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引言 2型糖尿病（T2D）是一种常见的慢性代谢性疾病，其特点是身体不能有效利用胰岛素（胰岛素抵抗）或胰腺无法分泌足够的胰岛素，导致血糖水平升高【1-3】。胰岛素是一种由胰腺β细胞分泌的激素，帮助细胞摄取和利用血糖。当身体对胰岛素不敏感时，胰腺必须分泌更多的胰岛素来维持正常的血糖水平。随着时间的推移，胰腺可能无法跟上这种需求，导致胰岛素不足，进而引发高血糖。T2D的主要风险因素包括不健康的饮食、缺乏运动、超重或肥胖、遗传因素和年龄的增长。该疾病通常起病缓慢，可能无明显症状，但长期高血糖可引发心脏病、中风、肾病、视力丧失等严重并发症。由于遗传和环境因素共同作用导致T2D的发病，因此GWASs研究已经将超过600个序列突变与T2D关联起来【4,5】。这些变异大多位于非编码区，与胰腺β细胞的顺式调控元件（CREs）高度富集有关，表明这些变异可能通过改变CRE功能和效应基因表达，导致胰岛β细胞功能障碍和衰竭。T2D的发病过程涉及遗传变异与环境应激因素（如内质网（ER）应激和炎性细胞因子应激）的动态交互作用。然而，目前关于非编码区变异如何在这些应激条件下影响胰岛的转录反应，了解仍十分有限。 近日，来自美国杰克逊基因组医学实验室的Michael L. Stitzel和Duygu Ucar合作在Cell Metabolism上发表了Resource类论文Multi-omic mapping of human pancreatic islet endoplasmic reticulum and cytokine stress responses provides type 2 diabetes genetic insights。在本研究中，作者利用多组学分析揭示了胰岛细胞在应对环境压力时的转录反应，并将这些转录反应与非编码区变异关联起来，这项研究为理解T2D的发病机制提供了新的见解。 为了揭示环境应急对胰岛细胞的基因转录影响，作者首先使用来自非糖尿病供体的胰岛细胞，将其暴露在ER应激（thapsigargin）和促炎性细胞因子（IL-1b + IFN-g）中，作为研究胰岛应激反应的模型，然后通过RNA-seq分析胰岛细胞的基因表达变化。数据表明，约30%的基因（5131个基因）对ER应激或促炎细胞因子应激产生响应，这些基因中有85%单独对某个应激条件发生反应。其中ER应激激活了与未折叠蛋白反应（UPR）和ER蛋白处理通路相关的基因，如ATF4、ERN1/IRE1a、DDIT3/CHOP等，这些基因与β细胞功能和存活密切相关。另外，ER应激还显著诱导了胆固醇合成、氨基酸生物合成等代谢通路，表明ER应激对细胞功能的影响比单纯的蛋白质折叠更为广泛。与促炎性细胞因子相关的基因主要涉及细胞因子和趋化因子信号传导途径（如NF-kB通路），这些通路与胰岛β细胞功能障碍有关。促炎性应激还激活了多个固有免疫途径（如NLRP3炎症小体和RIG-I样受体信号通路），这些通路与早期1型糖尿病（T1D）的自身免疫激活有关。 为了进一步解读胰岛中不同细胞类型（尤其是α细胞和β细胞）对ER应激和促炎性细胞因子的反应，作者继续利用同样的方法处理非糖尿病供体的胰岛细胞，随后进行scRNA-seq分析。研究表明，β细胞表现出比α细胞更强的对ER应激和促炎性细胞因子的敏感性，β细胞对ER应激的反应中有98个基因被激活，而α细胞仅有35个，其中30个基因是两者共有的。在应激处理的胰岛细胞中，DDIT3、S100A6和MT1F等基因显著在β细胞中诱导表达，而α细胞中没有明显变化。β细胞在ER应激下可分为两个不同的亚群：β簇1（BC1）：占94%的β细胞，显示出较为常规的应激响应；β簇2（BC2）：占6%的β细胞，表现出更为强烈的与细胞死亡相关的基因表达，如蛋白酶体超家族基因PSMB8、PSMB9、PSMB10，这些基因与蛋白质降解和凋亡密切相关。这表明β细胞在T2D的病理机制中可能起着更重要的作用。 接下来，作者利用ATAC-seq绘制胰岛细胞在ER应激和细胞因子应激条件下的CRE的可及性图谱，旨在找出与这些应激反应相关的CREs，并解析它们如何调控基因表达。研究发现，大约14%的CREs（14,968个CREs）在应激处理后发生了显著变化，大多数应激响应的CREs是特异性的，仅有393个CREs在两种应激条件下共同响应。对这些应激响应CREs进行基因组注释发现，约91%的应激响应CREs位于距离最近的基因转录起始位点（TSS）1 kb之外，表明这些CREs可能是增强子，调控基因在应激条件下的表达。通过将这些CREs与胰岛细胞中表达的基因联系起来，研究发现应激响应的CRE的开放或关闭与相应基因表达的变化一致。转录因子结合位点的富集分析显示，ATF4、CHOP和NFIL3等UPR介导因子在ER应激条件下显著富集，而IRF8、IRF3以及NF-kB家族成员p65（RELA）的结合位点在促炎细胞因子应激下富集，表明不同的应激通过不同的转录因子调控其特定的基因表达。此外，这些应激反应不仅影响胰岛细胞的染色质结构和基因表达，还可能通过下调关键转录因子如PDX1和MAFA，削弱胰岛细胞的功能，进而导致葡萄糖代谢失调，促进T2D的发生。 作者还分析了与糖尿病相关的遗传变异和胰岛细胞在ER应激或促炎细胞因子应激条件下的CRE变化之间的关系。通过分析多个GWASs数据集，作者共发现161个与T2D、1型糖尿病或相关血糖性状相关的变异与应急反应 CRE的开放或关闭有关。其中，21个T2D相关变异与ER应激特异性开放的CRE重叠，24个T2D相关变异与细胞因子应激特异性开放的CRE重叠。例如，rs4744423通过增强FOSB/JUNB的结合来调控ER应激下AOPEP基因的表达，而rs6444081则通过破坏NRF2的结合位点，减少ETV5基因的表达，削弱胰岛功能。 文章的最后，作者选择了一个T2D相关的遗传变异rs6917676进行细致的研究。结果表明，rs6917676-T风险等位基因通过增强ER应激反应，增加MAP3K5表达，促进胰岛β细胞凋亡的分子机制。通过药物抑制MAP3K5，可能为减少T2D患者胰岛细胞凋亡、保护β细胞功能提供新的治疗策略。这些发现表明，特定的遗传变异可能通过改变胰岛细胞的应激反应，从而影响糖尿病的发生和发展。 模式图（Credit: Cell Metabolism） 总的来说，作者通过多组学研究剖析了ER应激和促炎症细胞因子应激对人类胰岛细胞转录调控网络的全基因组影响，并激发了将rs6917676风险等位基因与增强的ER应激反应性MAP3K5介导的β细胞凋亡联系起来的变异到功能研究。这项研究将遗传突变和环境因素的变化与胰岛细胞的转录影响关联起来，为理解T2D发病机制以及开发潜在的治疗方法提供了重要的借鉴意义。 参考文献 1. Halban, P.A., Polonsky, K.S., Bowden, D.W., Hawkins, M.A., Ling, C., Mather, K.J., Powers, A.C., Rhodes, C.J., Sussel, L., and Weir, G.C. (2014). b cell failure in type 2 diabetes: postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Diabetes Care 37, 1751–1758. 2. Lawlor, N., Khetan, S., Ucar, D., and Stitzel, M.L. (2017). Genomics of islet (Dys)function and type 2 diabetes. Trends Genet. 33, 244–255. 3. Ashcroft, F.M., and Rorsman, P. (2012). Diabetes mellitus and the b cell: the last ten years. Cell 148, 1160–1171. 4. Suzuki, K., Hatzikotoulas, K., Southam, L., Taylor, H.J., Yin, X., Lorenz, K.M., Mandla, R., Huerta-Chagoya, A., Rayner, N.W., Bocher, O., et al. (2023). Multi-ancestry genome-wide study in >2.5 million individuals reveals heterogeneity in mechanistic pathways of type 2 diabetes and complications. Preprint at medRxiv. 5. Vujkovic, M., Keaton, J.M., Lynch, J.A., Miller, D.R., Zhou, J., Tcheandjieu, C., Huffman, J.E., Assimes, T.L., Lorenz, K., Zhu, X., et al. (2020). Discovery of 318 new risk loci for type 2 diabetes and related vascular outcomes among 1.4 million participants in a multi-ancestry meta-analysis. Nat. Genet. 52, 680–691. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2024.09.006 责编|探索君 排版|探索君 来源|BioArt End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

这项研究发现了IFN感应性的丧失在多个动物模型中使得肿瘤对ICB更加敏感。这可以通过两种机制介导，第一是经典MHC-I类分子的上调能够抑制NK细胞，第二是非经典MHC-I类分子Qa-1b的上调可以通过 免疫检查点阻断（ICB）疗法在多种肿瘤中都取得了巨大成功。然而，仍有许多患者对ICB没有响应，不同肿瘤中的免疫逃逸机制也需要进一步探索。 近日，由布罗德研究所（Broad Institute）的Robert T. Manguso和Kathleen B. Yates带领的研究团队，在著名期刊Nature Immunology发表重要研究成果[1]。 为了发现肿瘤逃避免疫治疗的机制，他们在接受ICB治疗的癌症模型中，开展了基因组层面的CRISPR筛选。 他们的发现让他们大吃一惊：在多种肿瘤模型中，肿瘤细胞对干扰素（IFN）感应性的丧失，竟然使得肿瘤对ICB的响应更加敏感。 具体来说，肿瘤的IFN信号通过两种方式发挥免疫抑制的作用：第一，肿瘤IFN感应能够上调经典的第一类主要组织相容性复合体（MHC-I）抑制自然杀伤（NK）细胞；第二，肿瘤IFN感应通过上调非经典的MHC-I类分子Qa-1b抑制CD8+T细胞。 要知道，大量的研究表明IFN-γ在肿瘤的免疫监视中发挥重要作用[2-4]。这一发现可以说颠覆了我们对IFN-γ信号的认知。 论文首页截图 接下来我们就一起来看看这个研究是如何开展的。 研究团队利用代表了5种癌症类型（黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、肾癌和结肠癌）的8个小鼠肿瘤模型，进行CRISPR体内筛选，找出ICB治疗后富集或清除的sgRNA，以鉴定与ICB抵抗性或敏感性相关的基因（指该基因缺失时分别与ICB抵抗性或敏感性相关）。 他们发现Nlrc5、Pten、Casp8、Ccar1、Ubr5、Dot1lh、Smg9和Pdcd10的缺失与ICB抵抗性相关，并对Ccar1缺失这一新发现的ICB抵抗机制进行体内实验验证。 在ICB敏感性方面，除了已报道的Ptpn2、Traf2、Ripk1、Serpinb9、Cd47、Atg7外，研究团队还发现了Calr、Rnf31、Vps45、Ilf2、Pnpo、Kcmf1、Fitm2、Morc2a和Thop1的缺失与ICB敏感性相关，并进一步对Calr、Med16和Rnf31缺失介导的ICB敏感机制进行体内实验验证。 CRISPR筛选发现的与ICB抵抗性或敏感性相关的基因 研究团队进一步对清除的sgRNA进行了通路富集分析，令人意外的是，MHC-I类抗原呈递信号通路相关的基因在除Lewis肺癌细胞（LLC）外的所有模型中都被清除，细胞因子响应、II型IFN和先天免疫相关的基因也在多个模型中被清除。这提示这些基因的缺失可以使得肿瘤细胞对ICB更加敏感。 我们都知道，IFN-γ可以上调MHC-I类分子的表达，从而促进细胞毒性CD8+T细胞（CTL）识别肿瘤细胞[4]。还有很多研究表明，IFN感应性的丧失与ICB的抗性相关[2,3,5,6]。在类似的小鼠肿瘤模型中进行体外CRISPR筛选，发现肿瘤细胞IFN和抗原呈递通路的丧失会引起肿瘤细胞对CTL杀伤的抵抗[7]。而本研究发现抗原呈递和IFN通路相关基因的清除竟然与ICB的敏感性相关，这似乎与上述研究结果相矛盾。 为了搞清楚矛盾背后的原因，Manguso团队进一步对比了他们的体内CRISPR筛选结果和前人的体外CRISPR筛选结果，结果发现了一些与IFN（如Jak1、Ifngr1、Ifngr2）和抗原呈递（如Tap1、Tap2、B2m）相关的基因，在体外和体内CRISPR模型中分别发生了富集和清除。 这一发现提示，在体外研究中，这些基因的缺失可能促进了肿瘤细胞对T细胞杀伤的抵抗；而在体内研究中，这些基因的缺失让肿瘤细胞对T细胞更敏感。 体外模型与体内模型中CRISPR筛选得到的sgRNA对比 为了进一步探究IFN诱导肿瘤细胞对ICB抵抗的机制，Manguso团队对比了ICB治疗后的清除的sgRNA与IFN-γ刺激后改变的IFN刺激基因（ISG）。结果显示，抗原呈递相关基因（H2-T23、B2m、Tap1、Tap2、Tapbp和Erap1）在ISG中富集，这些基因同样在ICB治疗后清除的sgRNA中富集，这提示这些基因能够被IFN-γ刺激诱导上调，并与ICB治疗的抵抗性相关。 体外实验也说明，在IFN-γ或IFN-β刺激后，经典MHC-I类分子H-2K、H-2D，非经典MHC-I类分子Qa-1b以及PD-L1的表达会发生上调。这些结果提示IFN诱导的ICB抵抗机制可能是由MHC-I类分子的上调所介导的。 IFN-γ刺激能够诱导多种发挥ICB抵抗性的基因上调 为了验证这一假设，研究团队设计了一种体内竞争性实验，以检测IFN-γ感应基因和MHC-I类抗原呈递途径相关基因的遗传上位性。 他们将对照sgRNA和靶向Ifngr1或Jak1（IFN-γ感应基因）的sgRNA转染的KPC细胞（这些细胞分别是对照sgRNA背景、Tap1敲除背景和B2m敲除背景，Tap1和B2m为MHC-I类抗原呈递途径相关基因）1：1混合，然后将这些细胞分别在NSG鼠，WT鼠和接受ICB治疗的WT鼠体内成瘤，对比不同组中转染对应sgRNA的细胞的富集与清除。 结果显示，在对照sgRNA背景的细胞中，Ifngr1或Jak1敲除的细胞被清除；而在Tap1和B2m敲除背景的细胞中，Ifngr1或Jak1敲除的细胞没有发生显著清除。这提示相比于对照细胞，IFN感应性缺陷的细胞具有依赖于MHC-I类的竞争劣势，即IFN感应性通路发挥功能依赖于MHC-I类分子的表达。 IFN-γ感应基因发挥功能依赖于MHC-I类抗原呈递途径相关基因 在人类基因组中，6p21.3基因座编码MHC-I类分子表达相关的基因，如TAP1、TAP2、TAPBP、PSMB8和PSMB9等[8-10]。TCGA中多种癌种都有超过10%的肿瘤发生了6p21.3缺失，然而6p21.3缺失与绝大多数肿瘤患者的生存无关。 在接受抗PD-1治疗的肾透明细胞癌患者队列中，当肿瘤为6p21.3两倍性时，高ISG特征与患者更差的生存相关。然而在6p21.3缺失的肿瘤中，高ISG特征不再与患者更差的生存相关。这提示肾透明细胞癌中，IFN介导的ICB抵抗作用依赖MHC-I类分子。 肾透明细胞癌中高ISG特征仅在6p21.3两倍性肿瘤中与患者差的预后相关 研究团队为进一步鉴定体内杀伤IFN感应性缺陷肿瘤的免疫细胞，分别在ICB治疗时使用抗体清除CD8+T细胞、NK细胞和CD4+T细胞，结果显示NK细胞和CD4+T细胞的清除影响了对Jak1缺陷肿瘤细胞的杀伤，而清除CD8+T细胞对Jak1缺陷肿瘤细胞的杀伤没有影响。由于NK细胞不表达PD-1，而CD4+T细胞表达PD-1，研究团队推测ICB治疗后，CD4+T细胞辅助NK细胞发挥肿瘤细胞杀伤作用。 为进一步在体外验证NK细胞对IFN感应性缺陷肿瘤的杀伤能力，他们将Jak1缺陷和对照肿瘤细胞，分别与IL-12/18激活的NK细胞共培养，结果显示活化的NK细胞能够杀伤Jak1缺陷肿瘤细胞，而肿瘤细胞中Tap1或H2-K1的缺失可以逆转这一效应。这提示肿瘤IFN感应性可以通过上调经典的MHC-I类分子，在体内和体外抑制NK细胞的毒性。 Manguso团队进一步探究了哪些MHC-I类抗原呈递途径的基因发挥功能依赖于NK细胞，他们对比了NK细胞清除与不清除时，ICB治疗清除的sgRNA。结果显示，尽管Ifngr1、Ifngr2、Stat1、Jak1、Jak2和H2-K1的清除表现出NK细胞依赖性，靶向Tap1、Tap2、H2-D1和H2-T23这几个抗原呈递基因的sgRNA在NK细胞存在与不存在时都会发生清除。这说明部分MHC-I类抗原呈递分子的缺失，所引起的肿瘤细胞杀伤是非NK细胞依赖性的。 在上述基因中，H2-T23引起了Manguso团队的关注。因为H2-T23编码非经典MHC-I类分子Qa-1b（相当于人类中的人类白细胞抗原HLA-E），而Qa-1b能够结合抑制性受体NKG2A/CD94。这些结果提示尽管NK细胞介导了对IFN感应性丧失的细胞的杀伤，但是某些MHC-I类分子（如Qa-1b）的表达可能会抑制其他的效应性细胞群。 某些MHC-I类分子（如Qa-1b）的表达可能会抑制除NK细胞外的效应性细胞 为了探究Qa-1b表达抑制了哪些效应性细胞群，研究团队首先检测了Qa-1b的缺失是否会增强ICB响应。结果显示，Qa-1b的缺失会增强ICB响应，而Qa-1b的过表达能抑制ICB响应。 当在接受ICB治疗的小鼠胰腺导管腺癌（KPC）肿瘤模型中敲除HT-T23后，分别清除NK细胞和CD8+T细胞，结果显示NK细胞清除对于Qa-1b缺陷型肿瘤的ICB响应没有影响，而CD8+T细胞清除抑制了Qa-1b缺陷型肿瘤的ICB响应。这提示Qa-1b主要通过抑制CD8+T细胞发挥作用。 单细胞测序数据也提示，ICB治疗后引起效应、耗竭和增殖的CD8+T细胞亚群扩增。而效应、耗竭和增殖CD8+T细胞亚群高表达NKG2A（Klrc1）和CD94（Klrd1），这提示肿瘤细胞的Qa-1b表达可能通过与CD8+T细胞的NKG2A/CD94抑制性受体结合发挥作用。 ICB治疗时CD8+T细胞发挥杀伤Qa-1b缺陷肿瘤作用 由于IFN能够诱导Qa-1b的表达，Manguso团队假设肿瘤的IFN感应性可以通过Qa-1b抑制CD8+T细胞。然而由于肿瘤IFN感应性丧失可能引起经典的MHC-I类分子下调，导致对CD8+T细胞的抗性，从而掩盖IFN可能介导的抑制作用。为解决这个问题，利用嵌合抗原受体（CAR）T细胞进行杀伤试验，由于CAR-T细胞的识别不依赖于MHC-I类分子，可以避免IFN-γ处理后MHC-I类分子上调带来的影响。 他们首先检测了CD19 CAR-T细胞对Qa-1b缺陷型CD19+KPC细胞的杀伤能力，结果显示CD19 CAR-T显著杀伤Qa-1b缺陷型肿瘤细胞，提示Qa-1b能够抑制CAR-T的杀伤能力。 为探讨Qa-1b上调是否是由IFN介导的CAR-T细胞杀伤抵抗机制，Manguso团队将CD19 CAR-T细胞分别与IFNγ刺激的对照和Jak1（IFN-γ感应基因）敲除CD19+KPC细胞的混合物1:1共培养。结果显示，CAR-T细胞对于这2类细胞的杀伤能力没有显著差异，这表示CAR-T细胞消除了Jak1敲除肿瘤细胞的生存优势。 为了探究IFN诱导的PD-L1上调是否抑制CAR-T的杀伤能力，他们检测了CAR-T联合抗PD-1单抗时两组细胞的存活情况。结果显示当CAR-T联合抗PD-1单抗时，Jak1敲除肿瘤细胞存活增多，这提示PD-L1上调对T细胞杀伤能力发挥抑制作用，联用抗PD-1单抗能够杀伤更多对照组肿瘤。 当Manguso团队使用Qa-1b缺陷型KPC细胞或联用抗NKG2A抗体时，结果显示Jak1敲除肿瘤细胞存活显著增多。这些结果提示CD8+T细胞优先杀死具有完整IFN感应能力的肿瘤细胞，而Qa-1b的上调抑制这种杀伤能力。至于背后的机制，Manguso团队认为这可能是因为IFN能够诱导粘附分子（如ICAM-1）的表达[11]，进而促进CD8+T细胞的杀伤。 在体内实验模型中，Manguso团队发现CAR-T对Jak1缺陷型肿瘤杀伤作用明显，而这种杀伤能力在Qa-1b缺陷的肿瘤中消失。这些结果提示IFN信号可以通过上调Qa-1b来抑制CAR-T细胞毒性。 IFN信号通过上调 Qa-1b来抑制 CAR-T 细胞毒性 最后，Manguso团队探讨了IFN信号对于免疫治疗响应预测的能力。 他们分析了一组接受抗PD-1单抗治疗的黑色素瘤患者队列（6p21.3两倍性），发现ISG的表达与更好的响应相关，这一结果与前述的ccRCC患者队列中的结果相反。 这提示利用IFN特征预测ICB响应需要考虑CD8+T细胞和NK细胞的响应优势，在NK细胞响应占优时，IFN特征与接受抗PD-1治疗差的响应相关；而在CD8+T细胞响应占优时，IFN特征与接受抗PD-1治疗好的响应相关。 高IFN特征在不同肿瘤微环境中与不同的ICB响应相关 Manguso团队还评估了1个接受ICB治疗的202名黑色素瘤患者的队列，分别在基线、治疗后6周和治疗后6个月时间点取样，检测血清中ISG蛋白的水平。 结果显示，在治疗后6周时，响应和无响应患者血清ISG蛋白含量都会增加。而治疗后6个月时，无响应患者血清ISG蛋白含量显著增加。并且，在这2个时间点，血清ISG的变化都与患者更差的无进展生存相关。因此，接受ICB治疗过程中，对于ICB的抵抗可能与IFN和ISG的水平升高有关。 ICB治疗后血清ISG蛋白水平升高与治疗抵抗有关 总的来说，这项研究发现了IFN感应性的丧失在多个动物模型中使得肿瘤对ICB更加敏感。这可以通过两种机制介导，第一是经典MHC-I类分子的上调能够抑制NK细胞，第二是非经典MHC-I类分子Qa-1b的上调可以通过NKG2A/CD94抑制CD8+T细胞。 既往研究往往关注IFN感应性的丧失会引起对ICB的抵抗，这项研究提示了IFN感应性功能的复杂性，IFN介导的MHC-I类分子上调可以发挥促进对CD8+T细胞抗原呈递和抑制NK细胞的双重作用。在高表达NK配体（MICA和MICB）的肿瘤中，由于IFN驱动的MHC-I类分子上调可以抑制NK细胞，高ISG特征与差的响应相关。而在T细胞高度克隆扩增的肿瘤中，由于IFN能够促进对T细胞的抗原呈递，高ISG特征与好的响应相关。因此，ISG特征在肿瘤中的作用可能取决于肿瘤中的免疫效应主要由NK细胞还是CD8+T细胞介导。 除此之外，这项研究中发现非经典MHC-I类分子Qa-1b（HLA-E）可以发挥免疫抑制作用，非经典MHC-I类分子如HLA-F、HLA-G可能发挥的免疫抑制作用也值得进一步探索。