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“早上困，中午困，下午困，晚上一拿手机就不困”“熬最长的夜，敷最贵的面膜”“三点睡五点起，阎王夸我好身体”......成了不少年轻人/打工人的真实写照。睡眠的重要性不言而喻，但随着社会飞速发展以及生活节奏加快，“拼命十三郎”们只能舍弃睡眠时间，转而投入996甚至007的“社畜”工作中。 除了繁忙的工作压缩了睡眠时间外，一个更常见的现象是“报复性熬夜”——白天被各种琐事儿缠身，只有当晚上躺在床上的那一刻，时间才开始属于自己，接着就是“无止境”的熬夜。当从手机中“缓过神”的时候，发现自己根本睡不了几个小时又要搬砖了！ 今年最新发布的《2024中国居民睡眠健康白皮书》显示，我国居民的平均睡眠时长为6.75小时，甚至有28%的人夜间睡眠时长不足6小时。睡不着、睡不深、睡不够等问题困扰着越来越多的人。 正如大家调侃得那样“晚上不睡，白天崩溃”，崩溃的不仅是精神，还有身体的方方面面——熬夜使得主要心血管不良事件的风险提升92%；增加海马体中抑制神经元活动，破坏记忆巩固；导致癌症的发生等等。早在2007年，国际癌症研究机构（IARC）就把熬夜（包括昼夜节律打乱的轮班工作）定义为2A类致癌物。 近日，来自大连医科大学的研究团队揭示了睡眠不足成为癌症“铺路石”的详细机制——具体来说，当机体睡眠不足时，脂肪酸氧化能够感知到昼夜节律的紊乱，并进一步传递到致癌代谢信号，增强癌症干性和肿瘤发生。但好消息是，有改善方法！ DOI: 10.1016/j.cmet.2024.04.018 “睡眠不足会扰乱昼夜节律”并不是新闻，睡眠不足（SD）会引发多种病理过程，包括：免疫功能紊乱、新陈代谢失调，以及过早死亡。而这种昼夜节律的紊乱同样会作用于癌症发展过程，比如：改变葡萄糖、谷氨酸、胆汁酸和脂质代谢等诸多代谢，进而刺激肿瘤生长、转移和免疫逃逸。但其中的具体机制仍不清楚，也是本次研究的焦点。 第一步，研究者定位到生物机体内感知昼夜节律的关键一环——脂肪酸氧化（FAO）。 具体来说，研究者首先发现，与对照组小鼠相比，SD组有着更长的清醒时间，以及更短的非快速动眼（NREM）和快速动眼（REM）睡眠。由此可见，睡眠不足确实会导致小鼠昼夜节律发生紊乱。 紧接着，研究者分析了野生型C57BL/6J小鼠在SD和对照组培养4周后肺组织中的转录组和代谢组的差异。RNA测序结果显示，3284个基因在SD之后失去了昼夜振荡，而这些基因与脂质代谢的生物过程高度相关，尤其是FAO。 FAO是指，利用脂肪酸转化成的乙酰辅酶A（CoA）亚基来进一步生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、乙酰-CoA和三磷酸腺苷（ATP），参与到产生能量、氧化还原平衡和生物合成反应的过程中。事实上，与FAO相关的代谢酶和代谢物表现出生物节律，以维持生理功能的平衡。 对比SD组和对照组发现，对照组的FAO基因显示出节律模式，但SD组的FAO基因则出现了明显的紊乱。同时，进一步的超高效液相色谱/质谱分析显示，SD小鼠肺组织中振荡脂质代谢物的数量明显减少，并找到了47种节律紊乱的脂质代谢物，其中游离脂肪酸（FFAs）占比最大。 由此可见，FAO能在基因表达和代谢功能水平上感知到SD诱导的生理状态节律紊乱。 FAO能感知到SD情况下的昼夜节律紊乱 第二步，找到FAO在SD促癌过程中担任的“角色”。 与对照组对比，SD明显加速了肺癌的发生和发展，包括促进肺肿瘤的形成、提高Ki-67和CD166的蛋白水平，同时还会在mRNA和蛋白水平上增加MYC、SOX2、CD166和NANOG的表达。 类似的情况也发生在患者源性异种移植模型中，SD导致肿瘤体积明显增加，降低肿瘤小鼠的存活率，并提高了肿瘤组织中干性标记物的表达。 当研究者对肺肿瘤进行RNA-seq分析后发现，SD显著上调了827个基因，而这些上调的基因主要属于脂肪酸代谢过程，尤其是FAO。同时，SD组的肿瘤组织中FAO基因表达量明显高于对照组的，并表现出了节律紊乱。 为了进一步确认FAO在整个过程中的重要作用，研究者给小鼠注射了FAO抑制剂依托莫西（ETO）。结果并不令人意外，ETO逆转了SD增强的肿瘤发生，还阻碍了肺癌中Ki-67、CD166、乙酰-CoA和ATP水平的升高，即ETO逆转了SD增加的肿瘤形成率。 总结来说，FAO感知昼夜节律紊乱是SD增强肺癌干性的基础；相反，当FAO受到抑制，肿瘤进展也会被阻碍。 FAO昼夜节律紊乱维持SD诱导的肺肿瘤病变 第三步，详细定位到FAO节律紊乱维持SD诱导肺癌干性过程中的关键分子。 对比两组情况，研究者定位到13个可能导致SD引起的致癌FAO节律紊乱的常见基因。进一步，在这13个基因中发现，Acsl1 mRNA水平在SD处理的肺肿瘤中显著升高；类似的情况还出现在患者源性异种移植模型里，ACSL1蛋白表达同样有所增加。 那么，ACSL1是不是我们要找的关键分子呢？当研究者敲除了Ascl1之后，SD促进肺癌进展的作用被阻断了，Ki-67、CD166和ACSL1的表达也趋于平常，再一次证实了ACSL1是SD增强肺肿瘤发生和发展的必要条件。 于是，研究者进一步的分析了“可能作为ACSL1底物和产物的长链FAO代谢物”。鉴于棕榈酸（PA）是最主要的饱和脂肪酸，也是长链饱和或不饱和脂肪酸的前体，研究者将目光投向了PA及其代谢产物PA-CoA。 ACSL1具有将PA转化为PA-CoA的能力，而PA-CoA将以棕榈酰肉碱的形式进一步转运到线粒体中，以促进FAO的过程。而本实验结果表明，睡眠不足会扰乱了ACSL1的节律使得更多的PA转化为PA-CoA，从而促进FAO，导致肺癌生长的加速和干性特征的维持。 除此之外，ACSL1还能感知到SD诱导的CLOCK节律失常，同样能促进肺癌的发生。 睡眠不足致癌的信号通路 当然，好消息是，研究者找到了解“癌”方案——β-内啡肽。 在14种与睡眠相关的激素中，研究者发现，注射了β-内啡肽能够显著下调肺癌细胞系中的CLOCK和ACSL1 mRNA的表达，而连续给药甚至能逆转SD诱导的肿瘤生长。 为了评估上述发现的临床价值，他们还开展了前瞻性和回顾性的临床研究，评估了血清β-内啡肽水平、睡眠质量与肺癌发展之间的临床相关性。结果令人“鼓舞”，血清β-内啡肽水平与深度睡眠和REM的比例呈正相关，而与清醒次数呈负相关，即β-内啡肽水平能够很好地预测睡眠质量。 不仅如此，对62例肺癌患者开展的回顾性分析显示，β-内啡肽水平与CLOCK、ACSL1、CD166和Ki-67评分呈负相关，呈现出抗肿瘤效果；而生存期分析结果表明，血清中的高β-内啡肽水平具有较好的预后价值。 临床试验中β-内啡肽水平与指标之间的影响 综上所述，睡眠不足会促进癌症的生长、转移和免疫逃逸，而在这个过程中，FAO的节律紊乱发挥了重要的作用。不过好消息是，补充β-内啡肽或能有效地规避这一风险。 因此，“睡眠不足，癌症来找”是有科学依据的。睡眠的重要性不言而喻，不如就从今天开始早睡计划吧！ 参考资料： [1]Peng F, Lu J, Su K, Liu X, Luo H, He B, Wang C, Zhang X, An F, Lv D, Luo Y, Su Q, Jiang T, Deng Z, He B, Xu L, Guo T, Xiang J, Gu C, Wang L, Xu G, Xu Y, Li M, Kelley KW, Cui B, Liu Q. Oncogenic fatty acid oxidation senses circadian disruption in sleep-deficiency-enhanced tumorigenesis. Cell Metab. 2024 May 14:S1550-4131(24)00138-4. doi: 10.1016/j.cmet.2024.04.018. Epub ahead of print. PMID: 38772364. 撰文 | Swagpp 编辑 | Swagpp ● 重磅！科主任训话：卫健委鼓励医护兼职创业，不是让你去摆摊、送外卖！要和医疗相关！上了热搜后，他从医院离职了！医护兼职到底能干啥？ ● 阿司匹林再添新用！JAMA最新：仅低剂量服用，能使肝脏脂肪减少10.2%、糖尿病风险降15%！ ● 热议！阳光绩效实行，医生工资升，护士工资降？护士透露：从9千多降到2千多，不怕本科护士全跑光？护士有400万缺口，不能厚此薄彼 版权说明：梅斯医学（MedSci）是国内领先的医学科研与学术服务平台，致力于医疗质量的改进，为临床实践提供智慧、精准的决策支持，让医生与患者受益。欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。 点击下方「阅读原文」 立刻下载梅斯医学APP！

摘要：抗体药物偶联物（ADCs）已经彻底改变了包括乳腺癌在内的许多类型癌症的治疗方法。最近，两种新的ADC药物获得批准，曲妥珠单抗德鲁替康和萨西图珠单抗戈维替康；两者在总生存期方面都展示了令人印象深刻的改善，曲妥珠单抗德鲁替康在所有三种亚型的转移性乳腺癌中，萨西图珠单抗戈维替康在亮面和三阴性转移性乳腺癌中。这些药物是ADC三个组成部分——单克隆抗体、有效载荷和连接体——构建方面取得显著进展和创新的结果，并且是新靶点抗原发现的结果。ADC工程学深刻改变了癌症治疗的范式，一方面对被认为天生对药物有效载荷类别具有抗性的肿瘤有效，另一方面在目标表达非常低的肿瘤中也显示出活性。然而，我们可能只是处于一个新时代的开始，随着新靶点的识别以及新的ADC结构和组合的引入，ADC领域将在未来几年迅速扩展。 1.  引言 在过去十年中，杂交瘤技术的快速发展，以及更多亲水性和血液稳定的连接体的开发，以及更广泛高效载荷的引入，导致了第三代抗体-药物偶联物（ADCs）的开发，与传统疗法相比，ADCs具有多个优点。鉴于每个组分与肿瘤和肿瘤微环境的复杂相互作用，新一代ADCs的活性超越了选择性地向肿瘤传递高细胞毒性载荷，并扩展到被认为天生对治疗药物类别具有抗性的肿瘤。事实上，由于连接体偶联不影响抗原结合位点，抗体骨架保持了其自身的肿瘤靶点调节功能，并通过其Fc区域激活抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬作用和补体依赖性细胞毒性（CDC）。此外，可切割连接体的日益增长的使用允许亲脂性载荷穿过细胞膜扩散，有可能杀死不表达ADC靶标的邻近细胞，即所谓的旁观者效应。最后，新偶联技术的快速发展和亲水性连接体的日益增长的使用导致了更加均匀和稳定的ADCs，具有更高的药物对抗体比例和更低的免疫原性。目前，已有14种ADCs在不同国家获得批准，用于实体瘤和血液肿瘤的治疗，其中3种被批准用于早期或转移性乳腺癌（BC）的治疗，在所有三种BC亚型中展示了总生存期（OS）的显著改善。然而，我们只是处于一个新时代的开始，ADC领域可能会迅速丰富，基于新技术和靶点抗原的新有希望的化合物将会出现。不幸的是，ADCs也导致了新的毒性，这可能会影响患者的生活质量，并需要教育以实现其最佳管理。目前，大量试验正在评估新的ADCs和基于ADC的组合，以进一步提高疗效结果，并更好地理解未识别的抗性机制、特定毒性和缺乏预测性生物标志物。在这篇综述中，我们讨论了ADCs在乳腺癌治疗中的未来之路。 2.  目前，针对乳腺癌的已批准ADCs 2.1.  靶向HER2 Ado-trastuzumab emtansine（T-DM1），一种第二代抗HER2 ADC，是首个被批准用于治疗HER2阳性乳腺癌患者的ADC。T-DM1，一种基于曲妥珠单抗的ADC，携带一种细胞毒性微管抑制剂作为有效载荷，通过硫醚不可切割连接体显著改善了无进展生存期（PFS）和总生存期（OS），用于二线及以后治疗的HER2阳性乳腺癌患者。在III期临床试验TH3RESA中，606名经过大量预处理（平均4线）的患者被随机分配接受T-DM1（n=404）或医生选择的治疗（n=198）。实验组的中位OS明显更长（22.7比15.8个月；HR 0.68，95%CI 0.54–0.85），尽管对照组有47%的患者在疾病进展时接受了T-DM1。在III期EMILIA试验中，T-DM1与当时二线最常用的治疗方案拉帕替尼加卡培他滨进行了比较，在991名曾接受曲妥珠单抗和紫杉醇治疗的HER2阳性乳腺癌患者中。T-DM1在客观反应率（ORR，43.6%比30.8%）、中位PFS（9.6比6.4个月；HR 0.65，95%CI 0.55–0.77）和OS（29.9比25.9个月；HR 0.75，95%CI 0.64–0.88）方面明显优于标准治疗。鉴于其美登素载荷，T-DM1最常见的不良事件（AEs）是血小板减少（3级，14%）和肝毒性（3级，5%）。基于在转移环境中的积极结果，T-DM1作为辅助治疗在新辅助化疗后仍有残留浸润性疾病的HER2阳性乳腺癌患者中进行了测试。改变实践的KATHERINE试验表明，与辅助曲妥珠单抗相比，辅助T-DM1将复发风险减半。 最近，第二种抗HER2 ADC，trastuzumab-deruxtecan（T-DXd）彻底改变了转移性乳腺癌的治疗。T-DXd由一种可切割的四肽连接体和一种exatecan衍生物组成，这是一种喜树碱类似物，通过抑制拓扑异构酶I（TOPO1）导致DNA断裂。在II期单组DESTINY-Breast01研究的显著结果之后，该研究促成了2019年12月的FDA加速批准，进一步的研究证实了T-DXd在HER2阳性和HER2低表达（免疫组化1+或2+和原位杂交阴性结果）患者中相较于标准治疗的更大疗效。关键的III期DESTINY-Breast03试验比较了T-DXd和T-DM1在转移性HER2阳性乳腺癌中的疗效，这些患者之前曾接受过紫杉醇和曲妥珠单抗治疗。共有524名患者被随机分配接受T-DXd或T-DM1。与T-DM1相比，T-DXd的中位PFS延长了4倍（28.8比6.8个月；HR 0.33，95% CI 0.26–0.43）。在平均研究随访28.4个月（范围，0.0–46.9个月）时，两组均未达到中位OS，但差异显著（HR 0.64，95% CI 0.47–0.87）。此外，III期DESTINY-Breast02研究比较了T-DXd与医生选择的治疗在曾接受过T-DM1的HER2阳性转移性乳腺癌患者中的疗效，证实了T-DXd在后续治疗线中的更大疗效，中位PFS为17.8个月，而标准治疗为6.9个月（HR 0.36，95% CI 0.28–0.45）。 基于T-DXd旁观者效应的临床前证据以及I期的初步数据，III期DESTINY-Breast04试验评估了T-DXd在经治的HER2低表达转移性乳腺癌患者中的疗效，这些患者曾接受过一线或两线的化疗。共有557名患者被随机分配接受T-DXd或医生选择的化疗。在激素受体（HR）阳性的患者亚组中（n=494），T-DXd改善了中位PFS（10.1比5.4个月；HR 0.51，95%CI 0.40–0.64）和OS（23.9比17.5个月；HR 0.64，95%CI 0.48–0.86）。这些益处也见于HR阴性乳腺癌患者，中位PFS为9.9（比5.1个月；HR 0.50，95%CI 0.40–0.63）和OS为23.4（比16.8个月；HR 0.64，95%CI 0.49–0.84），尽管这是对58名患者的探索性分析的限制。有趣的是，T-DXd在HER2阴性乳腺癌患者中也显示出活性，如II期DAISY研究所示，在该研究中，转移性乳腺癌患者根据HER2表达被分为三个队列接受T-DXd治疗。在高HER2表达队列中注册的患者（免疫组化[IHC] 3+或IHC2+/ISH+），ORR为69.1%，中位PFS为11.1个月。HER2低表达队列中的患者（IHC1+或IHC2+/ISH-肿瘤）的ORR为33.3%，中位PFS为6.7个月。在HER2非表达队列中（IHC 0），ORR为30.6%，中位PFS为4.2个月。总的来说，T-DXd具有普遍可控的安全性概况，血液学、低级别胃肠道不良事件是最常见的。间质性肺毒性（ILD）是最令人关注的不良事件。在九项I/II期T-DXd单药治疗的汇总分析中，ILD的总发生率为15.4%，其中大多数为低级别；77.4%为1级或2级，在极少数情况下是致命的（5级，2.2%）。可能与增加ILD风险相关的因素包括年龄<65岁，在日本招募，T-DXd剂量>6.4 mg/kg，氧饱和度<95%，中度/重度肾功能不全，存在肺部合并症，以及自最初诊断以来的时间>4年。尽管ILD的发病机制仍不清楚并正在调查中，但T-DXd可能通过不依赖靶标的摄取进入肺泡巨噬细胞可能是关键机制。 2.2.  靶向TROP-2 滋养层细胞表面抗原2（Trop-2）是一种跨膜糖蛋白，作为钙信号转导因子。在正常组织中含量较低，但在上皮性肿瘤中高度表达，包括80%的乳腺癌患者，Trop-2的过度表达与肿瘤的侵袭性和生长有关，这是由于间充质至上皮的转录调控。Sacituzumab govitecan是一种针对Trop-2的首创ADC，其中抗Trop-2抗体通过可水解连接体与SN-38偶联，SN-38是拓扑异构酶I抑制剂伊立替康的活性代谢产物。在ASCENT试验中，在至少接受过两种系统治疗的转移性三阴性乳腺癌（TNBC）患者中，与医生选择的单药化疗相比，sacituzumab govitecan展示了增加的中位PFS（5.6个月对1.7个月；HR 0.41，95% CI 0.32–0.52）、OS（12.1个月对6.7个月（HR 0.48，95% CI 0.38–0.59））和ORR（35%对5%）。在TROPiCS-02试验中，在至少接受过一种基于内分泌治疗的转移性HR阳性乳腺癌患者中，包括之前的CDK4/6抑制剂，以及2至4线的转移性疾病化疗，sacituzumab govitecan与研究者的选择进行了比较。在中期分析中，sacituzumab govitecan显示出统计学上显著的PFS改善（5.5对4.0个月：HR 0.66，95% CI 0.53–0.83）和OS改善（14.4对11.2个月；HR 0.79，95%CI 0.65–0.96，p=0.02）优于标准化疗。在III期ASCENT和TROPiCS-02试验中，最临床相关的3级及以上不良事件是中性粒细胞减少、腹泻和脱发，主要与SN-38有关。尽管在开处sacituzumab govitecan时不需要药物基因组筛查，但在ASCENT试验中，携带UGT1A1*28等位基因纯合子的患者严重中性粒细胞减少症的发生率是其他患者的两倍。 3.  未来乳腺癌中的ADCs 在过去的十年中，我们见证了ADCs的前所未有快节奏的扩张，大量新型ADC结构进入了临床开发，利用新的抗体骨架，通常针对多个抗原或不同的表位，新载荷概念，包括非化疗药物，以及更广泛的适用靶点，不仅在肿瘤中，也在肿瘤微环境中。以下是目前正在BC中探索的新型ADC结构的主要属性，特别关注进一步的潜在临床开发（表1）。 3.1.  针对已知抗原的新ADC结构 几项正在进行的试验一直在评估针对已知抗原的新ADC结构，即HER2和Trop-2，旨在提高治疗的疗效和耐受性。 3.1.1.  HER2 最近至少有8种不同的针对HER2的ADCs进入了临床开发，显示出不同的活性和毒性特征。Vic-trastuzumab duocarmazine（SYD985）由一个DNA烷基化剂载荷通过可切割连接体附在曲妥珠单抗上。在I期试验中显示出对经过大量预处理的HER2阳性和HER2低表达乳腺癌患者显著的临床活性，并获得了FDA快速通道指定后，在III期TULIP试验中与标准治疗相比表现良好。该研究达到了其主要终点，通过增加中位PFS（7.0对4.9个月；HR 0.64，95%CI 0.49–0.84）并显示出OS获益的趋势（HR 0.83，95%CI 0.62–1.09）。最常见的治疗相关不良事件是眼部毒性，76%的患者报告了任何级别的结膜炎和角膜炎，12.2%和5.6%的患者报告了3级或更高级别的角膜炎和结膜炎。值得注意的是，接受Vic-trastuzumab duocarmazine治疗的患者中有7.6%（5.2% 1-2级）报告了ILD，包括两名5级患者。正在评估不同的缓解措施，如预防性使用眼药水。 Disitamab Vedotin（RC48）由一种新型人源化单克隆抗体组成，针对HER2，hertuzumab，其特点是对HER2的亲和力更高，ADCC更强，以及通过可切割连接体偶联的单甲基奥瑞他汀E（MMAE）载荷。在剂量递增的C001 CANCER I期试验中，RC48在不同HER2表达水平的患者中显示出活性。在HER2阳性亚组中，RC48 1.5、2.0和2.5 mg/kg剂量的ORR分别为22.2%、42.9%和40.0%，中位PFS分别为4.0、5.7和6.3个月。在HER2低表达亚组中，RC48 2.0 mg/kg的ORR和中位PFS分别为39.6%和5.7个月。这种化合物还获得了中国国家药品监督管理局（NMPA）的有条件批准，用于治疗HER2阳性局部晚期或转移性胃癌患者和转移性尿路上皮癌患者。 ARX788是一种基于非天然氨基酸的位点特异性共轭技术的ADC，因此具有很高的均匀性。它由一种人源化HER2抗体组成，结合了一种微管抑制剂amberstatin（AS269）。在一项只招募HER2阳性乳腺癌患者的I期试验中，ORR为65.5%，中位PFS为17.0个月。最常见的3-4级不良事件是眼部不良事件（5.7%）和肺炎（4.3%）。正在进行的2期ACE-Breast-03（NCT04829604）研究正在评估ARX788在对T-DM1、T-DXd和/或含tucatinib方案耐药的转移性HER2阳性乳腺癌患者的活性和安全性。然而，ARX788的开发目前处于暂停状态。 其他两种含有MMAE载荷的ADCs在临床开发中也显示出对HER2阳性乳腺癌患者有希望的活性。首先，ALT-P7在一项招募了27名接受过至少两种抗HER2治疗的HER2阳性乳腺癌患者的I期试验中，ORR为77%，中位PFS为6.2个月。最常见的不良事件包括肌痛（33.3%）、疲劳（25.9%）、感觉神经病变（22.2%）、脱发（22.2%）、瘙痒（22.2%）和中性粒细胞减少症（22.2%）。第二种，MRG002，在HER2低表达乳腺癌患者中显示出显著的活性，IHC 1+和2+的ORR分别为34.1%和37.5%。报告的不良事件包括中性粒细胞减少症（53.6%）、天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶增加（分别为46.4%和32.1%）以及脱发（39.3%）。 3.1.2.  靶向TROP-2 Datopotamab deruxtecan（Dato-DXd）是一种第三代ADC，靶向Trop-2，由一个IgG1单抗与一个拓扑异构酶I抑制剂（MAAA-1181a，一种exatecan衍生物）通过一个基于四肽的可切割连接体偶联，药物与抗体的比例约为4:1。目前，作为单药或与免疫检查点抑制剂联合使用，正在进行多个I-III期研究。在正在进行的I期多队列研究TROPION-PanTumor01（NCT03401385）中，44名经过大量预处理的TNBC患者观察到32%的ORR和80%的疾病控制率（DCR）。值得注意的是，在接受过靶向拓扑异构酶I的ADC治疗的13名患者中，也有9名报告了肿瘤缩小。最常见的任何级别的不良事件包括口腔炎（73%）、恶心（66%）、呕吐（39%）、疲劳（34%）和脱发（36%）；3级口腔炎在11%的病例中报告。在先前接受过RH+/HER2-转移性乳腺癌治疗的患者队列中，ORR为29%，DCR为85%。最常见的不良事件包括口腔炎（80%）、恶心（56%）、疲劳（46%）和脱发（37%）。目前正在进行两项III期试验，评估Dato-DXd与标准护理相比作为晚期TNBC患者的一线治疗（NCT05374512）以及作为晚期HR阳性乳腺癌患者的二线或三线治疗（NCT05104866）。此外，一项III期试验正在评估Dato-DXd联合或不联合durvalumab治疗接受过新辅助系统治疗后仍有残留浸润性疾病的I至III期TNBC患者（NCT05629585）。 3.2.  新型选择性靶点 3.2.1  HER3 HER3是一种跨膜生长因子受体，在50%的乳腺癌中过度表达。HER3介导对EGFR、HER2、PI3K/AKT/mTOR导向治疗和内分泌治疗的抗性，其变构功能对HER2放大的癌症生长至关重要[38–40]。HER3过度表达与不同肿瘤类型（包括乳腺癌）的癌症进展风险更高和预后更差有关。Patritumab deruxtecan（U3-1402，HER3-DXd）是一种靶向HER3的ADC，由一个人类IgG1单抗（mAb，patritumab）与一个拓扑异构酶I抑制剂载荷（MAAA-1181a，一种exatecan衍生物）通过一个基于四肽的可切割连接体链接，具有高达8的药物与抗体比例。1/2期研究U3-1402-J101研究包括HER3+（IHC 2+或3+）的经过大量预处理的转移性乳腺癌患者：113例亮面型，53例TNBC和14例HER2阳性乳腺癌。ORR分别为30%、23%和43%。有趣的是，HER3-DXd的活性与HER3表达无关。同样，在TOT-HER3研究中，测试了HER3-DXd单剂量在未经治疗的早期亮面型乳腺癌患者的临床和生物学活性，ORR与基线HER3 IHC和ERBB3 mRNA表达水平无关。目前正在早期和转移性环境中进行进一步的II期和III期研究（NCT05569811, NCT04965766, NCT04699630）。 3.2.2.  LIV-1 LIV-1是一种具有金属蛋白酶活性的跨膜蛋白，属于ZIP（Zrt, Irt-like proteins）锌转运蛋白的一个亚家族，在不同正常组织中表达异质。中/高LIV-1表达在约90%的HR阳性乳腺癌和TNBC中被发现，它与淋巴结和远处转移进展相关，与其在上皮-间充质转化中的作用一致，通过E-钙粘蛋白下调。Ladiratuzumab vedotin（SGN-LIV1A）是一种ADC，由一个针对LIV-1的人源化单抗组成，通过一个可被蛋白酶切割的连接体与一种强效的微管破坏剂，单甲基奥瑞他汀E（MMAE）载荷偶联，是dolastatin 10的合成类似物，它决定了G2/M细胞周期停滞并最终导致细胞凋亡。 目前正在积极招募经过大量预处理的转移性LIV-1阳性TNBC或HR阳性内分泌抵抗性乳腺癌患者进行I期开放标签剂量递增和扩展研究（NCT01969643）。纳入剂量递增和扩展队列的44名TNBC患者的中期分析显示，ORR为32%，中位PFS为11.3周（95%CI 6.1–17.1周），最常见的所有级别不良事件为疲劳（59%）、恶心（51%）和周围神经病变（44%），而中性粒细胞减少（25%）和贫血（15%）是最常见的3级和4级不良事件。确定的RP2D为每3周2.5 mg/kg，然而也在研究每周一次的计划，以确定它是否扩大了治疗窗口。在适应性平台试验I-SPY2中，与标准臂相比，新辅助疗法使用4个周期的SNG-LIV1A 2.5 mg/kg每3周，然后是4个周期的多柔比星+环磷酰胺，并没有增加病理完全缓解率。尽管正常的凋亡死亡是非免疫原性的，但临床前证据表明SGN-LIV1在LIV-1阳性细胞中诱导ER应激并释放免疫原性细胞死亡（ICD）标志物，如ATP和HMGB1。基于这些数据，2项正在进行的研究正在评估SGN-LIV1A与pembrolizumab（NCT03310957）或atezolizumab（NCT03424005）的组合在TNBC患者中的活性，作为一线或二线治疗，无论PD-L1和LIV-1表达如何。 3.2.3.  Nectin-4 Nectin-4是一种参与细胞增殖、迁移和粘附的跨膜糖蛋白。在60%的膀胱癌和乳腺癌中报告了中度至强染色，而其在正常组织中的表达较低。Enfortumab vedotin（EV）是一种靶向nectin-4的第三代ADC，由一个完全人源化的IgG1抗体与一个微管抑制剂（MMAE）通过一个可被蛋白酶切割的连接体偶联。2021年9月，它获得了FDA批准用于治疗转移性尿路上皮癌患者。目前，一项多队列的2期研究（NCT04225117）正在评估EV在不同局部晚期实体瘤患者中的活性和毒性，包括接受过预处理的HR阳性乳腺癌和TNBC患者。Nectin-4表达不是研究纳入标准，而是作为探索性生物标志物进行评估。 3.2.4.  CEACAM5 另一个新兴靶点是癌胚抗原（CEA）相关的细胞黏附分子5（CEACAM5），一种跨膜糖蛋白，在包括胃肠道、肺和乳腺在内的多种肿瘤类型中高度表达，其中它参与肿瘤侵袭和转移，而其在正常组织中的表达较低。Tusamitamab ravtansine（SAR408701）是一种新型靶向CEACAM5的ADC。它包含一个与DM4偶联的人源化单抗，通过一个可切割的N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)丁酸酯（SPDB）连接体。在I期研究中，92名不同CEACAM 5表达水平的患者接受了逐步增加剂量的SAR-408701治疗，包括1名乳腺癌患者。总体上，在低表达和高表达队列中分别观察到2个部分缓解（ORR 7.1%）和13个PRs（ORR 20.3%）。最常见的治疗相关不良事件是乏力、食欲下降、角膜炎和恶心，每项在25%的参与者中观察到。目前正在对SAR-408701进行非小细胞肺癌和其他实体瘤的II期和III期临床试验（NCT04154956, NCT04659603, NCT04394624, NCT05071053, NCT04524689）。 3.3.  新ADC构建 3.3.1.  抗体技术 ADC的抗体部分技术不断发展，目标是优化细胞内吞率、肿瘤渗透性和从肿瘤微环境中招募细胞。 双特异性ADCs，即针对同一癌细胞上的两种不同受体，或双特异性ADCs，即针对同一受体上的两种不同表位，旨在提高靶向特异性、内吞作用，同时最小化对健康组织的毒性。MEDI4276结合了一种双特异性抗体，针对HER2上的两个不重叠表位，特异性共轭到一种基于tubulysin的微管抑制剂载荷。通过增加内吞作用和溶酶体的运输及降解，它在体内模型中显示出强大的抗肿瘤潜力，特别是在T-DM1耐药或HER2表达低的情况下。在一项针对接受过抗HER2药物治疗的晚期或转移性HER2阳性乳腺癌患者的I期试验中，MEDI4276导致了1/47的完全反应（0.5 mg/kg）和2/47的部分反应（0.6和0.75 mg/kg），但主要由于肝功能测试增加而产生不可接受的毒性。另一个概念是使用一个内吞作用差但特异性的抗原与一个内吞作用快速的抗原。这样，快速内吞的抗原加速了内吞作用差的抗原的摄取。从这个意义上说，一种靶向HER2和催乳素受体（PRLR）的双特异性ADC比靶向HER2的ADC更有效地杀死癌细胞。与HER2相比，PRLR快速且持续地内吞，PRLR在细胞表面的水平足以确保内吞作用。使用一种结合了两种受体的双特异性ADC，非共价交叉结合HER2和PRLR到细胞表面，显著提高了内吞作用和细胞毒性潜力。 Probody药物偶联物是扩大治疗窗口的另一项创新技术。它们是一类利用肿瘤蛋白酶活性来传递其治疗效果到肿瘤微环境而不是健康组织的新一类蛋白酶激活的重组抗体前药。在肿瘤内靶向肿瘤可以减少不良反应，从而提高安全性和/或剂量。最近，CX-2009，一种针对CD166（ALCAM）的Probody药物偶联物，与DM4共轭，在涉及92名患者（其中39名患有晚期乳腺癌）的I期试验中进行了研究。在5名乳腺癌患者中观察到部分反应，消化和剂量依赖性眼部毒性是最频繁的不良事件。目前，CX-2009的开发已中断。 另一种发展方向是用小分子替换抗体骨架。小分子药物偶联物（SMDCs）仍处于开发的早期阶段，但它们可能具有较小的免疫原性、更容易合成，以及穿透实体瘤和解剖屏障的高潜力。 3.4.  新载荷 免疫刺激抗体偶联物（ISACs）使用免疫刺激剂，如Toll样受体（TLR）激动剂、干扰素刺激基因激动剂（STING）作为载荷。这些免疫刺激剂不能安全地系统性给药，但通过使用特异性靶向抗体，它们可以被传递到肿瘤细胞或微环境细胞。在临床前小鼠模型中，BDC-1001是一个由双TLR7/8激动剂与靶向HER2的抗体共轭而成的ISAC，引发了局部免疫反应，导致肿瘤中髓系和T细胞的减少和免疫记忆。目前正在进行一项1/2期剂量递增/扩展研究，以评估BDC-1001 ± pembrolizumab在接受标准治疗后病情进展的HER2表达实体瘤患者中的疗效（NCT04278144）。SBT6050也是一个由TLR8激动剂与靶向HER2的单克隆抗体共轭而成的ISAC。它在体外和体内显示出令人鼓舞的结果，特别是在与曲妥珠单抗联合使用时。其他含有细胞毒素放射性同位素的ADCs已显示出临床活性，如ibritumomab tiuxetan，一种与碘-131链接的抗CD20抗体，用于治疗淋巴瘤。然而，据我们所知，目前没有含有细胞毒素放射性同位素的ADCs在乳腺癌中进行开发。 4.  乳腺癌中未来ADCs组合策略 4.1.  ADCs和免疫检查点抑制剂 大量临床前证据支持将ADCs与免疫疗法结合使用。首先，大多数ADCs诱导ICD，ICD包括细胞表面暴露或死亡细胞释放损伤相关分子模式（DAMPs）。DAMPs被免疫系统识别，并最终导致吞噬肿瘤细胞的抗原呈递细胞和交叉呈递给细胞毒性T细胞。其次，抗体骨架通常保持其免疫效应功能，能够通过其Fc部分激活ADCC和CDC。最后，微管抑制剂载荷（美登素类、多拉司他汀、奥瑞他汀）和拓扑异构酶I抑制剂载荷能够直接诱导树突细胞激活。总的来说，这些证据为将ADCs和免疫疗法结合提供了强有力的理由，这种组合可以进一步增加肿瘤微环境中的T细胞浸润。 在乳腺癌中将免疫检查点抑制剂与ADC结合的最早试验是在HER2阳性乳腺癌患者中进行的。随机II期KATE2试验招募了330名接受过治疗的HER2阳性乳腺癌患者，结果显示，将atezolizumab添加到T-DM1中，无论是在意向治疗人群（HR 0.82, 95%CI 0.55–1.23和HR 0.74, 95%CI 0.42–1.30）还是PDL1阳性人群中（HR 0.60, 95%CI 0.32–1.11和HR 0.55, 95%CI 0.22–1.38），都没有带来统计学意义上的PFS和OS益处。组合臂中的不良事件更为常见，主要涉及血小板减少症（13%对4%）、天门冬氨酸氨基转移酶增加（8%对3%）和贫血（5%对0%），导致研究因无效而终止。T-DM1和atezolizumab单药治疗的药代动力学和免疫原性结果符合预期；值得注意的是，1.7%和12.1%的患者报告了针对T-DM1和atezolizumab的治疗性抗体。一个较小的Ib期试验（NCT03032107）评估了T-DM1和pembrolizumab在20名接受过治疗的HER2阳性乳腺癌患者中的组合，报告了20%的ORR（95% CI 5.7–43.7%）和9.6个月的中位PFS（95% CI 2.8–16个月）。所有治疗相关的不良事件均为2级和3级（分别为65%和20%）。PDL-1和肿瘤浸润性淋巴细胞与这个小队列的反应无关。最近，一项1b期研究（NCT03523572）评估了T-DXd和nivolumab在经过大量预处理的HER2表达（HER2阳性或HER2低）转移性乳腺癌和尿路上皮癌患者中的组合。ORR分别为65.6%（95% CI, 46.8–81.4）和50%（95% CI, 24.7–75.3），中位PFS分别为11.6个月（95% CI, 6.9-未达到）和7.0个月（95% CI, 2.3–10.8）。然而，与T-DXd单药治疗在HER2阳性患者中的疗效结果（DESTINY-Breast02中的ORR 60.9%和PFS 16.4个月）相比，这些结果令人失望。每种研究药物单药治疗的安全概况符合预期。治疗相关的不良事件发生在≥3级的比例为48.9%；ILD发生在7名患者中（14.6%），其中6名为2级，1名为5级。相比之下，T-DXd和durvalumab的组合在Ib期研究BEGONIA中显示出有希望的结果，这是一项多臂试验，评估了转移性乳腺癌一线治疗中的不同治疗组合。在HR-/HER2低BC队列中，ORR为57%（26/46），中位PFS为12.6个月（95% CI, 8-未达到），与PDL1状态无关。所有等级中最常见的不良事件为恶心（73%）、疲劳（46%）和呕吐（30%）。5名患者（9%）经历了与治疗相关的间质性肺病或肺炎，大多数为1级或2级，1例与COVID相关的5级病例。 ADCs与免疫检查点抑制剂的组合也在TNBC中进行了评估。在Ib期试验（NCT03310957）中，对51名未经治疗的晚期TNBC患者进行了拉迪拉图单抗vedotin和pembrolizumab的组合评估。在这项进行中的试验中，至少有3个月随访的26名患者的ORR为54%（95% CI 33.4–73.4），超过了pembrolizumab单药治疗在PDL-1阳性TNBC患者中的疗效（ORR 21.4% [95% CI 13.9–31.4] ）。最常见的≥3级不良事件是中性粒细胞减少症（16%）、腹泻、疲劳、低钾血症和斑丘疹（各8%），以及腹痛、丙氨酸氨基转移酶增加和尿路感染（各6%）。同样，在BEGONIA试验的TNBC队列中，47名接受Dato-DXd和durvalumab组合治疗的患者，无论PD-L1表达如何，ORR为79%（95% CI, 61%-91%）。100%的完全或部分反应患者在6个月随访时仍处于反应状态。任何级别的最常见不良事件是胃肠道（恶心55%和口腔炎51%）。没有报告间质性肺病/肺炎或血小板减少症的病例。 其他组合正在I-II期试验中评估，例如：T-DXd与pembrolizumab（NCT04042701）或durvalumab或durvalumab加紫杉醇（NCT04538742），在转移性HER2阳性BC中；T-DXd与durvalumab加紫杉醇在转移性HER2低BC中（NCT04556773）；sacituzumab govitecan与pembrolizumab（NCT04468061）或与atezolizumab（NCT03424005）。 4.2.  ADCs和靶向疗法 靶向疗法和ADCs的组合主要在HER2阳性BC中进行了评估。T-DM1和pertuzumab在细胞培养模型中显示出协同活性，并在Ib/II期研究中具有可接受的安全性。在纳入接受过治疗的HER2阳性BC患者的MARIANNE试验中，将pertuzumab添加到T-DM1中没有实现临床上显著的OS益处（51.8 vs 53.7个月），两组之间的治疗相关不良事件相似（48.6 vs 47.1%）。T-DM1和pertuzumab的组合也在两个试验的新辅助环境中进行了评估。KRISTINE研究比较了新辅助T-DM1 plus pertuzumab与多西他赛、卡铂、曲妥珠单抗 plus pertuzumab在444名II/III期HER2阳性BC患者中的疗效。T-DM1和pertuzumab的组合与多西他赛-卡铂-曲妥珠单抗-pertuzumab（TCHP）治疗相比，在手术前局部区域进展更多（6.7 vs. 0%）的情况下，无事件生存期更短（HR 2.61, 95%CI 1.36–4.98）。相比之下，手术后的无侵袭疾病生存期相似（HR 1.11, 95%CI 0.52–2.40）。T-DM1臂的病理完全缓解率为44.4%，而标准方案为55.7%。在I-SPY II期试验中也取得了类似的结果，该试验将临床II/III期HER2阳性BC患者随机分配到T-DM1 plus pertuzumab、紫杉醇 plus pertuzumab和曲妥珠单抗，或紫杉醇 plus 曲妥珠单抗，然后进行多柔比星/环磷酰胺治疗，然后手术。T-DM1臂的3年无事件生存率为88%（95% CI 79–99%），而紫杉醇 plus pertuzumab和曲妥珠单抗为92%（95% CI 84–100%），紫杉醇 plus 曲妥珠单抗为87%（95% CI 75–100%）。值得注意的是，基线时HER2通路信号和磷酸化程度与T-DM1 plus pertuzumab组合的反应相关，并可以进一步识别对这种组合高度敏感的患者。此外，T-DM1与pertuzumab的不足疗效可能受到肿瘤内HER2异质性的驱动。实际上，HER2异质性，定义为ERBB2扩增区域>5%但<50%的肿瘤细胞，或FISH检测的HER2阴性区域，在接受T-DM1和pertuzumab新辅助治疗的非异质性亚组中，完全缓解率分别为0%和55%。 最后，T-DM1在II期NSABP Foundation Trial FB-10中与neratinib联合。在这项研究中纳入的27名HER2阳性BC患者中，有19名患者可评估反应，ORR为63.2%。该研究内进行的转化研究表明，HER2抗体的抗性机制可能是HER2受体的丢失和p95HER2的高表达。 在开发有效的靶向疗法和ADCs后，TNBC中ADCs加靶向疗法组合的开发也加快了。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂，即olaparib和talazoparib，在OLYMPIAD和EMBRACA试验中将HER2阴性BC和BRCA胚系突变患者的PFS大约减半[87, 88]。在Ib期SEASTAR研究中报告了两例TNBC患者接受rucaparib plus sacituzumab govitecan的组合。第一名患者有有害的同源重组修复基因（HRR）突变，部分反应，第二名患者没有HRR突变，在24周时病情稳定。正在进行的I/II期试验NCT04039230正在评估sacituzumab govitecan加talazoparib在转移性TNBC患者中的组合。 其他几个I/II期试验正在进行中，正在不同的BC亚组中测试基于ADC的组合与单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂或内分泌疗法。 4.3.  ADCs和化疗 ADC与化疗组合的首个临床证据来自ECHELON-1试验，表明brentuximab vedotin改善了晚期霍奇金淋巴瘤患者的结果。此后，在实体瘤中评估了ADC和化疗的组合，并显示出有希望的疗效。很少有试验涉及BC中化疗和ADC的组合。I期试验，STELA，在14名可评估患者中，使用T-DM1 plus nab-paclitaxel和lapatinib治疗，ORR为85.7%。值得注意的是，T-DM1的药代动力学没有受到组合的影响。正在进行的篮式试验，包括转移性TNBC患者，正在评估ADC与化疗的组合（NCT02996825, NCT03102320, NCT04538742, NCT04556773）。 探索ACD组合的所有临床试验在表2中进行了总结。 5.  结论和展望 在过去的几年里，我们见证了实体瘤中，特别是在乳腺癌中，新ADCs的惊人发展，这得益于ADC生产新技术的可用性和新合适靶点的识别。然而，一方面治疗格局正在迅速被新的ADCs和新的ADC组合填补，另一方面我们迫切需要了解ADC的作用机制和抗性，以更好地定义临床实践中未来的ADC连续策略。抗性机制可能涉及目标抗原、ADC内吞、运输途径、细胞周期修饰和信号通路、药物外排泵、溶酶体功能、细胞毒素化合物靶标的改变以及凋亡失调。这些抗性机制中的许多目前正在接受第三代ADCs治疗的患者中进行积极评估。在DAISY试验中进行的转化研究揭示了额外的抗性机制。原发性抗性可能与HER2 0细胞的高患病率和空间分布或ERBB2半合子缺失有关，而获得性抗性涉及HER2表达的减少和SLX4突变的发生。同样，报告了两名患者对sacituzumab govitecan的抗性，其中一名缺乏TROP2表达并迅速进展，而另一名是长期反应者，最初TROP-2表达高，TACSTD2/TROP2基因局部扩增。在进展期，对最后一名患者的不同转移亚克隆的分析显示，获得性TOP1 E418K抗性突变和随后的移码TOP1突变，这些突变赋予了对SN-38的抗性，以及TACSTD2/TROP2 T256R错义突变，导致TROP-2的细胞膜定位缺陷。毫无疑问，对ADC抗性机制更全面的知识将使我们在未来能够根据每个患者的具体肿瘤特征和获得性抗性突变，选择最合适的ADC连续策略。由于ADC是模块化的，ADC平台的开发也可能进一步发展为更加个性化的、针对特定患者的化合物，其中抗体骨架、连接体和载荷的选择将基于特定肿瘤和肿瘤微环境激活的途径和表达的蛋白质。

摘要：随着人类多能干细胞（hPSCs）特定谱系分化技术的进步，下游细胞分离已成为生产hPSC衍生产品的关键步骤。由于分化过程通常导致异质细胞群的形成，需要进行细胞分离，以富集所需的细胞群或去除不需要的细胞群。本文总结了hPSC衍生细胞分离过程的最新进展，包括标准的分离技术，如磁激活细胞分选，以及基于粘附强度和代谢通量等新型分离策略。特别讨论了下游生物加工流程和不同细胞谱系表面标记的识别。尽管大规模hPSC衍生细胞的下游生物加工仍面临挑战，但应实施合理的质量设计方法，以增强对过程与产品之间关系的理解，并确保所产生细胞的安全性。 1.引言 人类多能干细胞（hPSCs）因其独特的自我更新能力和分化成几乎所有类型细胞的能力，为多种体细胞组织提供了替代细胞来源。hPSC衍生物已在几个I期临床试验中进行了测试，以评估它们作为治疗产品的潜在用途，并且还用于药物发现和疾病建模。最初，hPSC衍生细胞的开发和制造集中在优化分化效率上，即上游生物加工，从而改进了分化协议，允许以高效率和纯度生产特定谱系的细胞。例如，使用基于胚胎体（EB）的协议或通过双重抑制SMAD（小母体抗背足蛋白）信号的单层协议，可以从hPSCs中以70-90%的纯度生成少突胶质细胞前体（OPCs）和神经前体细胞（NPCs），以及使用生长因子或小分子引导的协议可以生产30-90%纯度的心肌细胞。这些高效分化协议的开发显示了上游生物加工在生产hPSC衍生细胞方面的巨大进展。然而，下游生物加工（即细胞分离），作为完成hPSC衍生产品的关键步骤和瓶颈，需要进一步研究。 由于当前从hPSCs分化的过程通常会产生包括残留未分化细胞在内的混合细胞类型，因此需要进行下游生物加工，以选择性纯化所需的细胞群或去除不需要的细胞群（图1A）。例如，最终的干细胞产品不含未分化细胞或不需要的谱系的前体细胞对于减少移植后畸胎瘤形成的风险至关重要。在这里，我们回顾了hPSC衍生物的新兴下游生物加工，包括hPSC扩增和分化后的细胞分离的最新进展。我们提供了识别新型谱系特异性表面标记的例子，这些标记可以用于分离hPSC衍生细胞。此外，我们还讨论了hPSC下游生物加工的方法和实际流程，以及生产神经和心脏细胞面临的特定挑战。 图1 hPSC衍生产品的下游生物加工。(A) 富集和耗竭策略以分离hPSC衍生细胞。(i) 富集：收集所需细胞（适用于低分化效率）。(ii) 耗竭：去除不需要的细胞（适用于高分化效率）。(B) 下游处理的主要步骤。(1) 细胞收获；(2) 离心以去除收获酶；(3) 保持等待所有细胞被收获；(4) 耗竭以去除不需要的细胞；(5) 离心以去除耗竭缓冲液；以及 (6) 填充和完成将细胞转移到冷冻保护缓冲液中进行冷冻保存。如果每个步骤在理想情况下的产量为90%，则这些步骤后的总产量预计为59%。(C) 聚集对大规模细胞标记的影响。(i) 单细胞悬浮液允许用磁性珠进行细胞标记。(ii) 如果发生聚集，目标细胞无法均匀标记，聚集体中未标记的细胞被去除，从而降低了产量。(iii) 具有高聚集倾向的细胞保持在配制的缓冲液中作为单细胞悬浮液，以提高处理效率。本图包含了Servier Medical Art (smart.servier.com)的图像。 2.纯化hPSC衍生产品的技术 在分化过程中，hPSCs及其衍生物在细胞密度、表面标记的表达、代谢需求和粘附强度方面具有阶段特异性。基于这些和其他特征，已经评估了不同类型的干细胞衍生细胞的分离过程，包括基于密度的分离和荧光激活细胞分选（FACS）以及基于特定表面标记的磁激活细胞分选（MACS）等标准分离技术。随着对hPSC属性的更好理解，也开发了基于差异粘附到培养容器的细胞分离和基于不同代谢活性的选择性去除细胞等新型分离策略。 2.1.基于密度的分离 在分化培养中可能会产生具有不同细胞密度的混合细胞类型，可以根据它们的密度进行分离。一个例子是使用Percoll梯度离心来富集hPSC衍生的心肌细胞。从分化培养中收获的细胞被加载到Percoll的两层上，然后进行离心。大多数心肌细胞将出现在Percoll的下层，而非心肌细胞将在其他分数中。从含有大约50%心肌细胞的起始分化培养中可以获得高达95%纯度的心肌细胞。然而，这种方法分辨率低，不适合大规模分离。 2.2.基于细胞生物物理特性的分离 在未分化的hPSCs、部分重编程细胞、体细胞和hPSC衍生的分化细胞之间观察到显著的生物物理特性差异。例如，粘附特性、质膜刚度和光学特性在hPSCs的不同发育阶段表现出不同。这些特性的变化可以作为选择特定承诺群体的目标。 hPSC衍生的心肌细胞显示出来自肌球蛋白杆状体的特定二次谐波信号，这使得它们能够从异质的分化细胞群体中分离出来。或者，从重新培养的分化hESC聚集体中衍生的神经嵴细胞会自发地从主要细胞团中分离出来，这使得它们可以通过形状选择和手动挑选进行隔离。 另一方面，从小鼠诱导多能干细胞（miPSCs）衍生的扩增色素细胞被证明比非色素细胞更具粘附性。这种特性使得它们可以通过调节暴露时间和酶解离的类型来进行纯化：非色素菌落可以通过5分钟的Accutase处理和吹打来回收，而剩余的粘附色素细胞可以用胰蛋白酶二次回收。类似地，在细胞解离前用ROCK（Rho相关蛋白激酶）抑制剂（Y-27632）进行介质补充，可以去除粘附性较低的细胞，从而富集内皮祖细胞。此外，发现退出多能性会增加细胞膜刚度。这些膜流动性和脂质组成的改变可以与分化阶段联系起来。基于这一原理，可以根据膜流动性条件下它们的粘附特性进行细胞分离，以选择各种分化细胞。 人类诱导多能干细胞（hiPSC）菌落可以在4分钟内通过85-125 dynes/cm2的剪切应力在流体流动应用下脱落，而分化细胞由于粘附强度更高而保持附着。这种方法可以从异质重编程培养物和分化的后代中分离出完全重编程的iPSC菌落，纯度超过95%。然而，这种方法尚未评估用于特定谱系分化的细胞。 由于细胞/粘附表面相互作用在分化过程中受到调节，这导致了新型生物材料的开发，用于特定分化表型的细胞隔离。在未分化阶段，iPSC菌落可以从热敏聚合物（PNIPAAm（聚（N-异丙基丙烯酰胺）））在低温（即22°C）下选择性脱落，而承诺的细胞仍然附着在表面。这种方法可以实现未分化干细胞群体的非侵入性富集。类似地，hiPSCs承诺用于心脏谱系，种植在与层粘连蛋白-521涂层的聚（N-异丙基丙烯酰胺）上，其临界溶液温度在8°C，促进心肌细胞的特定脱落。 此外，研究发现，通过高速激光照射光响应聚合物的特定区域（即聚[（甲基丙烯酸甲酯）-共（分散黄7丙烯酸酯）]层）可以消除承诺的细胞。或者，不同亚型的层粘连蛋白促进各种分化细胞类型的不同粘附强度。例如，LN211/332/511E8促进非上皮细胞的粘附，而LN332/511E8则有利于上皮细胞的附着和增殖。细胞与不同层粘连蛋白亚型结合的特异性使角膜上皮细胞能够从异质分化的细胞中纯化。 2.3.基于代谢活性的选择性细胞去除 基于心肌细胞和非心肌细胞在葡萄糖和乳酸代谢上的显著生化差异，可以从hPSC分化培养中获得高纯度（高达99%）的心肌细胞。未分化的hPSCs和主要依赖糖酵解的非心脏细胞在葡萄糖耗尽和乳酸丰富的条件下无法生存，而心肌细胞可以通过使用乳酸作为替代能源而存活。因此，在补充乳酸的葡萄糖耗尽培养基中，心肌细胞更倾向于存活并因此被富集。同样，使用葡萄糖耗尽并补充脂肪酸和3,3′,5-三碘-L-甲状腺素（即促进脂肪酸氧化和线粒体生物发生的分子）的培养基，已报道了心肌细胞的选择和成熟。视网膜上皮细胞（RPE）被发现表达高水平的脂蛋白受体内化AcLDL（乙酰化低密度脂蛋白）。基于这一原理，使用Dil偶联的AcLDL对分化的RPE群体进行特异性标记和富集。另一个例子是靛青绿（ICG）被肝细胞特异性内化。通过修改ICG的荧光发射特性，设计了一种肝细胞纯化剂（HPA，λem = 562 nm），用于标记和体外分选来自hPSCs的纯化肝细胞。 2.4.负选择 与正细胞选择相反，其他方法已经开发出来，通过特异性诱导不需要的细胞类型的凋亡来去除它们，从而提高所需表型的回收率。例如，将PSCs转染与合成微小RNA（miRNA）开关（即在没有目标miRNA的情况下减少相关蛋白的翻译水平），miR-Bim（Bcl-2相互作用的细胞死亡介质）开关，诱导未分化细胞的选择性凋亡，同时保持分化的心肌细胞。或者，凝集素rBC2LCN-PE23被发现能够特异性结合并内化到未分化的干细胞，并诱导它们的凋亡。这种化合物被发现可以有效地降低畸胎瘤形成的风险。 2.5.通过FACS分离 FACS设备可以检测用荧光素偶联抗体标记的细胞的荧光信号。基于标记特征和目标标记（通常是表面抗原），FACS允许将单个细胞根据多个表面标记进行高选择性地排序和分离成不同群体（例如SSEA（阶段特异性胚胎抗原）-4阳性或SSEA-4阴性）。FACS的一个优点是它允许基于多个表面标记进行连续和多参数分离，尽管细胞活性可能会受到排序程序的影响。然而，FACS的通量有限，每秒可排序5×103到7×104个细胞。因此，FACS更适合研究用途的小规模细胞分离。 2.6.通过MACS分离 MACS是一种类似于FACS的技术，但使用带有针对特定细胞表面抗原的抗体的磁性颗粒。在磁场中，磁性标记的细胞将在柱中保留，未标记的细胞将流出。例如，通过针对心肌细胞相关表面标记VCAM1（血管细胞粘附分子1）的MACS，从hPSC分化培养中富集心肌细胞至95%。然而，尽管MACS是一种吸引人的方法，可以从细胞混合物中选择性地去除不需要的细胞，但它也有其局限性。例如，一项建模研究表明，为了从分化和未分化细胞的池中清除SSEA-1阳性的未分化干细胞，需要不切实际数量的重复MACS。然而，磁性珠的亲和力也可以通过新型表面修饰来提高，以提高排序效率。MACS的一个优点是，由于成本较低和商业化的自动化、封闭系统的可用性，它比FACS更适合大规模处理。MACS珠的替代品，SpheriTECH，通过简单的亲和结合在大珠上排序细胞，无需纯化标签，就能纯化来自hiPSCs的光感受器前体细胞。 2.7.使用微流控技术分离 微流控技术最近被证明是hPSC培养、表征和筛选的高效工具。微流控技术也可用于异质分化细胞群体的分离。例如，已制造微流控滚动柱用于选择性分离SSEA-1阳性细胞。滚动柱芯片的边界涂有抗体，降低了SSEA-1阳性细胞的滚动速度，而承诺的细胞则流出通道。因此，SSEA-1阳性细胞在通道内停留的时间更长，从而可以从分化细胞中分离出来。通过在微流控芯片底部覆盖有抗Tra（肿瘤相关抗原）-1-60抗体的脊状图案，也进行了类似的操作，从hiPSCs衍生的心肌细胞中消除未分化细胞。 3.表面标记识别用于分离hPSC衍生细胞 由于FACS和MACS依赖于表面标记的检测，因此识别不同谱系在hPSC分化过程中不同阶段的特异性表面标记非常重要。我们讨论了关于未分化细胞和三个胚层衍生物（包括神经细胞、心肌细胞和胰腺前体）表面标记的研究示例（表1）。 3.1.未分化细胞的表面标记 表面标记如Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA-4已被用于识别和去除未分化的hPSCs（小鼠胚胎干细胞，mESCs使用SSEA-1）。例如，FACS和MACS可以从其他细胞中分离出SSEA-4和Tra-1-81标记的hESCs（人类胚胎干细胞），针对SSEA-5、CD（分化群）9和CD90的FACS，这些是多能干细胞的标记，可以从未完全分化的hESC培养物中去除具有畸胎瘤形成潜力的细胞。波达卡林样蛋白-1也在未分化细胞中高度表达，识别波达卡林样蛋白-1的细胞毒性抗体已被用于选择性杀死未分化的hESCs。此外，表面蛋白的特定糖基化可以区分多能细胞和非多能细胞；因此，具有独特结合能力的凝集素已被用于去除hPSCs。 需要注意的是，畸胎瘤也可能起源于仍具有干细胞特征且未完全分化的前体细胞；因此，这些前体细胞也需要从干细胞衍生产品中去除。无论如何，对于安全的细胞治疗来说，确定去除标准和检测未分化干细胞或前体的检测方法的灵敏度至关重要。 3.2.神经分化的表面标记 当前的hPSCs神经分化方法在发育阶段和谱系规范方面导致细胞异质性。CD133、A2B5、CD29、CD146、NCAM（神经细胞黏附分子）（或CD56）和CD271被报道为神经前体细胞（NPCs）的表面标记，CD24和NCAM是神经元的表面标记。通过FACS靶向CD24或NCAM可以分离分化的神经元。NPCs、神经元和胶质细胞的分离也可以通过标记组合实现（例如CD184+/CD271−/CD44−/CD24+用于NPCs；CD271−/CD133+用于神经元），不同的组合可以用来描绘NPCs：CD184+/CD326−、CD133+/CD45−/CD34−，CD133、CD15和GCTM-2的表达，以及CD24、CD15和CD29的表达。最近，使用CORIN（一种地板板标记）来分离人类iPSC衍生的多巴胺能前体。使用LMX1AEGFP（LIM同源框转录因子1-A）报告细胞系，已鉴定出可以从hESCs衍生的多巴胺能神经元中选择性富集的新膜标记，如多唾液酸化的胚胎形式的神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）和接触蛋白2（CNTN2）。其他研究已经鉴定出新的表面标记，用于正向富集中脑多巴胺能神经元，如LRTM1（富含亮氨酸重复和跨膜域1）、CORIN和CD166，或在LMX1+ FOXA2（叉头框A2）+细胞分选后去除不需要的细胞（CXCR4，C-X-C基序趋化因子受体4）的标记。 报道的少突胶质细胞前体的表面标记包括NG2（神经/胶质抗原2）、PDGFRα（血小板衍生生长因子受体α）和DLX2（远端缺乏同源框2）或PDGFRα/CD140。然而，由于细胞表型的异质性很大，因此很难仅基于单一标记分离少突胶质细胞。 3.3.心肌细胞分化的表面标记 已经鉴定了心脏前体细胞和成熟心肌细胞的标记。KDR（激酶插入域受体）low/C-KITneg心脏前体细胞表达高水平的心脏转录因子，并且在进一步分化后可以产生>50%的心肌细胞。同样，KDR+/PDGFRα+心脏前体细胞可以分化成>80%的心肌细胞。此外，也已经鉴定出心肌细胞特异性表面标记，包括信号调节蛋白α（SIRPA）、VCAM1和活化的白细胞细胞粘附分子（ALCAM）。从起始培养物中基于SIRPA的选择，这些培养物约有40-50%的心肌肌钙蛋白T阳性（cTnT+），90-98%的细胞对cTnT+呈阳性。通过MACS基于VCAM1的选择可以富集cTnT+细胞高达95%。与这些正向选择方法相比，对于心肌细胞分化效率高（80-90%）的培养物，可能考虑去除不需要的细胞群体。同样，可以使用VCAM1偶联的磁性Dyna珠子或整合素（α1、α5和α6）和N-钙粘蛋白纯化心肌细胞至90%以上纯度。 3.4.内胚层、肝脏、肾脏和胰腺细胞分化的表面标记 hPSC衍生的胰腺细胞是异质性的。CD142被鉴定为胰腺内胚层（PE）细胞的标记，这些细胞能够产生具有葡萄糖反应性的胰岛素分泌细胞，而CD200和CD318是内分泌细胞的标记。因此，靶向如CD142这样的标记可以富集PE细胞，这也被证明可以降低畸胎瘤形成的概率（从46%降低到0%）。GLUT2（葡萄糖转运蛋白2），与PDX-1（胰腺和十二指肠同源盒1）共表达，以及与PDX-1+细胞相关的CD24，也已被评估用于富集来自hPSCs的胰腺前体细胞。此外，在一项针对SOX17以分离hESC衍生内胚层细胞的研究中，已鉴定出表面标记CXCR4、CD49e、CD141和CD238。尽管CD133被报道为小鼠胰腺前体的标记，但它在人类中的表达可能比胰腺PDX-1阳性细胞更广泛。更成熟的内胚层细胞，如源自PSCs的肝细胞，也可以通过特定的膜标记（例如SLC10A1（溶质载体家族10成员1）、CLRN3（Clarin 3）或AADAC（芳基乙酰胺脱乙酰酶）），或ASGR1（即Asialoglycoprotein受体1）进行分离。通过一组膜标记，如CD9−/CD140a+/CD140b+/CD271+细胞，还可以分离出OSR（Odd-Skipped Related Transcription Factor）1+/SIX2（SIX同源框2）+肾脏前体细胞。类似地，通过选择性耗尽CD200+细胞可以选择性地分离角膜上皮细胞。 然而，仍然存在问题，即通过不同标记集识别的细胞群体是否是不同阶段的相同细胞，还是沿着相似发育轨迹的不同细胞。对于生产目的，需要对分离的群体进行全面表征，并证明其对目标应用具有一致的属性。 3.5.用于分离hPSC衍生细胞的非表面标记 除了表达在细胞膜上之外，特定于特定细胞的标记也可以用于分离这些细胞。例如，可以通过分子信标（MBs）检测活细胞中的mRNA，它们是带有荧光团的茎-环（发夹）寡核苷酸探针，另一端带有猝灭剂。针对Oct-4（八聚体结合转录因子4）或Sox2（性别决定区Y盒2）的MBs可以从分化细胞中分离未分化的PSCs；针对心肌细胞标记肌球蛋白重链β（MYH7）的MBs可以富集来自小鼠和人类胚胎干细胞的心肌细胞；针对NPPA（心钠素A型）mRNA的MB，已知与早期工作型心肌细胞相关，可以从心肌细胞分化培养中富集工作型心肌细胞。对于使用MBs进行细胞分离，精心设计并广泛验证针对所需基因的MB探针至关重要。 3.6.敲入报告细胞系 基因组编辑技术（例如CRISPR/Cas9（簇状规律间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9）、TALEN（转录激活因子样效应核酸酶）等）的应用使得构建新型细胞系成为可能，这些细胞系在特定标记表达时发出荧光或通过诱导抗生素抗性而具有特定表型，从而实现纯化。例如，CRISPR/Cas9编辑hiPSCs已实现双报告TBX5（T-Box转录因子5）Clover2和NKX2-5（NK2同源框5）TagRFP细胞的生成，用于纯化心脏细胞亚型，如来自第一心脏领域、心外膜、第二心脏领域和内皮细胞系的细胞。或者，NKX2-5eGFP/w和MLC（肌球蛋白调节轻链）2vmCherry/w报告细胞已被生成以分离心室样细胞。基因组编辑（TALEN）也被用来在肌球蛋白轻链2（MYL2）位点引入选择标记（新霉素）或GFP，用于识别和选择心室心肌细胞。同样，引入在心脏特异性α-肌球蛋白重链（即α-MHC，MYH6）启动子控制下的Zeocin抗性基因已被用于在心肌梗死小鼠模型中纯化iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）。 类似的策略也被用于识别和选择肌源性衍生物。例如，CRISPR/Cas9介导的同源重组方法已被用于选择MYF5（肌源因子5）GFP肌肉前体。构建双报告PAX7（配对盒7）tdTomato和MYF5EGFP使得能够纯化肌肉干细胞（卫星细胞），而诱导PAX7表达系统促进了均匀的骨骼肌源性前体细胞群体的生成。报告细胞也已生成用于纯化神经衍生物。例如，引入驱动mCherry表达的人类囊泡GABA（γ-氨基丁酸）转运蛋白（hVGAT）启动子已实现GABA能神经元的分离，而中脑多巴胺能神经元可以使用酪氨酸羟化酶（TH）RFP构建进行选择。然而，鉴于hPSC衍生物的治疗应用，这些方法可能因基因组修改而增加肿瘤形成的风险。 4.hPSC衍生细胞下游生物加工的工作流程 hPSC衍生细胞生产的下游生物加工涉及多个步骤，这些步骤将累积减少每个步骤的产量（图1B显示了使用MACS耗竭的示例）。主要步骤包括：(1) 细胞收获：将细胞从大量培养容器的粘附表面分离；(2) 离心或浓缩和培养基交换：去除收获酶并洗涤细胞；(3) 保持：收集的细胞在缓冲液中保持，等待所有细胞被收获和离心；(4) 耗竭：去除不需要的杂质细胞；(5) 离心：去除耗竭缓冲液，并在冷冻保护缓冲液中重悬；(6) 细胞配方用于冷冻保存：将细胞转移到冷冻管中并准备冷冻保存。由于这些众多步骤，如果每个步骤的产量为90%（理想情况），最终产量将是50-60%，如果每个步骤的产量为80%（良好情况），最终产量将是30-35%。因此，由于下游加工，可能会损失超过一半的细胞，这通常发生在细胞扩增和分化数月后的一个工作日。 因此，了解每个步骤的操作参数绝对是必要的，以最小化细胞损失的同时保持功能活性细胞。 4.1.细胞收获 从大量容器中收获细胞的关键组成部分是收获酶和洗涤体积。酶的高浓度或不适当的解离溶液或持续时间可能会降低细胞活性和/或无法去除表面上的所有细胞。对于分化培养，胰蛋白酶一直是常用的酶，但其浓度和孵化时间需要针对特定细胞类型进行优化。使用作为高渗溶液配制的柠檬酸钠的新非酶传代方法已被用于分离hPSCs的多细胞聚集体。对于生物加工，希望减少收获体积，这需要在低体积和由于洗涤不足导致的细胞损失之间取得平衡。通过将温度从37°C改变到4°C，使用热响应水凝胶释放hPSCs的新进展已经实现。 4.2.离心 离心过程中的参数包括速度、时间、细胞悬浮液体积和细胞浓度。已经观察到不同细胞收集的沉降变化，这触发了多次离心。收获酶、淬灭缓冲液和等待时间都可能有助于沉降性能。对于大量容器，需要开发大规模离心过程（例如使用袋子）以减少离心步骤的时间。 4.3.保持缓冲液和保持温度 当容器数量高（>100 T- flasks）且处理时间长（长达6-8小时）时，保持过程变得重要。为了将所有细胞一起用于后续处理，首先收获的细胞必须在缓冲液中等待，直到收获步骤完成。因此，需要评估保持缓冲液和保持温度（37°C、25°C或4°C）以维持细胞活性。在制定保持缓冲液时，应考虑细胞聚集。尽管收获的细胞处于单细胞悬浮状态，但细胞可能在保持期间自组装成聚集体。聚集的程度取决于细胞类型、细胞浓度和保持时间。聚集体的形成将影响后续步骤中细胞标记和分离的效率，显著降低细胞产量。 4.4.耗竭缓冲液配方和体积 当细胞群体中有高比例的所需细胞时，耗竭被用来去除少量的杂质细胞。这个过程可以通过MACS针对不需要的细胞表面上的标记来完成。耗竭缓冲液的要求与保持缓冲液相似：维持细胞活性和防止细胞聚集。聚集的细胞不允许与抗体偶联珠均匀标记和容易的细胞-珠分离（图1C）。因此，需要仔细制定耗竭缓冲液。耗竭的细胞浓度和体积影响耗竭规模。首选高细胞浓度（>107细胞/mL）和低体积（<100 mL），同时需要最小化细胞损失。由于可以使用多个标记进行耗竭，因此可能需要重复此步骤以去除不同的细胞群体。 4.5.冷冻保存配方 冷冻保存缓冲液和体积是该步骤的重要参数。一般来说，冷冻保存缓冲液取决于感兴趣的分化细胞类型，冷冻保存的细胞浓度取决于预期的应用。对于移植研究，可能需要高浓度的细胞（每管107-108个细胞），以最小化解冻过程的时间和达到所需细胞剂量的管数。 5.hPSC衍生产品下游加工的挑战 5.1.hPSC衍生神经前体细胞下游加工的挑战 使用MACS已经实现了从PSCs衍生的神经元的大规模纯化，产量高达105-106个神经元（纯度超过90%）。然而，这些特定谱系的下游加工仍然存在特定挑战。在神经前体细胞的情况下，收获的细胞密度相对较低（约每平方厘米1×106个细胞），这可能需要从大量容器中收获细胞。如果能够达到更高的收获密度，那么为了获得所需数量的细胞（每次生产约109个细胞，下游加工体积为50-100 mL），所需的容器数量将显著减少。通过增加播种密度和/或增强细胞增殖来增加收获密度。然而，根据培养系统和细胞表型对密度变化的敏感性，播种密度可能会影响自分泌和旁分泌因子的分泌，这些因子已被证明影响hPSC的自我更新和分化。为了增强细胞增殖，可以考虑改变生长培养基（含有生长因子）和通常涂有层粘连蛋白、Matrigel和纤维连接蛋白等基质蛋白的基质。然而，对培养基和基质所做的任何改变都需要仔细比较。 5.2.hPSC衍生心肌细胞下游加工的挑战 对于心肌细胞来说，下游生物加工的负担比神经前体细胞更为严重。治疗应用所需的细胞数量对心肌细胞来说更高（每次生产约1010个细胞），比神经前体细胞（每次生产约109个）多。在心肌细胞的下游生物加工的所有步骤中，可能需要比神经前体细胞多10倍的浓缩细胞制备或多10倍的悬浮液体积。使用代谢选择方法已经实现了从人类PSCs衍生的心肌细胞的大规模纯化，纯度达到99%，产量高达2×109个功能细胞。心肌细胞也比神经前体细胞更容易形成聚集体，因此耗竭步骤的产量可能会降低。为了有效地用磁性珠标记细胞并分离不同的群体，心肌细胞需要在下游生物加工过程中保持为单细胞悬浮液。因此，需要制定保持缓冲液和耗竭缓冲液（例如抗聚集剂、生物聚合物）以防止细胞聚集（图1C）。鉴于治疗用途所需的数量，hPSC衍生心肌细胞的下游加工规模可能很大。因此，将需要扩大下游生物加工过程中不同步骤的规模（例如大规模离心）。或者，为收获hPSC衍生心肌细胞设计的自动化过程将是有益的。 6.结论和展望 在实现了hPSCs的高效分化后，下游生物加工已成为生产hPSC衍生细胞治疗产品的瓶颈。识别所需谱系的特定标记和去除未分化细胞的策略对于生产安全的细胞治疗至关重要。理想情况下，高细胞纯度，去除不需要的细胞类型将减少下游生物加工的负担。需要开发严格的质量控制系统和高灵敏度的检测方法，以确保细胞分离后产品的一致性。能够预测体内效应的体外检测是可取的，以减少临床前研究的数量。应用质量由设计（QbD）策略来理解过程和产品，更好地控制过程，以生产一致和安全细胞产品应该可能实现hPSCs的潜力。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 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