糖代谢和谷氨酰胺/天冬酰胺代谢的副产品。当葡萄糖从更高效的TCA循环转向更快的发酵途径时，会形成乳酸。如果氧气不可用，就不能进行氧化磷酸化，细胞将通过替代途径代谢葡萄糖，例如乳酸发酵，产生乳酸。乳酸产生速率取决于克隆，受培养基配方的强烈影响。乳酸积累最终可能导致代谢转向乳酸消耗，尽管如此，仍然会导致生长停止和活力下降。此外，当乳酸脱氢酶A（LdhA）和丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）1、2和3同时低表达时，CHO细胞中mAb产量增加，当丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）被化学抑制时也是如此。乳酸对哺乳动物细胞培养的影响已与乳酸积累导致的氧化磷酸化速率下降相关。尽管在几项研究中被识别，但并非所有CHO克隆都观察到乳酸代谢转变。即使在同一项研究中，这也是细胞系和克隆特异性属性。有趣的是，从培养基中摄取谷氨酰胺的细胞中可能发生的乳酸代谢转变与谷氨酰胺的存在相关，这表明谷氨酰胺分解可能促进乳酸产生。然而，由于乳酸存在时线粒体氧化途径活性降低，代谢并未恢复正常。乳酸消耗另一个重要作用是再生糖酵解所需的NAD+辅因子。表达丙酮酸羧化酶的CHO细胞的分批培养表明，尽管观察到乳酸代谢转变，但培养寿命仅延长了1天（从10天延长到11天），尽管达到了更高的细胞密度。值得一提的是，这一现象可能受温度影响。在33°C培养的HFN 7.1杂交瘤中，即使谷氨酰胺完全消耗，乳酸生产仍在继续导致细胞死亡。然而，当相同细胞在37°C培养时，谷氨酰胺耗尽时乳酸生产停止。作者团队的未发表结果显示，在无谷氨酰胺、化学定义的培养基中分批培养的GS-NS0细胞产生的乳酸很少（<4mM），这可以归因于这些细胞在无谷氨酰胺的培养基中生长，并且只会产生它们所需的谷氨酰胺量（来自谷氨酸）。然而，另一种在分批培养中消耗乳酸的GS-NS0细胞系直到谷氨酰胺（最初不出现）达到0.4mM才开始消耗乳酸。只要保持谷氨酰胺浓度低，乳酸浓度就保持稳定，当谷氨酰胺浓度仅增加时就会产生乳酸。对于可以将乳酸和谷氨酰胺代谢联系起来的细胞系，培养基设计的一个重要限制是确保将谷氨酰胺浓度保持在最低以避免乳酸产生。控制谷氨酰胺水平也很重要，以避免产生氨。氨是谷氨酰胺代谢的副产品，与乳酸相反，它将培养pH值转变为碱性值。氨在2.5mM、6mM和高达29mM的浓度下分别对杂交瘤、HEK 293和CHO细胞培养产生负面影响。此外，氨的产生可能是细胞系和克隆特异性的。使用GS-NS0细胞进行的工作报告了不同水平的氨，从低于1mM到接近6mM。 3.2.4.温度 哺乳动物细胞生长、蛋白质生产和生化反应由酶催化，其活性受温度影响。生物加工规模与哺乳动物细胞生物加工开发中的温度控制相互关联。在小规模，直到台式生物反应器，温度控制是在受控环境中实现的，例如在孵化器中，而随着规模的增加，需要冷却和/或加热系统来控制温度并避免温度曲线的显著偏差。关于温度对哺乳动物细胞培养影响的分子机制有大量文献。具体来说，与热休克诱导的凋亡相关的转录独立的p53、钙失调和Bax具有调节作用。热休克蛋白70（HSP70）通过几种可能的机制参与保护免受温度诱导的凋亡。 在CHO细胞中，HSP70很重要，因为它延迟了半胱天冬酶-3的表达。鉴定了200多种具有温度依赖性表达谱的蛋白质，其中118种上调，与生长、凋亡和糖蛋白质量控制直接相关的23种蛋白质与温度降低直接相关。几项研究表明，高于最佳温度（37°C）的培养温度会触发凋亡。在CHO细胞中，过表达HSP27和HSP70导致由于在37°C时延迟表达半胱天冬酶2、3、8和9而增加了寿命。尽管报告了产品滴度的增加，但未描述产品质量属性和遗传稳定性，也未证明这种策略是否会改善更高温度下的CHO培养。事实上，在39°C培养CHO细胞增加了生长速率，但导致G2/M期细胞周期停滞，活力和生产力下降，尽管整体产品滴度增加。在NS0细胞中，转染HSP70基因的克隆也导致对凋亡的抵抗力增加。野生型NS0细胞中缺乏HSP70表示细胞系对温度诱导凋亡的特异性反应。在产品质量方面，CHO细胞生产的Epo-Fc融合蛋白的唾液酸化在37和39°C之间没有显著差异。在几种杂交瘤中，37°C以上的培养温度对mAb生产不利。具体来说，这种效应在39°C和38°C的杂交瘤细胞培养中观察到。有人建议温度的效应可能是搅拌依赖的，因为非搅拌杂交瘤培养在38°C（与37°C相比）时具有更快的特定生长速率，产生mAb的速率相似；搅拌培养的情况正好相反，在38°C时生长较慢，产生mAb的速率较低。 低于最佳温度的温度也会影响培养寿命、细胞生长和生产力。在CHO培养中，单克隆抗体的聚集在33°C时比37°C高2到5倍。当生产双特异性抗体的CHO细胞的温度从36°C降低到32.5°C时，也观察到相同的效应。在这种情况下，重要的是确保细胞产生所需的双特异性mAb，而不是截短版本或完整的单特异性mAb。降低温度降低了生长，但促进了所需双特异性mAb结构的形成；尽管在较低温度下也观察到聚集，但总体上认为降低温度是有益的。建议采用两阶段培养策略，即在36°C进行生长，在32.5°C进行mAb生产，提高整体产品质量和下游处理产量。这些观察是细胞系和产品特异性的。在表达人类组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的CHO细胞中，将温度从37°C降低到30°C在指数生长期增加了细胞周期抑制剂2A（细胞周期停滞诱导剂）的表达，对DNA损伤响应基因没有影响，尽管相应的基因没有上调，但tPA生产率增加（未提供产品质量数据）。此外，与能量产生和凋亡保护相关的基因上调，葡萄糖和乳酸的代谢速率减慢，而谷氨酰胺消耗保持不变。 在低温（30°C）条件下，CHO细胞的代谢速度较慢与G0/G1期阻滞有关。Trummer等人报告了产品质量数据，并显示唾液酸化减少了40%。对NS0细胞的研究表明，将温度从37°C降低到34°C可以在不影响培养寿命的情况下略微提高单克隆抗体（mAb）的产量。进一步将温度降低到22°C则显示无增殖并诱导凋亡，同时细胞周期在G2/M期被阻滞。尽管有DNA微阵列证据表明，在低温条件下培养细胞会停止代谢并诱导凋亡，但据我们所知，还没有研究报告低温诱导凋亡的详细机制。 3.2.5.pH值 在哺乳动物细胞培养中，严格的pH控制至关重要，因为即使是微小的偏差也可能导致细胞死亡。此外，pH值影响生长、单克隆抗体（mAb）产量、多种氨基酸的摄取率以及产品质量，如表5所示。尽管pH值很重要，但其在凋亡中的作用机制尚未完全阐明。 尽管最佳pH值取决于细胞系，但在哺乳动物细胞生物加工中，接近7.0的pH值通常被认为是理想的。在pH 6.8下培养CHO细胞对培养寿命最有利，而最大细胞密度在pH 6.9下获得。在所有评估的pH条件下，主要碳源（葡萄糖）的耗尽导致显著的活性下降和代谢转向乳酸消耗。Brunner等人表明，即使是短期的pH扰动也会影响细胞生理，而Trummer等人则表明，尽管在pH 6.8下获得了最高的单克隆抗体滴度，但在pH 7.1下达到了最高的体积生产力。尽管Trummer等人没有观察到pH 6.8和7.1之间产品质量（Epo-Fc的唾液酸化）的显著差异，但Brunner等人报告了在pH 6.8、7.0和7.2下培养的mAbs的基本和酸性变体中的几种差异。在另一项研究中，CHO灌注培养中第9天将pH从7.15降至6.85，增加了细胞密度和寿命，并改善了单克隆抗体的糖基化和效力，同时保持了生产力。 对其他细胞系也观察到了类似的效果。在Sp2/0补料分批培养中，中性pH最理想，当pH从7.2降低到7.0时，活细胞的积分和滴度都有所增加，尽管没有报告产品质量数据。在F2N78细胞培养中，pH从6.8增加到7.4会减少寿命并加速代谢，导致副产品积累更多，pH 6.8被认为是最佳选择。Osman等人受到在添加碱/酸时对生物反应器进行pH扰动的调查的启发，将GS-NS0细胞在pH 7.3下培养，并研究了单一和多重pH扰动的影响。作者报告说，单一pH 8扰动没有显著的不利影响，但对pH 9扰动有时间和剂量依赖性的反应。因此，有效的搅拌和谨慎选择添加碱/酸的点对于避免生物反应器非均匀区域的凋亡很重要。 如上所述，有毒代谢物（如乳酸）的积累会降低培养pH值。虽然在某些研究中，酸化是早期凋亡的特征，与DNA损伤有关，但在其他研究中，酸化并未导致细胞死亡，也没有影响生长，Bcl-2和Mcl-1提供了保护。在NS0细胞培养中，凋亡可以独立于细胞内pH变化发生，在酸度下HL-60细胞中观察到增加的半胱天冬酶活性。事实上，Bax在pH 4.0时形成线粒体膜孔的能力是在pH 7.5时的8倍，而Bcl-2几乎可以完全抵消这种效果。由于氨的产生，培养基的碱化是一个已知的增殖过程特征。然而，其对细胞生理的影响机制仍需阐明。碱性环境可能会抑制半胱天冬酶-3，但如果之前已经激活，蛋白质在pH值增加后仍然保持活性。 3.2.6.渗透压 关于渗透压的研究评估了盐分和代谢物对生长和生产力的影响，如表6所总结。尽管高渗透压在CHO细胞中激活了半胱天冬酶3和7，导致DNA碎片化，在小鼠肾细胞中导致DNA双链断裂，但渗透压诱导凋亡的机制需要进一步研究。在生物反应器中，由于pH控制通常是通过碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂实现的，这需要CO2，因此很难将盐分和CO2的影响分开。一项使用低盐培养基配方的研究表明，高渗条件与凋亡强烈相关，而CO2分压单独对Sp2/0细胞培养的活性没有显著影响。相比之下，pCO2对CHO细胞的生长有显著影响，而高渗压（尽管在310至376 mOSm/kg的非常窄的范围内）没有。氯化钠（NaCl）通常用于渗透压研究，并且已经证明了其对CHO细胞生长的剂量依赖性影响。有趣的是，脯氨酸补充已被成功用于抵消由NaCl添加引起的高渗压力的影响。这些结果令人惊讶，因为添加溶质进一步增加了培养基的渗透压，表明对NaCl或氨基酸诱导的渗透压增加有不同的反应机制。事实上，向小鼠肾细胞培养中补充尿素至最终渗透压600 mOsm/kg对DNA的损伤程度与添加NaCl至最终渗透压300 mOsm/kg相同，证实了溶质特异性效应的假设。这在生物加工中特别相关，因为人们一直在努力使用氯化钠提高细胞对渗透压应激的抵抗力；然而，这样的研究可能并没有针对与渗透压相关的问题的真正原因。最近，通过使用“渗透压空间”成功地从培养基配方中去除了氯化钠（和其他成分），以增加营养物质浓度而不使细胞受到高渗压力。在蛋白质生产方面，高渗性效应是产品特异性的，导致EPO-Fc滴度降低但单克隆抗体滴度不变。 与CHO细胞不同，当渗透压从290增加到450 mOsm/kg时，NS0细胞培养实现了延长的寿命，尽管细胞密度较低。只有在高渗培养（450 mOsm/kg）的最后几天才观察到滴度差异，这归因于它们改善的寿命。然而，在高渗条件下，特定单克隆抗体（mAb）的生产力和特定增长率更高。有趣的是，另一项研究表明，将补料分批NS0培养的渗透压从平均276增加到平均326 mOsm/kg显著改善了生长和单克隆抗体滴度，而进一步增加到381 mOsm/kg则有轻微的负面影响。这些结果表明，渗透压对细胞生长的影响取决于细胞系，可能还特定于克隆，并且对生产力和滴度的影响是产品特异性的。 3.2.7.错误折叠蛋白引起内质网应激 为了实现高滴度培养，需要过度表达蛋白质。然而，过度表达蛋白质可能触发内质网（ER）应激，导致凋亡和产品质量下降，因为由于内质网无法应对高蛋白质浓度，不完全的产品被分泌出去。表7显示了有关内质网应激对相关生物加工细胞系影响的文献综述。 未折叠蛋白反应被描述为内质网和细胞核之间的相互作用。错误折叠或未折叠蛋白的聚集激活了ER应激受体，即atf6（激活转录因子6）和需要肌醇的酶1（IRE1）。这些事件，连同atf4的激活，导致内质网和细胞核之间的相互作用，目的是重新建立ER的折叠能力，并通过合成蛋白酶和分子伴侣来减少正在处理的蛋白质数量。严重的ER应激导致一系列不同的事件，包括CHOP（C/EBP同源蛋白，一种促凋亡转录因子）的表达阻断和JNK（c-Jun N端激酶）对Bcl-2的磷酸化。这些结果导致Bim激活，进而激活Bax通道在ER和线粒体膜上形成。因此，钙，细胞色素C和其他凋亡激活剂被释放，最终触发半胱天冬酶激活和凋亡细胞死亡。另一个关键的相互作用是ER和线粒体之间的串扰。ER是钙离子的主要内部储存库，它们介导几种信号传导途径，ATP产生和凋亡。肌醇三磷酸受体类型1（IP3R-1），是钙信号传导机制的关键因素，被认为是半胱天冬酶-3的底物，Bcl-2或BcL-xL可能与ER表面不同类型的IP3R（1、2或3）相互作用，以控制钙离子释放速率，这种相互作用被Bax阻止。删除IP3R1基因导致对凋亡的抵抗。这些发现证实了钙在ER应激诱导的凋亡中的重要作用。 来自同一亲本CHO克隆的高和低单克隆抗体生产克隆中ER应激的动态表明，重链mRNA的上调与每个克隆的生产水平相关，并且分子伴侣的浓度将在培养结束时增加，此时达到最大单克隆抗体滴度。然而，低生产者比高生产者晚2天进入凋亡，而凋亡率保持不变。在IgG生产的CHO细胞中，过度表达未折叠蛋白反应基因成功地产生了一个生产力更高的克隆，尽管没有评估产品质量。同样，在NS0培养的下降阶段，ER蛋白表达的增加与单克隆抗体产量的增加相关。这些结果表明，未折叠蛋白反应（UPR）基因是增加单克隆抗体生产的好目标。然而，也有研究表明高单克隆抗体生产与分子伴侣表达增加有关，但X盒结合蛋白1（XBP1）的表达没有变化，XBP1是UPR的标志，这表明未折叠蛋白反应途径在GS-NS0细胞中活性并不更高，这些细胞具有更高的单克隆抗体生产率。作者建议这一观察可能是特定于克隆的。 识别对ER敏感的克隆和ER报告基因可以帮助选择高产者并在凋亡发生之前的所有工艺开发阶段监控压力。基于ER的选择策略已应用于CHO细胞，采用GRP78（ER应激报告基因）的表达作为高表达的标志；类似的策略已应用于NS0细胞，使用GADD153基因，其在几个NS0克隆中的表达被修改。GADD153被认为是ER应激开始的良好报告基因，其过度表达本身并不是凋亡的原因。总之，ER应激应考虑在内，特别是在细胞系开发和克隆选择的早期工艺开发阶段。 4.系统方法  传统上，生物工艺优化是通过顺序实验进行的，因此仅限于筛选设计空间的一小部分区域。最近，高通量策略和“组学”技术使评估范围更广的设计空间成为可能，尽管它们既耗时又成本高昂。凋亡工程和凋亡建模是合理的“系统”方法，可以促进细胞生物工艺的优化，因为它们可以筛选整个设计空间，有可能减少时间和成本。下面回顾了这些策略，可以单独使用或结合使用（图1）。 4.1.凋亡工程 凋亡工程是一种针对细胞系工程的方法，目标是通过合理的基因表达修改，发展抗凋亡细胞系。可以过度表达抗凋亡蛋白和/或下调促凋亡蛋白。这些研究的总结见表8。 最常用的抗凋亡基因是Bcl-2，它在各种环境压力下都能提供抗凋亡能力。在杂交瘤细胞中过度表达Bcl-2延长了几种培养条件下的寿命。在NS0细胞中，过度表达Bcl-2导致相互矛盾的观察结果：一些研究报告了对细胞密度和单克隆抗体生产的积极影响，而其他报告则没有显著影响。在CHO细胞培养中，过度表达Bcl-2导致细胞密度增加，寿命改善和凋亡减少，但没有影响单克隆抗体生产。过度表达Bcl-xL或Mcl-1提供了有希望的结果的替代策略。一项关于CHO细胞中过度表达Bcl-xL和Bcl-2的比较研究得出结论，Bcl-xL是CHO细胞工程比Bcl-2更有希望的目标，因为后者可能会损害蛋白质生产。事实上，通过在CHO细胞中过度表达Bcl-xL实现了2.7倍的灌注蛋白生产增加，而另一个过度表达Mcl-1的CHO克隆报告了单克隆抗体滴度增加了40%，没有显著影响产品质量。有人建议Bcl-2和Bcl-xL的效果可能是功能上冗余的，这种可能性也在Sp2/0细胞的研究中被指出，其中Bcl-xL的表达显著改善了培养寿命。 在CHO细胞中的其他凋亡工程方法包括过度表达Aven（凋亡体抑制剂）和E1b-19k（BH3-only蛋白抑制剂），这可以延长培养寿命。另一种方法是消除促凋亡蛋白。具体来说，在CHO细胞中消除Bax和Bak增加了培养寿命，并产生了更高的单克隆抗体滴度，同时使细胞对凋亡更加抵抗（即使化学诱导的凋亡），在33和37°C下均如此。有关这些策略的详细评论，包括抑制其他基因和使用半胱天冬酶抑制剂，可以在其他地方找到。最后，据我们所知，尚未实施的凋亡工程的一个不同方法是直接针对凋亡逆转机制，通过过度表达凋亡可逆性基因（XIAP、PARP、HSPs等），这可能导致阻止凋亡事件并启动Anastasis，将凋亡群体恢复为活性。 尽管针对凋亡的细胞工程取得了有希望的结果，但关于产品质量和副作用（如代谢变化和遗传稳定性）的信息仍然不足。蛋白质生产要么没有报告，要么显示出微小的改进，这归因于生物能量学的下调。两个例外是使用NS0细胞进行的恒化器研究，其中实现了单克隆抗体产量的3倍增加，以及在CHO细胞中过度表达Bcl-xL的研究，实现了单克隆抗体产量的2倍增加。由于细胞将能量利用集中在基本功能上，因此非基本功能的能量减少。这突出了阐明细胞能量学、其在凋亡中的作用以及遗传操作引起的任何代谢变化的重要性。例如，一个潜在的有趣替代策略是通过氨基酸和葡萄糖喂养来提供凋亡保护。尽管理想情况下是互补的，但营养喂养和凋亡工程可能是不兼容的。在过度表达Bcl-xL的Sp2/0细胞克隆中，谷氨酰胺喂养后活性保持不变，而野生型在喂养后活性得到改善。细胞的遗传操作也引起了对过度表达抗凋亡蛋白的细胞系稳定性的担忧，不仅因为这些细胞中观察到异常，而且因为这些蛋白的表达可能在长期或在可能影响产品质量的特定应激条件下丢失。过度表达抗凋亡基因（Fadd、Faim、Alg-2和Requiem）的遗传工程CHO细胞不仅显示出增加的活细胞数量和γ-干扰素产量，而且还增加了唾液酸化。 4.2.凋亡的数学建模 如图2所示，凋亡是一个高度调节的过程，其中几种蛋白质的干预确保细胞以受控且无害的方式死亡。由于其在生物加工中的显著影响，凋亡的数学模型将有助于整合生物过程数据，并预测生物反应器几何形状和操作对细胞死亡的影响。然而，凋亡的生物学复杂性使建模具有挑战性。表9总结了各种有限的凋亡建模尝试。 详细数学描述参与不同凋亡途径的所有蛋白质和相互作用在（1）捕捉生物学，（2）获取验证模型预测所需的实验数据，以及（3）产生计算可追踪的预测模型方面提出了重大挑战，这些模型可用于基于模型的过程优化。因此，凋亡建模有两种先验选择。在生物学方面，需要仔细基于证据的决策，确定要建模的干预措施和相互作用，而在建模方面则决定模型结构。虽然一些研究人员选择了基于链反应的公式（启动、放大和执行）或模拟细胞群体在状态之间的转换（存活、凋亡和死亡），但大多数人选择了动力学/机制公式，由于其动态特性通常更受青睐（Kyriakopoulos等人，2018b年）。模型复杂性归因于通过建模少数相互作用以捕捉详细的动力学关联，或者通过考虑整个途径但仅考虑少数干预措施来建模。描述少数物种详细模型的例子包括（1）DNA损伤模型，（2）通过各种途径激活半胱天冬酶-3的模型，（3）Bax/Bcl-2相互作用模型，（4）包括双稳态研究的半胱天冬酶3和8相互作用模型，后来又与实验数据进行了比较，以及（5）UPR模型或自噬和凋亡之间相互作用的模型。复杂网络模型包括Fas信号模型，其中某些模拟与实验数据进行了比较，以及描述使用敏感性分析和实验验证的最小凋亡诱导配体/受体比例的CD95诱导凋亡途径模型。Bentele及其同事的工作提供了一个适合生物过程社区兴趣的模型特征示例，特别是在与生物过程优化相关的方面。在CHO细胞中使用代谢通量分析（MFA）对葡萄糖、乳酸、五种氨基酸和氨进行了代谢和凋亡的整合；然而，代谢物预测超出指数生长期与实验数据不符，未能捕捉代谢转变。尽管MFA提供了有关细胞平衡代谢状态的有价值信息，但它在动态过程中的应用有限。使用结合建模/实验方法分析了营养应激对GS-NS0细胞基因表达的影响，其中简化的动力学模型捕获了营养和代谢物剖面，并描述了批量模式下六个凋亡相关基因（半胱天冬酶3和8、atf5、bcl-2、bax和trp53bp2（p53结合蛋白2））的表达。这项工作的主要缺点是在补料分批模式下缺乏预测能力。 如前所述，跨尺度的凋亡诱导应激在生物过程开发中很重要（图4），需要在凋亡建模中纳入空间效应。例如，虽然细胞总体上可能不会经历高剪切应力环境，但有些细胞会物理上靠近搅拌器。同样，尽管pH可能得到了很好的控制，但在酸/碱添加点的局部扰动可能诱导暴露于扰动的细胞凋亡。同样，尽管气泡破裂在整体上不构成问题，但在气液界面附近可能是有害的。计算流体动力学（CFD）建模考虑了空间效应，集成CFD-动力学模型将为最佳反应器几何设计（尺寸、体积、挡板数量和搅拌器位置）、最佳操作条件（通气、O2水平、搅拌等）以及最佳培养基设计和补料策略提供有关生产力和产品质量优化的有价值信息。 5.结论和未来方向  生物反应器中的细胞死亡主要作为凋亡的结果，活力的降低可能会影响产品滴度和产品质量。为了实现最佳操作，了解引起凋亡的应激在生物过程开发中至关重要。对于各种工业相关的哺乳动物细胞系，仍然缺乏对凋亡的原因和效应的全面阐明，具体到细胞系和克隆。此外，建立稳健和快速的凋亡表征方法以及开发新方法，包括细胞工程和in silico建模，以对抗凋亡，将进一步改善生物过程优化。总之，生物过程开发和优化必须考虑细胞系和克隆特异性属性，并超越喂养策略、培养基配方和细胞工程，进行全生物过程设计，以减少/消除凋亡原因。上游改进将对下游加工产生积极影响，具有累加的有益影响。

摘要:抗体药物偶联物（ADCs）是一类重要的癌症治疗方法，已经彻底改变了实体瘤的治疗模式。迄今为止，许多正在进行的ADC与各种抗癌药物的组合研究，包括化疗、分子靶向药物和免疫疗法，正在临床前研究和临床试验环境中进行严格的进行。然而，联合治疗并不总是保证协同或相加效果，并且可能涉及重叠的毒性风险。因此，迫切需要了解ADC联合治疗的现状和潜在机制。这篇综述全面分析了ADC与其他类别的肿瘤药物的相加或协同效果的现有证据。在这里，我们讨论了不同ADC联合治疗策略的生物学机制，提供了突出的例子，并评估了它们的益处和挑战。最后，我们讨论了ADC联合治疗在临床实践中的未来机会。 1.背景 在过去的十年中，抗体药物偶联物（ADCs）已成为一种变革性的治疗方式，用于治疗广泛的实体和血液恶性肿瘤。ADCs是由三个主要组成部分构成的基于抗体的大分子复合物：抗体、连接物和有效载荷。它们的作用机制可以概括如下：当抗体与靶细胞表面的抗原结合时，ADC被内化，释放有效载荷并发挥细胞毒性（图1）。自2013年首次批准ADC用于实体瘤以来，这一领域的兴趣增加，许多此类偶联物已在各种肿瘤类别中进行了评估。 图1 传统ADCs的结构和作用机制。ADCs由三个基本组成部分构成：一个单克隆抗体，它与肿瘤细胞表面主要表达的抗原结合，提供靶向肿瘤细胞的特异性；一个连接器，它防止有效载荷在血液中过早释放，而是在肿瘤细胞中释放；以及一个细胞毒素有效载荷，通过靶向DNA、微管和拓扑异构酶等关键组分触发肿瘤细胞死亡。ADC的细胞毒性涉及一系列连续阶段：①抗体与抗原的结合，②ADC-抗原复合物的内化，③ADC在溶酶体中的降解，④有效载荷在细胞质中的释放，⑤其与靶标的相互作用；⑥可能将有效载荷的一部分排放到细胞外环境中，⑦随后发生的旁观者效应，它被肿瘤微环境中邻近细胞内化。缩写：TME，肿瘤微环境。 几种ADC已显示出对治疗难治性癌症的强大抗肿瘤活性。迄今为止，已有八种ADC被批准用于不同指征的实体瘤（表1）。然而，即使对于目标阳性的肿瘤类型，大多数患者也未能实现持久的疾病控制，并对ADCs产生抗性。因此，对于许多肿瘤类型，单一治疗是不够的，许多ADC正在进行临床试验，以寻求更有反应性的治疗方案。 表1 目前全球批准用于治疗实体瘤的ADCs的主要规格 在癌症治疗领域，人们普遍认识到，通过结合通过不同作用机制运作的治疗剂，实现完全缓解和治愈的可能性通常会增加，特别是当处理肿瘤异质性的复杂性时。解决抗性/或增强ADC疗法的主要方法涉及将ADCs与其他不同的治疗策略相结合。协同作用通常定义为两个或更多药物联合作用的效果大于预期的相加效果。相加效果通常被认为是协同作用检测方法的基线效果。因此，积极的研究正在探索将ADCs与各种其他类型的抗癌药物结合，如化疗、放疗、内分泌治疗、靶向分子药物和免疫疗法，无论是在临床前模型还是临床试验中。有兴趣开发合理的组合，与单一疗法相比，可以延长生存期。 在这篇综述中，我们讨论了不同ADC联合疗法的机制，并回顾了正在进行的临床试验，以选择和评估它们。最后，我们概述并检查了从联合角度来看的关键的转化、统计和监管考虑，突出了当前的进展和尚未解决的重大挑战。 2.ADCs与化疗药物的结合 将ADC与不同形式的化疗药物结合已被证明是一种被广泛接受的策略，用于克服药物抗性并在临床前和临床研究中实现有利的治疗结果。探索最有效的组合方案需要全面了解ADC抗体和有效载荷如何与化疗药物协同作用，影响细胞周期并改变表面抗原的存在。然而，到目前为止，许多ADCs仅仅是作为有毒载荷的载体添加到常用的化疗方案中，而没有考虑它们的协同效应，导致临床前和临床研究中的结果参差不齐。这突出表明了在设计ADC与化疗结合的临床试验方面继续努力的显著和未满足的需求。表2列出了此类试验的清单。 2.1.ADCs与化疗药物结合的机制 根据报道的发现，化疗和ADCs以包括针对细胞周期的不同阶段或调节肿瘤细胞表面抗原表达的方式协同作用。 2.2.细胞周期阶段阻断剂 许多化疗药物是DNA损伤剂，如抗代谢物、基于铂的化合物和拓扑异构酶抑制剂，它们针对细胞周期的S阶段并诱导G2/M期停滞，这可以有效地与含有针对细胞周期G2/M阶段的微管破坏载荷的ADC结合。这一概念已通过在卵巢癌临床前通过卡铂与mirvetuximab soravtansine（针对叶酸受体α的DM4）、anetumab ravtansine（针对间皮素的DM4）、或luveltamab tazevibulin（针对叶酸受体α的SC239）的有效组合得到说明。在早期阶段试验中，研究了基于ravtansine的ADCs与卡铂或多柔比星联合使用的协同效应，在卵巢癌患者中观察到积极的治疗反应，无论是对铂敏感还是耐药。 2.3.改善表面抗原表达 化疗伴侣的选择可能影响ADCs靶向的表面抗原的水平。例如，吉西他滨可以通过14.81倍上调胰腺腺癌细胞上的HER2表达，主要在G2/M期。因此，吉西他滨对DNA合成的影响使其对G1和早期S期细胞有效，而G2/M期细胞更具抵抗力。G2/M细胞中增强的HER2表达意味着吉西他滨与曲妥珠单抗emtansine（T-DM1，针对HER2的DM1载荷）有效结合的可能性更大，这有助于提高组合对胰腺导管腺癌细胞的疗效。因此，吉西他滨通过增强抗原可用性与T-DM1结合产生协同效应。然而，目前尚不确定这一观察是否适用于具有不同靶标的其他ADC-化疗组合，以及增加的抗原表达水平是否直接与ADC结合的实际可用抗原表位有关，甚至与ADCs的疗效有关。 2.4.不同药物的协调 给药时间是设计ADC组合时需要考虑的重要因素，因为大多数偶联物必须被肿瘤细胞内化才能有效，这涉及到系统运输和细胞进入过程。例如，DNA损伤引起的G2/M期停滞需要至少15小时的微管破坏剂才能发挥作用。Wahl等人在结直肠癌、肺癌和乳腺癌的临床前模型中巧妙地展示了这一概念。他们观察到，SGN-15（针对Lewis Y抗原的doxorubicin载荷结构）后跟紫杉醇的顺序管理比同时治疗导致更大的DNA片段化。这一观察表明，在设计ADC组合时，药物给药的顺序可能需要考虑。 然而，这些概念尚待临床试验评估，并应根据公认的ADC内化率和细胞周期进展在个别肿瘤类型中的情况进行探索。 2.5.ADC-化疗组合的安全性概况 值得注意的是，ADCs和化疗的结合带来了与重叠毒性相关的挑战。在这方面，临床试验已经获得了深刻的见解。例如，一项评估T-DM1与多西他赛（有无帕妥珠单抗）联合用于HER2阳性乳腺癌的研究显示，大约80%的转移性乳腺癌患者出现了剂量限制毒性（DLTs）和3级及以上不良事件。这些不良效应包括中性粒细胞减少、疲劳、鼻出血、口腔炎、恶心和腹泻。同样，T-DM1与卡培他滨的组合导致停药率增加，而没有显著提高反应率。在DESTINYGastric03试验中，曲妥珠单抗deruxtecan（T-DXd）与5-氟尿嘧啶（5-FU）或卡培他滨的组合导致转移性HER2阳性胃癌患者显著的毒性，剂量限制性口腔炎和3级及以上不良事件发生率高。 Datopotamab deruxtecan（Dato-DXd）与基于铂的化疗和pembrolizumab的组合在相当比例的患者中导致显著的3级及以上毒性，以恶心、贫血、疲劳和口腔炎的常见发生为特征。此外，在一项Ib期试验中，mirvetuximab soravtansine与卡铂的组合导致了显著的毒性，包括恶心、呕吐、腹泻、眼睛问题、疲劳和细胞减少。 总之，这些研究表明，当ADCs与常规化疗结合时，毒性显著增加。这可能是由于ADC载荷的非靶向和非肿瘤效应导致的毒性重叠所致。 表2 研究ADCs与化疗组合的临床试验摘要 3.ADCs与内分泌疗法的结合 内分泌疗法是一种广泛用于治疗激素敏感性癌症（例如，乳腺癌和前列腺癌）的治疗手段。它通过阻断激素合成或干扰刺激肿瘤细胞生长的激素来发挥作用。ADCs和内分泌疗法药物都能诱导细胞效应，共同阻碍肿瘤细胞的生存和增殖。联合疗法通过使用具有不同作用机制的多种药物，降低了肿瘤细胞发展抗药性的可能性。已有一些与ADC结合内分泌疗法相关的临床试验（表3），但缺乏探索联合作用机制的基础研究。 表3 研究ADCs与内分泌疗法组合的临床试验摘要 3.1.ADC-内分泌疗法组合的安全性概况 内分泌疗法的副作用很小。这使临床医生更有信心在内分泌疗法中加入ADC药物，正如KATHERINE III期临床试验所展示的那样。在这项试验中，将T-DM1的辅助应用与曲妥珠单抗在经过新辅助HER2靶向治疗后仍有残留疾病的HER2阳性乳腺癌患者中进行了比较。两个治疗组都被允许包括同时进行的辅助内分泌疗法。接受T-DM1有或没有内分泌疗法的患者显示出可比的任何级别的毒性率。同样，在3级及以上不良事件（26.0%对24.9%）、严重不良事件（12.9%对12.2%）和导致T-DM1剂量减少的事件（11.0%对15.0%）方面，两组之间没有显著差异。 已在早期和晚期HER2低表达乳腺癌患者中研究了将内分泌疗法与T-DXd结合使用的可能性。TALENT研究是一项随机II期试验，评估了在早期乳腺癌和低HER2表达患者中使用新辅助T-DXd，有或没有阿那曲唑的疗效。有趣的是，这项研究表明，两个治疗组显示出类似的毒性概况，突出了这种组合方法的可行性。同样，Ib期研究DESTINY-Breast08揭示了将阿那曲唑或氟维司群添加到T-DXd中没有导致任何剂量限制毒性（DLTs）。这种组合方法被观察到在转移性HER2低乳腺癌患者中维持了类似于单独使用T-DXd的毒性概况。 总的来说，ADCs和内分泌疗法的联合使用似乎不会导致毒性增加。这一观察结果与每种药物独立使用时表现出的不同不良效应模式一致。这也与大多数内分泌疗法相比其他系统性癌症治疗的有利安全性概况一致。 4.ADCs与放疗的结合 放疗与ADC的结合包括外部放射治疗与ADC以及放射性核素抗体偶联物（RACs）。RACs，也称为放射性免疫偶联物、放射性免疫疗法或靶向放疗，是一种使用带有放射性同位素（放射性核素，通常是β发射体）标记的特异性单克隆抗体的医疗治疗方法，正如Mattes 的综述所述。因此，RAC在本次综述中没有讨论。根据放疗和ADC给药的时间，组合是同时进行的或顺序的。同时放疗涉及ADC和放疗的同时给药。然而，顺序ADC给药的定义在研究中有所不同：当ADC在放疗前给药时，时间跨度为77至131天，当在放疗后给药时为420至1426天 。分割方案包括常规分割放疗和立体定向放射外科（SRS）/立体定向体放疗（SBRT）。表4显示了ADCs与放疗结合的临床研究。 表4 研究ADCs与放疗组合的临床试验摘要 4.1.ADCs与放疗结合的机制 放疗和ADC结合应用的协同机制包括放疗通过调节肿瘤细胞表面抗原表达，ADC增加肿瘤细胞对放疗的敏感性，以及其他潜在机制，如影响肿瘤微环境（TME）和血管通透性。 4.2.辐射诱导（新）抗原的产生 电离辐射（IR）引起组织形态和功能的改变。当“压力调节蛋白”被外部刺激高度上调时，肿瘤细胞更容易存活和传播。IR暴露后癌细胞表面表达的（新）抗原为开发癌症靶向治疗提供了机会。细胞粘附分子是首先被识别的IR诱导蛋白 。然而，这些诱导蛋白表达在微血管内皮细胞上，而不是肿瘤细胞上，有些从细胞表面脱落。葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是一种辐射诱导的内质网应激反应蛋白，在辐射抗性、增强肿瘤细胞增殖、防止凋亡和促进肿瘤血管生成中发挥重要作用。将GRP78抗体与放疗结合的有效性之前已有研究 。研究人员发现，针对GRP78功能域的抗体破坏了它与其结合伙伴的相互作用。因此，这降低了肿瘤细胞的活性并增强了放疗增敏。另一种辐射诱导的肿瘤特异性靶标，Tax相互作用蛋白1（TIP-1），在暴露于IR后转移到细胞质膜。基于这一发现，Lewis等人将一种高亲和力的抗TIP-1抗体（7H5）与载荷如单甲基奥瑞他汀E（MMAE）和缬氨酸-瓜氨酸（Vc）连接子结合，形成一种放疗增敏剂（7H5-VcMMAE）。7H5-Vc-MMAE与放疗结合使用导致肿瘤生长的延迟延长，并提高了A549和H1299非小细胞肺癌（NSCLC）动物模型的生存率。迄今为止，使用ADCs结合放疗靶向辐射诱导的抗原在临床试验中尚未探索。使用IR引导药物输送的新临床范式值得在涉及辐射抵抗性癌症患者的临床前和临床试验中进一步研究。 4.3.ADCs增加肿瘤细胞对放疗的敏感性 细胞周期阶段在决定细胞相对辐射敏感性方面起着重要作用 。细胞在G2/M阶段对IR最敏感，在G1阶段显示中等敏感性，在S阶段后期表现出最低的敏感性。基于这些发现，已经开发了许多放疗增敏药物，以增加抗肿瘤活性并优化患者结果。然而，在实践中，由于非靶向的副作用，放疗增敏药物的临床应用受到严重限制。为了解决这一关键挑战，放疗增敏载荷（例如MMAE、MMAF和DM1）已经与抗体偶联，以选择性地基于抗原过表达使肿瘤对放疗增敏。这些放疗增敏剂-ADCs能够增加肿瘤对放疗增敏剂的传递，增强辐射诱导的细胞毒性，并改善肿瘤控制 。此外，与放疗结合，放疗增敏剂-ADCs已被证明可以增强放疗的效果并提高肺癌、头颈部、食管、乳腺和胰腺癌的临床前肿瘤模型的生存率。 4.4.其他潜在机制 放疗不仅直接作用于肿瘤细胞，还以复杂和动态的方式影响TME。据报道，肿瘤血管内的几种辐射诱导分子，包括ICAM-1、E-selectin、P-selectin和β3 integrin，可能具有作为治疗靶标的潜力 。此外，越来越多的证据表明，放疗与TME之间的相互作用可以被利用来通过改变血管和基质来增强纳米颗粒和脂质体制剂在肿瘤中的积累和分布，其次是对缺氧、间质流体压力、实体组织压力以及骨髓来源的髓细胞的招募和激活的影响 。之前的一项研究发现，在高于400 cGy的剂量照射后24小时，肿瘤血管的通透性显著增加，导致辐射后抗体吸收增加。除了影响肿瘤血管，放疗还直接影响血脑屏障的通透性。Nakata等人发现，单一大剂量20-40 Gy在临床前促进了大鼠脑组织的血清白蛋白的渗出。然而，常规分割放疗，通常在诊所中使用，是否可以促进ADC穿透血脑屏障仍然未知，其潜在机制仍然不清楚。最后，放疗对肿瘤中抗体分布和可裂解连接子ADCs载荷的影响尚未被研究。 总结来说，放疗和ADCs结合的多种潜在协同效益和潜在机制值得在临床前和临床阶段进一步探索。 4.5.ADCs与放疗组合的安全性概况 放疗增敏剂-ADCs的临床应用也已得到评估。对于非CNS肿瘤，关于ADCs与不同放疗分割方案结合使用的安全性概况和有效性的充分证据不足。现有数据主要集中在乳腺癌治疗。KATHERINE试验评估了辅助T-DM1在新辅助抗HER2治疗后仍有残留疾病的HER2阳性乳腺癌患者中的有效性。结果显示，辅助T-DM1治疗降低了疾病复发和死亡的风险（50%）。在这项临床试验中，接受保乳手术的患者以及那些在乳房切除术后有局部晚期疾病（临床T3N+/T4Nx/TxN2-3疾病）的患者，在手术后60天内接受了放疗。然而，没有对接受放疗的患者进行针对放疗组合治疗安全性概况的亚组分析。与未接受放疗的组相比，放疗组观察到≥3级毒性增加（27.4%对16.2%）。观察到的与放疗相关的皮肤并发症的发生率相似，分别影响T-DM1和曲妥珠单抗组的25.4%和27.6%的患者。接受T-DM1治疗的患者观察到辐射诱导的肺炎和肺辐射损伤发生率略有增加（分别为1.5%和0.1%），与接受曲妥珠单抗治疗的患者相比（分别为0.7%和0%）。考虑到与曲妥珠单抗相关的潜在心脏毒性风险，进行了一项研究，以调查T-DM1与放疗结合使用的心脏安全性和可行性，在116名患者（nconcurrent=39, nsequential=77）中进行。大约95%接受T-DM1加放疗的患者成功坚持了≥95%的计划放疗剂量，延迟≤5天。在接受T-DM1后没有报告协议预先指定的心脏副作用或心力衰竭的病例。然而，Zolcsak等人介绍了T-DM1和放疗同时使用的14名患者中的初始安全性概况，这些患者被诊断为残留浸润性HER2阳性乳腺癌。为乳房或胸壁的辅助放疗提供了50Gy的剂量，分25次给药。观察到两名患者的左心室射血分数（LVEF）可逆性2级降低。考虑到T-DM1的作用机制涉及通过微管抑制剂进行放疗增敏，并且在缺乏坚实的安全数据的情况下，应谨慎进行同时放疗的给药。最近的临床研究表明，与T-DM1相比，T-DXd改善了无进展生存期（PFS）和总生存期（OS），但关于T-DXd和放疗组合使用的信息很少。T-DXd观察到药物相关间质性肺病（ILD）或肺炎的发生率增加（10.5%对1.9%），并且T-DXd治疗更频繁地报告了胃肠道毒性。T-Dxd与胸部或腹部放疗的组合需要极度谨慎。在转移性乳腺癌的背景下，一项病例系列研究评估了三名骨转移患者同时进行姑息性放疗和T-DM1的毒性。放疗领域涉及胸椎、骶骨和肩部，规定的剂量为15Gy，分五次给药，或8Gy，一次性给药。所有患者都经历了显著的疼痛缓解，并且没有报告与放疗和T-DM1同时使用相关的不良反应。此外，大约50%的HER2阳性转移性乳腺癌病例与脑转移有关。在CNS转移性肿瘤方面，关于ADCs和脑放疗同时给药的有效性和耐受性的高水平数据不足。从病例报告或少数患者的小系列中收集的证据表明，T-DM1和同时全脑放疗的组合是可管理的，没有严重的副作用或任何临床上显著的毒性增加。然而，在考虑同时或顺序SRS时需要谨慎，因为文献中记录了几例并发症。Carlson等人提出的病例系列显示，在接受T-DM1治疗后接受SRS的7名患者中有4名（57.1%）发生了辐射性脑坏死。这种临床辐射性脑坏死的高发生率显然是不可接受的。在另一项涉及45名被诊断为乳腺癌CNS转移的患者的研究中，Stumpf等人观察到当T-DM1与SRS同时给药时，辐射性坏死的风险增加了13.5倍。DEBBRAH II期研究表明，将颅内治疗与T-Dxd和放疗结合使用是可行的，显示出在接受全脑放疗和/或SRS的HER2阳性和HER2低乳腺癌患者中毒性可管理。然而，作者没有提到放疗和T-DXd顺序给药之间的时间。值得注意的是，这些研究之间观察到显著的异质性。关于原发性CNS肿瘤，已经有关于ADC和放疗组合的有效性和安全性结果的一些数据。一种与MMAF偶联的抗EGFR抗体，Depatuxizumab-mafodotin（Depatux-M），被用于接受标准治疗的胶质母细胞瘤（GBM）患者，该治疗包括放疗加替莫唑胺。Depatux-M与放疗和替莫唑胺联合治疗新诊断GBM的安全性概况是可以接受的。然而，中期分析显示，对于新诊断的EGFR扩增GBM的治疗，Depatux-M没有产生OS益处，尽管PFS更长。研究在早期阶段被终止。这些负面结果的潜在原因如下：1. Depatux-M可能对治疗GBM无效；2. 有可能Depatux-M有效地消除了EGFR扩增（特别是EGFRvIII突变）肿瘤细胞，提高了PFS；然而，抗性克隆出现并抵消了任何OS益处，这一假设得到了来自患者衍生异种移植物的结果的支持；3. 血脑屏障的异质性传递限制了Depatux-M在CNS肿瘤中的有效性，不可裂解的连接物对肿瘤内药物扩散不利。 总结来说，放疗增敏剂-ADCs与放疗结合是一种有前景的治疗策略；然而，迫切需要关于其安全性的高水平证据。 5.ADCs与分子靶向癌症治疗的结合 靶向治疗，包括单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）和抗血管生成剂，已经用于临床实践数十年，用于治疗具有特定突变、过表达和扩增的肿瘤，具有临床证明的安全性和有效性。然而，这些治疗与ADC结合的有效性仍然不甚了解。在本节中，我们重点讨论将ADCs与靶向治疗相结合的治疗策略，并讨论它们的潜在协同效应和安全性概况。相应的临床试验见表5。 表5 研究ADCs与靶向治疗组合的临床试验摘要 5.1.ADCs与靶向治疗结合的机制 分子靶向药物（包括抗体）和ADCs的联合效应涉及多种机制，如通过靶向肿瘤血管改善肿瘤内药物输送、调节肿瘤细胞表面抗原表达、克服肿瘤内异质性和肿瘤药物抗性以及合成致死性。 5.2.增强的细胞摄取和抗肿瘤活性 ADCs的大分子大小限制了渗出并导致ADCs在肿瘤组织中的分布受损，最终导致效果不佳。已经确定了影响ADC输送的两种屏障：血-肿瘤屏障，一种物理屏障，以及结合位点屏障（BSB），一种生物学屏障。在血-肿瘤屏障微环境中，实体瘤中的血管由许多不成熟和无序的血管组成，导致血流不畅和缺氧。与此同时，高肿瘤间质渗透压使肿瘤血管塌陷，从而限制了ADCs从血液进入肿瘤间质液的对流传送。改变肿瘤血管的主要方法包括使用诸如抗血管内皮生长因子抗体如贝伐单抗等药物调节血管生成和血管孔隙性。Jose F Ponte等人表明，mirvetuximab soravtansine（一种FRα靶向ADC）和贝伐单抗的联合治疗迅速破坏了肿瘤微血管并引起广泛坏死，并提高了对铂类耐药的上皮卵巢癌（EOC）模型的疗效，强调了联合治疗的优越生物活性概况。另一项临床前研究表明，anetumab ravtansine（一种间皮素靶向ADC）与贝伐单抗的联合使用提高了ST081和OVCAR-3人类卵巢癌模型的抗肿瘤活性。两项研究调查了mirvetuximab soravtansine与贝伐单抗联合治疗晚期卵巢癌的安全性和有效性，表明mirvetuximab soravtansine（6 mg/kg调整理想体重）和贝伐单抗（15 mg/kg）的联合治疗，每三周静脉注射一次，耐受性良好，并在接受复发性上皮性卵巢、输卵管或原发性腹膜癌的患者中显示出令人鼓舞的疗效。然而，关于ADC与抗血管生成治疗结合的观点并不一致。Arjaans等人报告称，贝伐单抗触发的肿瘤血管正常化妨碍了抗体的摄取。从正常化到过度修剪的时间跨度取决于抗血管生成剂的剂量和给药后的持续时间，这已被证明是具有挑战性的。重要的是，当贝伐单抗与mirvetuximab soravtansine一起引入时，在六名患者（9%）中检测到1-2级肺炎，而单独使用mirvetuximab soravtansine时没有观察到肺炎病例。因此，迫切需要严格设计临床前和临床试验来探索这种联合治疗引起的肺炎的潜在机制。由于贝伐单抗可能导致ADCs在肿瘤中的积累减少，因此在非临床试验环境中与ADCs和贝伐单抗的联合治疗必须谨慎进行。 BSB是肿瘤血管区域的生物学屏障，由于抗体在渗出点成功结合细胞抗原，导致抗体隔离和肿瘤暴露不足，从而限制了高亲和力抗体的有效性。许多因素，包括抗原表达升高和快速抗原内化结合肿瘤摄取缓慢和治疗性抗体的缓慢间质扩散，导致抗体渗透到肿瘤的能力差。瞬时竞争性抑制是改善固体肿瘤中抗体分布的一种策略，是克服BSB的一种方法。T-DM1和帕妥珠单抗的联合使用在细胞培养模型中显示出协同活性，并在Ib和II期研究中具有可接受的安全性概况。Bordeau等人发现，与曲妥珠单抗共同给予的抗-曲妥珠单抗单域抗体（1HE）显著增加了曲妥珠单抗从血管的渗透以及肿瘤区域染色为曲妥珠单抗阳性的百分比。1HE与单剂量T-DM1共同给予NCI-N87异种移植小鼠显著增强了T-DM1的疗效并增加了中位生存期。然而，多项III期临床试验（MARIANNE、KRISTINE和KAITLIN）的结果显示，T-DM1与帕妥珠单抗（T-DM1+P）的方案减少了3级及以上不良事件，并确保了更好的生活质量，并且这种方案比化疗与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的方案具有更高的无事件生存和无侵袭性疾病生存的机会。然而，尽管单克隆抗体与ADCs的结合可以克服BSB，改善ADCs在肿瘤细胞中的分布和抗肿瘤效果，并减少毒性，但ADC仍然无法替代标准化疗。 总结来说，ADCs与抗血管生成治疗的剂量和时间窗口应在未来的进一步探索。建立合理的模型至关重要。目前数据显示，裸抗体与ADC结合可以克服BSB，增加肿瘤渗透和抗肿瘤效果；然而，它们仍然无法在临床环境中替代传统化疗。 5.3.表面抗原的上调以及克服肿瘤内异质性和药物抗性 肿瘤内异质性是导致治疗失败的关键因素。此外，肿瘤治疗中补偿途径的出现是药物抗性的一种机制，通常伴随着表面抗原的下调。肿瘤异质性和药物抗性是癌症治疗和研究中的主要挑战。单克隆抗体和TKI的不同作用位点使得联合治疗成为克服这些困难的潜在策略。在组合靶向阻断中加入TKI可能提供更大的选择性，潜在地改善治疗指数。能够克服ADC抗性的TKI的数据很少。最近，有一项关于T-DM1抗性的临床前研究被报道。PLK1，一个关键的细胞周期调节因子，在获得性和原发性T-DM1抗性模型中都被上调。使用volasertib抑制PLK1在体外和体内都导致了T-DM1的再次敏感。ADCs也可能是调节靶向药物抗性机制的有效伴侣。患有NSCLC的患者经常发展出对EGFR TKIs的获得性药物抗性。HER3是ERBB家族中一个独特的伪激酶成员。它与其他ERBB家族成员（EGFR和HER2）二聚体化，并且在EGFR突变的NSCLC中经常过表达。Haikala等人报告称，奥希替尼通过抑制EGFR导致HER3膜表达增加，并促进HER3-DXd ADC内化和效力，支持在EGFR突变肺癌的临床前发展中，EGFR抑制剂/HER3-DXd组合的临床发展。另一个例子是EGFR-TKI奥希替尼和T-DM1的联合给药，这有助于发挥协同的抗肿瘤效果，其中T-DM1能够延迟或克服EGFR突变NSCLC模型中奥希替尼的抗性。在黑色素瘤中，AXL高表达细胞对MAPK途径抑制剂有抗性，而AXL低表达细胞对它们敏感。异质性肿瘤显示出部分治疗反应，允许抗药性克隆的出现，这些克隆通常表达高水平的受体酪氨酸激酶AXL。Boshuizen等人发现，在一项临床前研究中，AXL-107-MMAE和MAPK途径抑制剂通过消除异质性黑色素瘤细胞池中的不同群体，协同抑制肿瘤生长。此外，BRAF/MEK抑制剂通过诱导AXL转录增强了AXL-107-MMAE的效果。在急性髓系白血病中，一项临床前研究发现了一个有前景且有效的抗白血病策略，即联合给予midostaurn（一种抑制FLT3途径的TKI）和一种新型FLT3靶向ADC。TKI诱导药物抗性和调节表面抗体表达的机制是复杂的，并且因不同药物而异。HER2靶向TKI（拉帕替尼、来那替尼、图卡替尼和波齐替尼）已被证明可以增加T-DM1的效果。然而，虽然拉帕替尼通过强有力的转录上调和减少泛素化增强了HER2的丰度，来那替尼通过刺激内化和内吞作用降低了表面HER2的丰度。图卡替尼对细胞表面HER2的效果仍然复杂，波齐替尼上调了外显子20突变型，而不是野生型HER2，表明协同机制独立于HER2表面密度。一些临床试验已经探索了TKI与ADCs联合使用。TEAL研究表明，将T-DM1、拉帕替尼和白蛋白结合型紫杉醇的组合用于HER2阳性乳腺癌患者的新辅助治疗，与标准紫杉醇、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合相比，产生了改善的反应，这在传统上具有挑战性的激素受体阳性亚组中更为明显。T-DM1/T-DXd和图卡替尼的联合方案用于先前接受过紫杉醇和曲妥珠单抗治疗的晚期乳腺癌进展，在接受ERBB2/HER2阳性转移性乳腺癌患者中显示出可接受的毒性和初步抗肿瘤活性，无论是否伴有脑转移。此外，正在进行的III期试验测试T-DM1或T-DXd与图卡替尼（HER-2CLIMB-02和HER2CLIMB-04），我们期待它们的结果。 5.4.合成致死性和联合靶向 合成致死性是针对DNA同源重组修复途径存在缺陷的肿瘤的一种有前景且临床有效的治疗策略。鉴于最近对癌症治疗中DNA损伤反应（DDR）途径的关注，包括ATR、ATM、DNA-PK、CHK1、CHK2、Wee1和PARP在内的几种DDR蛋白已被广泛探索为抗癌药物开发的有前景的合成致死性靶点。虽然PARP抑制剂在2014年首次获得临床批准，但针对其他DDR蛋白的抑制剂目前正在进行密集的临床研究。一些ADCs的一个子集将拓扑异构酶I（TOPO 1）抑制剂作为有效载荷。例如，TOPO 1，一种酶，启动双链DNA的一个链的切割，导致部分解旋和随后的链重联以释放张力。喜树碱及其衍生物结合到TOPO 1/DNA复合物并防止正确的重联。这种干扰可能导致由于部分切割的DNA积累而导致细胞死亡。SN38，喜树碱的半合成衍生物，是伊立替康的活性成分，已在sacituzumab govitecan中使用，这是一种临床批准的TROP2靶向ADC。另一个喜树碱衍生物，DXd，是exatecan的衍生物，其效力大约是SN38的10倍，IC50值为310纳摩尔。这种强效化合物被用作HER2靶向（DS-8201a）和TROP2靶向（DS1062）ADCs的有效载荷。PARP-1，PARP蛋白家族中最丰富的成员，已被观察到在整个细胞周期中与Topo I共定位。然而，当DNA损伤发生时，PARP-1从Topo I解离，导致酶活性降低。将TOPO I抑制剂与PARP抑制剂（PARPi）结合使用可导致双链DNA断裂（DSBs）的积累，通过延缓有效地精确修复DNA损伤的同源重组修复途径。这种DSB积累最终触发细胞凋亡和细胞死亡。此外，在缺乏功能性BRCA1/2基因或同源重组修复机制缺陷的细胞中，出现了一种称为非同源末端连接的替代但不太精确的DNA损伤修复途径。这种更容易出错的途径进一步使细胞走向无法修复的DNA损伤和细胞凋亡。最近的研究还表明，CPT-11（SN-38的前药）和PARPi的结合在体外实现了对BRCA1野生型和BRCA1突变三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系的协同抑制。同时，sacituzumab govitecan与奥拉帕尼、卢卡帕尼或他拉唑帕尼的结合也在携带BRCA1/2基因突变的HCC1806 TNBC肿瘤中，以及在野生型对应物中，协同抑制了肿瘤细胞生长并增加了DSBs。 5.5.ADCs与靶向治疗的联合使用的安全性概况 在目前批准的15种ADC中，T-DM1与靶向药物的联合使用具有最多的有效性和安全性证据。一项Ib期试验评估了T-DM1与HER2 TKI图卡替尼的联合使用。尽管这种联合使用被良好地耐受，但它与频繁的胃肠道和肝脏毒性相关。特别是，37%的患者经历了至少一次临床显著的不良事件，56%的患者需要停用图卡替尼。正在进行的III期HER2CLIMB-02试验评估了T-DM1与图卡替尼的联合使用，与单独使用T-DM1相比，这些结果可能为这种联合使用的额外毒性提供了更多的见解。另一项Ib期研究评估了间歇性抑制T-DM1和使用ribociclib的CDK4/6；然而，没有观察到DLTs。然而，由于血小板减少或中性粒细胞减少，58%的患者需要减少ribociclib的剂量，一名患者经历了2级QTcF延长。在涉及转移性TNBC患者的Ib期研究中，sacituzumab govitecan与PARP抑制剂talazoparib联合使用。该研究表明，主要由严重的骨髓抑制引起的几个DLTs，如初始研究结果所述。特别是，大多数注册患者经历了发热性中性粒细胞减少症。最后，一项Ib期研究评估了将bevacizumab添加到mirvetuximab soravtansine的效果。该研究包括对铂类耐药的卵巢癌患者。这种联合使用的毒性概况与单独使用ADC相似。然而，值得指出的是，在添加bevacizumab后，6名患者（9%）观察到1-2级肺炎。这与单独使用mirvetuximab soravtansine时未观察到肺炎形成对比。总结来说，尽管我们在临床前模型和临床试验中观察到TKIs和ADCs联合使用的有希望的结果，但其背后的分子相互作用还远远没有完全被理解。更好的机制理解有助于药物组合的选择和管理潜在的副作用。 6.抗体药物偶联物（ADCs）与免疫疗法的结合 越来越多的证据表明，ADCs对免疫治疗剂的有效性很敏感。将免疫疗法与ADCs结合使用是临床实践中的一个当前趋势，许多临床前研究和早期临床试验的初步结果表明，这种方法可以提高抗肿瘤效果。临床试验列在表6中。我们仍在等待大型队列随机III期临床试验的结果，以证明这种组合与传统治疗相比的有效性的确凿证据。 表6 研究ADCs与免疫疗法组合的临床试验摘要 6.1.ADCs与免疫疗法结合的机制 潜在的机制多种多样，包括Fc介导的效应功能、引发免疫原性细胞死亡（ICD）、树突细胞（DCs）的成熟、增强T细胞浸润、加强免疫记忆的强化以及表达免疫调节蛋白，如程序性死亡配体1（PD-L1）和主要组织相容性复合体（MHC）。多项研究表明，与免疫缺陷模型相比，ADCs在免疫能力完好的动物模型中发挥更强的效果，表明它们具有显著的免疫调节能力。这些发现为设计临床试验提供了基础，将低剂量ADCs作为免疫刺激剂纳入，以提高免疫疗法的疗效，同时避免不良影响。 6.2.Fc介导的效应功能 在ADC的设计中，抗体组分扮演着多方面的角色，而不仅仅是向癌细胞输送细胞毒素。其独特的Y形结构具有许多额外的功能，包括调节先天免疫反应。抗体的抗原结合片段负责识别目标抗原并确定其特异性，而结晶片段（Fc）与免疫细胞相互作用，并调节抗体在血液中的循环持续时间。事实上，Fc区域在几种关键功能中发挥着重要作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用和补体依赖性细胞毒性。前两个作用的有效性依赖于Fcγ受体（FcγRs），这些受体存在于自然杀伤细胞、巨噬细胞和其他各种免疫细胞上。相反，补体依赖性细胞毒性是由C1q蛋白触发的。 IgG抗体家族由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类组成，每个亚类对抗体溶解度、半衰期、与C1q蛋白的相互作用以及与FcγRs的结合强度等因素产生不同的影响。IgG1亚类抗体是15种临床批准的ADCs中最常用的。选择IgG1作为ADC的骨架原因是它具有大约21天的长半衰期，与IgG2和IgG4相似，但以其增强的激活补体系统和结合FcγRs的能力为特征。相比之下，IgG2和IgG4在触发效应功能方面的效力有限，并且在抗体设计中被策略性地使用，当诱发免疫反应不是主要目标时。相比之下，IgG3是最具有免疫原性的亚类，能够诱发免疫反应。然而，这些抗体通常在ADC设计中被绕过，因为它们的半衰期短（大约七天）。 在临床前模型中，T-DXd和T-DM1都表现出维持未偶联曲妥珠单抗固有功能的能力，包括触发与IgG1亚型相关的ADCC。除了这些治疗益处外，Fc介导的效应功能也带来了不良副作用。例如，T-DM1通过与其FcγRIIA的相互作用被巨核细胞内化，这可能导致这种药物已知的副作用——血小板减少症的发展。 调节ADC与免疫系统的互动能力可能涉及Fc区域的工程改造。一种方法是生产无岩藻糖化IgGs，这通过增加与FcγRIIIa的结合亲和力来增强ADCC。相反，Fc区域可以通过引入影响效应功能的突变来修改，产生所谓的“Fc沉默抗体”。例如，MEDI4276采用这种策略，在其Fc域中引入三种突变，以减少FcγR结合，旨在最小化T-DM1观察到的血小板减少症。 另一种涉及Fc与FcγRs之间相互作用的方法发生在TME中，其中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）占相当大的比例。在临床前模型中，非靶向ADCs已被证明被TAMs有效吞噬。通过FcγRs的参与，TAMs内化并处理这些ADCs，导致在TME中释放细胞毒素有效载荷。这导致邻近肿瘤细胞的死亡，称为“旁观者效应”。这种机制可以提高ADCs对表现出异质性或低水平目标抗原的肿瘤的疗效。 然而，重要的是要认识到，这种不依赖抗原的ADCs被TME内非恶性细胞吸收的机制可能会加剧ADCs的毒性。例如，它可能导致ADCs的更快清除和降低整体疗效。另一个与在TME中释放细胞毒素有效载荷和随后的旁观者效应相关的理论关注是，可能破坏局部T细胞，这可能对免疫检查点抑制剂（ICIs）的疗效产生负面影响。 总结来说，虽然ADCs的Fc与TME之间的相互作用代表了提高ADCs对具有挑战性特征的肿瘤活性的潜在途径，但必须仔细考虑在提高疗效与潜在缺点（如增加毒性和干扰免疫检查点抑制）之间取得平衡。 6.3.免疫原性细胞死亡 根据初始刺激，癌细胞死亡可以激活免疫系统（免疫原性）或不被免疫系统察觉（非免疫原性）。ICD是一个调节过程，其特征是在内质网和细胞结构中引起压力。这个过程伴随着细胞表面组成的变化和可溶性介质的随后释放，这些介质遵循精确的空间时间序列，最终导致细胞死亡。药物诱导ICD和建立免疫记忆的能力通常通过其在体外诱导损伤相关分子模式（DAMPs）的能力来预测。包括传统化疗、放疗和靶向抗癌药物在内的多种抗癌疗法已显示出诱导DAMPs的潜力。只有一小部分（<10%）的所有化疗药物，如蒽环类抗生素和奥沙利铂，被归类为诱导ICD的药物。在ADCs中使用的大多数细胞毒素有效载荷在实验室和活体生物中都能激活免疫细胞，这不仅提高了它们的抗肿瘤效果，而且在临床前模型中与ICIs的效应协同增强。 在小鼠模型中，带有美登素、吡咯并苯并二氮杂环和微管抑制蛋白等有效载荷的ADCs已被证明能够诱导ICD，触发免疫调节，并建立免疫记忆。这些ADCs不仅表现出强大的细胞毒性，而且还与各种ICIs协同作用。值得注意的是，这些ADCs在免疫能力完好的小鼠中表现出的抗肿瘤活性显著大于在免疫缺陷的小鼠中，这突出了免疫系统在它们的效力中的作用。同样，一种新开发的含有强效蒽环类衍生物有效载荷的抗HER2 ADC（T-PNU）增加了DAMP表达，并在与抗PD-1药物联合使用时在乳腺癌模型中提高了效果，该模型对其他HER2靶向疗法产生了抗性。值得注意的是，当CD8+T细胞被耗尽时，T-PNU的效果显著降低，证实了适应性免疫系统在调节T-PNU抗癌活性中的关键作用。此外，T-PNU似乎促进了肿瘤携带动物的免疫记忆形成，从而防止了肿瘤的再次挑战。这种由ICD诱导的内在炎症反应也已在brentuximab vedotin、ladira tuzumab vedotin和enapotamab vedotin中观察到，这三种ADC共享相同的MMAE有效载荷。这种独特的属性进一步提高了ICIs的效果。 6.4.树突细胞的直接激活和成熟 成熟的DCs在肿瘤免疫中起着关键作用，它们作为抗原呈递细胞，能够通过MHC II类复合物激活抗肿瘤T细胞反应。然而，癌细胞经常通过抑制DC成熟或使它们功能失常来发展免疫抑制，最终导致免疫逃逸。克服这些障碍对于改善临床实践中的免疫治疗结果至关重要。 以前的研究表明，能够破坏微管的化合物能够诱导DCs表型和功能的成熟，这在使用如紫杉醇这样的微管稳定化合物时没有观察到。这种现象似乎是这类化合物的一个共同特征，表明它们作为“免疫刺激”剂的潜在用途。这种免疫刺激效应首先在长春碱中报告，随后在许多其他微管破坏剂中报告，如美登素类（例如，ansamitocin P3及其合成衍生物DM1）和多拉司他汀（auristatins衍生物），它们经常用作ADCs的有效载荷。在临床前模型中，这些有效载荷已被证明可以直接触发DCs的激活和成熟。重要的是，即使在没有癌细胞死亡的情况下，也观察到了这些强大的免疫调节效应，表明了一种独立的二元作用模式。这些ADCs的完整治疗效果包括有效载荷的细胞毒性和免疫调节功能；后者强烈依赖于完整的宿主免疫系统，在免疫缺陷的小鼠模型中显著降低。 结合基于微管抑制剂的ADCs和ICIs的临床前研究已经证实，这两种治疗方式可以协同作用，增加治疗效果，而不是仅仅有相加效果。在肿瘤对联合治疗完全响应的情况下，小鼠在再次挑战同一肿瘤时显示出保护，表明成功建立了免疫记忆。值得注意的是，对28名接受T-DM1短期术前治疗的乳腺癌患者的配对样本分析，作为WSG-ADAPT方案子试验的一部分，发现肿瘤浸润性T细胞的数量和密度显著增加。有证据表明，拓扑异构酶I抑制剂也可以通过激活DCs作为免疫调节剂，如T-DXd，这是一种携带exatecan衍生物DXd（一种拓扑异构酶I抑制剂）作为有效载荷的HER2靶向ADC。T-DXd被发现显著增加了肿瘤浸润性DCs的存在和成熟和激活标志物的表达，导致肿瘤浸润性CD8+T细胞的增加，以及肿瘤细胞上PD-L1和MHC I类表达的增加。值得注意的是，在CT26-HER2肿瘤模型中，T-DXd与抗PD-1药物的联合使用被证明比单独治疗更有效，可能是因为T-DXd诱导的免疫调节变化。值得注意的是，与其他同类产品相比，T-DXd的有效载荷具有更强的拓扑异构酶I抑制活性（比SN-38强10倍），这可能导致比其他同类产品更强的免疫效应。 6.5.结合ADCs和ICIs 目前，HER2靶向ADCs因其与ICIs联合使用的协同效应正在接受密集的临床研究；然而，许多试验仍在进行中，确定性的证据非常有限。唯一发表的评估ADC和ICI联合使用的随机试验是KATE2试验。这项研究评估了T-DM1加阿特珠单抗的有效性，并将其与T-DM1加安慰剂进行了比较。该研究在之前接受过HER2阳性乳腺癌治疗的患者中进行，令人失望的是，联合疗法并没有在整体患者人群中导致PFS的统计学显著改善，联合治疗组的中位PFS为8.2个月，对照组为6.2个月（P=0.33）。然而，观察到一种趋势，表明在特定亚群中可能有益，这些患者的PD-L1表达为阳性，其中联合治疗组的中位PFS为8.5个月，对照组为4.1个月（P=0.099）。这表明在HER2+乳腺癌的HER2靶向治疗中加入ICI可能对PD-L1阳性亚群特别有益。大多数纳入已发表研究的癌症患者之前没有接受过ICI治疗。因此，我们不确定ADC在与ICIs联合使用时可能提供的协同效益，特别是在已知对免疫疗法反应良好的肿瘤类型中。然而，目前可用的临床数据表明，与这些特定肿瘤类型的单独免疫疗法的历史疗效结果相比，反应率显著提高。在特定癌症环境中看到显著的疗效改善后，某些组合可能会成为新的护理标准，可能取代传统的细胞毒性治疗方法。为了说明这一理论，enfortumab vedotin（一种靶向nectin 4的ADC）和pembrolizumab的联合使用已被评估为局部晚期或转移性尿路上皮癌患者的一线治疗选择（如EV-103/KEYNOTE-869研究所示；ClinicalTrials.gov标识符：NCT03288545）。在这些患者群体中，联合疗法取得了令人印象深刻的客观反应率73%，并将PFS延长至12.3个月。这一结果导致美国FDA授予了突破性认定，特别是对于不能接受基于顺铂的疗法的患者。此外，其他癌症，包括宫颈癌、三阴性乳腺癌、霍奇金淋巴瘤和原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，在用抗PD-1抗体和靶向特定标记的ADCs（如组织因子、TROP2和CD30）联合治疗时也显示出令人鼓舞的结果。这种新型的联合治疗策略具有巨大的潜力，特别是对于年老体弱的患者，他们有更大的风险经历传统化疗方案的严重副作用。在未来的几个月和几年里，我们期望看到更多的试验结果，这些试验采用了各种免疫治疗剂来增强ADC活性。 6.6.ADCs与免疫疗法联合使用的安全性概况 在III期KATE2试验中，在之前接受过HER2阳性转移性乳腺癌治疗的患者中，观察到接受阿特珠单抗和T-DM1联合治疗的组中不良事件显著增加，包括一例与治疗相关的死亡。在引入阿特珠单抗后，临床显著不良事件（33%对19%）和大多数不良反应的频率，特别是发热（35%对16%，包括几次住院）增加。同样，现在也有了enfortumab vedotin有无pembrolizumab的随机数据，涉及149名晚期尿路上皮癌患者。引入pembrolizumab导致临床显著（23.7%对15.1%）和致命（3.9%对2.7%）不良事件的发生更高，以及所有不良事件的总体增加。值得注意的是，观察到严重皮肤反应的增加。尽管如此，该组合在2023年4月获得了FDA的加速批准，用于治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌患者，特别是那些不能接受基于顺铂的化疗的患者。这一批准是基于联合治疗的疗效。然而，大多数其他关于ADC和ICI联合疗法的研究缺乏随机设计，使得很难对许多未回答的问题得出明确结论。迄今为止，没有令人警惕的迹象表明ICIs与T-DXd、Dato-DXd或sacituzumab-govitecan联合使用会增加毒性，所有这些都有附加的毒性概况。这些安全性概况包括类似比例和强度的间质性肺病（ILD），这通常发生在基于DXd的ADC治疗中。有趣的是，ICIs的添加似乎并没有增加与ADCs相关的ILD发生率。正在进行的随机III期试验（NCT05629585, NCT05382286, 和 NCT05633654）预计将为这一领域提供额外的见解。这些试验可能会进一步阐明将ICIs与ADCs联合使用的治疗方法的毒性模式，超出T-DM1的范围。 7.结论 ADCs的单药治疗已在广泛的实体瘤和血液恶性肿瘤中显示出变革性的抗肿瘤效果。目前的研究现状特点是学术界和工业界都在大力推进对ADC联合疗法的理解，这包括通过识别新的肿瘤靶点和阐明其药理特性来推进下一代ADCs的发展。值得注意的是，ADCs与化疗或化学免疫疗法方案（不包括ICIs）的结合，在随机研究中对血液恶性肿瘤已显示出比既定标准方案有明显生存优势。尽管ADCs与ICIs的结合已展现出令人鼓舞的结果，如enfortumab vedotin和pembrolizumab在不适合顺铂治疗的尿路上皮癌中的FDA突破性认定，但在随机对照试验的背景下，实体瘤预期的生存改善和潜在的生物学机制仍然难以捉摸。此外，ADCs与靶向药物的联合，特别是针对HER2和DDR途径的抑制剂，具有巨大的潜力，尽管其潜力取决于通过更成熟的数据集进行验证。迄今为止，在第一代ADCs（例如T-DM1）的联合治疗中所见证的有限成功可以归因于许多因素，包括目标分子的非特异性表达，导致对正常组织的非肿瘤副作用、重叠的毒性、有限的疗效和不明确的抗性程序。基于ADC的联合疗法的现状仍然是动态的，当前的挑战突出了靶点表达的复杂性、肿瘤异质性和治疗方式之间复杂的相互作用。除了理解药理特性（例如DAR和旁观者效应）以提高ADC疗效外，还迫切需要对高反应率的患者进行分层，并检测相关的预测生物标记物谱。在精心特征化的来源于患者的异种移植模型中进行临床前实验，并在机会窗口的背景下进行临床试验，可能有助于在临床实践中识别有前景的基于ADC的组合。需要更具有策略性的方法来有效地识别适合选定患者群体和肿瘤类型的基于ADC的组合方法。这不仅将利用ADC设计和特性的改进，而且还将利用明智的患者选择策略来优化治疗结果。 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。