fibrin

Genentech’s TNKase was originally approved for heart attacks and acute myocardial infarctions in 2000. Image credit: Shutterstock / Sundry Photography. Genentech has secured a second marketed stroke therapy after the US Food and Drug Administration (FDA) approved a label expansion for clot-dissolving agent TNKase (tenecteplase) – the first stroke medicine approved by the agency in almost 30 years. TNKase will be available for the treatment of acute ischemic stroke in adults, joining the Roche subsidiary’s Activase (alteplase) on the market – also approved for the same indication. Before TNKase, Activase was the only pharmacological treatment approved by the FDA for acute ischemic stroke. Whilst Genentech has enjoyed market domination since 1996 – the year in which Activase was approved – the company pursued TNKase’s approval for the disease to offer a faster and simpler administration method. Genentech’s new stroke drug is delivered as a single five-second intravenous (IV) bolus, whereas Activase is administered as an IV bolus followed by a one-hour infusion. The differences in administration come down to TNKase’s longer half-life and higher fibrin specificity. Genentech said it will also introduce a new 25mg vial configuration in the coming months to support the approval of TNKase in its latest indication. The expanded approval of TNKase was based on a non-inferiority study (NCT03889249) across 22 stroke centres in Canada that demonstrated it performs comparably to Activase in terms of safety and efficacy in acute ischemia patients. Stroke is the fifth leading cause of death in the US, according to the US Centers for Disease Control and Prevention (CDC). More than 795,000 people in the US have a stroke each year, with 87% of those being ischemic stroke. TNKase is one of Genentech’s cardiovascular staples, having been approved nearly 25 years ago for the treatment of heart attacks and acute myocardial infarctions. The drug works by breaking down fibrin, a component of blood clots. It is a modified version of a tissue plasminogen activator and helps blood flow freely again without causing systemic bleeding. Combined global sales of TNKase and Activase generated SFr1.2bn ($1.35bn) last year, as per Roche’s product sales report. GlobalData’s Pharma Intelligence Center expects peak sales to come this year, with future sales potentially impacted by increased competition and shortages. TNKase, under a different brand name in Europe, already experienced a shortage in 2022. GlobalData is the parent company of Pharmaceutical Technology . Boehringer Ingelheim markets Activase and TNKase under the brand names Actilyse and Metalyse , respectively, outside the US, Canada and Japan.

摘要：心脏疾病仍然是全球死亡率最高的疾病。包括药物治疗、外科手术和器官移植在内的当前临床策略对于患者来说益处有限，因为它们不能再生受损的心肌。在过去的十年中，由于其独特的自我更新和免疫特权特性，干细胞疗法产生了浓厚的兴趣。此外，干细胞分化为特殊细胞类型的能力使它们成为对抗各种疾病的流行治疗工具。这篇全面的综述提供了不同类型干细胞在心血管疾病治疗潜力方面的概述。此外，它还揭示了每种细胞类型相关的优缺点。还详细分析了干细胞研究面临的挑战以及其临床转化的障碍和可能的解决方案。它审视了围绕胚胎干细胞的争议以及替代方法的出现，如使用诱导多能干细胞进行心脏治疗应用。总体而言，这篇综述为再生医学领域的研究人员、临床医生和政策制定者提供了宝贵的资源，指导开发安全有效的基于干细胞的治疗方法，以彻底改变患者护理。 1.引言 心力衰竭继续成为全球死亡率的首要原因。仅在2019年，全球约有1790万人死于心血管疾病（CVDs 2021）。预计随着老年人口的增长，患者数量将激增。除了老年人，由于肥胖、高胆固醇、高血压和久坐生活方式等风险因素，年轻人也容易患心脏疾病。显然，心力衰竭的主要病因是冠状动脉疾病和心肌缺血。这些病因通常共存，并增加发展心力衰竭的风险。治疗心血管疾病的传统疗法包括基于导管的介入治疗，包括血管成形术以疏通动脉，以及外科手术，包括冠状动脉搭桥手术或在心力衰竭晚期进行器官移植。这些治疗可能还包括使用心脏保护药物，如β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂或口服利尿剂。这些心脏保护治疗已被证明可以增强冠心病患者的心脏功能，并帮助患者在初次心脏骤停后预防任何严重的心脏影响。然而，这些治疗在长期疾病恢复方面只能提供边际益处，并且它们的持续使用可能与严重的副作用相关，掩盖了它们对患者的积极影响。尽管如此，这些治疗不足以再生或修复心脏环境，因此它们在心脏重塑中的作用有限。此外，对于只有器官移植作为唯一选择的患者，手术受到可用于移植的器官数量的限制。因此，正在研究超越传统方法治疗心脏疾病的新治疗选择。由于心脏在缺血性损伤后的有限再生能力，使用细胞疗法的组织再生是研究的活跃领域。细胞疗法为替换心肌缺血期间丢失的终末分化的心肌细胞（CMs）提供了可靠的解决方案。干细胞疗法是一种新的治疗方法，涉及使用未分化的干细胞来改善给定的心脏状况。干细胞是我们体内未分化的细胞，具有自我更新和分化为体内多种细胞类型的能力。根据它们的分化能力，干细胞可以是全能的、多能的或多能的。全能细胞具有生成人体所有细胞类型的能力，包括胚胎和胚外组织。多能细胞通常来源于胚胎的内细胞团。它们有能力分化为所有三个胚层（内胚层、中胚层或外胚层）的细胞类型，除了胚外组织。这些细胞被称为胚胎干细胞（ESCs）。此外，多能干细胞也可以从成人体细胞如皮肤组织或血细胞中诱导出来，通过在所需的生长因子（称为山中因子）存在下使它们去分化。这些诱导多能干细胞（iPSCs）最近受到了很多关注，因为它们可以灵活地从任何体细胞中重新编程并分化为目标细胞。多能间充质干细胞（MSCs）的分化潜力有限，只能生成某些细胞类型。这些干细胞可以从成人组织中分离出来，包括骨髓（BM）、血液、脂肪组织（AD）或新生儿来源如脐带（UC）、胎盘或羊水（图1）。根据供体，干细胞移植可以是自体的（将患者的细胞注射回同一人进行治疗）或异体的（将健康供体的细胞注射到疾病中，非自身宿主）。 图1. 心脏再生的干细胞类型及干细胞来源。用于心脏治疗的干细胞类型包括间充质干细胞（MSCs）和多能干细胞。MSCs可以从髂嵴和股骨的骨髓（BM-MSCs）中提取；脐带（UC-MSCs）；脂肪组织（AD-MSCs）；或从羊水中提取。多能干细胞可以从胚泡阶段的胚胎（ESCs）中分离出来，或者通过在生长因子存在下从皮肤或血液中的体细胞去分化（iPSCs）。使用BioRender（BioRender.com）创建。 2.不同类型的干细胞用于心脏修复 2.1.多能干细胞 2.1.1.胚胎干细胞 ESCs是从第4至7天囊胚阶段内细胞团中获得的多能干细胞。由于ESCs能够无限增殖并分化成所有三个胚层的细胞，它们是治疗心脏疾病有希望的候选者。自1994年首次分离出人类胚胎干细胞（hESCs）以来，它们已被广泛用于生成不同细胞类型以用于多种治疗应用。在适当的培养条件和CM特异性因子下，可以实现hESCs向CMs的定向分化。然而，在所需条件下，只有一小部分hESCs（5%-15%）会自发分化成CMs。当前研究集中在控制hESCs向心脏系谱的分化，以增加用于细胞治疗的hESC衍生CMs的产量。已经开发了富集、纯化和选择技术，以指导心脏分化朝着比较纯净的均质性发展。长期培养、三维（3D）组织工程、机械负荷、电刺激、基质刚度修改以及神经激素物质治疗等策略已在hESC衍生CMs中进行测试，以提高它们的分化潜力和成熟状态。ESCs已显示出在临床前试验中通过分化成心脏祖细胞来促进心脏重塑的潜力，这些祖细胞植入宿主心肌并减少瘢痕形成。一项研究报告称，由人类多能干细胞（hPSCs）衍生的心血管祖细胞（hPSCs-CPCs）分泌的细胞外囊泡（EVs）在缺氧条件下表现出心脏保护作用，进而增加了与转移相关的肺腺癌转录本1（MALAT-1）的表达水平。MALAT-1被发现通过靶向miR-497促进人脐静脉内皮细胞的管状形成。此外，Chong等人证明了hESC衍生CMs通过心肌内（IM）给药使梗死猴子心脏重新肌肉化的能力。他们发现，移植的细胞与宿主肌细胞形成了电机械连接，表明在人类梗死心肌再生方面具有显著潜力。尽管ESCs的持续植入较为罕见，但已观察到ESC衍生的祖细胞通过旁分泌机制对梗死心脏组织的重塑产生积极影响。在首例临床病例报告中，一名68岁的严重心力衰竭患者，hPSCs-CPCs显示出有希望的结果，没有与心律失常、肿瘤形成或免疫抑制相关的并发症，并且移植后左心室射血分数（LVEF）增加了（36%）。Menasche等人评估了hESCs在严重缺血性左心室衰竭患者中的安全性，并探索了生产临床级CPCs的可行性。在这项ESCORT试验中，大约820万hESC衍生的心血管祖细胞嵌入纤维蛋白补丁中，在冠状动脉旁路手术期间被心外膜递送至六名患者的心外膜，这些患者的平均LVEF为26%。在治疗一年后，基于心脏或非靶肿瘤的成像和每个患者放置的心脏复律除颤器的连续询问来评估患者安全性，以筛查心律失常。该研究还检查了受体中供体特异性抗体的存在，以评估同种免疫反应。观察到少数患者获得了临床上沉默的同种免疫。此外，大多数患者症状得到缓解，细胞处理段显示出增加的收缩运动。这项试验帮助建立了从hESCs获得高纯度（97.55%）心血管祖细胞群的协议。尽管有确立的体外细胞分化技术和来自体内临床前研究的鼓舞人心的结果，但在ESCs被广泛接受作为心肌梗死（MI）患者的临床候选者之前，必须克服几个障碍。例如，由于它们的胚胎起源，hESCs的分离在许多国家与伦理问题相关。此外，一些研究也表达了对ESCs注射后形成畸胎瘤的担忧。 2.1.2.诱导多能干细胞 自2006年以来，iPSCs作为再生医学领域的革命性发展出现。这些细胞是通过使用四个Yamanaka因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc）重编程成人体细胞产生的。iPSCs展现出独特的多能性和自我更新特性，正成为再生医学领域的理想选择。此外，还有几种细胞培养方法和协议的修改已经优化，以促进iPSCs的心腔特异性分化，生成心室、结和心房CMs、平滑肌细胞和心脏成纤维细胞。与它们的胚胎对应物不同，iPSCs因其可获取性和伦理可接受性而被高度考虑用于疾病建模和药物筛选。一项研究表明，iPSC衍生CM移植通过减少瘢痕大小改善了猕猴心脏的功能恢复。此外，在移植后1个月，CM处理的心脏在全球LVEF中显示出显著恢复，约为10.6% ± 0.9%。在Ye等人的研究中，研究了iPSCs在急性MI中的有效性，该研究在猪模型中进行。从iPSCs衍生的三种细胞被心肌内给药，即CMs、内皮细胞和平滑肌细胞。此外，应用了3D纤维蛋白补丁，释放胰岛素样生长因子-1（IFG-1）以增加存活率。在许多心脏功能参数上观察到显著改善，如左心室功能和动脉密度。此外，心肌代谢和ATP周转率显著改善，而凋亡和梗死大小显著减少，没有发生室性心律失常。另一种使用iPSCs治疗心脏病的方法是通过iPSC衍生的EVs（iPSC-EVs）。这些囊泡包含分子货物，如iPSC释放的miRNAs和其他有助于细胞分化和血管生成的因子。Adamiak等人比较了iPSCs和iPSC-EVs在急性MI小鼠模型中的有效性。小鼠被分为三组，分别是IM注射载体、iPSCs或从小鼠iPSC上清液中获得的iPSC-EVs。虽然iPSCs和iPSC-EVs在功能性心肌改善方面显示出相似的改善，但iPSC-EVs在凋亡减少方面显示出更显著的减少。此外，在iPSC组观察到畸胎瘤形成，但在iPSC-EV组中没有观察到。iPSCs最富有成果的应用之一是开发不同病理条件的疾病模型。几位研究人员报告了患者特异性iPSCs的分离和应用作为疾病模型，因为这些细胞提供了可以研究其遗传异常的特定于患者的基因型，而不影响细胞的表观遗传效应。这些模型已报告用于瓣膜缺陷、节律障碍、代谢障碍和扩张型心肌病的特定患者iPSCs。 目前正在进行的几项临床试验正在研究胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）在心脏治疗中的应用。一项正在进行的I期试验（NCT03763136）正在评估异体iPSC衍生的CM移植在严重心力衰竭患者中的安全性和有效性。这项研究目前正在招募大约20名患者，并预计于今年完成（Help Therapeutics，2022年）。另一项I期临床试验（NCT04696328）正在研究异体iPSC衍生的CM片治疗缺血性心肌病的安全性和有效性。这项试验将重点关注LVEF的改善以及其他与安全性相关的评估。这些临床试验正在评估干细胞治疗心脏病的安全性和有效性，其结果可能为这些疗法在心脏患者的临床应用潜力提供重要见解。然而，为了确保成功的临床转化，解决与iPSCs使用相关的挑战很重要，例如形成畸胎瘤的风险和高生产成本。最近，在一项研究中，将诱导性caspase-9（iC9）引入iPSCs，这些iPSCs暴露于化学二聚体诱导剂（CID）导致caspase级联反应的启动，有助于消除形成肿瘤的细胞，从而创建了一个高效的iC9/CID保护系统。iPSCs在心脏中的移植也报告会引起心律失常反应；在大型动物模型中，与小型动物模型相比，发展为临时性室性心律失常的风险更大。Okawa等人比较了胎儿心脏的转录组图谱，发现iPSC衍生的CMs（iPSC-CMs）具有类似的不成熟表型和电生理学特征，这可能导致心律失常。为了克服这一挑战并实现成熟表型，Parikh等人使用三碘甲状腺原氨酸和地塞米松的组合增加了iPSC-CMs中T管的形成，这导致随后的钙释放和兴奋-收缩耦合与成年心肌相似。 2.2.用于心脏治疗的MSCs MSCs是具有分化成特定谱系细胞能力的多能细胞，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。MSCs可以从几种成年或新生儿组织中分离出来，包括骨髓、脂肪组织、子宫内膜、牙髓和脐带血以及几种其他来源。它们易于分离和维护，以及最小的畸胎瘤形成倾向，使MSCs成为临床研究的有利候选者。目前，骨髓和脐带血中的MSCs在心脏治疗中最广泛用于临床，其次是脂肪组织衍生物。MSCs通过分泌各种参与组织再生途径的旁分泌因子发挥作用，包括血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）和转化生长因子（TGF）-beta，这些因子有助于血管生成和伤口修复。它们还释放免疫抑制分子，如IL-10、前列腺素E2（PGE2）、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子（TNF），这些因子有助于防止缺血性心肌中的不良免疫反应，从而修复组织。 2.2.1.骨髓来源的MSCs 骨髓来源的MSCs（BM-MSCs）通常从骨盆的髂骨脊或股骨骨髓中获得的血液中分离出来。这些细胞易于分离，并在体外容易扩增，功能不失。此外，它们可以从年轻健康供体中获得，并移植到异体、患病和老年宿主中。许多实验研究报告了BM-MSCs在通过分泌可溶性因子和促进血管生成、减少免疫反应和预防纤维化来改善受损心肌功能方面的支持证据。Boomsma等人证明，在将小鼠BM-MSCs注射到梗死心肌后，注射后保持了收缩功能。此外，MSCs能够迁移到损伤部位，并通过分泌旁分泌因子恢复心脏的收缩力。在扩张性缺血性心肌病的兔模型中，Mu等人证明，自体BM-MSCs的移植通过与内源性CMs的旁分泌相互作用改善了心脏功能。BM-MSCs还导致VEGF受体的上调，从而表明它们的促血管生成潜力。在猪MI诱导损伤模型中，BM-MSCs的IM注射改善了心脏功能和心室壁厚度，同时减少了瘢痕大小。Cai等人在急性MI模型中报告了类似的发现，其中BM-MSCs在猪心脏中的注射通过mTOR的上调和通过增加GLUT1和4转运蛋白的表达改善心脏的葡萄糖代谢，从而改善了心脏功能。在CHART-1研究中，评估了351名参与者中自体心脏诱导MSCs的疗效，MSC治疗组在干细胞注射后1年内显示出左心室舒张末期和收缩末期体积的逐渐减少。尽管在几项研究中获得了有希望的结果，但一些报告已经表明，随着年龄的增长，几种凋亡和衰老基因的表达增加，这可能影响从老年患者中分离出的自体干细胞的功能和增殖，限制了自体MSCs在临床试验中的使用。然而，衰老本身并不影响MSCs疗法的积极结果，这在Golpanian等人的研究中显示，接受MSCs治疗的患者被分为不同的年龄组，改善心脏功能和瘢痕大小的结果并不因接受者的年龄而异。除了在体内改善心脏功能外，BM-MSCs还被报告刺激心肌中ckit+细胞的分化和增殖。在猪MI模型中，用BM-MSCs治疗导致ckit+和GATA4+心脏干细胞的增加，与对照动物相比。在这项研究中，MSCs刺激了体外Nkx和肌钙蛋白阳性成年心脏母细胞的生成。 此外，黄等人表明，在心肌梗死（MI）后将自体骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）的片状片段移植到猪模型的梗死心肌中，显著改善了心室扩张并维持了心脏功能。哈尔等人在Prochymal试验中测试了异体间充质干细胞在急性MI患者中的疗效，发现与未治疗对照组相比，接受BM-MSCs治疗的患者左室射血分数（LVEF）提高，逆向重构。为了解决MSC剂量对调节心脏功能的影响，Florea等人进行了TRIDENT试验，30名缺血患者接受了不同剂量（2000万或1亿）的MSCs。接受较高剂量MSCs的患者与接受较低数量MSCs治疗的患者相比，EF有所提高；然而，两组都显示出疤痕大小的减少。 2.2.2.脐带血来源的MSCs 脐带血来源的MSCs（UC-MSCs）在胚胎发育的第五周形成。脐带是MSCs的丰富来源，可以从其不同部分分离，包括血液、脐带内皮和华通胶。UC-MSCs表达成人干细胞标记和胚胎干细胞（ESC）标记，如Tra 1-60、Tra 1-81和阶段特异性胚胎抗原1和4以及碱性磷酸酶。与脂肪或骨髓衍生物相比，这些MSCs表现出更高的多能性。与BM-MSCs类似，UC-MSCs已知能抑制T细胞增殖，但它们的排斥时间比BM-MSCs慢；因此，它们更受青睐用于异体移植。此外，UC-MSCs表现出更长的端粒和更高的端粒酶活性，更高的增殖率，以及通过最少侵入性分离的便利性，与其他多能干细胞类型相比，使它们成为心脏干细胞治疗MSCs的有前景的来源。在一项使用小鼠MI模型的研究中，接受人类UC-MSCs（hUC-MSCs）片的小鼠与未治疗对照组相比，EF显著改善，梗死大小也有所改善。作者还报告了低致癌性以及减少的TNF-α分泌。另一组研究人员显示了UC-MSCs在小鼠MI模型中的抗凋亡和促血管生成作用。他们还发现UC-MSCs治疗的动物中驻留心脏祖细胞的激活增强。此外，UC-MSCs条件培养基也被报道通过阻止NF-κB途径的激活减少炎症，治疗动物也显示出心脏功能的改善和纤维化的减少，如TGF-β和IL-6水平所见。在一项类似的扩张型心肌病大鼠研究中，UC-MSCs治疗的动物中TNFα、TGF-β1和ERK1/2的表达减少，突出了其抗纤维化作用。在Yannarelli等人的研究中，与BM-MSCs共培养的胚胎性心肌细胞（CMs）与UC-MSCs共培养相比，心脏特异性遗传标记的显著上调。一些研究还表明，UC-MSCs可以在定义条件下培养分化成肌管、平滑肌细胞和搏动的CMs。Qui等人表明，伴随UC-MSC注射的心脏同种异体移植与无UC-MSCs的动物相比，主要组织相容性复合体II（MHC-II）表达较少，存活时间更长。在少数使用UC-MSCs对心脏患者进行的临床试验中，RIMECARD试验评估了UC-MSCs在慢性心力衰竭患者中的疗效和安全性。接受UC-MSCs治疗的患者LVEF显著改善，在12个月的随访期间没有不良事件。此外，在注射后90天内没有产生针对移植细胞的异体抗体。目前，正在进行一项随机临床试验，涉及20名接受冠状动脉旁路移植术（CABG）的MI患者，以研究hUC-MSCs在改善这些患者心脏功能方面的效果。 2.2.3.AD来源的MSCs Zuk等人（2001年）首次确定AD作为细胞治疗的MSCs来源。AD来源的MSCs（AD-MSCs）是从AD的基质中分离出来的，使用胶原酶介导的降解，产生可以分化成成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞类型的祖细胞。由于与骨髓和脐带相比，自体AD更容易获得，以及丰富的脂肪组织用于它们的分离，AD-MSCs是多种病理的候选者。除此之外，这些细胞在缩短翻倍时间和产生显著更高的干细胞祖细胞方面也具有优势，与BM-MSCs相比。AD-MSCs可以分化成CMs，并且衰老的起始时间较晚，表明它们有潜力用于治疗慢性心脏状况。一些研究报告了AD-MSCs分化成不同血管系的细胞，有助于心血管重塑。此外，通过自发或化学诱导的体外分化，也报告了CMs的生成，表明AD-MSCs在心脏再生中的潜力。在这样一项研究中，Chang等人证明，接受AD-MSCs治疗的MI后大鼠心脏功能改善。移植后12周，作者还观察到移植的AD-MSCs中CM标记物的表达，包括GATA1和肌球蛋白重链。Ammar等人表明，AD-MSCs能够缓解糖尿病大鼠中阿霉素（Dox）治疗的心脏毒性症状。AD-MSCs治疗的糖尿病大鼠显示出减少的胶原沉积和平滑肌肌动蛋白（SMA）表达，以及Dox处理的心肌中免疫细胞浸润的减少。在急性MI的猪模型中，自体AD-MSCs的冠状动脉内（IC）注射与增加的心脏保护和更好的心脏灌注相关，EF或心脏体积没有显著变化。除了单独使用AD-MSCs，几项研究表明，在缺血性心肌中移植AD片也有积极效果。Kim等人表明，在急性MI模型中使用AD-MSC片比接受AD-MSCs注射的心脏有更好的细胞植入和更高的生长因子和细胞因子分泌，以防止不良心脏重塑。鉴于临床前研究的积极结果，已经进行了好几项临床试验，使用AD-MSCs评估移植后心脏功能的变化。 在一项随机、双盲的APOLLO试验中，首次测试了AD-MSCs在ST段抬高心肌梗死（STEMI）患者中的安全性。通过冠状动脉内（IC）输注AD-MSCs被认为是安全的，没有冠状动脉血流受阻。作者报告称心脏功能改善，疤痕形成减少了50%。PRECISE临床试验在27名缺血性心肌病患者中进行。接受AD-MSCs治疗的患者在18个月的随访期间显示出更好的最大氧消耗量，与未治疗对照组相比。患者还显示出改善的左室质量和平壁运动评分指数，同时保持了AD-MSCs治疗患者的运动能力。Athena试验项目在31名缺血性心肌病患者中进行了双盲研究。尽管AD-MSCs和安慰剂患者的左室功能没有差异，但AD-MSCs治疗的患者显示出改善的心脏灌注和降低的12个月住院率。在最近的一项涉及心力衰竭和降低的射血分数（HFrEF）患者的II期临床试验中，接受AD-MSCs治疗的患者在3年的随访期间生活质量有所提高；然而，与安慰剂组相比，心室功能和尺寸没有变化。鉴于不同试验中混合的结果，需要进行更广泛的研究以了解AD-MSCs在改善心脏功能中的作用。 2.3.干细胞输送至心脏 干细胞输送至心脏的途径和技术是影响细胞疗法临床结果的关键因素。干细胞可以通过肌肉内（IM）、静脉（IV）和冠状动脉内（IC）途径输送至受损的心肌，或使用3D支架。肌肉内注射涉及直接将干细胞输送至缺血性心肌组织。它被认为是最精确的细胞输送方法，可以在冠状动脉心脏疾病患者中借助导管进行。尽管肌肉内注射提供了针对性的干细胞输送，但这种模式是侵入性的，可能导致严重的负面影响，包括患者死亡。出于同样的原因，在同一患者中注射多剂细胞是不可行的。另一方面，静脉方法涉及通过静脉滴注将干细胞注入血流。它通常优先用于急性MI后的患者，并且由于其侵入性最小，这是一种可行的多细胞输注途径。然而，尽管这是细胞输送的常见方法之一，但通过静脉模式移植的许多细胞并未存活，可能最终被困在血管或非靶向器官中。此外，这种技术依赖于干细胞在受损心肌中的归巢，使用旁分泌信号。冠状动脉内输注允许细胞通过冠状动脉之一输送至心肌。这是最常见的细胞输送模式，因为它可以伴随MI患者的外科干预。然而，这种方法可能不适用于血管灌注较少的患者。此外，在输送之前，可能需要考虑细胞的大小和动脉，以防止细胞在较小的毛细血管中受阻。在涉及猪MI模型的一项研究中，测试了不同输送方法的有效性。在心内膜、肌肉内和冠状动脉内途径中，冠状动脉内注射显示出与其他MSCs管理方式相比，平均最多的植入细胞数。一项这样的研究表明，在注射后6周，只有3.5%的注射MSCs被限制在心脏中。然而，还发现当MSCs在MI后一天注射时，保留的这些细胞数量最多。一些研究还报告了使用基于生物材料的贴片输送干细胞的使用。当细胞通过贴片输送时，干细胞的保留和植入有所改善。然而，鉴于细胞类型和特性的变化，一种输送模式可能基于目标器官和患者状况而优于另一种模式，以实现最佳可能的结果。 2.4.干细胞临床转化的挑战 干细胞技术无疑在治疗心脏病的临床使用方面取得了进展（表1）。然而，在干细胞疗法成为临床设置中的常态之前，还有几个挑战和不足需要解决（图2）。以下是干细胞疗法转化的一些障碍。 图2. 干细胞疗法在心脏修复中临床转化的挑战：（i）干细胞的异质性：干细胞的分化潜力在不同干细胞类型之间以及同一干细胞类型内部都有所不同，这导致了治疗后效果的变异性。（ii）剂量优化：优化干细胞移植的剂量很重要。鉴于不同的细胞数量可以导致不同的结果，并且这些结果取决于细胞类型和移植的器官，移植的细胞数量应在干细胞疗法临床适应前进行优化。（iii）干细胞迁移到非靶向器官可能导致移植后细胞损失或甚至小毛细血管的阻塞。（iv）移植后干细胞的免疫特权丧失：这导致宿主免疫系统识别干细胞，从而引发免疫反应，最终导致移植部位的细胞损失。干细胞的免疫抑制能力因细胞类型和来源而异，这应在移植前考虑，以提高供体心脏中的存活率。部分图形使用软件bioicons（https://bioicons.com/）创建。 2.4.1.干细胞的异质性 首先，表征MSCs非常具有挑战性，因为这些细胞缺乏独特的表面标记物的表达，并且表达也存在于其他细胞类型上的标记物。因此，尽管国际细胞治疗协会定义了标准，但这些标准相当模糊，可以应用于其他细胞类型。例如，MSCs显著表达CD29（整合素ß1），这也表达于上皮细胞和肌上皮细胞。同样，CD90（Thy-1）由造血干细胞和角朊细胞干细胞共表达。此外，CD105（内皮糖蛋白）也由内皮细胞和某些造血干细胞表达。除了MSCs，多能干细胞也报告了在不同层面的异质性。由于ESCs和iPSCs以其无限的增殖和多能性而闻名，控制这些细胞产生的分化细胞群体具有挑战性。每个ESC和iPSC细胞系在分化潜力上表现出差异，偏爱不同的细胞类型。在其他因素中，导致培养间变异的主要因素包括它们在培养中的时间，以及遗传因素。最近，单细胞培养的分析揭示了单个多能干细胞群体中存在不同类型的细胞，增加了干细胞异质性的复杂性。在Yang等人的一项研究中，外显子测序揭示了小鼠成纤维细胞衍生的24个iPSC克隆中几乎有400种iPSCs变体。 利用单细胞RNA测序，另一项研究揭示了人类PSC衍生的角膜缘干细胞在时间依赖性方式下的变化。此外，缺乏标准协议导致不同实验室产生不同程度的多能干细胞。所有这些因素显著地导致了胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）移植后结果的低可复制性和更大的变异性。 2.4.2.移植干细胞在体内的存活 除了与干细胞特征描述相关的挑战外，确保间充质干细胞（MSCs）在缺血性心肌中更长存活和植入还有很长的路要走。导致心肌细胞死亡的主要因素包括减少的血液供应、增加的氧化应激和增强的心肌炎症。因此，为了克服这些挑战，通过改善细胞植入、抑制细胞死亡途径和增加细胞存活蛋白的表达来增强受损心肌中干细胞的存活可能对其临床转化很重要。因此，对MSCs进行遗传修饰以增加促存活基因的分泌已被实践以提高心脏中干细胞的存活。Noiseux等人证明，过表达Akt的MSCs在减少凋亡和增加分泌后心功能方面有显著改善。同样，另一项研究表明，通过针对VEGF信号通路增加MSCs的拉伸可以改善它们的血管生成潜力并减少凋亡。其他几项研究也显示了移植前对干细胞进行缺氧预处理的积极效果。化学或物理建立的缺氧对改善体内干细胞存活有类似的效果。还表明，在高氧存在下用caspase抑制剂预处理的MSCs提高了体内细胞存活。Hu等人比较了正常培养的MSCs和缺氧预处理的MSCs在灵长类动物心肌梗死模型中的细胞存活率和凋亡率。3个月后，由于分泌了促血管生成因子如HGF、促红细胞生成素和血管紧张素-I，疤痕大小和左室功能有了显著改善。许多研究者提出，由于体内的缺氧微环境，2%-5%的O2水平有助于增强干细胞的治疗潜力，同时防止ESCs的自发分化。此外，由于iPSCs在移植后无法适应环境，由于血管化不足和坏死的发生，iPSCs的存活率较差。为了解决这一挑战，提出了联合给药含有IGF包封微球的纤维蛋白补丁以提供这种生长因子并增加存活和心脏功能。Ye等人发现，与纤维蛋白补丁结合的iPSCs的植入得到了改善，植入率大约提高了20倍。体内干细胞的迁移和归巢 干细胞治疗的另一个主要挑战是细胞迁移到损伤部位以及它们在移植部位的低保留率。一些报告称，干细胞的表面标记物表达、细胞大小以及培养条件在它们的植入和迁移到目标部位中起着重要作用。在其中一项研究中，过表达CXCR4的干细胞能够更好地迁移和植入缺血性心肌，促进血管生成。同样，Becker等人表明，MSCs的迁移与基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达相关。他们还报告说，MSCs在培养中的高密度导致了MMP-2抑制剂的增加合成，因此细胞迁移减少。此外，为了实现移植细胞更好地迁移到目标器官，干细胞可以预先用某些趋化因子和因子处理，包括TNFα和整合素β1。抑制MSCs表面的粘附分子包括VCAM也被发现对其转移到目标器官有积极影响。此外，更高的培养温度通过NF-κβ途径对干细胞迁移产生负面影响。干细胞大小是另一个重要因素，在心脏注射干细胞之前需要考虑。冠状动脉毛细血管的大小限制在约7-10微米。因此，为了防止由于微血管堵塞引起的微梗死，考虑较大干细胞的大小在注射前很重要。Gao等人在18-80岁的STEMI患者中进行了随机对照试验。根据这项研究，通过IC注射MSCs可能导致这些细胞粘附到毛细血管并影响心脏的血流。此外，另一项研究报告称，由于MSCs的较大大小，在IV注射后不久MSCs被困在肺部。在另一项比较多能干细胞、神经前体细胞、骨髓单核细胞和MSCs的研究中，作者发现较小的细胞能够与较大的MSCs相比绕过肺微血管屏障。另一项研究报告了患者在IV注射AD-MSCs后出现肺栓塞。 2.4.3.移植后干细胞的免疫原性 MSCs被认为是免疫特权的；因此，这些细胞应该能够逃避宿主免疫系统并避免免疫排斥。然而，几项研究报告称，MSCs在移植到缺血性心脏后变得具有免疫原性。因此，MSC基础治疗的临床转化的另一个主要挑战是在移植后保持干细胞的免疫特权。Huang等人研究了MSCs在大鼠心肌梗死模型中移植后是否保持其免疫特权和功能能力。在6个月时对心脏环境的评估显示，同种异体MSCs将其免疫耐受状态转变为免疫反应状态。免疫状态的改变是由于多种原因，包括细胞表面免疫抗原的表达变化，MSCs表面的MHC-II分子，或减少分泌免疫抑制可溶性因子如PGE2。干细胞的免疫活性也可以归因于供体的年龄以及干细胞的来源。Wu等人表明，来自老年动物的BM-MSCs和ADSCs与来自年轻动物的细胞相比，对CD4+、CD8+ T细胞的抑制较少，强调了供体年龄在调节干细胞免疫特权中的重要作用。同样，Ribeiro等人比较了来自成人和新生儿组织的MSCs的免疫抑制能力，发现这些细胞在抑制CD4+和CD8+ T细胞激活的能力上存在差异，进一步强调了干细胞来源对移植的重要性。 2.4.4.体内干细胞不受控制的分化导致不期望的表型 一些其他研究报告了对干细胞分化为不期望表型的担忧。移植后，当细胞暴露于宿主微环境时，它们可能会响应可用因素并经历自发分化。 除了这些，由iPSCs或ESCs分化产生的CMs可能是未成熟的表型，因此在钙处理和肌节组织方面表现出差异。这可能导致在心肌中移植这些细胞后心律失常增加。此外，在一些较旧的研究中，未分选的BM细胞在某些情况下已被证明可以分化成成骨细胞，导致心脏组织的骨化。因此，在确保它们的纯度的同时，建议在灌注液中使用足够的MSCs。为了克服这些障碍，最好使用来自干细胞的分化CMs进行心脏修复和再生。移植经过定向分化因子处理的细胞可能是另一种考虑的方法。Boland等人建议，在MSCs的培养基中添加Wnt-3可以抑制MSCs的成骨能力。另一方面，可能有益的是完全排除使用细胞，而考虑细胞衍生产品。无细胞系统越来越受欢迎，因为它们结合了两个世界的优点。它们能够逃避免疫反应，因为它们缺乏抗原呈递细胞表面蛋白的表达。此外，它们展现出与整个细胞移植相似的积极效果。 2.5.大规模生产干细胞用于临床应用的挑战 为了替换在缺血事件中丢失的CMs，使用外源性干细胞的治疗显示出巨大的希望。然而，为了达到预期结果，这些细胞需要在移植到患者体内之前扩大到更高的数量。这些大量的干细胞是通过生物反应器获得的。尽管如此，大规模生产干细胞面临着主要挑战。在执行这些步骤时需要考虑许多方面，从供体选择到最终准备用于体内给药的纯化产品。首先，缺乏标准化/优化的协议用于获取、分离和维持足够数量的高质量干细胞。Heathman等人强调了了解供体特征对扩大自体和同种异体细胞治疗生物过程的影响的重要性，在从众多BM-hMSC供体开发制造过程中。其次，干细胞具有有限的增殖能力，影响其可扩展性和扩展范围。为了实现大规模生产，干细胞需要在体外扩增，同时保持它们的干细胞特性，避免可能影响其安全性和有效性的遗传异常或其他变化。第三，进行质量控制和特性分析以确保干细胞的安全性和有效性用于临床使用非常重要。这涉及全面的特性分析，以确认身份、纯度、效力和无污染或遗传异常。这也是解锁过程可比性的关键步骤，允许进行任何必要的过程更改和多站点制造模型。第四，扩大干细胞的生产将显著增加成本。优化生产方法，包括自动化和生物反应器系统，可以帮助提高效率，降低劳动力和材料成本。最后，在扩大干细胞生产时必须解决伦理和监管考虑。满足监管要求和获得必要的批准可能是一个复杂且耗时的过程，增加了大规模生产的挑战。 解决这些挑战需要科学家、工程师、临床医生和监管专家之间的多学科合作。持续的研究和技术进步将在克服这些障碍和实现干细胞大规模生产用于临床应用中发挥关键作用。 2.5.1.未来方向：干细胞治疗心脏再生 干细胞治疗已显示出心脏再生和修复的希望。然而，要将基于干细胞的方法转化为临床应用，需要解决上述挑战。干细胞分离和培养程序的异质性可以通过标准化用于每种干细胞类型的培养基成分来解决。优化临床用培养基成分是一项艰巨的任务。然而，报告表明，标准化培养条件有利于防止培养间变异性。据报道，在标准条件下培养的iPSCs在基因组上的变异较小。许多研究人员认为，胎牛血清（FBS）是培养基中最广泛使用的成分，其组成未定义，可能带来与异种成分转移到人体相关的健康风险。然而，它也与p53相关基因表达的降低和干细胞重编程效率的提高有关。因此，细胞培养基不可避免地需要更好的标准化。Dessels等人强调了干细胞培养的各种替代品，通过生长因子或血清白蛋白取代血清成分，完全取代胎牛血清。对于人类细胞培养，可以考虑不同的选项，如血浆、富含血小板的血浆和血浆裂解物。在其中一项研究中，Kocaoemer等人检查了人类AB血清和凝血酶激活的富含血小板的血浆作为FBS的替代品的效果。作者报告说，与用牛血清培养的细胞相比，用人类供体血清培养的细胞分化为成骨和脂肪细胞系的能力显著降低。同样，Atashi等人显示，在自体富含血小板的血浆存在下培养的干细胞细胞增殖更高。Palombella等人的元分析比较了基于FBS的培养基与基于人类血小板裂解物（HPL）的培养基在不同参数上的差异。他们测量了倍增时间、干细胞标记物的表达、MSCs的旁分泌活性、免疫抑制能力以及细胞形态。作者发现，在HPL补充的培养基中MSCs的倍增时间更高。然而，在两种条件下都没有报告免疫抑制能力的差异。另一方面，Copland等人建议，HPL中纤维蛋白原的存在可能对MSCs的免疫抑制能力产生负面影响，因为它能够通过激活TLR4受体触发MSCs的促炎表型。一个可能的解决方案是减少HPL中的纤维蛋白原含量。然而，这个问题仍需要在未来的研究中解决，以确保干细胞程序的安全性，因为大多数制造设施已经开始使用HPL培养干细胞。 2.6.无细胞系统在心脏再生中的应用 2.6.1.心脏再生的生物材料 细胞保留和存活是实现干细胞全部治疗效果的主要障碍。因此，研究使用有无干细胞的生物材料来再生心肌的新途径，正成为一个活跃的研究领域。生物材料为注射的干细胞提供了一个有利的三维微环境，同时掩盖了触发免疫反应的表面抗原。除此之外，生物材料还为生长和支持内源性或注射的细胞提供了高效的环境，帮助心脏再生。用于心脏再生的最常见生物材料包括有机化合物如聚乙二醇；无机化合物，包括硅纳米粒子、金纳米粒子、碳纳米粒子以及生物材料，包括病毒样颗粒、蛋白质纳米系统以及外泌体（EVs）。蛋白质如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、胶原和多糖也被用作模仿自然细胞外基质的支架。这些半支架可以作为生长因子如成纤维细胞生长因子（FGF）、VEGF和HGF的结合位点。在最近结束的一项临床试验中，为了证明胶原水凝胶用于心脏干细胞输送的安全性和有效性，接受CABG的患者另外接受了“细胞与胶原”治疗或单独的“细胞”治疗。接受水凝胶包裹的MSCs治疗的患者，在治疗后1年显示出改善的左室射血分数（LVEF），没有不良反应。Jin等人将MSCs嵌入到聚乳酸-ε-己内酯共聚物中，用于大鼠心肌梗死（MI）模型，并注意到它显著改善了LVEF并减少了梗死面积。Rafieerad等人研究了使用零维碳化钛MXene量子点（MQDs）对免疫反应调节的影响，目的是治疗同种异体移植血管病变。MQDs被发现通过特别减少人类CD4+IFN-gamma+ T淋巴细胞的激活和增强免疫抑制性CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞的增殖来展现免疫调节效应。在一些最近的研究中，使用量子点来追踪体内注射的MSCs的路径。这些材料可以提供荧光分子和有机染料的替代品，因为它们具有光稳定性。 2.6.2.外泌体作为无细胞系统在心脏再生中的应用 最近，外泌体因其包括不会引起由细胞表面标记引起的免疫反应和由于尺寸较小而不限制注射剂量等优点，已成为心脏再生的有希望的无细胞系统。此外，它们可以通过修改其货物来针对特定组织或器官。根据它们的大小，EVs可以分为微泡（100-1000纳米）、凋亡体（50纳米-5微米）或外泌体（30-150纳米）。其中，外泌体是最被研究的EVs之一。据报道，干细胞衍生的外泌体通过旁分泌机制产生与细胞治疗相似的积极结果。外泌体包含核酸、蛋白质、脂质和其他几个因素，据报道在包括房颤、MI和心脏肥大在内的心脏疾病模型中发挥积极作用。此外，通过作为重要miRNAs的载体，外泌体可以调节炎症和凋亡，从而减少纤维化和炎症标记物的表达并改善心脏功能。在Shao等人的研究中，表明MSC衍生外泌体（MSCs-Ex）的miRNA序列谱与MSCs相似，表明外泌体可能是MSCs积极效应的可能原因。Zhang等人表明，缺氧预处理的BM-MSCs分泌的外泌体过表达miRNA-24抑制了大鼠CMs的死亡。Cheng等人进行的一项研究说明了过表达HIF1α的EVs对大鼠CMs的影响。通过旁分泌信号，这些外泌体在缺氧条件下减少了瘢痕并增加了CMs的存活。特别是对于多能干细胞，外泌体可以防止畸胎瘤形成的风险，如Adamiak等人所示。作者比较了iPSCs和iPSC-EVs在MI模型中的效果。尽管两组对心脏组织都显示出类似的积极效果，但iPSC组显示出心脏肿瘤，这在iPSC-EV治疗的动物中是不存在的。与MSCs类似，根据一项在多能细胞中进行的研究，iPSC衍生的CMs（iPSC-CMs Ex）的外泌体被报告具有与iPSC-CMs相似的miRNA谱。iPSC-CM Ex组在治疗后显示出减少的凋亡和心脏纤维化以及改善的心脏功能。这项研究作为外泌体潜在靶转录本的重要来源，从而确定可能增强其治疗效果的合适货物。同样值得注意的是，iPSC-CMs-EVs也被证明在猪模型中改善了壁厚、减少了心脏肥大，并促进了血管生成，没有任何与纤维组织形成和不需要的重塑相关的安全问题。目前，一项临床试验（NCT03384433）正在进行中，旨在检查含有miR-124的异体MSCs-Ex对急性缺血性中风患者的影响。该研究将使用修改后的排名量表，在1年期间评估这些外泌体的安全性。 另一种有前景的方法包括应用模仿外泌体的纳米颗粒来靶向心肌梗死（MI）。由Yao等人进行的一项研究表明，使用模仿外泌体的纳米复合物是可能的，特别是覆盖有间充质干细胞（MSC）膜的介孔硅纳米颗粒。膜涂层是一种对免疫系统的伪装策略，因为纳米颗粒能够有效地到达目标区域，并减少沿途与其他环境的相互作用。这种纳米复合物还包括了miRNA，特别是miR-21，这是外泌体的一个重要部分。已经显示它能促进梗死心肌的再生并减少心肌细胞（CM）凋亡。纳米颗粒在心脏修复中的潜在应用至关重要，因为这种技术侵入性较小，并且可以改善递送效果。 2.6.3.遗传操作干细胞 迄今为止，已有无数的基因修饰疗法被研究，目的是将干细胞疗法带入患者护理环境。这些遗传修饰可以增强细胞存活，改善干细胞向心脏特异性分化，改善旁分泌因子的分泌，或减少移植干细胞产生的免疫反应。用慢病毒颗粒处理的AD-MSCs，以增强IFG-1的分泌，与未转导的AD-MSCs相比，显示出改善的心脏功能。IGF1+ AD-MSCs还显示出增强的VEGF和HGF分泌。此外，Li等人表明，当MSCs经过遗传操作以增加IGF-1的表达，并在猪模型中用5-氮胞苷（5-AZA）处理时，它们比单独用5-AZA处理的细胞更倾向于分化为类似CM的细胞。另一种增加MSCs迁移和存活的策略是遗传工程它们过表达基质衍生因子-1，这是在细胞迁移中起作用的最常见的趋化因子之一。此外，遗传修饰MSCs过表达免疫抑制因子如环氧合酶2被报道可以提高它们在缺血性大鼠心脏中的存活率。MHC-II和人类白细胞抗原（HLA）是干细胞移植后产生免疫反应的主要因素。因此，一些研究专注于防止MHC-II的上调，以防止MSCs产生免疫反应。另一组研究人员将PSCs工程化以在B2M位点表达HLA-E基因，而没有HLA-A、B或C的表面表达，使它们对自然杀伤细胞裂解有抵抗力，并且不被CD8+ T细胞识别。Liang等人研究了MSCs中ERBB4的上调是否在增加小鼠MI模型中的心脏保护作用。ERBB4过表达减少了凋亡，加速了CM分裂，并减小了梗死面积。此外，它还促进了细胞迁移，并使MSCs对心脏环境中的缺氧和低糖条件产生抵抗力。因此，可以合理地宣称，过表达ERBB4的MSCs具有显著的心脏保护益处。 3.结论 干细胞疗法有潜力为心脏病患者提供长期的改善前景。干细胞表现出旁分泌效应，以抑制缺血性心脏中的免疫反应，有利于逆转重构。多项研究的结果支持它们在改善心脏功能、减少心脏纤维化、预防CM死亡和促进缺血后心肌血管再生方面的作用。然而，干细胞领域在细胞培养技术和细胞表征方面缺乏标准化，这可能是导致临床结果变化的因素。这可以通过为所有实验室定义标准操作协议来解决。干细胞还面临宿主免疫排斥和移植后迁移到不需要的组织的问题。然而，使用合成生物材料直接注射到心肌中和EVs作为其旁分泌因子的载体是细胞疗法的一个可行替代方案。尽管这些策略是可行的，但需要进行更深入的研究来评估它们的疗效和安全性，以便在心脏病患者中进行转化应用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病晚期常见的严重并发症，常导致患者反复住院，严重时可引发感染、坏疽甚至截肢等危及生命的情况。尽管治疗糖尿病足的方法众多，但尚无明确有效的方法降低糖尿病足患者的截肢率。近年来，干细胞疗法在DFU治疗中的理解进展，为其作为一种新型治疗方法提供了可能。随着干细胞疗法研究的深入，干细胞有望成为未来治疗DFU的新方法。其治疗效果主要通过促进血管生成、分泌旁分泌因子、控制炎症、促进胶原沉积和调节免疫等途径实现。尽管许多研究证实了干细胞疗法治疗DFU的有效性，但仍需建立标准化治疗方案。本文综述了干细胞疗法治疗DFU的相关研究，探讨了作用机制、干细胞类型和给药方式。 干细胞微信群 扫描二维码，符合加群要求者， 即可加入干细胞治疗的微信群！ 1.背景 糖尿病（DM）是一个重要的公共卫生问题，是全球最关键的医疗紧急情况之一。由于现代社会生活水平提高、生活和工作压力增大以及人们对糖尿病的忽视，糖尿病的发病率逐渐增加，发病年龄趋于年轻化。糖尿病是一个在大多数国家迅速增长的流行病。DFU是其主要并发症之一，也是导致患者死亡的主要原因之一，全球患病率约为1.8%-6.3%，约20%的患者面临截肢风险。其中，大部分下肢截肢可以追溯到糖尿病足溃疡，约占85%。DFU的成因众多，但成因和机制尚不明确。大多数人认为DFU的发生主要与周围神经病变、血管病变和足部感染有关。DFU伤口愈合缓慢被认为与其血管生成减少、炎症因子浸润和胶原沉积减少有关。与DM共病的周围血管疾病是DFU患者发病和死亡的重要原因。这也是糖尿病被认为是可以影响所有大小和类型血管的疾病的原因。足部感染也是糖尿病足的常见并发症，与创伤的高血糖环境有关。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等细菌感染在DFU中常见，通常需要抗生素治疗和负压手术清创。 目前，西医治疗的主要原则是控制血糖、控制感染、清除坏死组织、减压和高压氧治疗以及恢复血流重建。然而，对于一些远端动脉狭窄和闭塞，无法进行血管介入或血管旁路手术。更何况，由于病情原因，手术治疗也是不可能的。因此，迫切需要开发一种新的DFU治疗方法，以降低其截肢率。 近年来，对DFU管理的新治疗方式兴趣日益增加，包括局部应用生长因子、新型生物敷料的出现以及干细胞疗法的兴起。以前的研究发现，富含血小板衍生生长因子的生长因子可以用来治疗糖尿病足神经病变性溃疡，通过促进细胞聚集、血管生成和细胞增殖来加速修复伤口的肉芽组织生长。通过组织和生物工程开发，许多可以携带药物和生长因子的敷料被发明出来。一些研究表明，自体富含血小板的凝胶可以显著缩短病程，提高DFU的治愈率，并预防感染。普鲁士蓝纳米颗粒（PBNP）是一种具有良好的生物相容性和强大的活性氧清除能力的铁基材料，含有PBNP的敷料可以通过减少活性氧产生和促进血管生成有效促进DFU的愈合。尽管这些发展充满希望，但值得注意的是，国际糖尿病足工作组对广泛使用改变伤口微生态的药物持谨慎态度，如生长因子和自体富含血小板的凝胶，因为缺乏大规模、随机对照试验的确凿证据。单独使用生长因子无法考虑到伤口愈合过程的复杂性。另一方面，干细胞在这一过程中至关重要，干细胞可以通过改善伤口微环境全面调节组织再生。许多研究表明，使用干细胞移植比单独传统疗法更有效。此外，传统治疗方案与干细胞疗法结合治疗DFU的协同效应也有记录，表明改善了结果。尽管许多研究表明干细胞疗法治疗DFU安全有效，但具体机制和治疗方式尚未完全阐明。因此，本综述将描述干细胞疗法治疗DFU在这两部分的研究进展。 2.干细胞疗法治疗糖尿病足的分子机制 2.1.促进血管生成 伤口愈合是一个复杂的过程，尤其是当高血糖环境影响伤口血管生成时。需要多种细胞和细胞因子之间的协同作用以获得最佳结果。其中，血管内皮生长因子（VEGF）尤为重要。尽管出于伦理原因，胚胎干细胞（ESCs）的使用受到限制，但之前的动物研究表明它们可以增加纤维连接蛋白、VEGF和表皮生长因子（EGF）的表达水平。随着干细胞研究的进展，发现多能干细胞（MSCs）可以分化成血管内皮细胞，这是血管生成的关键步骤。它们可以激活特定的信号通路，例如，肝细胞生长因子（HGF）与c-Met受体结合激活包括PI3K/Akt、MAPK和STAT3在内的多个信号通路，这些通路参与VEGF表达的调节。观察到人间充质干细胞（HMSCs）通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的信号通路分泌VEGF和HGF（图1）。MSCs可以系统性调节受损和缺血组织，上调其中的细胞因子和生长因子，改善伤口的微环境，从而促进糖尿病足伤口的愈合。细胞因子和生长因子通过多种机制发挥作用，包括调节免疫细胞活性和改善血管通透性，也作为信号分子。已经证明VEGF刺激创伤情况下局部血小板衍生生长因子B（PDGF-B）和成纤维细胞生长因子2（FGF-2）的上调，促进骨髓来源细胞聚集，促进伤口愈合和组织重塑。其中，内皮祖细胞（EPCs）和成年骨髓来源的造血干细胞（BMHSCs），可以作为红细胞、血小板和白细胞的前体，被引入伤口局部微环境，观察到它们促进愈合过程和组织再生。MALAT1在DFU患者中的表达被发现下调，而microRNA-205-5p被发现是VEGF蛋白翻译的直接调节器，可以抑制VEGF蛋白的翻译，从而阻碍DFU的愈合。尽管MALAT1与microRNA-205-5p存在竞争关系，MSCs通过表达高水平的MALAT1降低microRNA-205-5p的水平，促进VEGF的产生。此外，观察到糖尿病小鼠皮肤中MALAT1水平的升高增强了I型和III型胶原的表达，导致伤口部位胶原沉积增加和伤口愈合加速，而胶原由成纤维细胞分泌。此外，增加伤口局部MALAT1水平可以大大减少炎症并加速愈合。例如，MSCs中MALAT1的过表达诱导M2型巨噬细胞极化，并降低促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平。因此，MSCs可以通过上述途径促进DFU的愈合。ADSCs已成为治疗糖尿病足溃疡的有希望的治疗策略，主要因为它们能够通过表达转录因子Nrf2增强血管生成和内皮祖细胞的增殖。转录因子Nrf2依赖于血红素氧合酶-1（HO-1），其主要作用是促进血管生成和血管生成因子的表达增加。已证明BMMSCs中HO-1的过表达通过Akt信号通路促进BMMSCs增殖并增强BMMSCs分泌VEGF。这一系列事件最终导致伤口溃疡修复的显著改善。MFG-E8对VEGF诱导的AKT磷酸化至关重要，并且在血管周围和血管内都有表达。一项研究已证实BMMSCs可以过表达MFG-E8以增强血管生成，进一步强调干细胞疗法在治疗DFU等慢性伤口中的潜力。在DFU中，c-Jun的表达也减少，发现局部皮下注射过表达c-Jun的HUC-MSCs通过增加PDGFA和HGF水平加速血管生成和再上皮化。激活蛋白1（AP1）代表MAPKs的主要下游效应器之一。c-Jun，AP-1的主要组成部分，是细胞增殖的重要调节器。研究表明，糖尿病慢性溃疡中增加的MMP-2和MMP-9可以通过降解皮肤细胞外基质（ECM）减缓伤口愈合。相比之下，已证明AP-1主要调节糖尿病伤口中MMP-2和MMP-9的转录。MSCs中c-Jun的过表达可能通过下调MMP-2和MMP-9的表达促进伤口修复。 图1 间充质干细胞（MSCs）增强肝细胞生长因子（HGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的机制。 2.2.控制炎症和调节免疫以促进伤口修复 长期炎症可以创造一个低氧环境，并导致血管生成信号的异常产生。移植干细胞的抗炎和免疫调节效应被认为是干细胞疗法恢复效应的潜在机制。免疫系统由轻微炎症调节，这在消除病原体、加速组织修复和维持稳态中起着至关重要的作用。然而，持续和严重的炎症是延迟愈合或不愈合糖尿病足溃疡（DFU）的主要原因。免疫抑制和长期炎症并存并不罕见。严重的免疫反应可能导致严重的全身性炎症或过敏性状况的发展，而免疫反应减弱可能导致严重或复发性感染的发生。因此，需要确保伤口的促炎和抗炎方面处于平衡状态。进行了一项研究，以调查胚胎干细胞提取物在治疗糖尿病足溃疡中的疗效。结果显示，这些提取物的局部应用导致CD45+炎症细胞和干扰素-α（IFN-α）减少，同时调节性T细胞（Tregs）、增殖Ki-67+细胞和内皮细胞标记CD31增加。这表明胚胎干细胞可以通过调节免疫反应促进伤口愈合。先前的研究表明，间充质干细胞（MSCs）可以减少局部促炎反应并抑制CD45表达，展示了MSCs在修复DFU中的抗炎效应。在DFU中观察到CCL2水平降低，其表达增强可以通过血管新生和胶原蛋白积累的正常化来促进伤口愈合。发现局部给药MSCs后CCL2表达显著升高。CCL2受体在巨噬细胞上表达，这些巨噬细胞分泌VEGF和TGF-β，而巨噬细胞水平在DFU中降低。相反，一些研究表明MSCs可以在糖尿病伤口部位增加VEGF和TGF-β水平。因此，局部应用干细胞可能通过增加CCL2促进巨噬细胞聚集和VEGF及TGF-β的生长。转录因子Nrf2直接调节表皮角质形成细胞分泌CCL2。反过来，CCL2可以调节损伤部位巨噬细胞产生的表皮生长因子（EGF），进而刺激角质形成细胞的增殖。因此，推测MSCs可能通过促进角质形成细胞的功能恢复增强CCL2分泌，从而逆转巨噬细胞浸润的减少，并最终促进溃疡修复。此外，高血糖已被证明可以减少内皮祖细胞（EPCs）的数量，损害它们的功能和聚集能力。糖尿病小鼠中CCL2的表达增加进一步促进了EPCs在伤口部位的积累，从而促进新内膜形成。糖尿病中的慢性不愈合伤口以促炎细胞因子的升高为特征，包括IL-1、IFN-γ、TNF-α和IL-6。这些细胞因子主要由活化的巨噬细胞产生，在调节免疫细胞中起着关键作用。局部应用MSCs可能通过分泌IL-10减轻炎症反应。发现与IL-10抗体联合使用胎盘源性间充质干细胞（PMSCs）的治疗显著减缓了DFU的愈合。观察到PMSCs强烈抑制皮肤成纤维细胞中脂多糖（LPS）诱导的NF-kB激活（Varela等人，2019年）。虽然NF-kB在调节IL1、TNF-α和IL-6等促炎细胞因子的产生中起着关键作用，但间充质干细胞（MSCs）通过减少伤口区域促炎细胞因子的释放和促进抗炎细胞因子的产生来促进皮肤伤口愈合。巨噬细胞有多种类型，不同表型具有不同的作用。巨噬细胞可分为两个主要表型：M1和M2。M1巨噬细胞由促炎细胞因子激活。相反，抗炎细胞因子可以诱导巨噬细胞从M1向M2表型转变。研究表明，M2巨噬细胞促进血管生成，减少神经损伤，并抑制炎症，局部应用干细胞到伤口已被证明可以诱导巨噬细胞向抗炎表型（M2）转变。 3.细胞机制 3.1.分化细胞和前胶原沉积 伤口愈合是一个复杂的过程，包括稳态、炎症、增殖和重塑期。在前两个阶段，MSCs促进凝血并控制炎症。在增殖阶段，MSCs也发挥着关键作用。在这个阶段，上皮细胞进行增殖和修复，并合成胶原和其他细胞外基质蛋白。MSCs是具有自我调节和增殖能力的前体细胞。人间充质干细胞（HMSCs）可以积极分化为上皮细胞和内皮细胞，HMSCs与ADSCs共享共同属性，使它们能够发展成为内皮细胞和新血管生成。它们转化为内皮细胞的具体途径尚未完全表征。已经显示，MAPK/ERK信号通路促进VEGF诱导的BM-MSC向内皮细胞分化，而PI3K信号通路调节ADSC向内皮细胞分化。 胶原的产生和分布主要在皮肤的真皮层，由成纤维细胞释放，与皮肤损伤的愈合密切相关。间充质干细胞（MSCs）可能增加胶原的产生，并促进糖尿病足溃疡（DFU）中胶原的形成。糖尿病足伤口中的脂肪源性干细胞（ADSCs）直接转化为成纤维细胞，并显著促进I型胶原和III型胶原的表达。已有研究表明，来自糖尿病足组织的成纤维细胞显示出减少的增殖能力和产生较少的生长因子。人间充质干细胞（HMSCs）可以显著增加糖尿病成纤维细胞的细胞外基质（ECM）产生。因此，MSCs可能通过刺激成纤维细胞增殖和功能恢复来促进肉芽组织生长。这反过来又刺激成纤维细胞释放更多的ECM和生长因子，从而促进组织修复（图2）（表1）。 图2 间充质干细胞（MSCs）在修复糖尿病足溃疡中扮演重要角色。MSCs，指间充质干细胞；IL-1，白介素-1；IL-6，白介素-6；IL-10，白介素-10；TNF-α，肿瘤坏死因子-α；TGF-β，转化生长因子-β；EGF，表皮生长因子；EPCs，内皮祖细胞；ECM，细胞外基质；FGF-2，成纤维细胞生长因子2；PDGF-B，血小板衍生生长因子B；IFN-γ，干扰素-γ；VEGF，血管内皮生长因子。 4.干细胞的分类 4.1.间充质干细胞（MSCs） MSCs广泛存在于广泛分布的结缔组织和器官间质中，可以从骨髓、脂肪、胎盘、脐带和羊水中提取。由于其在人体中含量巨大、易于获取和经济性，它是研究中最常用的干细胞类型。其中，骨髓间充质干细胞（BMMSCs）和脂肪源性间充质干细胞（ADSC）是使用时间最长的干细胞来源。已有研究发现MSCs可以迁移到皮肤的真皮层，并在慢性伤口中经历表型变化或衰老。鉴于骨髓细胞的高度可塑性，推测它们有潜力生成新的皮肤细胞。大量证据表明，BMMSCs的给药可以有效增强伤口愈合，并促进受损皮肤的重建，其对慢性不愈合伤口的治疗是安全有效的，伤口越大，需要的细胞越多。当DFU与下肢缺血结合时，外周血来源的MSCs可以有效促进伤口愈合并降低截肢率。治疗是通过将药物肌肉注射到DFU和下肢缺血病患者的缺血下肢和足部。结果表明，这种干预能够防止足部和下肢截肢，并提高生活质量。此外，该方法可能被认为是治疗下肢缺血病的安全有效方法。相比之下，脂肪源性间充质干细胞（AMSCs）被认为是治疗慢性病的理想细胞治疗方法，因为它们的位置浅表、易于获取、来源丰富，大约是BMSCs免疫抑制活性的三倍，并且由于AMSCs的细胞分裂能力更大。伦理方面更容易通过，因为AMSCs是从自体成人脂肪中获得的。此外，几项研究表明AMSCs能够通过刺激上皮和肉芽组织的形成，通过其抗炎和抗凋亡效应以及促血管生成来促进伤口愈合。然而，自体AMSCs在糖尿病细胞治疗中的应用受到糖尿病效应的限制。因此，在应用之前需要进行干预以增强细胞功能。例如，向AMSCs中添加富含血小板的血浆，将AMSCs嵌入自体富含血小板的纤维蛋白（PRF）中等。人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）是一种具有高分化潜力的祖细胞，可以促进新血管的形成并改善组织再生。此外，其衍生的外泌体稳定且免疫原性低，能够运输具有不同作用的多功能蛋白和生长因子，不仅如此，它还可以调节BMMSCs的增殖和分化。尽管骨髓目前是MSCs的主要来源，但许多研究表明胎盘源性干细胞（PDMSCs）可能是一个更好的选择。它容易获取，可以分离出许多细胞，免疫原性较低，排斥反应较少。此外，PDMSCs可以分化成多种细胞类型。 4.2.单核细胞（MNC） MNC通常分为两个主要来源：骨髓和外周血。这两种类型都具有自我更新、分化和增殖的能力。它们可以在某些条件下进一步区分为特定的细胞类型，如平滑肌细胞和血管内皮细胞，并且也可以分泌细胞因子以促进伤口愈合。一项临床研究证明了自体外周血MNC治疗DFU的安全性和有效性。试验显示，应用自体外周血MSCs显著降低了DFU患者的截肢率。然而，还进行了额外的随机研究，以评估肌肉注射BMMNC和BMMSCs治疗糖尿病临界肢体缺血和足部溃疡患者的慢性伤口的疗效。结果表明，虽然两种方法都减轻了疼痛并改善了踝臂指数（ABI）和经皮氧分压（tcPO2），但灌注BMMNCs在促进伤口愈合和改善灌注方面的效果不如BMMSCs。这一发现也可以解释为什么目前对MSC研究的关注更多。 4.3.胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs） 胚胎干细胞（ESCs）是多能干细胞；它们是从早期发育的囊胚内细胞群或体外受精胚胎中分离出来的。它们具有自我更新能力，能够分化成任何细胞系。已经证明，未分化的ESCs的局部给药可以加速糖尿病小鼠的伤口愈合，促进生长因子的分泌，再上皮化，并加速伤口愈合，其提取物具有抗炎和免疫调节特性。然而，由于其伦理问题以及其过度的增殖和分化能力，可能导致免疫排斥或诱发肿瘤形成。与ESCs类似，iPSCs具有多能性和自我更新能力，以及分化成有机体各种细胞类型的潜力。它们理论上可以从各种成人组织中获得，包括皮肤，因此在伦理上比ESCs争议较小，iPSCs在组织再生和慢性伤口愈合方面比其他干细胞更有优势。iPSC衍生的终末分化细胞可以通过分泌多种生长因子和细胞因子来补偿糖尿病足患者细胞因子的不足水平，从而促进伤口愈合。然而，iPSC在器官三维打印、伤口愈合和血管生成领域的研究仍处于临床前阶段，如果可能用于临床，其安全性需要进一步评估（表2）。 5.给药途径 干细胞治疗可以分为两种主要方法：局部和全身给药。文献综述表明，这两种途径都促进了糖尿病足溃疡（DFU）的愈合。通常，局部注射是最常见的细胞递送方法。在临床研究中，肌肉内注射是最常用的，而在临床前研究中，皮内和皮下注射是最普遍的。与静脉给药相比，局部注射减少了干细胞进行趋化和归巢到目标器官的联系，有效地增加了目标器官中干细胞的浓度。这种方法还可以通过刺激细胞外基质的分泌和组织的再生来加速愈合过程和改善移植物存活。在全身途径中，干细胞可以通过动脉或静脉给药。已经表明，这种方法具有免疫调节作用，并且可以调节血糖。然而，血管内给药增加了微血栓形成的风险，可能与给药剂量有关。与局部注射和静脉治疗相比，药物的局部伤口应用具有更好的安全档案，更直接和方便。将干细胞制剂局部应用于伤口，并与增强干细胞活性和更好地控制细胞间距的新载体相结合，是DFU治疗的新方向。大量研究证实，局部给药不仅更安全，而且比全身给药更有效。 6.讨论和结论 总结研究结果表明，干细胞在DFU治疗中具有光明的应用前景。它们主要通过促进血管生成、分泌生长因子、刺激血管分化、抑制炎症、促进胶原沉积和免疫调节发挥作用。已经显示，干细胞在糖尿病伤口愈合和降低截肢率方面是有效的。然而，大多数当前的研究都是临床前的，未来需要进行大规模样本的临床随机对照研究来验证它们的疗效。特别是，应该探索不同干细胞的比较疗效、给药途径和给药剂量，以找到标准化的治疗方案。此外，尽管干细胞的疗效令人兴奋，但与之相关的许多风险。例如，首先，免疫排斥，尽管可以通过免疫抑制治疗减少排斥，但相应增加了感染风险；其次，肿瘤形成的风险，干细胞的无控制增殖调节和免疫调节促进肿瘤形成，它们分泌的多种生长因子促进新生血管生成和免疫调节促进肿瘤发生。此外，还需要制定适当的干细胞生产诊断和治疗标准以及法律法规，以确保临床可行性。糖尿病足溃疡可以通过多种方式治疗，综合治疗在糖尿病足的治疗中更有效。例如，为了提高干细胞移植的存活率，可以进行缺氧预处理，并使用干细胞支架复合物，结合PRP和生物材料更有利于糖尿病足溃疡伤口的愈合。总之，干细胞治疗糖尿病足具有光明的未来，但需要更有效的制剂方法，并且需要进一步的研究来确定治疗所需的最佳干细胞类型、其安全性、适当剂量和最有效的给药途径。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 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