HER2 x Hyaluronic acid

导读：近年来，纳米医学领域研究取得显著进展，抗体偶联脂质纳米颗粒（Ab-LNP）因其强的特异性和治疗效果而成为一种有前途的靶向治疗递送策略。 2023年12月，Sanofi研发团队Sheryl Wang、Hong Wang等人在Molecular Pharmaceutics上发表题为《Unleashing the Potential: Designing Antibody-Targeted Lipid Nanoparticles for Industrial Applications with CMC Considerations and Clinical Outlook》的文章，对抗体工程、Ab-LNP的化学偶联和Ab-LNP的制备方法做了全面汇总，详见下文。 该文章同时分析了Ab-LNP的CMC产业化考量，菌菌将在下期文章中详细分享，关注~ 01  Ab-LNP的设计 就小分子药物而言，由磷脂和胆固醇组成的传统脂质体形成脂质双层，包裹治疗有效载荷的水性核心。对基于核酸的疗法（如siRNA和mRNA等递送），LNP常由可电离脂质和结构脂质组成。胆固醇和结构脂质控制颗粒的稳定性和尺寸；PEG-脂质可提高稳定性并帮助纳米颗粒逃避免疫系统的清除；可电离脂质的pH敏感性使LNP在生理pH值下具中性或阴离子电荷，在内体酸性环境中带正电荷，该特性可减少毒性及非特异性转导脱靶细胞类型和组织。 图1 LNP开发示意图 偶联抗体显著增强LNP的特异性，且抗体密度影响靶向效率、抗原亲和力和内化速率等多方面。多种偶联策略涉及抗体与脂质锚点的位点特异性连接，用于实现对抗体密度的精确控制。目前已出现由两种不同抗体偶联的LNP，这一发展对细胞群靶向和解决细胞表面异质抗原表达具有深远的影响。 图2 EphrinA2（EphA2）靶向Ab-LNP的示意图 02  抗体工程 据治疗性抗体数据库（https://tabs.craic.com）最新数据显示，目前已有148种基于抗体的疗法获得批准，含118种单克隆抗体和9种抗体-药物偶联物（ADC）。设计Ab-LNP中偶联的抗体需考虑靶标特异性、低免疫原性、偶联性、粒径、可及性和细胞内化等。 尺寸控制：Fab片段、单链可变区（scFv）或单结构域抗体（sdAb）等紧凑结构的抗体形式常用于Ab-LNP制备，这些较小的抗体有助于纳米颗粒渗透至实体组织或肿瘤中，Ab-LNP整体尺寸应约为100nm或更小。 免疫原性：通过抗体人源化等策略降低免疫原性，其对防止不良反应（如产生抗药抗体（ADA））至关重要。 抗原特异性：确保Ab-LNP以最小的脱靶效应递送至特定细胞。ELISA或流式细胞术等用于脱靶结合筛选，生物分布分析用于评估体内特异性。 稳定性：抗体的稳定性决定其完整性和有效性。采用差示扫描量热法（DSC）、差示扫描荧光法（DSF）、尺寸排阻色谱法（SEC）及动态光散射（DLS）等方法来评估稳定性。 设计Ab-LNP抗体的其他关键因素包括抗体的亲和力和活性、生产产量、药代动力学特性及生物分布。 03  抗体偶联方法 （1）碳二亚胺反应：将含羧基（-COOH）的脂质与抗体中的伯胺（-NH）偶联； （2）二硫键交换：抗体中半胱氨酸残基的巯基（−SH）与吡啶基二硫基反应性基团形成不稳定的二硫键； （3）Michael加成：PEG脂质的马来酰亚胺基团与部分还原抗体的巯基之间的反应。相较于使用三（2-羧乙基）膦（TCEP）选择性地还原铰链二硫化物，一种更可控的方法是将马来酰亚胺偶联到位点特异性半胱氨酸上，如HER2 scFv与马来酰亚胺末端的PEG-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（Mal-PEG-DSPE）的偶联物在GMP中得到证明。 人们对基于“点击化学”（具有良好反应速率、位点特异性和生物正交性的化学反应）的位点选择性抗体偶联越来越感兴趣，其中独特的四嗪连接可在生理条件下实现高效、及时的脂质抗体偶联。此外，肽标签可在C端或溶剂可及的框架表面环中进行设计，以实现酶依赖性偶联。如甲酰甘氨酸生成酶（FGE），可用于以位点特异性方式在肽标签中引入反应性基团；转谷氨酰胺酶，可识别肽标签中的谷氨酰胺，以便与含胺脂质进行位点特异性偶联。 已有抗体与表面含有马来酰亚胺脂质的LNP直接表面偶联的报道，其中反应性硫醇可偶联到脂质胶束上，纯化后插入LNP后偶联，中间抗体-脂质偶联物的生产受到青睐，因其可促进偶联物的分析表征和纯化，提供对插入LNP的抗体密度精确控制，并确保可重复性。 评估抗体偶联对其功能的影响非常重要，包括抗原结合能力、稳定性和免疫原性。如用于评估结合能力的表面等离子体共振（SPR）、用于评估稳定性的热稳定性分析及确定免疫原性的ADA分析等检测对于确认抗体在偶联后保持其功能至关重要。 04  Ab-LNP制备方法 4.1 一锅法制备Ab-LNP 一锅法在颗粒形成过程中结合配体-脂质偶联物，配制过程中配体的稳定性至关重要，尤其对于疏水性或高分子量配体。常用一锅法将具有强理化稳定性和水溶性的配体掺入Ab-LNP中，如叶酸和甘露糖配体。 4.2后修饰法制备Ab-LNP Ab-LNP表面引入配体还可采用表面偶联法和后修饰法，表面偶联法涉及配体与颗粒表面官能团的共价连接。而后修饰法将预先形成的脂质纳米颗粒与胶束配体-脂质偶联物在水溶液中混合，通过脂质插入将配体有效地附着在纳米颗粒的表面；或将含有点击化学官能团的PFG-脂质胶束插入预制脂质体或LNP中，用修饰配体进行点击化学以实现表面偶联。 图3 Ab-LNP制备方法 对于筛选新蛋白质配体这一挑战，Kedmi等人开发了一种使用LNP进行细胞特异性siRNA递送的平台，通过被称为锚定二级scFv激活靶向（ASSET）的重组脂蛋白结合靶向抗体，该脂蛋白与Fc结构域相互作用，掺入率达95%以上。与化学偶联相比，ASSET介导的偶联使LNP粒径和多分散指数（PDI）略有增加，同时具有高结合率和配体亲和力，且与LNP结合的抗体逃避了Fc受体的识别。 图4 ASSET平台的设计与搭建 活性靶向的有效性取决于配体与细胞表面受体的识别和结合，其受受体表达水平、循环速率和配体-受体结合的饱和度等因素的影响。 为解决异质性、耐药性相关的难题，采用双配体策略来改变Ab-LNP的选择性和细胞摄取机制，双靶向策略可设计为靶向具两种受体的细胞，具不同受体的两类细胞，或将细胞靶向与细胞内靶向结合（如靶向线粒体或细胞核）。此类配体包括RGD寡肽（Arg-Gly-Asp）、透明质酸（HA）和转铁蛋白（Tf）等。 05  总结 Ab-LNP靶向递送平台将抗体特异性和脂质纳米颗粒的多功能性相结合，在最大限度减少脱靶效应的同时提高了治疗效果。 上文中菌菌基于最新综述文献，汇总了常用的抗体偶联方法，包括碳二亚胺反应、二硫键交换和Michael加成法。其中Michael加成反应最为常用，基于PEG脂质的马来酰亚胺基团（maleimide-PEG），将其偶联到工程化抗体的特定位点。 此外，靶向两种受体细胞的双配体偶联策略能够进一步改善疾病异质性和耐药性问题，是LNP-RNA靶向递送的另一开发方向。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2023年诺贝尔生理学或医学奖授予了卡塔琳·卡里科（Katalin Karikó）和德鲁·韦斯曼（Drew Weissman），表彰他们研发了mRNA技术，但鲜少人知道mRNA疫苗的幕后功臣---将mRNA封装并且安全有效地送进机体细胞的脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle，LNP）。实际上，利用mRNA-LNP治疗癌症患者一直是十分火热的研究领域，该领域的发展甚至远早于将该技术应用于新冠疫苗的开发。虽然目前还没有临床上市的基于mRNA-LNP的肿瘤疫苗或直接在肿瘤内注射编码促炎细胞因子，但许多制药公司已经开展了肿瘤领域mRNA-LNP相关药物的研发，且相当一部分已经进入临床试验。（表1）本文旨在介绍各种mRNA-LNP靶向癌细胞的递送策略，并探讨临床实践中需要克服的障碍和未来前景[1]。表1 部分进入临床试验的mRNA-LNP药物LNP是目前临床上最先进的非病毒基因输送系统，其通常包含四种脂质成分：首先是在特定环境下产生正电荷的可电离脂质，能与带有负电荷的mRNA紧密结合；其次是一类聚乙二醇化的脂质，负责稳定纳米颗粒的结构；最后两种分别是磷脂和胆固醇分子，负责填充纳米颗粒的结构。这四种简单的成分将mRNA包裹起来，避免它们降解，并送到细胞内。（图1）图1 mRNA-LNP的构建  01  靶向策略1.1被动靶向被动靶向是指将 mRNA-LNP 递送至组织和细胞而不用靶向修饰其表面的方法。在肿瘤学中，这种方法用于靶向可触及的肿瘤以及非恶性组织（例如脾脏和淋巴结）进行抗肿瘤免疫调节。1.1.1瘤内注射mRNA-LNP 的瘤内给药是递送纳米颗粒的最简单方法。但大多数肿瘤的脉管系统组织较差、缺乏淋巴引流以及细胞外基质密度较高，可能会限制 LNP 从注射部位扩散到此类肿瘤。因此，一些基于 mRNA-LNP 的癌症疗法临床前研究已使用瘤内注射来表达细胞因子和细胞毒素。值得注意的是，无论 mRNA 负载如何，LNP 都具有先天的佐剂作用，可促进 CD4+ T 辅助细胞 1 (TH1) 介导的细胞因子反应。TH1 反应通常具有肿瘤抑制作用，而 TH2 反应则与细胞介导的免疫力降低以及具有促癌表型的免疫群体的激活有关。基于此，研究人员将编码细胞因子（包括但不限于 IL-12、IL-15 和 IL-36γ）的 mRNA-LNP 注射到小鼠肿瘤内，从而形成有利于抗肿瘤活性的肿瘤微环境 (TME)。在小鼠癌症模型中，肿瘤内注射编码 OX40L、IL-23 和 IL-36γ 的 mRNA-LNP 可引发抗肿瘤免疫反应，并防止肿瘤再攻击。总之，瘤内注射提供了一个通过操纵 TME 来促进抗肿瘤免疫反应的机会，并使细胞因子能够局部表达，避免这些细胞因子在全身给药时可能会产生的过度毒性。尽管如此，这种方法仅限于可触及的实体肿瘤以及非肿瘤组织具有耐受性的情况。1.1.2 内源性靶向为了到达肿瘤部位，静脉注射的 mRNA-LNP 必须安全地通过血管系统，避免全身清除，渗透到肿瘤内部并递送到肿瘤细胞。这个过程每一步都包含多个屏障，疾病状态和肿瘤结构也会影响这些屏障。一般来说，由于循环中血清蛋白的吸附，LNP在全身给药后非常容易在肝脏中累积，为了延长循环时间，LNP 配方中经常掺入 PEG 连接的脂质。PEG 基团是亲水性的，使 LNP 能够逃避网状内皮系统的摄取并具有胶体稳定性，从而为 LNP 提供隐形特性。接下来，LNP 必须从血流渗出到肿瘤中。药物可以从血流扩散到肿瘤主要依赖于肿瘤周围血管渗漏增强的假设，这被称为增强渗透性和保留（EPR）效应。外渗到肿瘤区域后，LNP 必须穿透整个肿瘤才能在恶性细胞之间充分分散。组织穿透研究表明，由于高细胞密度和间质液压力，直径 >20 nm 的颗粒几乎无法穿透肿瘤区域。使用调节肿瘤流体和 ECM 的方法对于提高 mRNA-LNP 的渗透效率可能至关重要。有趣的是，用 mRNA-LNP 修饰 ECM 可以增强淋巴细胞浸润。使用 mRNA-LNP 来利用 ECM 并增强免疫细胞浸润的概念是未来药物开发的一个令人兴奋的途径。图2. mRNA-LNP靶向策略1.2 主动靶向主动靶向被认为是药物递送的圣杯。mRNA-LNP的主动靶向涉及通过使用小分子配体到单克隆抗体等靶向部分修饰纳米粒子的表面，将其递送至特定细胞类型。当针对恶性细胞时，主动靶向方法的优点是可以促进细胞对 mRNA-LNP 的摄取，这对于基于核酸有效负载的活性至关重要；当针对非恶性细胞时，主动靶向可以将 mRNA 递送到不太容易吸收LNP的细胞中，如淋巴细胞，并激活抗肿瘤免疫。1.2.1靶点选择对于直接靶向癌细胞，理想的靶标是肿瘤特异性抗原（TSA），通过结合可激活迅速内化的分子，从而使核酸有效负载进入细胞，并具有可控的生物活性。由于TSA 很少见，研究者们将目光也聚焦在具有临床意义且高表达的肿瘤相关抗原 (TAA) 上。可以使用抗体（完整抗体或片段）、肽、糖和其他小分子来靶向 TAA、TSA 和免疫调节受体。报道的靶标和结合它们的分子包括 CD44 和透明质酸、叶酸受体和叶酸，以及具有特异性抗体的 EGFR、CD29、CD38 和 PD-L1。在考虑可能的靶标时，应考虑靶配体的活性以及相互作用的潜在生物效应。例如，用于将 mRNA 有效负载递送至 T 细胞的 CD3 靶向 mRNA-LNP 已被证明具有不利影响，虽然 T 细胞激活可能有用，但由于潜在的过度激活和 T 细胞耗竭，不受控制的激活可能是有害的[2]。此外，也应考虑肿瘤和患者的异质性问题。例如，HER2（一种常见的乳腺癌生物标志物）仅存在于这种癌症类型的15-20% 患者中，并且其表达水平在同一肿瘤内的细胞之间可能有所不同，同时，HER2 表达水平也会随着疾病进展和复发而变化[3]。鉴于 RNA 治疗剂必须到达细胞质才能发挥其功能，内化和内体逃逸对于 mRNA-LNP 的活性至关重要（图 2）。大多数关于靶向和受体内化的数据来自抗体药物偶联物 (ADC) 的研究。但适用于 ADC 的特征不一定适用于 mRNA-LNP，因为后者通常比前者大。所以，体内内化率和机制很难预测。例如，结合西妥昔单抗后的EGFR内化可以从网格蛋白介导的内化转变为巨胞饮作用。通过后一种途径的内化可能有利于 mRNA-LNP 的传递，因为纳米颗粒很大，并且巨胞饮作用涉及更大的膜面积。除了有效传递有效负载之外，如果抗体没有内化，它们还有触发效应功能的风险，例如，抗体依赖性细胞毒性和巨噬细胞中其他 Fc 区触发的活动。由于所有这些考虑因素，除了筛选之外，对靶向相互作用、其在疾病中的背景以及经验证据的深入生物学理解对于有效的靶向设计至关重要。  02  结合抗体的 mRNA-LNP 的设计目前，主要有两种方法可用于功能化 LNP 表面的靶向抗体。第一个是在 LNP 配方中包含“锚定”脂质（图 3a），在颗粒制备后可以将功能配体与其缀合。常用的锚定脂质包括磷脂酰乙醇胺、PEG-马来酰亚胺和磷脂酰肌醇，它们可以与靶向抗体化学缀合。该方法能够通过调整锚定脂质的摩尔质量来控制 LNP 上存在的靶向部分的数量。然而，这种方法也有利于不完整或方向错误的抗体的缀合，例如Fc区暴露的方向的抗体，这可能导致不需要的免疫反应并影响药代动力学特征和分布。此外，该策略效率比较低下，并导致需要多个清除阶段来去除未结合的靶向部分和大量废物。第二种策略涉及制备 LNP 制剂，然后通过优化共孵育将疏水性抗体衍生物（例如脂质-配体缀合物）插入到预制的 LNP 中。这种方法不需要 LNP 配方中的反应性锚定脂质，并且能够更好地控制抗体-脂质缀合。已证明插入后可以更好地保留 LNP 的原始理化性质，例如：“锚定的二级 scFv ”靶向分子，它可以后插入 LNP 中，并通过结合所选靶向抗体的 Fc 区充当通用接头（图 3b）。该系统已成功用于将 mRNA 有效负载传递至小鼠的特定免疫细胞群和癌细胞多种基于 mRNA-LNP 的靶向应用有可能用于肿瘤学，其中几种目前正在临床前研究。虽然靶向方法可以将有效负载驱动到不一定被动吸收 LNP 的特定细胞中，但被动靶向的一些障碍，例如如上所述的从组织渗透到实体瘤，仍然没有得到解决。图3 LNP抗体修饰策略  03  临床应用开发癌症疫苗的专家正在尝试同时编码多种抗原，从而提供个性化疫苗。此类疫苗依赖于 mRNA 治疗平台的优势：模块化、整合大量有效负载的能力以及制造速度。例如，mRNA-4157是一种mRNA-LNP疫苗，可在编码多表位的单个mRNA多联体中包含多达34个新抗原肽，这可以通过编码散布在切割敏感位点的短表位多联体来实现。mRNA-4157 目前正在 I 期和 II 期试验中进行测试。个性化癌症疫苗需要高速的产品生产。据报道，从对患者来源的肿瘤样本进行测序到生产和施用个性化疫苗的时间最短只需30-40天，这是因为与基于小分子或蛋白质的疗法不同，大多数 mRNA 有效负载仅在核苷酸序列上有所不同，因此可以快速进行个性化制造。癌症疫苗治疗通常涉及多次注射，这些多次注射方案可能会导致 LNP 反应原性、脂质随着时间的推移在组织中积累以及被抗药物抗体清除。尽管如此，多种mRNA-LNP疫苗仍获得了 FDA的快速通道资格，这表明在目前的开发阶段，对这些患者的益处被认为超过了潜在的缺陷。推进该领域新的临床机会的一个潜在方面是小鼠模型和患者之间的“差距”，这一点在肿瘤学中众所周知，并且在 LNP 领域也越来越得到认可。例如，mRNA-LNP 疫苗在人类中诱导 IL-1 分泌，而在小鼠中则上调 IL-1 受体拮抗剂蛋白。小鼠和人类之间的这些差异可能反映了其他尚未揭示的活动变化，应该在未来的研究中进一步探讨。  04  未来研究策略除了改进靶向策略之外，mRNA-LNP 的使用还面临一些其他挑战。这些挑战之一是mRNA-LNP 在冰箱温度或室温下并不稳定，这是由于 mRNA 有效负载固有的不稳定性而不是 LNP 载体的不稳定性导致的。其次，LNP 不是惰性的，其能够增加宿主体内的细胞因子水平，从而引起急性炎症。为了提高 mRNA-LNP 特异性并减少脱靶效应，研究者们进行了许多尝试。比如根据 mRNA本身编码的特定序列来介导差异表达。由于其依赖于编码可编程序列而不是蛋白质或脂质的化学修饰，因此在产品生产效率上看，这种策略是可行的。此外，可编程序列能够增强或抑制特定细胞类型中靶标的表达，该策略还可用于靶向缺乏 TSA 的癌细胞。有意思的是，可编程序列也可用于细胞特异性翻译，其能够通过操纵 mRNA 分子的结构动力学激活特定细胞内的翻译，一些方法利用mRNA 5 '非翻译区(UTR)中的反应性3D结构，可以在靶细胞中存在差异的分子和/或序列存在的情况下激活或阻止翻译起始。如依赖IRES启动翻译过程。此外，不同细胞类型之间独特的tRNA表达模式可用于在不同细胞群体或组织中以不同速率翻译序列。最后，可以将细胞特异性microRNAs (miRNAs)的结合序列整合到UTR中，以影响不同细胞群体的降解率。（图 4a）提高mRNA-LNP靶向性的另一种方法依赖于更好地了解影响不同LNP制剂生物分布的因素。具体而言，不同的可电离脂质结构与某些器官和细胞分布倾向之间的构效关系需要更好的机理表征。（图 4b） 图4 未来靶向设计的策略  写在最后  在过去的几年中，使用被动或主动靶向将 mRNA-LNP 靶向递送至肿瘤取得了有希望的的进展。方法的选择通常取决于易于生产和特异性之间的折中（图 5）。mRNA-LNP 目前已成为预防性疫苗领域的主要工具，多个相关疗法已进入肿瘤领域的临床试验中。我们期望看到使用各种靶向方法增加细胞特异性表达，通过这个多功能、强大的平台在肿瘤学中实现更多新的治疗应用。图5 mRNA-LNPs靶向肿瘤的被动和主动策略的选择和潜在应用参考文献[1] Edo Kon, et al. Targeting cancer with mRNA-lipid nanoparticles: key considerations and future prospects. Nat Rev Clin Oncol 20(11):739-754 (2023).[2] Kheirolomoom, A. et al. In situ T-cell transfection by anti-CD3-conjugated lipid nanoparticles leads to T-cell activation, migration, and phenotypic shift. Biomaterials 281, 121339 (2022).[3] Houdaihed, L., Evans, J. C. & Allen, C. Dual-targeted delivery of nanoparticles encapsulating paclitaxel and everolimus: a novel strategy to overcome breast cancer receptor heterogeneity. Pharm. Res. 37, 39 (2020).识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。