CYP3A x SARS-CoV-2 3CLpro

2023年上半年已经过去，FDA的CDER（药物评价与研究中心）在过去的六个月内一共监管批准了26款NME（新分子实体）药物。值得注意的是，获批的这26款药物中包括4个多肽拟肽类药物，占据了15%的比例。而在过去的2022年里，FDA一共只批准了3款多肽药物：Tirzepatide,Lutetium 177Lu Vipivotide Tetraxetan和Terlipressin。其中terlipressin之前已经作为Glypressin®在美国以外上市。也有文献将2022年获批的Gadopiclenol归类于多肽类药物，但这种划分并不严谨。Gadopiclenol分子中只有酰胺键，但却并不是由两个氨基酸缩合构成的，因此不应被视为多肽分子。01FDA 2023年上半年批准的多肽拟肽药物2023年上半年FDA批准的四款多肽拟肽药物是：Trofinetide、Rezafungin、flotufolastat F 18、nirmatrelvir/ritonavir。1.Trofinetide化学结构Trofinetide是glypromate的新型合成类似物，也称为甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸（GPE）。GPE是大脑中天然存在的蛋白质和胰岛素样生长因子1（IGF-1）的N末端三肽。而trofinetide相对于GPE的脯氨酸Cα上多出了一个甲基。雷特综合征Trofinetide（DaybueTM）由Acadia开发，是2023年3月10日被FDA批准用于治疗Rett综合征（雷特综合征）的多肽药物，它也因此成为了历史上第一款被FDA批准的雷特综合征药物。雷特综合征是一种罕见病，伴有一系列认知、运动和自主神经症状。它是一种复杂、罕见的神经发育障碍，通常由MECP2基因的基因突变引起。其特征是婴儿在6至18个月大之前有一段正常发育期，随后出现显著的发育倒退，伴有获得性的沟通技巧和双手使用功能的丧失。雷特综合症的症状还可能包括出现手部刻板，例如拧手和拍手，以及步态异常。在美国，雷特综合症影响了6000至9000名患者，其中已确诊患者为4500名左右。Trofinetide的获批对于人类与雷特综合征抗争的历史来说，无疑是具有里程碑意义的事件。Trofinetide作用机理大多数Rett综合征病例与编码甲基CpG结合蛋白2（MECP2）的基因发生功能丧失突变有关。MECP2是一种DNA结合蛋白，在基因表达的表观遗传调控中发挥作用。这些突变会导致突触大脑皮层的突触不成熟、导致神经元发育异常的大脑胆固醇异常代谢，以及神经元信号异常。Rett综合征在女孩中比男孩更常见。Trofinetide在雷特综合征中的确切作用机制尚未完全阐明。在小鼠研究中，GPE多肽改善了运动和心肺功能，增加了脑重量，并延长了MECP2缺陷小鼠的寿命。作为GPE的合成类似物，trofinetide在缺氧损伤大鼠模型中，以剂量依赖性方式类似地减弱细胞凋亡并减少梗塞面积。Trofinetide发挥多方面的作用来减少炎症、兴奋性毒性诱导的组织损伤和细胞凋亡，从而保护神经元及其周围的基础组织。2.Rezafungin新的棘白菌素多肽药物2023年3月22日，FDA批准了Cidara和Melinta的Rezzayo™（注射用rezafungin）用于治疗18岁或以上患者的念珠菌血症和侵袭性念珠菌病。Rezafungin是新一代广谱长效的棘白菌素（echinocandin）。Rezafungin对念珠菌属、曲霉属和肺孢子菌显示出有效的抗真菌活性。Rezafungin也成为十多年来首个获得FDA批准的新棘白菌素（echinocandin）。与卡泊芬净（caspofungin）和米卡芬净（micafungin）等其他棘白菌素类药物不同，rezafungin具有长效药代动力学和高稳定性的特征，使其可以长时间间隔给药，并保持高血浆暴露。Rezafungin的半衰期超过130小时，可以每周给药一次而无需每天给药。念珠菌血症和侵袭性念珠菌病念珠菌血症和侵袭性念珠菌病是罕见、严重且危及生命的感染。根据美国国家疾病控制与预防中心的数据，美国平均新感染率约为每10万人中有9人感染，每年约有2万5千例。这些感染易发生在已经患有其他疾病的患者身上，并且可导致高发病率和死亡率。有侵袭性真菌感染风险的患者包括重症患者、免疫抑制患者、手术后患者和使用中心静脉导管的患者。在这个已经很脆弱的患者群体中，念珠菌的侵入性感染通常会导致严重的疾病和死亡。患有这些侵袭性感染的患者可能会在其基础疾病之上患上一系列合并症，包括发烧和感染性休克。念珠菌血症和侵袭性念珠菌病诊断后估计需要额外住院3至13天。此外，这些感染患者的死亡率超过40%。棘白菌素（Echinocandins）被作为念珠菌血症和侵袭性念珠菌病的实践指南中的一线抗真菌剂，因为它们具有公认的疗效和安全性以及强大的杀真菌活性。又一款环肽Rezafugin是在开发一种口服给药的棘白菌素的过程中被发现的。它的突出结构特征在于其化学修饰，主要是在环状六肽环上添加胆碱部分，这显著提高了分子稳定性和生物学特性。相对于其他棘白菌素，rezafungin降低的新陈代谢和降解增强的了它的稳定性并延长了药物的半衰期。这使得每周一次静脉内给药成为了可能。这样的给药方案可以产生前负荷暴露，使rezafungin的潜在治疗益处最大化。这些益处包括改进的杀灭性和更大的组织分布。Rezafungin作用机制Rezafungin是一种棘白菌素类抗真菌药物。它抑制真菌细胞壁中的1,3-β-D-葡聚糖合酶复合物，后者负责形成1,3-β-D-葡聚糖。由于1,3-β-D-葡聚糖是真菌细胞壁的重要成分，rezafungin可破坏包括念珠菌属在内的真菌物种的细胞壁，并作为浓度依赖性体外杀真菌剂发挥作用。哺乳动物细胞不表达β-1-3-葡聚糖合酶，因此，rezafungin的作用是针对真菌的（杀真菌剂）。3.Posluma（flotufolastat F 18）Posluma是一种18F标记的配体，也是一种成像剂，用于在PET（正电子发射断层扫描）检测和定位前列腺癌。Posluma含有一种成像剂（18F），其活性成分是结合非放射性镓的flotufolastat F 18 gallium。Flotufolastat F-18与细胞（包括前列腺癌细胞）上表达的前列腺特异性膜抗原（PSMA）（IC50=4.4 nM）结合。在需要局部治疗的复发性前列腺癌患者中，使用18F标记的配体进行正电子发射断层扫描（PET），可提供准确的诊断成像。Flotufolastat中的18F基团是一种β+发射放射性核素，可以使用正电子发射断层扫描（PET）进行检测。由于前列腺癌细胞过表达PSMA，并且flotufolastat F-18被细胞内化，因此这种放射性试剂可用于前列腺癌患者的诊断成像。Posluma于2023年5月25日，得到FDA监管批准，用于疑似转移的前列腺癌男性的PSMA阳性病变的PET。它是第一个获得FDA批准的采用专有放射性杂交技术开发的PSMA靶向成像剂。负责与PSMA结合的部分中，拟肽承担了重要角色。Flotufolastat F 18分子中的拟肽结构，包含Glu,γ-Glu,Orn,1,4-丁二酸,Lys,Dap（Diaminopripionic acid）等氨基酸结构。4.Paxlovid（nirmatrelvir,ritonavir）虽然Paxlovid早在2021年12月a就已经获得FDA批准，用于中度至重度成人及儿童SARS-CoV-2病毒感染，但其全面获得FDA批准，则是2023年5月25日的事情，它与Posluma在同一天得到了FDA的批准。Paxlovid中的两个活性物质nirmatrelvir和ritonavir都是拟肽类物质。Nirmatrelvir以蛋白酶抑制剂的身份阻断病毒繁殖所需的蛋白酶活性。它是3C样蛋白酶（3C-like protease，3CLPRO，亦称Mpro）的抑制剂，后者在SARS-CoV-2病毒的复制过程中起到关键作用。Paxlovid中的第二种拟肽活性物质ritonavir被用作nirmatrelvir的药代动力学增强剂，通过抑制CYP3A4对于nirmatrelvir的降解作用，提升后者的半衰期和生物利用度。两种拟肽的相得益彰，造就了Paxlovid“沧海横流，方显英雄本色”的医药史地位。022023年上半年获批多肽拟肽特征1.重要性Rezafugin对于侵袭性念珠菌病的治疗非常重要。后者是一种获得性感染，相关死亡率高。用于管理侵袭性念珠菌感染患者的抗真菌药物武器库非常小，仅限于三个药物家族：多烯类、唑类和棘白菌素类。美国传染病学会和欧洲临床微生物学疾病学会国际指南都支持使用棘白菌素作为治疗侵袭性念珠菌感染的一线药物。Paxlovid的重要性更无需赘述，在Covid-19肆虐全球的背景下，是这款拟肽药物，在疫苗接种的基础之上，挽救了成千上万重症患者的生命。2022年，Paxlovid为辉瑞带来了220亿美元的全球销售额。Posluma的批准，为整个前列腺癌患者的管理和治疗提供了非常重要的支持，它代表了一类基于新型放射性杂交技术的高亲和力PSMA靶向的放射性诊断试剂。诊断前列腺癌，确定其存在以及转移情况，对于建立最优化的临床管理策略至关重要，因为高达25%的原发性前列腺癌患者可能经历区域盆腔淋巴结转移，及时有效的检测与复发风险和相关的总生存率息息相关。Trofinetide（DaybueTM）的重要性同样不言而喻，它是FDA批准的首款雷特综合征药物。服用Trofinetide的受试者在几个关键领域都有所改善，包括社交沟通，精细运动技能和呼吸方面。2.创新型Rezafugin是一种创新性、一周一次的新一代棘球白素（echinocandin）药物。为10多年来首款新棘白菌素（echinocandin）抗真菌药物。与其他棘白菌素相比，在C5鸟氨酸位置具有胆碱部分，导致体外和体内稳定性增加。微生物学数据显示，雷扎芬净和其他棘白菌素类药物具有相似的敏感性和耐药性。Rezafungin具有较长的半衰期（80小时）和良好的安全性。Flotufolastat的创新性在于使用18F作为成像剂，使用18F放射性同位素进行放射性标记，可提高正电子发射断层扫描（PET）扫描分辨率，改善病变描绘。Posluma的分子结构采用放射性杂化™技术，DOTAGA复合物与非放射性镓和放射性18F共价结合于硅。这种模式的诊断试剂大大提高了前列腺癌的诊断准确性和及时性。Paxlovid的问世同样包含了很多看点。它的起效成分nirmatrelivir是一款可逆共价抑制剂，其分子结构中的活性弹头氰基，可以与受体蛋白SARS-CoV-2病毒的Mpro蛋白上的Cys145巯基之间发生共价结合，从而抑制了这个关键蛋白在宿主细胞中复制与感染。除此之外，另一个有效成分ritonativir起到了关键的“药代动力学增强剂“（pharmacokinetics enhancer）的作用。Ritonavir可以通过抑制CYP3A4酶对于nirmatrelvir的酶促降解，改善nirmatrelvir的药代动力学特性，从而保护nirmatrelvir充分发挥口服蛋白酶抑制剂的药理学功效。这两款多肽活性成分相得益彰，保障了paxlovid的抗病毒复制功能，并且实现了口服制剂的递送方式。Paxlovid的药物设计可谓充满艺术气息。来源 | 同写意Biotech（药智网获取授权转载）撰稿 | 杨翼责任编辑 | 八角声明：本文系药智网转载内容，图片、文字版权归原作者所有，转载目的在于传递更多信息，并不代表本平台观点。如涉及作品内容、版权和其它问题，请在本平台留言，我们将在第一时间删除。商务合作 |  张武龙 13368443108（同微信） 阅读原文，是受欢迎的文章哦

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注小分子药物目前仍是治疗的主流，特异性治疗的生物药日益显示其优势，构成了对小分子药物创制和应用的挑战。小分子药物的优势是方便口服，患者依从性好。构建小分子药物的难点，是将药效、药代、选择性和安全性都融于化学结构之中。由于尺寸小，表面积不大，小分子药物就会对众多蛋白有不同程度的适配性结合，导致脱靶引起不良反应，在这个意义上选择性作用是首要的。在以靶标为核心构建和优化分子结构，又需要全盘顾及各个属性的要求，往往顾此失彼，达到全维度的优化实在勉为其难。本世纪的药物创制，广泛注入了分子生物学和结构生物学元素，涌现了新的策略和技术，并获得了成功，满足了患者的需求。例如共价结合药物，是在结构生物学指引下，将适度的“亲电弹头”连接在分子的恰当位置，在分子互补性的结合中，加以共价键不可逆锁定。分子生物学直接应用于抗体偶联药物（ADC）的研制中，抗体（A）作为载体和导向（药代），将毒性分子（D）传输到癌性细胞内，发挥杀伤作用（药效）。隔离的药效和药代分子实体靠连接基偶联（C）成ADC分子。PROTAC也是双功能分子，招募靶蛋白和泛素连接酶E3，形成三元复合物，犹如催化剂，使靶蛋白发生泛素化，导致被蛋白酶体降解。此外，近年来药物固定的配伍应用，在提高选择性、安全性、长效性和治疗效果方面也有长足进步，可视作不拘一格的物理合用的创新策略。本文列举一些成功实例，从药物化学和治疗应用的视角，简要讨论上述内容。关键词共价结合药物；抗体偶联药物；PROTAC；药物组合在药物治疗领域里，现今虽然仍以小分子药物为主流，但以特异性治疗为特征的生物大分子药物之崛起，日益显示其优势所在，构成了对小分子药物创制和应用的挑战。以方便口服而应用的小分子药物，集药效、药代、选择性和依从性等多种属性于化学结构之中，是其特点，也是难点。在以靶标为核心构建分子结构，需全盘顾及各个属性的要求，但往往顾此失彼，达到全维度的优化状态实在勉为其难。这其中最难驾驭的是由于脱靶作用而引起的不良反应，限制了治疗窗口，选择性作用显得格外重要。其实，过分拘泥于传统新药物分子实体（NME）的整合性创制理念，往往会削足适履而达不到目的，也延误患者之急需，在COVID-19的3年疫情中尤显迫切。本世纪出现的一些平台技术就是突破了传统的创制理念，将整合于一个结构之中的诸多属性，从结构或组成上作分割或分散性处理，整合为一个大分子或组方，已成为行之有效的策略。本文就某些成功上市的新药为例，简述为提高小分子药物的活性和选择性而采用的一些方法。1精准调节的共价结合基团既往的共价结合药物，大多是在小分子上连接亲电性较强的原子或基团，例如氮芥连接在L-苯丙氨酸的美法仑(1, melphalan)，以提高肿瘤组织摄入药物，其实并未达到对肿瘤组织是选择性摄入。至于至今应用的治疗睾丸精原细胞瘤的氮甲，即N-甲酰溶肉瘤素(2, N-formylsarcolysin)，只是偶然幸运发现而已。从生化上讲，人体布满了亲核性基团，不允许有强亲电的“虎狼基团”存在，避免受到共价键结合的化学侵害。因而长时间来，药物学家除抗肿瘤药物外避开共价结合药物的研究。分子和结构生物学的发展，为研制特异性共价键结合药物提供了结构依据，近些年来上市了不少高选择性共价结合药物。这类药物的共同特点是，基于设定靶标的结合腔或裂隙，设计或筛选出形状互补、电性（静电、氢键）互补、发生疏水-疏水结合的分子或片段，形成较强结合，在此基础上基于结构生物学提供的结合腔中重要亲核性基团的空间位置和性质，在配体分子的适当位置连接足以形成共价结合的相匹配基团，选择的亲电性无过无不及，是精准设计提高选择性的关键。1EGFR激酶抑制剂共价结合药物的研制特征 非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶发生变异，位点是L858R，导致癌细胞对这个信号通路的依赖而发展。对此单变异型激酶，第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼（3，gefitinib）和厄洛替尼（4，erlotinib）成为治疗NSCLC一线治疗药。N1和N3分别与激酶发生氢键结合，C4连接的苯氨基结合于疏水腔，喹唑啉的6/7位处于酶开口处，用来修饰溶解性。但用药一段时间后60%患者出现耐药，是由于激酶的ATP结合位点的门户残基（gatekeeper）发生了T790M突变，突变逃逸了3和4的抑制作用。还由于3和4对野生型的EGFR激酶也有抑制作用，不能加大剂量。为克服耐药性研制了第二代“替尼”，是共价结合药物，为不可逆抑制剂，例如阿法替尼（5, afatinib）和达可替尼（6, dacomitinib）。化学结构类型基本不变，以适配于ATP结合腔，但在6位引入了有弱亲电性的不饱和酰胺，后者由于靠近激酶开口处的残基Cys797，从而在烯碳与巯基间发生麦克尔加成，共价键结合导致不可逆抑制。5和6提高了抑制双突变激酶的活性，因而对第一代药物发生耐药的患者有效。然而由于包括野生型在内的所有EGFR激酶开口处都有Cys797，降低了选择性作用，呈现不良反应。AstraZeneca公司为克服上两代“替尼”的耐药性，设定的目标是①对L858R和T790M双突变型的EGFR激酶(DM)选择性抑制；②不抑制野生型(WT) EGFR激酶；③不抑制胰岛素生长因子1受体（IGF1R）。为此，必需针对突变后生成的Met790的结构特征，使化合物强效结合ATP结构域，“超过”因T790M变异提高的与ATP结合力，所以，目标的本质是提高选择性：对双突变激酶高活性，对野生型激酶和IGF1R无或低活性。该公司完全摆脱了上两代的结构类型，普筛出化合物7对双突变激酶活性强于野生型近百倍（IC50(DM酶)=0.009μmol·L-1），然而对双突变细胞的活性降低了90倍（IC50(DM细胞)=0.77μmol·L-1），可能难以摄入细胞内，进而优化对DM细胞的活性，而且，7中加入亲电性基团，以期与酶开口处的Cys797发生共价结合（相同于第二代抑制剂）。经分子模拟，将亲电性基团丙烯酰胺连接在苯胺的间位，这是易于同Cys797的巯基发生共价结合的位置。合成的化合物8在细胞水平上对单突变（AM）和双突变（DM）的活性都强于野生型（WT）。化合物8与EGFR激酶结合的复合物晶体证明丙烯酰胺确实与Cys797形成了共价键结合。为改善物化性质对吲哚和对麦可尔基团作构效关系变换，优化出化合物9, 后者对双突变细胞的活性为IC50(DM细胞)=0.096μmol·L-1，对野生细胞活性很弱IC50(WT细胞)=23μmol·L-1，选择性高达240倍。为了提高共价结合的效率，将碱性和麦可尔基团分散在苯环的不同位置，化合物10对双突变细胞的活性为IC50(DM细胞)=0.0006μmol·L-1，对野生细胞活性IC50(WT细胞)=0.145μmol·L-1，溶解性为222μmol·L-1。然而10对胰岛素生长因子受体1有较高抑制活性，有潜在引起高胰岛素血症等不良反应。该脱靶作用的原因是IGF1R激酶的ATP结合域的门户氨基酸是甲硫氨酸，与耐药（双突变）EGFR激酶的门户氨基酸相同。这个脱靶作用对治疗剂量是个限制因素。从而对嘧啶环的4和5位取代基作进一步SAR优化，最终得到化合物11，对双突变细胞的活性为IC50(DM细胞)=0.015μmol·L-1，对野生细胞活性IC50(WT细胞)=0.480μmol·L-1，对IGF1R激酶IC50=2.9μmol·L-1，对hERGs钾通道的抑制作用很弱，IC50=16.3μmol·L-1)。化合物11确定为候选化合物，定名奥希替尼（osimertinib），经临床前和临床研究，证明对晚期非小细胞肺癌、特别是用一线替尼类药物治疗后疾病恶化的患者有效，于2015年11月美国FDA批准上市。2BTK激酶抑制剂共价结合药物的研制特征 在B细胞抗原受体的信号通路中，Bruton酪氨酸激酶（BTK）起着重要作用。BTK是Tec激酶家族的成员，为非受体型胞浆酪氨酸激酶，主要表达于造血细胞。与BTK同属于Src激酶家族的另一激酶，称作淋巴细胞特异性蛋白激酶（LCK），主要表达于T淋巴细胞，功能是调节免疫应答。BTK和LCK激酶的ATP结合域具有相似性，分子模拟表明结合位点大同小异，但BTK的残基为Cys481，LCK为Ser481，半胱氨酸巯基的亲核性强于丝氨酸的羟基，研制者基于这个差异用于设计并抑制出BTK选择性不可逆抑制剂伊布替尼（12, ibrutinib），于2013年经FDA批准上市。分子的主要骨架异嘌呤二苯醚定位于BTK激酶的AYP结合腔中，弱亲电性基团丙烯酰胺靠近Cys481，与巯基发生麦可尔加成反应。伊布替尼是治疗与B淋巴细胞相关的套细胞白血病的一线用药。AstraZeneca于2017年上市阿可替尼(13, acalabrutinib)是第二代BTK不可逆抑制剂。与伊布替尼相比，阿可替尼更具有选择性作用，是在结构优化中注重了降低对野生型 EGFR、Tec 的结合，避免了对正常激酶的脱靶，提高了靶标特异性并增强了 BTK 的效力，从而减少不良反应。阿可替尼用丁炔酰胺作为共价结合基团与 Cys481 的反应具有更高的选择性和体内靶标覆盖率，包括抑制 ERK、IKB 和 AKT 下游靶标的酪氨酸磷酸化，但不抑制正常EGFR、ITK 和 Tec 活性。 我国百济神州公司针对伊布替尼的口服生物利用度低(F<10%)，剂量大，治疗窗口较窄的缺点，而且对野生型表皮生长因子受体(EGFR)呈现抑制，引起皮疹和腹泻等不良反应，研制高选择性抑制剂。理念也是以竞争激酶 ATP 结合腔为作用模式，抑制剂模拟 ATP 腺嘌呤环，并变换杂环的结构骨架，设计了氨基吡唑酰胺类化合物，酰胺是为了形成分子内氢键，用假杂环模拟平面性稠合的嘧啶环[8]。在适宜的位置连接麦克尔加成基团，以实现不可逆抑制。经过数轮的 SAR 研究，研制出 BTK 新一代不可逆抑制剂泽布替尼(14, zanubrutinib)，于 2019 年经 FDA 批准在美国上市，成为治疗套细胞淋巴瘤和慢性淋巴性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤的第三个有效药物。 泽布替尼与 BTK 激酶共晶结构显示，分子定位于 ATP 结合腔，酰胺基与铰链上 Glu475和 Met477 形成氢键网络，哌啶的氮原子也与 Met477 发生氢键结合，吡唑的氮原子经水分子(氢键)介导与 Lys430 的侧链氨基形成氢键，二苯醚的末端苯环与 Phe540 发生 T-型 π-π 相互作用，麦克尔基团与 Cys481 巯基的距离 2.9 Å，处于有利发生共价结合的范围。此外，酰胺基与哌啶氮的分子内氢键(图 1 中未示)也验证了最初模拟嘧啶酮结构的设想[9]。3含共价结合基团酮基酰胺的NS3蛋白酶抑制剂 丙肝病毒（HCV）是正链单链RNA病毒，其中NS3蛋白酶对丙肝病毒的生长和增殖具有重要作用，成为研制丙肝药物的靶标。NS3酶的水解机制是由三元体构成：N端的His57和Asp81，以及C端的Ser139。图2是Asp-His-Ser三元体催化水解肽键过程的示意图。三元体与底物形成氢键，提高了肽键羰基的亲电性，丝氨酸的羟基向羰基作亲核进攻，促进了肽键水解。设想抑制NS3蛋白酶的一个重要反应位点，是与该三元体结合，尤其希望与Ser139发生共价键结合。由于NS3水解多肽的活性中心表浅而无特征，为寻找先导化合物，将某些亲电性基团连接到长肽链中，例如醛、酮、三氟甲基酮和α酮基酰胺等，以得到有较强结合作用拟肽类先导物，然后简化和修饰成小分子化合物。发现十一肽化合物15的活性Ki=1.9nmol·L-1，亲电性基团酮基酰胺在十一肽的P1和P1′之间，这个位置很重要。15的相对分子质量为1265，距离口服吸收的物化和药代要求甚远，结构需要简化。化合物15的高活性，在于它与NS3活性中心的结构匹配，以及酮基酰胺的亲电性和所处的适宜位置并与丝氨酸残基发生形成共价结合而使复合物稳定化，如图3所示。将化合物15的C端4个氨基酸Met-Ser-Tyr-Ser-NH2切除，得到临近端点含有酮基酰胺的七肽酰胺（16），活性Ki=43nmol·L-1, 虽然下降25倍，但相对分子质量降低到796。16作结构简化，于P1′处引入一个苯基甘氨酸以增加P2′的疏水性，删除P4~P6的三个氨基酸残基，成为五肽的化合物17，Ki=98nmol·L-1, 活性低于16一倍，但相对分子质量又减少了100余。X-射线晶体学分析表明，P2的侧链接近酶的Arg155，后者应带有正电荷。但在抑制剂中引入羧基并未形成盐键，没有提高活性。设想P2可能与Arg155的亚烷基链发生疏水性结合。变换不同的烷基发现P2为较小的环丙基有利于结合，进而将P1′的烷基也变换成环丙基，得到化合物18，活性明显提高，Ki=15nmol·L-1，但对感染细胞未见活性，EC90>5μmol·L-1，原因可能是游离羧基的存在不利于进入细胞膜。进一步经过多位点变换，发现P2为二甲基环丙基并脯氨酸、P3为叔丁基甘氨酸并且氨基用叔丁氧羰基修饰，P2′的羧基制备成二甲酰胺以消除负离子和有利于穿越细胞膜，得到化合物19，活性为Ki=5nmol·L-1，对感染细胞的EC90=0.1μmol·L-119活性有明显提高，但药代性质不佳，生物利用度F=4%，达不到临床前最低要求（AUC≥1.0μmol·L-1·h，生物利用度F≥10%）这是因为分子仍然偏大，MW=725，仍需结构小型化。根据前面述及的去除P1′和P2′的甘氨酰苯基甘氨酸仍保持活性，将化合物19的这两个氨基酸删除，使α-酮基酰胺处于端点，并将一个叔丁基改为环己基，化合物20的活性Ki=25nmol·L-1，对感染细胞的EC90=0.4μmol·L-1，虽活性有所减弱，但分子尺寸显著减小，MW=532。对20的环丙基用其他脂环替换，发现环丁甲基活性最高，再扩环活性下降，提示对P1体积的恰当容纳度。P2处的偕二甲基环丙基并脯氨酸片段已优化为最佳状态。P3处的氨基变换为烷基、芳烷基、酰胺基、氨甲酰基、脲基、磺酰胺基或磺酰脲基，发现用脲基代替氨甲酰氧连接基，活性和其他性质最佳，遂将这些优化因素综合成化合物21。21的体外活性Ki=14nmol·L-1，对感染细胞的EC90=0.35μmol·L-1，MW=519，对HCV的NS3抑制活性强于人嗜中性弹性酶2200倍，有很高的选择性。21与NS3复合物单晶结构表明，两个叔丁基分别和S4与S3疏水腔发生疏水相互作用，P2的二甲基环丙基并脯氨酸片段采取弯曲构象，与酶的Ala156、His57和Arg155侧链发生最大程度的疏水性交盖，环丁基占据了S1腔，酮基酰胺的羰基与Ser139形成可逆的共价结合。定名化合物21为波普瑞韦（boceprevir），经3期临床研究证明对丙肝患者有显著治疗作用，于2011年经FDA批准上市。由Vertex和强生公司研制的替拉瑞韦(22, telaprevir)是与波普瑞韦同时研制的丙肝治疗药，于波普瑞韦批准10天后被批准上市，替拉瑞韦的作用靶标也是NS3蛋白酶，其研发策略也是以酶底物NS5A-5B为出发点，筛选出十肽类似物，后以含醛基的四肽作为先导物，由于醛基的亲电性过强，后演变成酮基酰胺的拟肽，作用机制与波普瑞韦相同，同酶的催化中心Asp139也发生可逆性的共价键结合。4含有机硼酸基团的蛋白酶体抑制剂硼替佐米 蛋白酶体(proteasome)与细胞内NF-κB讯号传导途径密切相关，由于NF-κB在炎症过程和肿瘤细胞的发生发展扮演重要角色，干扰NF-κB活化过程，可间接或直接地阻断炎症和促成肿瘤细胞凋亡。所以蛋白酶体是研发抗炎和抗肿瘤药物的靶标。哈佛大学的Goldberg在研究蛋白酶体抑制剂对细胞生长和增殖以确定其催化功能的过程中，发现三肽化合物苄氧羰酰-亮氨酰-亮氨酰-亮氨醛（23，MG-132）有抑制活性，Ki=4nmol·L-1。化合物23与蛋白酶体的复合物单晶结构分析表明，它连接在活性中心β亚基的N端，醛基与苏氨酸残基的羟基发生亲电加成，生成具有共价键结合的半缩醛，虽然是可逆性结合，但酶的活性受到强效抑制。化合物23的结构域P1、P2和P3都是异丁基，变换这些疏水片段以优化活性，发现P1位置仍以异丁基最佳，P2和P3变换为萘基，增强了活性，例如化合物24的Ki=0.24nmol·L-1，25的Ki=0.015nmol·L-1，提示增加P2和P3的疏水性有利于提高活性。然而醛基的化学性质活泼，可与多种亲核基团发生加成反应，选择性不高，例如对组织蛋白B（cathepsin B）和钙蛋白酶（calpain）也有抑制作用。为此，用其他亲电性基团，例如氯甲基酮和三氟甲基酮替换醛基，但未显示出活性。苯并噁唑酮（26, Ki=214nmol·L-1）和二酮酯（27, Ki=45nmol·L-1），活性显著低于化合物23。用硼酸置换醛基得到的化合物28，活性显著提高，Ki=0.03nmol·L-1强于先导物23大约100倍。硼元素处于周期表第3族，外层电子有一p空轨道，可与O和N的未偶电子对形成配位键。化合物27与蛋白酶体的活性中心N端的苏氨酸侧链的羟基发生的特异性配位结合，而抑制组织蛋白酶B的活性很低，Ki=6100nmol·L-1，弱于蛋白酶体20万倍硼酸。这是因为硼酸难于与半胱氨酸蛋白酶的巯基结合，因为B←S配位键是不稳定的。三肽硼酸28抑制蛋白酶体的活性达到10-11mol·L-1浓度，这样高的活性意味着为改善成药性而变换结构可有较大的余地，例如降低三肽的分子尺寸。其实，减少一个氨基酸残基成二肽醛（29）仍有抑制蛋白酶体活性，Ki=1600nmol·L-1，而且对丝氨酸蛋白酶不显示活性，提示二肽醛仍具有选择性作用，尤其是当P2结构域为萘环时，含硼酸基化合物30的活性提高，Ki=97nmol·L-1，选择性显著提高，化合物31的Ki值为0.62nmol·L-1。由三肽28（MW=491）简化为二肽31（MW=384），分子量降低了107，活性虽然有所降低，仍在高活性范围，而且对人的其他蛋白酶如白细胞弹性酶、凝血酶和组织蛋白酶等活性很低，表明对蛋白酶体具有高选择性抑制作用。由于化合物31具有优良的活性和成药性，确定为候选化合物，定名为硼替佐米（bortezomib），经临床前和临床研究，硼替佐米于2003年FDA批准上市治疗多发性骨髓瘤。5铁螯合物改变头孢药物的抗菌谱 革兰阳性致病菌由一层细胞膜构成，而阴性菌由外膜和内膜双层结构构成，阴性菌更难以摄入药物，因而抗革兰阴性菌的药物较少。日本盐野义公司基于细菌增殖生长需要从宿主细胞摄取铁离子，是靠细胞壁上的载铁蛋白转运摄入菌体内。Ito等利用该蛋白的嗜铁属性，合成了含有儿茶酚和噻唑结构的头孢菌素，研发出头孢德罗(32, cefiderocol)。分子低能构象儿茶酚和噻唑环在空间上的靠近容易螯合铁离子成33，33被载铁蛋白结合经主动转运摄入，就这样携带着抗菌的头孢进入菌体内，后者与青霉素结合蛋白作用，阻断细胞壁的合成而杀死细菌。32对多种有氧阴性菌（包括多药耐药菌）抑制活性MIC50<2μg·mL-1，具有可克服碳青霉烯类抗药性3种主要机制（孔蛋白通道改变、β-内酰胺酶失活、外排泵高量产生）的独特能力。临床显示对复杂尿路感染以及难治的肠道感染疗效显著，头孢德罗于2019年经FDA批准上市。2变构抑制剂1变构调节 变构调节(allosteric modulation)是指小分子化合物与酶蛋白分子活性中心以外的某一部位特异结合，引起酶蛋白分子构象变化、从而改变酶的活性。经变构结合而激活酶活性的称为正向调节，即激动剂，比如酶的辅因子；抑制酶活性的负向调节即变构抑制剂(allosteric inhibitor)。变构位点与酶活性中心的位点相隔离，之间没有竞争性结合，所以变构抑制剂对活性中心发生变异的蛋白仍然有疗效，也为联合用药提供了选择。变构抑制剂作为药物的最大优势是提高选择性，酶或受体多存在同工酶和亚型，结构和功能的差异较小，导致结合于活性中心的化合物(正构药物)而缺乏选择性作用，变构结合腔则各有不同，避免了脱靶作用。2KRAS突变在实体瘤的变构药物 RAS基因家族编码的鸟苷三磷酸酶(GTPase)包括NRAS、HRAS和KRAS，对细胞生长和增殖扮演重要角色。KRAS是最常见的肿瘤驱动基因之一，在人癌的突变率占30%, 最常发生的是G12C-KRASG12C变异。虽然以RAS为靶标的药物研究已30多年，但因该蛋白缺乏适宜的结合腔穴而成效甚微，被认为是非成药性靶标。该KRASG12C隐藏在变构腔穴中。2.1 利用变异的半胱氨酸的亲核性垂钓先导化合物Patricelli等用带有弱亲电基团的化合物探索与隐藏的Cys12发生共价结合，以发现与变构位点有结合力的苗头和先导物，发现Cys12隐藏于H95/Y96/Q99构成的结合腔内（图4）。苗头化合物经过优化得到化合物ARS-1620(34)，p-ERK-IC50=0.831μmol·L-1(p-ERK指细胞外调节蛋白激酶的磷酸化，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键步骤)。安进公司也以同样的策略优化出化合物35，p-ERK-IC50=0.220μmol·L-1。2.2 先导物优化和索托拉西布的成功35的口服生物利用度低，而体内清除率很高，安进公司比较了34和35的结合模式发现34的喹唑啉环结合于H95的隐性腔内，从而设计了通式为36化合物系列，Y处引入疏水性片段是34所没有的，根据是利用结构生物学提供的信息。用生化和细胞活性评价化合物的活性，发现37活性最强，酶-IC50=0.101μmol·L-1, 细胞p-ERK-IC50=0.335μmol·L-1。分析37与KRASG12C复合物晶体结构（图5），发现喹唑啉酮、7位连接的取代苯和哌嗪的2位还有可优化的空间，从而变换了这些位置的原子或基团，例如7位连接不同取代基的苯环，萘环苯并咪唑杂环，喹唑啉酮8位的氮杂，哌嗪2位的甲基取代等，在不同的组合中，对化合物在酶、细胞、选择性、过膜性(MDCK)、溶解性、小鼠的生物利用度、清除率、分布容积和半衰期等多参数进行比较，优选出38的R-异构体。38产生光学异构的原因是喹唑啉酮与异丙基苯的单键旋转受到阻碍，R和S活性有较大差异。然而克服阻转的活化能并不很高，ΔG‡=26kcal·moL-1，25℃半衰期(t1/2)=8天，说明不能得到稳定的纯优映体。为解决这个阻转异构，采用的策略是提高旋转异构的能垒，使ΔG⧧>30kcal·moL-1，以得到稳定的立体异构体；或降低旋转异构的能垒ΔG⧧<20kcal·moL-1，成为可以自由旋转的混合物，或者设计没有手性轴的分子。研制者设计了两种方法测定化合物的阻转异构问题：用变温核磁（VT-NMR）测定快速旋转异构的化合物；用时间过程1H-NMR的变化测定慢速旋转异构的化合物。在系列变换异丙基苯中发现4个化合物有较强的活性和稳定的阻转异构体，结构与数据列于表1中。动物实验表明R-39的药效和药代性质优胜，但在解决多晶性时发现晶型比原先用的无定形粉末的生物利用度降低了10%，这对于控制血药浓度是不利的。为解决R-39的这个问题，再做结构优化：通过降低喹唑啉酮环上亲脂性和提高R-39的极性表面积，例如用吡啶代替苯环等，最终发现了化合物44，其R-构型活性显著强于S型，二者的阻转异构的自由能垒ΔG⧧>31kcal·moL-1, 25℃下t1/2>180年，提示R-44是非常稳定的优映体。图6是R-44与KRASG12C的结合图。R-44定名为索托雷塞(sotorasib)，临床研究表明治疗小细胞肺癌有很高的应答率。2021年FDA批准为首款治疗KRAS变异的靶向药物。Figure 6 Binding diagram of R-44 to GDP-KRASG12C3变构抑制剂阿思尼布的研制 慢性粒细胞白血病(CML)是血液干细胞过度增殖发生的，由于第22号和第9号染色体交互易位，导致22号染色体变短（被称作费城染色体），成为人类癌症与基因变异之间关系的最早的证据。染色体易位的分子基础是Bcr–Abl编码的蛋白酪氨酸激酶过于活化所致。所以，抑制Abl酪氨酸激酶的活性，阻止ATP对蛋白的磷酸化治疗CML。伊马替尼成为最早以分子靶向为目标的抗癌药物。在这以后上市了不少针对Bcr–Abl发生变异的CMC药物，但都是以抑制ATP结合为特征，因而发生普遍的耐药性问题。诺华公司基于Abl激酶C端半段处存在变构区域，天然变构底物是正十四烷酸(豆蔻酸)，为正向调节剂，参与酶功能的自调节作用。诺华公司根据伊马替尼-Abl1晶体结构的特征，用核磁共振15N, 1NH-HSQC分析了化合物与激酶变构区的信号，测定C端螺旋-1的构象，特别是Val525的信号变化，以评价化合物的结合状态，通过基于片段的分子筛选发现了与豆蔻酸竞争结合变构位点的两个苗头物45和46，但都没有抑酶活性。去除影响45和46结合的酯基和正己基（在变构腔中会与螺旋-1发生碰撞），通过基团的变换连接45和46，得到化合物47虽然有结合作用但仍没有活性（没有影响螺旋-1中Val525的信号变化），将二氯换成三氟甲氧基化合物48，根据是借用了化合物GNF2含有的OCF3基团（GNF2对BL SH3/2/1的活性很高，IC50=0.009μmol·L-1），拉电子的OCF3基团将螺旋-1诱导成非活性构象，48呈现出细胞活性（GI50=8μmol·L-1），核磁共振的Val525信号明显降低。进而对中间的苯基取代基和哌嗪环变换，49的结合与抑制细胞活性明显提高。48的结合模式显示吗啉环电荷密度分散，影响结合作用，从而变换为芳香环提高疏水结合作用。化合物50通过嘧啶环和3-羟基吡咯烷基的引入。活性大幅提升(Kd=0.023μmol·L-1；GI50=0.017μmol·L-1)。与变构区的晶体结构显示，CF3中的一个氟原子（对称的三氟之一）与变构区的亮氨酸L359的羰基发生不利的正交极性相互作用，从而用氯原子取代OCF3中的一个氟原子实现了活性的进一步提升，再用吡唑环代替嘧啶环降低了与hERG钾通道的结合，最终研制出ABL1变构抑制剂51，定名为阿思尼布(asciminib)。51对重组BCR-Abl1的Luc-Ba/F3细胞生长半数抑制率(IC50)野生型和T315I突变型分别为1和25nmol·L-1，临床结果表明对既往接受治疗费城染色体阳性慢性髓系白血病(Ph+CML)的耐药患者有治疗效果，于2021年获FDA批准。图7显示了变构药物阿思尼布和正构药物尼罗替尼(nilotinib)与BCR-Abl1结合位点的区别，前者结合于变构区，后者占据ATP结合区。4氘可来昔替尼的研制 4.1 TYK-2激酶的JH2结构域是变构位点Janus激酶家族是非受体型酪氨酸激酶，包含JAK-1、JAK-2、JAK3和TYK-2等4个亚型，分别结合于膜上细胞因子受体的胞内域，导致Janus激酶催化转录蛋白的信号转换因子和激活因子发生磷酸化，再经二聚化转移至核内。其中TYK-2与JAK-2二聚化调节白介素IL-12和IL-23信号通路，是炎症和免疫性疾病重要蛋白靶标。抑制TYK-2激酶对某些自身免疫性疾病有治疗作用，例如多发性骨髓瘤、溃疡性结直肠炎和牛皮癣等。该靶标重要之处还在于抑制TYK-2不影响免疫系统，不增加真菌感染的风险，这与JAK-1和JAK-2抑制剂因免疫力下降而发生真菌感染有明显区别。由于JAK家族的催化结构域（JH1）的高同源性，以此作靶标难以实现选择性作用。而TYK2存在有与JH1结构域相邻但无催化活性的假激酶结构域（JH2），成为实现选择性的突破口。Tyk2JH2与Tyk2JH1非常相似，但两个结构域的结合腔有差异。Tyk2JH2与ATP的结合非常弱，Kd=24μmol·L-1。4.2 已上市的Janus激酶抑制剂药物自2011年首创的泛JAK激酶抑制剂问世以来，在本品之前已有8个药物上市，表2列出的52~59都是JAK-1/-2/-3单一或组合靶标的抑制剂，对TYK-2没有或弱活性。这些药物有引起免疫力下降的不良反应。4.3 变构位点的抑制剂TYK2蛋白质具有多个结构域参与分子间和分子内的相互作用，其功能是介导受体的催化结构域的激活。TYK2中存在一个伪激酶结构域JH-2，本身没有催化活性，但通过自抑制作用，在调节受体介导的邻近催化结构域JH1的激活中却发挥关键作用。此外，自然杀伤(NK)细胞对肿瘤的监测也需要TYK2，但无需TYK2的激酶活性。若小分子将TYK2伪激酶结构域JH-2的构象稳定在阻止与激酶结构域JH-1之间的自抑制相互作用，就可阻断受体介导的激活和催化结构域的活性。这种稳定化作用导致下游信号转导被阻断。4.4 研制过程BMS对公司化合物库做高通量筛选，发现化合物60对TYK-2JH2有一定的活性和选择性，用人和小鼠肝微粒体温孵有较高的代谢稳定性，作为苗头化合物，首先对C3的酰胺基作变换。酰胺的单甲基化物61的活性虽然略有下降，但对TYK-2JH2选择性提高了。61与TYK-2JH2复合物单晶结构显示经氢键网络固定在JH2铰链处，C3酰胺上的甲基适配于邻近Ala671形成的“丙氨酸腔”。由于多数激酶此处的氨基酸尺寸都大于丙氨酸（数百个激酶中只有9个是Ala），这就解释了为什么60对JAK1/2也呈现结合，而61明显降低了。下一步优化61，考察母核C4经NH连接的苯甲酰胺的变换对活性的影响，化合物62对TYK-2JH2和细胞活性，都显著强于61，62的过膜性和对人和小鼠肝微粒体的稳定高于61。62曾作为高活性分子，进行了深入研究，发现肝微粒体对其有较强的代谢作用，证明是母核3-甲氨基酰基被氧化代谢失去甲基，预示该代谢产物因选择性降低而脱靶。为证明这个推断，合成62的N-氘代甲基化合物提高代谢稳定性。这个同位素效应用在了以后的优化上。在优化61时发现了63活性和选择性进一步提高，一是4′′位引入甲基消除抑制c-Kit作用；另一是2′-甲氧基-3′-取代的酰氨基片段，对TYK-2JH2的IC50为0.3nmol·L-1。化合物63与TYK2JH2复合物单晶衍射分析表明，3′的酰基氧原子与Arg738侧链的H-N形成氢键(3.1Å)，酰胺的N-H与2′-OCH3的氧原子形成分子内氢键，赋予N-吡啶甲基处于开阔的腔穴中。为了克服酰胺的代谢或化学的不稳定性或构象的异变性，63的C3′连接的酰胺片段用芳杂环置换。在药物化学中，常常用五元芳杂环对酰胺片段作骨架迁越，并确保N或O或NH作为氢键的接受体或给体的存在。SAR研究发现1-甲基-1, 2, 4-三唑化合物64对IFNα细胞活性高(IC50=4nmol·L-1)。此外对小鼠肝微粒体的代谢稳定性也很高，选择性作用也很强，64对260种激酶的抑制活性很低，低于对TYK-2JH2活性的1000倍，其中包括JAK-1/-2/-3酶的JH-1结构域的活性。然而64对hERG钾通道有一定的抑制作用，IC50=31μmol·L-1，仍需继续优化。下一步的结构改造是保持活性和选择性，改善过膜吸收和代谢稳定性，经过多轮优化，母核吡啶换成哒嗪环，6位的氨基芳杂环换成环丙基甲酰胺基，3位的甲胺酰基换成三氘代甲基，得到的化合物65过膜性强，保持了酶和细胞的高抑制活性，代谢稳定性高，半衰期可达120min，对hERG钾通道没有抑制作用，65作为候选物定名为氘可来昔替尼(deucravacitinib)，经临床研究证明口服治疗中/重型斑块状银屑病，于2022年FDA批准上市，成为首创的作用于TYK2的口服治疗银屑病的新药。图8是氘可来昔替尼与TYK2JH2蛋白复合物晶体结构，哒嗪环连接的C6胺基和C3酰甲胺基与酶的JH2域的铰链区形成三重氢键结合，环丙基在铰链区的延伸处，氘代甲基结合于TYK2JH2特有的丙氨酸腔穴中（Ala671），三唑与Arg736直接氢键结合。C2′的甲氧基与Lys642氢键结合，并处于蛋白C端的表浅的疏水槽内。3抗体偶联药物1组成 抗体偶联药物(ADC)是由单克隆抗体(mAb)和毒物（payload，本文称药物）经连接基（linker）共价结合为单一分子。设计ADC策略是基于单抗的高特异性靶向能力并作为运载体，将本来缺乏靶向能力的强效杀伤药物，经连接基成为单一分子。ADC靶向靶细胞，内化进入肿瘤细胞，溶酶体将药物释放，与靶标（蛋白或核酸）强效结合，实现了对癌细胞的高效精准杀伤。所以，ADC是利用单抗对携带有相应抗原的肿瘤细胞的选择性，利用药物对肿瘤靶标强效的杀伤性，在靶细胞内利用生化或化学反应释放出强效药物而杀伤，所以ADC也可认为是潜伏化的大尺寸前药（prodrug），实现选择性。自第一个ADC药物Mylotarg®（gemtuzumab ozogamicin，奥加米星吉妥组单抗）于2000年获得FDA批准以来，截至2022年全球共有11款ADC药物获批，用于血液系统恶性肿瘤和实体瘤，此外，目前还有100多个ADC候选物处于临床试验的不同阶段。图9是ADC作用机制的示意图。表3中列出了经FDA批准上市的ADC药物，为了叙述药物的结构特征，将ADC“还原分解”成三部分：单抗（antibody）、连接基（linker）和药物（payload）。以示连接的方式，读者也容易连接成ADC。表中DAR(drug-antibody ratio)代表每个单抗分子缀合药物分子的平均值，是ADC效率的一种量度。奥加米星吉妥组单抗：ADC内化后，腙键可以在内涵体酸性环境中水解，释放出卡奇霉素的前体，然后被谷胱甘肽还原为游离的活性卡奇霉素。后者与DNA小沟结合，并经过Bergman环化作用，从而产生高反应性双自由基，引起序列选择性的DNA双链断裂。维布妥昔单抗：连接基可裂解。ADC结合CD30后内化，转运到溶酶体。溶酶体中蛋白酶裂解出药物释放到胞浆中将细胞杀伤。恩特曲妥珠单抗：连接基是不可裂解的。4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(MCC)连接于单抗的Lys上。溶酶体内的蛋白酶只逐步将抗体水解，遗留下Lys-MCC-美坦新(Lys-MCC-DM)，美坦新带着连接基与微管蛋白结合，抑制微管的正常组装。伊组单抗奥加米星：连接基含有腙片段，在偏酸性癌细胞中裂解，释放出卡奇霉素，后者在亲核基团作用下，烯二炔电荷转移环合，生成1, 4失氢双自由基，与DNA共价嵌合，抑制细胞周期。维泊妥组单抗：蛋白酶可裂解二肽连接基缬氨酸-瓜氨酸，后者又分解出对氨基苄醇，与微管抑制剂单甲基auristatin E（MMAE）共价结合的氨基甲酸酯对酸也敏感。维恩妥人单抗：连接基可酶解断裂。马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(MC-Val-Cit)连接在抗体的半胱氨酸残基上，内吞后经溶酶体的蛋白酶水解，释放出药物MMAE。德曲妥珠单抗：连接基可裂解。四肽GGFG溶解性较好，与药物连接点为氮杂缩甲醛，在偏酸性的癌细胞中容易分解，释放出药物。戈沙妥珠单抗：Trop2是肿瘤相关钙信号转导2受体，该受体在三阴性乳腺癌中高表达。药物是喜树碱类拓扑异构酶I抑制剂SN-38，与连接基结合位点是敏感的C16羟基，经碳酸酯连接，对酸性是敏感的。玛贝妥单抗：BCMA单抗为无岩藻糖基化单克隆抗体，抗体的半胱氨酸残基连接马来酰亚胺己酰基，连接基与MMAF偶联。与抗原结合后在Fc区被岩藻糖基化，增强了内化后的细胞毒性。替朗妥昔单抗：连接基为酶可裂解的缬氨酸-丙氨酸和增加水溶性和稳定性的聚乙二醇，连接的药物是非对称的吡咯并苯并二氮杂卓（PBD）二聚体。释放出的二聚体与DNA嵌合。维替索妥人单抗：组织因子(TF)是参与肿瘤信号传导和血管生成的蛋白质，多数实体肿瘤中TF高表达，所以是ADC药物的理想靶标。连接基可裂解，连接药物单甲基奥瑞他汀E（monomethyl auristatin E），本品用于治疗宫颈癌，有望治疗多种实体瘤。索米妥昔单抗：FAα在卵巢中高表达，内化后连接基被裂解，释放出的药物美登素(ravtansine, DM4)阻断胞内微管网络形成，抑制细胞增殖。2连接基的设计是药物化学的主要任务 研制ADC旨在满足临床需求。选定病种，确定变异的抗原，选择已经批准的相应单克隆抗体，这是研制ADC的切入点。例如针对高表达叶酸α受体的卵巢癌，Mirvetuximabsoravtansine公司确定了叶酸α受体单抗为载体，研制成功了继PARP抑制剂奥拉帕尼等靶向药物后的首个治疗抗耐铂类药物的卵巢癌药物索米妥昔单抗(77)。日本第一/三共制药基于多种实体瘤高表达HER2蛋白，因而选择HER2为靶标的单抗，研制成功的德曲妥珠单抗(72)，已经批准数个实体瘤适应症（乳腺癌、胃癌、结直肠癌和非小细胞肺癌等）。选定靶标和单抗主要是临床医生和分子生物学家的任务。在药物(payload)方面，上市的ADC都是本身难以成药的细胞毒物，在基因水平上摧毁细胞增殖的毒性分子，ADC的单抗赋予了这些毒物以选择性—主要对癌细胞的DNA/RNA的复制或表达，终止了细胞周期。因而，构建连接基(linker)在一定意义上成为研制ADC的药物化学重点。内容包括：①ADC分子中药物-抗体比值(DAR)，即每个单抗连接的药物分子数，已上市的DAR=2~8。DAR值过低作用强度不够，过大有失稳定性风险；②稳定性，是连接基的最重要使命。要求在到达靶组织之前的循环血中ADC保持化学结构稳定不变，不得有游离药物的泄露，避免毒副作用；③释放性，要求ADC内化癌细胞后连接基迅速裂解（酶或化学分解），癌细胞浆偏酸性，是含有腙基(66、67、69)、对氨基苄醇酯片段(70、71、73、75、76)和氮杂缩甲醛(72)容易裂解的位点，蛋白酶可水解含有缬-瓜二肽(70、71)和甘-甘-苯丙-甘四肽(72)片段，肽结构还有助于水溶性。含有聚乙二醇的73和75更有利于溶解性。68的连接基是不可裂解的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(MCC)与单抗的单抗的Lys连接，溶酶体内的蛋白酶只逐步将抗体水解，留下Lys-MCC-美坦新(Lys-MCC-DM)，后者与微管蛋白结合，抑制微管的正常组装。4特异性降解靶标蛋白的蛋白水解靶向嵌合体1原理 上一节讨论的ADC是类双功能分子：单抗是导向载体，药物杀伤靶标和细胞。本节讨论的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）也是双功能分子, 也是由三部分组成：靶蛋白配体、E3泛素连接酶配体和连接基组成，但属于小分子范畴。PROTAC能特异性结合靶蛋白，同时募集并结合E3泛素连接酶，后者催化靶蛋白多聚泛素化、被泛素化的靶蛋白通过被蛋白酶体系降解成氨基酸和寡肽。简言之，PROTAC将靶蛋白和E3连接酶（E3ligase）结合成三元复合物：靶蛋白-PROTAC-E3连接酶，此时E3连接酶介导E2泛素结合酶将靶蛋白泛素化。三元复合物解离，PROTAC复原，被泛素化的靶蛋白被输送到蛋白酶体中降解，降低了靶蛋白水平。复原的PROTAC分子作新一轮的催化结合，循环多次，理论上没有消耗。PROTAC是小分子化合物，可以口服是一大长处。而又不是一般药物靠占据/结合靶标活性（或变构）位点作“消耗性”起效，而是在借助双配体的介导，靠蛋白酶体发生降解靶标蛋白的事件，这个过程即使PROTAC结合靶蛋白/E3酶的作用较弱，或浓度较低也同样能够发挥作用，加之其“催化”的特性，是通常药物所不及的。当然，活性强是获得最大降解水平(Dmax)（>90%）和低半数降解浓度(DC50)。为此，两种配体对靶蛋白和E3酶的强效亲和力是产生高Dmax结构基础。通过微调配体的结构、连接基的组成、长度和刚性以优化摄入细胞改善DC50。2现状 PROTAC在全球药企和大学研制的很多，但迄今还没有被批准上市的药物。目前处于临床研究的共24个，6个在II期和I/II期的列于表4。本文仅以PROTAC技术发明人Crews创始的Arvinas公司研制的ARV471（78）和ARV110（79）为例简述PROTACD的化学特征，这是目前已经完成II期临床研究处于领先的项目。两个候选物分别是雌激素受体降解剂（SERD）和雄激素受体降解剂（SARD）。分子的左侧（红色）是结合雌/雄激素受体的配体。两个配体（片段）分别借鉴雌/雄受体调节剂（SERM/SARM）的结构优化或简化而来，例如78与他莫昔芬（84, tamoxifen）骨架79与比卡鲁胺（85, bicalutamide）骨架具有结构相似性。目前研制PROTAC的靶蛋白配体的结构大都源自于已有的药物或活性物。与E3连接酶结合的配体是免疫调节酰亚胺药物(IMiDs)，分别是泊马度胺和来那度胺的类似物。它们高选择性地结合于E3连接酶CRBN，促进靶蛋白的多聚泛素化。PROTAC连接基与ADC不同，是稳固的共价结合片段，确保化合物的稳定性。为了保障良好的物理化学性质，连接基多为亲水性片段，78和79是哌啶甲基哌嗪。ARV-471的II期临床表明单药治疗ER+/HER2-乳腺癌患者显示良好的耐受性和38%的临床获益率（完全缓解率、部分缓解率或疾病稳定率>24周），优于氟维司群效果，达到了试验的主要终点。ARV110（79）的I期和II期临床试验结果显示, 在治疗携带AR T878X/H875Y（T878X=T878A或T878S）突变的转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者中表现出强力抗癌活性。在安全性上II期临床试验推荐剂量表现出可控的耐受性。5非药化途径提高药物选择性小分子药物集活性、选择性、合理药代和安全性于化学结构之中，实在勉为其难。即使多轮结构优化，也未必体现了全优属性，顾此失彼和退而求其次的通融倒是常态。但即便如此，还存在难以消除的缺点，在难以从结构层面上克服时，用另一药物消除、缓解和抵消不利因素，提升治疗效果也是一种策略。1熟知的药物配伍 现已应用较少的磺胺类抗菌药主要从尿中排出，但由于磺胺的偏酸性在尿液中溶解度低，容易发生结晶尿和在肾脏沉积，造成肾脏损伤，因此磺胺药同时服用碳酸氢钠，提高尿液pH值，增加在尿液中的溶解，这是改善药物排泄的历史悠久的例子。另一与磺胺配伍应用的是磺胺增效剂，例如甲氧苄啶（trimethoprim）是叶酸合成酶抑制剂。人体的叶酸是作为维生素从膳食中获得，而细菌的叶酸需从对氨基苯甲酸（PABA）和谷氨酸合成，磺胺的抑菌作用是PABA的抗代谢物；甲氧苄啶抑制叶酸的合成，所以同时服用磺胺和甲氧苄啶是从两个环节抗菌的。甲氧苄啶虽称作增效剂，也可作为抗菌药单独应用。久用β-内酰胺类抗生素引起的耐药菌的因素之一是细菌产生β-内酰胺酶，催化水解β-内酰胺环使药物失效。同时服用β-内酰胺酶抑制剂可维持抗生素的抗菌作用。克拉维酸（86，clavulanic acid）与阿莫西林或替卡西林的复方、舒巴坦（87, sulbactam）与头孢哌酮的合用，他唑巴坦（88, tazobactam）与哌拉西林的配伍都是常用的抗菌复方。2新的范例 Covid-19引发的全球3年疫情催生了辉瑞公司抗新冠病毒药物帕克洛维（Paxlovid）的研制，美国FDA于2021年12月批准上市。帕克洛维是一款固定剂量组合的复方制剂，它含有两种活性物质奈玛特韦(89, nirmatrelvir)和利托那韦(90, ritonavir)，两药各司其职，主药奈玛特韦抑制新冠病毒增殖（药效），辅药利托那韦延长主药的作用时间（药代）。冠状病毒普遍存在3C样半胱氨酸蛋白酶(3CLpro)，功能是整合和处理众多的原蛋白，是病毒增殖的重要酶系。辉瑞公司筛选出苗头化合物并改构得到含酮基的二肽，酮基作为亲电基团可与3CLpro的Cys145发生共价结合而抑制3CLpro。经多轮优化最终研制出89，是含有脂肪氰基的拟二肽，氰基可与Cys145共价结合成硫代亚胺酸酯，强效抑制酶活性和病毒复制。然而奈玛特韦在体内迅速被细胞色素CYP3A4代谢失活，研制者选用已上市的CYP3A4强效抑制剂利托那韦辅助用药，可将奈玛特韦的体内半衰期延长到6h，因而规定帕克洛维每隔12h服用一剂，两药分别履行药效与药代，共同维持治疗效果。3治疗心衰的双分子结合药物Entresto 2015年7月美国FDA批准诺华公司的复方制剂心衰药物Entresto上市（中文商品名诺欣妥），治疗慢性心力衰竭，这个复方制剂是以多种方式作用于心脏的神经内分泌系统，治疗效果与标准疗法比较，显著地降低心衰患者的死亡率，被认为是20多年来心衰治疗药的重大突破。Entresto是由沙库巴曲（91, sacubitril, 49mg）和缬沙坦（92, valsartan, 51mg）组成。沙库巴曲的作用靶标是抑制一种中性内切酶（neprilysin），后者是降解血浆中心房利钠肽（artrial natriuretic factor, ANF）的水解酶，因而沙库巴曲使内源性ANF肽维持在一定的水平，保护心脏的神经内分泌系统，有利于心衰患者；缬沙坦是血管紧张素I受体阻断剂，抑制AngⅡ的升压作用，阻断患者的过于活跃的肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）。复方制剂Entresto中的沙库巴曲是以新分子实体（NME）首次上市的，就与1996年就已上市的缬沙坦配伍，两个都是主成分，不同的药理作用的各司其职的互补性，使得Entresto在治疗心衰患者成为划时代的突破。Entresto在剂量设计和分子结构上也很有特色：两个成分的治疗剂量恰好是等分子比量；与钠离子形成配位键结合以及分子内和水分子间的氢键网络，构成了稳定的超分子结合的共晶结构。图10是共晶复合物结构。每个共晶体由6个沙库巴曲负离子，6个缬沙坦负离子，18个钠离子和15个水分子构成，分子式为C288H330N36Na18O48·15H2O，分子量为5748.03，为白色六边形片状结晶形粉末，熔点138℃。复合物在固态和pH5~7的水溶液是稳定的。4治疗成人重度抑郁症的Auvelity 2022年08月FDA批准了Axsome Therapeutics公司研制的复方缓释片剂Auvelity，用于治疗成人重度抑郁症，这是60多年来首款具有新作用机制的抑郁症口服药，提供了起效迅速的新疗法。在用药1周之后，抑郁症状就得到显著改善；2周以后，每个阶段的缓解率都显著更高，实现了快速、持久且显著改善抑郁症状。这个划时代成功制剂却是由两个已知药物组成的：右美沙芬（93, dextromethorphan HBr, 45mg）和安非他酮（94, bupropion HCl, 105mg），竟成为唯一被批准用于重度抑郁症的口服速效N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，全新的作用机制。Auvelity治疗作用的确切机制有待深入解析。这个组合中，右美沙芬是非竞争性NMDA受体拮抗剂，同时也是阿片σ受体激动剂，可调节谷氨酸能神经传递。安非他酮是去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制剂，还竞争性抑制细胞色素CYP2D6，后者阻断了右美沙芬的体内代谢降解，因而提高了生物利用度。研究表明Auvelity的血液水平是由两个药物之间独特的药代动力学相互作用决定的，在稳态时发现这种相互作用是非线性的。5消除抗精神病药物的不良反应 现有抗精神病药最常见的不良反应为引发锥体外症状，代谢紊乱和增重等，患者的依从性较差。Karuna Therapeutics公司研制了口服新型组合药物KarXT，是由呫诺美林（95, xanomeline）和曲司氯铵（96, trospium chloride）组成，呫诺美林是毒蕈碱受体激动剂，曲司氯铵是毒蕈碱受体拮抗剂。这种配伍旨在激活大脑中的毒蕈碱型乙酰胆碱受体的同时，减少对外周毒蕈碱型乙酰胆碱受体的作用。呫诺美林是毒蕈碱M1/M4受体选择性激动剂，对M2、M3、M5受体作用较弱，由于容易透过血脑屏障，皮质和纹状体的摄取率较高，是目前选择性很高的M1/M4受体激动剂。但因有外周作用引起胃肠和心血管系统不良反应。曲司氯铵为毒蕈碱全M受体拮抗剂, 属于抗胆碱能类化合物, 可松弛膀胱平滑肌，单独应用治疗膀胱过度活动症和急迫性尿失禁。由于结构中存在季铵离子难以穿越血脑屏障和进入中枢神经系统，所以只是外周毒蕈碱受体拮抗剂，因而服用KarXT不影响呫诺美林的药效，反而降低了对外周的不良反应。III期临床表明，口服KarXT可治疗精神和神经系统疾病，包括精神分裂症和阿尔茨海默症中的精神症状，由于减轻了不良反应，患者对KarXT的依从性也较好，有望成为50年来首个具有新颖且独特的双重机制的药物组合，通过不依赖多巴胺能或血清素能途径来治疗严重精神疾病的症状的药物。— 小结 —  提高创制药物的活性和选择性，无论是首创性或跟随性创新，都是以满足患者需求为前提、以靶标为核心的科技实践，它是由众多环节构成的价值链组成，这其中隐含着3个要素，即确证致病的分子机制、把握疾病的微观特征、阐明药物作用的分子机制，体现了生物学驱动研制的内涵。这3个要素的共同特征是把宏观的表象转化为微观的分子特征及其变化。始于设定并确定靶标分子是致病的根源，终于药物呈现的疗效是干预致病靶标的结果。靶标是致病分子机制的核心。然而将一种疾病“提炼”或归结成一个靶标蛋白或网络通路的关键节点，这个由繁至简的过程需要反复的验证，证明疾病与靶标不只有相关性，更需要有因果关系的证据。疾病的宏观表象和微观特征的关联，在发病和实验治疗中从微观分子水平进行分析，例如检测基因缺失与变异，应用蛋白质组学、转录组学、表观遗传等技术，分析患者的临床表现，经数据挖掘，归纳出基因-蛋白(酶、受体、通道、信号分子等)与疾病的关系，从而对创制新药和治疗方法提供新的科学依据。人工智能（AI）晚近有巨足的进展。阐明药物的作用机制是对致病分子机制的验证，也是创制过程的终点与归宿，这样，在微观的分子层面上完整地阐明了药物剂量-疗效-不良反应的内在关系。阐明药物的作用机制得以深化对疾病和治疗的认识，也有助于扩展和指导新一代药物的研制。本文是从实用角度例解提高药物活性和选择性的策略方法，读者也可从生物学层面分析这3个要素的内涵。文章信息源于公众号精准药物，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 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2月22日，BioBAY园内企业英矽智能宣布，其自主研发的抗新冠病毒口服创新药ISM3312已获得中国国家药监局的临床试验许可，即将进入临床试验阶段。这将是第二款在英矽智能自有AI平台赋能下发现的进入临床试验阶段的药物。 英矽智能是一家由端到端人工智能（AI）驱动的药物研发公司，通过下一代人工智能系统连接生物学、化学和临床试验分析，利用深度生成模型、强化学习、转换模型等现代机器学习技术，构建强大且高效的人工智能药物研发平台，识别全新靶点并生成具有特定属性分子结构的候选药物。英矽智能聚焦癌症、纤维化、免疫、中枢神经系统疾病、衰老相关疾病等未被满足医疗需求领域，推进并加速创新药物研发。 ISM3312是一款靶向主蛋白酶（3CLpro）的高选择性小分子抑制剂，其新颖的分子结构是由生成化学平台Chemistry42基于冠状病毒主蛋白酶结构全新生成的化合物优化而来，以全新的不可逆共价结合机制与靶点蛋白相结合，具有更广谱的抗冠状病毒活性、优秀的单药口服生物利用度、以及潜在抗临床耐药突变的能力。 临床前研究数据显示，ISM3312可显著降低肺部组织病毒载量并明显改善肺部炎症，且具有广谱抗冠状病毒活性，对多种新冠病毒流行株（如：SARS-CoV-2野生株、Delta、Omicron）及其他类型的冠状病毒（如：SARS-CoV、MERS-CoV等）均显示出抗病毒活性。 临床前药代动力学研究表明，ISM3312具有良好的口服吸收特性、渗透性和生物利用度。与辉瑞奈玛特韦和盐野义恩赛特韦相比，可在较低的剂量以及较低的暴露量下起效，且无需与其他CYP3A代谢酶和P-gp抑制剂（如：利托那韦）联用，从而有望进一步降低药物的毒副作用和药物相互作用风险，扩展药物的适用人群。 另外，鉴于冠状病毒的高度变异性，在使用Paxlovid™和类似的批准药物时，有可能出现耐药菌株。ISM3312具有克服临床耐药性的潜力，这可能为目前临床治疗中广泛使用同一作用机制药物造成的耐药性问题提供解决方案。 英矽智能联合首席执行官兼首席科学官任峰博士表示：“在新冠项目中英矽智能充分利用自身特色，将人工智能平台能力与研发团队专业能力相结合，设计了具有新颖结构和分子骨架3CLpro抑制剂，与已上市的同靶点药物相比ISM3312具有显著的差异化优势。我们期待通过针对新冠药物研发的快速通道，加速推进临床试验早惠及全球患者。” 作为一款由AI参与设计和筛选的小分子候选药物，ISM3312的化学合成相对简便，生产成本优势明显。从商业可及原料到化合物制备仅需两步合成，适用于大规模工业化生产以解决患者用药可及性问题。英矽智能将尽快启动ISM3312在中国的临床试验，探索该药物在人体内的耐受性、安全性和药代动力学特征，以及在不同新冠患者亚群中的药效和安全性，尽快为后疫情时代的健康管理提供新的选择。 英矽智能创始人兼首席执行官Alex Zhavoronkov博士表示：“生成式人工智能正在变革人类发展的各个领域。ChatGPT将生成式人工智应用进消费领域，然而，生成式人工智能并不新鲜。自2016年在该领域发表了第一篇同行评审论文以来，英矽智能一直致力于该领域的研究。我们非常高兴宣布，英矽智能第二款使用生成式人工智能设计的小分子药物已获批进入临床试验阶段，而且这款药物的发现有非常明确的时间表。” 新冠爆发之初，英矽智能利用SARS疫情中发现的病毒结构和知识来训练其生成式人工智能平台。2020年初，研发团队在靶点发现平台PandaOmics的支持下缩小研究目标并确定了靶向主蛋白酶的新药研发策略，同年2月英矽智能公布了利用其生成化学平台Chemistry42设计的第一组新型化合物结构，并在同年4月提交了新冠特效药相关的专利申请。 英矽智能是率先将生成式人工智能应用于药物研发领域的人工智能制药公司。自2021年以来，在人工智能平台Pharma.AI的赋能下，英矽智能高效发现了10款临床前候选化合物，覆盖纤维化、肿瘤学和免疫学等疾病领域，其中进展最快的抗特发性肺纤维化候选药物已完成在新西兰和中国开展的1期临床试验，将于近期启动全球多中心2期临床试验，该候选药物在2023年2月获得FDA孤儿药认定。 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。