Yellow Fever

疫苗一词是“疫苗之父”巴斯德( Louis Pasteur) 为纪念先驱者琴纳( Edward Jenner) 发明牛痘苗( vaccine) 而创造，指由减毒或灭活微生物制成、能够针对疾病产生免疫力的生物制品。疫苗作为人类与疾病斗争的有力武器，消灭或控制了许多传染病。脊髓灰质炎、鼠疫、麻疹、狂犬病、百日咳、破伤风、乙型病毒性肝炎(乙肝) 等发病率也通过接种疫苗大幅降低。自 18 世纪天花疫苗诞生至今，疫苗研发经历了数百年的发展其技术发展经历了 3 次革命。第一次始于 19 世纪末，巴斯德研制成功鸡霍乱疫苗、羊炭疽疫苗和狂犬疫苗，并利用生物传代和物理化学方法处理病原体，得到减毒和灭活疫苗; 第二次发生在 20 世纪 80 年代，其标志是以酵母制造乙肝疫苗。这一阶段，以重组 DNA 技术为代表的分子生物学技术的发展，使疫苗的研究从整体病原体水平进阶到分子水平; 第三次是 20 世纪 90 年代研制成功核酸疫苗，该技术最早由美国的沃夫( Wolff) 等发明。人类使用疫苗预防疾病已有200多年的历史，疫苗作为人类与疾病斗争的有力武器，消灭或控制了许多传染病。今天我们就来回顾一下，疫苗经历了怎样的发展轨迹？疫苗发展历程梳理一、萌芽期疫苗的横空出世首先得从天花病毒说起。天花是一种烈性传染病，不论什么人，一旦与患者接触，几乎都会传染，并且死亡率极高。但是在长时间的医疗中发现，有两种人是对天花有抵抗力的：一是从天花中康复的人，二是曾经护理过天花病的人。我们的前人在这种现象的启发下，研究出了用人痘接种预防天花的方法。该方法是将沾有疤浆患者的衣服给正常儿童穿戴，或将天花愈合后局部皮肤组织研磨成细粉，经鼻使儿童吸入。我们的前人在这种现象的启发下，研究出了用人痘接种预防天花的方法。该方法是将沾有疤浆患者的衣服给正常儿童穿戴，或将天花愈合后局部皮肤组织研磨成细粉，经鼻使儿童吸入。不过因为风险太大，这个技术一直没有推广开来，但这个技术的发展却给了人们很大的启发，让他们找到了对抗天花的方法。在18世纪末，一名英国的乡下大夫爱德华-琴纳接待一名妇女，她患有发烧、腰疼、呕吐等症状，他从中意识到接种牛痘可以预防天花。为了证实这一设想，他于1796年5月14日从一名正患牛痘的挤奶女工身上的脓疤里取少量脓液注射至八岁男孩詹姆斯费普臂内。六周后，男孩的牛痘反应消退，所以正如琴纳所说：“尽管假性天花接种小孩手臂出现类似的脓疤，除此之外几乎不可觉察。”琴纳为了证实其效果，先后多次给费普接种，但费普却安然无恙。2个月后，再接种天花患者来源的痘液，费普仅局部手臂出现疤疹，未引起全身天花。据此，琴纳于1798年出版其专著《探究》，称此技术为疫苗接种。在琴纳那个时代，人们根本不知道天花是由一种病毒引起的，也不知道种痘能让身体产生一种对抗天花的免疫。但是，经过他的实际观察，经过试验，确定了一种新的疫苗接种法，它不仅安全，而且很有效，是一个划时代的发明。琴纳（公元1749年—公元1823年）二、第一次疫苗革命这一阶段疫苗的发展归功于路易·巴斯德于19世纪末在疫苗研制领域的先锋作用和卓越贡献。被誉为疫苗之父的巴斯德的伟大贡献在于：他选用免疫原性强的病原微生物经培养，用物理或化学方法将其灭活后，再经纯化制成。灭活疫苗使用的毒种一般是强毒株，但使用减毒的弱毒株也有良好的免疫原性，如用萨宾减毒株生产的脊髓灰质炎灭活疫苗。减毒活疫苗是采用人工定向变异的方法，或从自然界筛选出毒力高度减弱或基本无毒的活的微生物制成疫苗，并以此给人接种而达到预防传染病的目的。在19世纪末，科赫发明了在固体培养基上分离细菌培养物的方法，该法为巴斯德研制疫苗奠定了基础。巴斯德首次发现，长期在人工培养基上，如将鸡霍乱弧菌置于两个星期后，这种菌种对雏鸡不会造成致病性。还有一点很重要：即使再次给这些被注射过的雏鸡注射了霍乱，他们也不会感染。巴斯德提出，这可能是因为在老的培养基中，鸡霍乱弧菌的毒性降低，但是其免疫原性保持不变，从而导致雏鸡对霍乱弧菌有了免疫力。以此理论巴斯德将炭疽杆菌在42~43℃的环境下培养两周后，制成人工减毒炭疽活疫苗。在巴斯德光辉成就的启发下，1908年卡麦特和古林将一株牛型结核杆菌在含有胆汁的培养基上连续培养13年213代，终于在1921获得减毒的卡介苗(BCG)。最初卡介苗为口服，20世纪20年代末改为皮内注射，卡介苗在新生儿抵御粟粒性肺结核和结核性脑膜炎方面具有很好的效果。自1928年至今，卡介苗仍在全世界广泛地被用于儿童计划免疫接种，已有40多亿人接种过卡介苗。这一阶段疫苗革命中还包括白喉、破伤风类毒素、鼠疫疫苗、伤寒疫苗和黄热病等30多种疫苗的成功研制。巴斯德三、第二次疫苗革命第二次疫苗革命主要是从分子水平上制备基因工程亚单位疫苗。由于分子生物技术、生物化学、遗传学和免疫学的迅速发展，使得研制新疫苗和改进旧疫苗的工作能 够在分子水平上进行。以酵母制备乙肝疫苗作为二次疫苗革命的分水岭。采用重组DNA技术、蛋白质化学技术开创了疫苗研制的第二次革命。1.重组核酸技术美国斯坦福大学于1972年提出重组核酸技术，并以迅雷不及掩耳之势风靡世界，开创了生命科学的新局面，其中包括疫苗的研制。基因重组技术的运用，为疫苗的研发提供了一条崭新的道路。该技术不仅可以获得几乎所有的免疫原，还可以让病原微生物的研究者和疫苗的接种者变得更加安全。例如，乙肝疫苗最初是从人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者血浆中提取，对健康人来说，其接种的危险性显而易见。20世纪80年代，又有研究报道了 HBsAg的基因在酵母和真核细胞中的表达，该方法既可获得类似于血液疫苗的免疫效果，又可获得简单、快速、廉价、高效的 HBsAg的抗体，对接种人群具有较高的安全性。当前，在不改变疫苗抗原性的前提下，利用重组核酸技术，以病毒、细菌作为载体，将目标基因导入到疫苗菌株及其质粒的基因组中，从而在不改变其抗原性的情况下，实现对疫苗菌株的高表达。所以，该疫苗对人体所起到的免疫作用是双向的。例如，第一次疫苗革命产生的卡介苗，现在采用重组核酸技术将γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)等细胞因子基因导入卡介苗中，成为重组卡介苗(γBCG)。重组卡介苗不仅保留传统卡介苗的特性，同时还分泌γ-干扰素和白细胞介素2，这样重组卡介苗既可用于结核病的预防，又能用于肿瘤或其他免疫性疾病的治疗。2.蛋白质化学和化学技术由于疫苗中的保护性抗原大部分为蛋白质，所以要得到特异性的蛋白质抗原，必须先对其进行分离纯化，由此可见蛋白质化学技术的发展对疫苗的研制起着重大作用。另外，可根据骨髓依赖性(B)淋巴细胞表位或胸腺依赖性(T)淋巴细胞表位直接采用蛋白质化学和化学技术合成多肤抗原，用来制备多肤疫苗。四、第三次疫苗革命核酸疫苗的开发研制，标志着第三次疫苗革命的到来。1995年美国纽约科学院召开专门研讨核酸疫苗会议，称之为疫苗学的新纪元和疫苗的第三次革命。1.核酸疫苗的发现和研制沃夫等人偶然的研究成果以及阿瑟的基因递送体系，为发展新型核酸疫苗奠定了基础。20世纪80年代后期，90年代初期，人们利用表达基因的核酸进行基因疗法，发现不经任何处理的裸露基因，可以在肌肉细胞内表达蛋白质，并且可以在肌肉细胞内持续两个月，引起人体产生免疫反应，由此引发了一场核酸疫苗的研发。在最初的动物实验中有两个令人欣喜的结果:第一是A型流感病毒核酸疫苗注射给小鼠，结果诱发了小鼠产生抗体和细胞毒性T细胞。然后用A型流感(PR/8) 攻击，100%小鼠健康存活，而对照组100%在9天后死亡。几乎同时，费南(Fynan)等人使用基因枪和编码红细胞凝集素的核酸，其结果也使小鼠获得 保护性免疫应答。另一个重要的研究结果是乙肝表面抗原的核酸疫苗。该疫苗不但能诱导动物产生相应的抗体，还能让转基因动物体内的 HBV表面抗原呈阴性。因此，可以用核酸疫苗来预防和治疗疾病，特别是对乙型肝炎的核酸疫苗。该结果对目前国内乙型肝炎疫苗的研发具有一定的指导意义。2.核酸疫苗的应用前景核酸疫苗的研究进展令人鼓舞，核酸疫苗因其独特的优势，在免疫防治中发挥了重要作用。因此，自1994年以来，美国 FDA先后批准了包括 AIDS，流感，乙肝，单纯疤疹，疟疾，Cancer在内的几种核酸疫苗的临床试验。欧美各国都投入了大量的人力物力，对核酸疫苗进行了研发。核酸疫苗已用于淋巴瘤、黑色素瘤、结肠癌及前列腺癌的临床前治疗研究。据统计，1989年至2004年，全球得到认可的基因治疗临床试验共9987例，仅肿瘤治疗占66%。然而，由于其高致死率，迄今尚无针对肝癌 DNA疫苗进行临床研究的相关报道。因此，开展肝癌核酸疫苗临床应用的研究具有重要意义。核酸疫苗也被广泛应用于基因缺陷导致的免疫缺陷疾病的治疗，其中以 ADA基因为代表的基因治疗是目前最有效的一种。mRNA 疫苗技术在新冠疫情应对中市场前景得到较大提升。2020年是 mRNA 技术平台的突破元年，新冠 mRNA 疫苗的推出和广泛使用极大提升了mRNA 疫苗的融资和市场活力。目前开发中的 mRNA 制剂有3个主要应用：预防性疫苗、治疗性疫苗和治疗药物。复星与拜恩泰科研发的mRNA新冠疫苗样品人类在200多年前就开始应用疫苗，它为我们构筑了一道强有力的生物屏障，使我们免受病毒的攻击。在这次疫情之后，疫苗是人类的“保护神”，这一点是毋庸置疑的。随着技术的进步，经过科学家们的不懈努力，将会有更多的治疗性和预防性疫苗被研制出来。疫苗对于人体的作用，无论怎样夸张也不为过，因为每一种新型疫苗的出现，都代表着一场人类对某种疾病的胜利！参考：[1]许丽丽,陈艳,陈征宇等.疫苗的发展与创新：从天花疫苗到新型冠状病毒疫苗[J].医药导报,2021,40(07):876-881.[2]贾冰冰,李卫国.疫苗技术发展的历史与展望[J].生物学通报,2016,51(06):1-3.[3]https://www.nobelprize.org/prizes/lists/all-nobel-prizes/[4]https://www.nature.com/immersive/d42859-020-00005-8/index.html识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

随着全球出生率的低迷、人口老龄化的加剧，以及疫苗新技术的应用，成人疫苗市场越来越被业内看好。近日Nature子刊npj vaccines发表了一篇关于对未来成人疫苗格局及挑战的研究，研究以美国市场为主要研究对象，采用定性和定量法对美国的关键行业利益相关者、免疫工作者和成人消费者进行调查，以衡量成人疫苗市场未来容量和挑战。01  |mRNA技术或将颠覆疫苗研发格局新冠大流行这场全球卫生危机暴露了全球成人疫苗产品布局的短板，但也刺激了疫苗创新，制药行业的领导者将成人疫苗行业内的挑战视为变革的催化剂——一预计未来10年成人疫苗市场可能会推出100多种针对新适应症的疫苗产品。成人疫苗的持续和加速转型预计将由RNA技术的崛起推动，将我们带入到数字疫苗的新时代。与传统的生物制品相比，基于RNA的解决方案不受不同抗原序列生产过程的限制，生产过程基本保持不变，只是RNA疫苗中编码的抗原序列有所变化——这是对“过程即产品”的传统疫苗研发原则的背离，也是未来疫苗设计和开发的一大飞跃。02    |儿童 VS.成人疫苗市场的此消彼长既往儿童疫苗的研发次序和上市应用数量都优于成人疫苗，这种偏见的形成主要是由于二战后医疗保健的改善和婴儿潮的出现导致青少年人口激增，迫切需要更多儿童疫苗来改善人口增长。中国也曾经面临着出生人口快速上升的情况，推动国家免疫规划和儿童疫苗的快速发展。同时，儿童、青少年群体对常见传染病（如麻疹、腮腺炎和风疹）的易感性也需要一个强有力的儿童免疫计划，儿童群体的同质性和他们与医疗保健系统的频繁互动，推动确定性的免疫程序推荐表的出现，这些因素共同促成了美国学龄儿童高达90%的疫苗接种率。相比之下，成人疫苗常常面临诸如认知不足、可及性差、疫苗价格通常较贵、疫苗犹豫等挑战，导致疫苗接种率仅在20-62%之间。然而最近的柳叶刀子刊指出，全球正经历着生育率低潮期，人口老龄化快速发展，似乎儿童疫苗研发优先的情况将成为历史。尽管挑战重重，成人疫苗市场仍然正经历着快速扩张——预计将有各种产品针对流感、肺炎球菌病、带状疱疹、肝炎和HPV等疾病。成人疫苗市场在2022年估值为194.8亿美元，预计到2028年将达到276.5亿美元，年复合增长率约6.1%，其增长驱动受到成人VPDs（疫苗可预防疾病）流行率的增加、RNA疫苗等技术进步以及对预防性医疗保健关注度的提高。03    |疫苗产品将扩展到4个疾病类别目前有35种产品用于预防13个疾病领域，未来10年的疫苗产品预计将增加3倍旨在保护40个不同的疾病领域。目前的疫苗主要分为两个疾病类别：那些针对众所周知的疾病，如流感、肺炎、带状疱疹和COVID-19等，以及那些为旅行或地方性疾病设计的疫苗，如乙肝、埃博拉、黄热病、蜱传脑炎和日本脑炎等。展望未来，预期这些类别将扩展到包括医院医疗场所应用的疫苗以应对在医疗环境中获得的感染，如艰难梭菌（C. diff）和金黄色葡萄球菌（Staph A）。以及针对高需求但未满足疾病预防的疫苗，如人类免疫缺陷病毒（HIV），可能在未来10年内将进入成人疫苗市场。此外，因为成年群体的免疫反应存在差异，为获得最佳保护效果，未来的疫苗可能需要针对不同的风险群体进行定制。尤其是对于老年人来说，他们通常由于免疫衰老而表现出较弱的免疫反应，因此老年人的疫苗可能需要更高的剂量或专利佐剂来弥补这一缺陷。比如赛诺菲巴斯德针对老年人设计的高剂量重组流感疫苗，GSK的佐剂RSV疫苗。不同年龄组流行的疾病可能由同一病原体的不同菌株/血清型导致，这就需要疫苗研发时考虑如何平衡某些年龄组的优先次序。比如肺炎球菌疾病，不同年龄组之间最重要的血清型各不相同，因此疫苗制造商可能更愿意在研发疫苗时优先考虑那些与儿科人群最相关的血清型。04    |全球成人疫苗竞争格局进一步加剧除了疫苗产品的扩展，预计全球疫苗市场竞争将加剧，尽管疫苗领域内的四位历史领导者——葛兰素史克、默克、辉瑞和赛诺菲正在取得重大进展，但COVID-19大流行可能已经重新洗牌了成人疫苗市场，该市场已成为制药行业中最具竞争力的空间之一。新的参与者带来了差异化的技术平台（如Moderna的mRNA产品组合和Dynavax的佐剂产品，后者主要是重组佐剂乙肝成人疫苗），以及低利润、大供应量的全球参与者（如印度血清研究所、巴拉特生物技术公司和中国科兴）带来的市场压力。此外，由于单个最佳产品可能不足以占领市场，疫苗制造商预计将采取差异化的产品组合策略，而非单个产品来区分自己。比如GSK的带状疱疹疫苗和RSV疫苗，都用于老年群体预防。随着越来越多的成人疫苗进入市场，成人疫苗推荐免疫程序表预计将在未来10年内得到大幅扩展。目前美国的免疫实践咨询委员会（ACIP）成人疫苗免疫程序推荐表建议≥18岁者接种流感和COVID-19疫苗，50岁及以上的成人接种带状疱疹疫苗，65岁及以上的人接种肺炎球菌疫苗。此外，对于免疫系统受损的18岁及以上的成人，也推荐这两种疫苗，65岁以下的人建议接种乙肝疫苗。最近，两种新的RSV疫苗已获批准，根据SCDM指和ACIP建议，为60岁及以上的成人接种。展望未来10年，预计大多数新疫苗将专门针对某些高风险群体开发，而不考虑他们的年龄。例如，可能会建议65岁及以上的住院或长期护理设施的人接种艰难梭菌疫苗。此外也预计COVID-19和RSV疫苗将像流感疫苗一样发展为季节性疫苗——这意味着成人可能要被建议在一个季度内接种完这些疫苗，这种潜在现象称之为强制季节性免疫，然而这需要实施联合接种的策略以提高接种率。05    |成人疫苗市场扩大对接种门诊的挑战虽然目前强制季节性免疫尚未给预防接种基础设施带来负担，但随着成人疫苗市场的增长，有限的时间内需要努力适应更多新的受种群体和新的疫苗，未来可能给预防接种基础设施带来负担。如果保持当前疫苗接种率不变（当前每年约接种2亿剂次），到2032年美国成人疫苗的全年接种量就将超过5亿剂。假设实施强制季节性免疫并且保持美国当前的疫苗接种趋势和行为，我们会发现——美国将需要在三个月的时间内使用掉相当于目前全球流感疫苗市场的全年接种量，这对当前美国的免疫生产力是一个巨大的挑战。在2022-2023年的流感疫苗季，根据CDC的Flu VaxView统计，9-12月份接种了整个流感季总数的76%（1.73亿剂次）。根据同一数据库，在2021-2022流感季结束时，65岁及以上接种疫苗的人中约有85%的人在11月底之前接种了流感疫苗——相当于每天接种110万剂。从目前的接种量来看，9-12月底将需要每天接种190万剂（每周1310万剂），这一数字甚至显著高于COVID-19疫苗接种高峰时期的每天接种的40万剂（每周310万剂），到2032年可能会增加到每天440万剂（每周3070万剂）。为了满足到2032年超过5亿剂疫苗的预期年度量，我们将不得不采取方法来显著提高疫苗接种效率。将接种窗口向前推移是一个解决方案，但实际上这种方法可能受到公众接种习惯的影响，因为公众通常更喜欢在9-12月份开始接种。这就需要扩大接种服务的获取途径、提高公众意识和教育，并实施有针对性的干预措施以推动行为改变。06    |药房对成人疫苗应用的关键作用通过访谈和调查成人疫苗市场的关键利益相关者，结果发现许多利益相关者可能没有充分意识到即将到来的成人疫苗浪潮。免疫工作者和消费者反而更关注这种即将到来的变化，但目前缺乏主动性。成人疫苗市场也出现了向新参与者转移的趋势，例如药房作为替代初级保健办公室的接种服务单位，便利性更高（营业时间更长、地点更近），目前在美国很流行并且这一趋势预期还将持续数十年。事实上美国的保健医生和药剂师之间通常存在一定程度的不和，医生通常不愿意授予药剂师为他们的患者接种疫苗或提供有关药物建议的权力。历史上，成人疫苗通过初级保健办公室、药房和疫苗诊所等提供疫苗接种，但既往模式下初级保健医生更倾向于优先考虑儿童免疫。此外，美国许多医疗保健专业人员在公众常规就诊时不会检查他们的疫苗接种情况，甚至把疫苗接种管理排除在他们的医疗实践范围之外，这可能限制了依赖于初级保健医生的成人获得免疫接种的机会。中国的免疫服务大多是基于国家基本公共卫生服务的预防接种，初级保健医生也更愿意为0-6岁儿童服务。在HPV疫苗的推广中，私立门诊或妇科门诊发挥了重大作用，但数量和便利性依旧不足。07    |疫苗接种的限制——“胳膊之战”所有年龄和风险组的消费者在接受调查时称，他们愿意每年接受4次疫苗接种，但更愿意将注射次数限制在每次预约只接种2剂，也就是每只胳膊只打一针，这显然低于接种工作者的预估。也意味着需要在一年内进行多次预约，以达到他们每年接受4次疫苗接种的意愿。该研究中公众和接种工作者可能高估了预约接种次数，2018年的调查数据显示，平均而言，所有年龄组群体与医生进行的预防性医疗服务的预约每年不足1次，而该研究的意愿是至少每年2次。美国的联合接种策略似乎也没有想象中的那么好推荐——在衡量公众对未来接种疫苗剂次的安排时，33%的消费者仍然表示愿意在每次预约中接受多种疫苗，但28%的人表示强烈偏好于安排更多的接种预约，而不是在单次预约中采取联合接种策略，51%的人群强烈同意每年进行多次预约以便接种更多疫苗。目前，50岁和65岁的成年人在一次访问中最多分别接种2.8种、3.5种ACIP推荐的疫苗。估计10年内，50岁和65岁成年人的推荐剂量数量预计将分别增加到每年5.6个和6.4个。随着可用疫苗数量的增加，接种工作者将帮助公众在疫苗的优先级和管理方面做出复杂的决定，医生的建议已被证明可以提高免疫接种率，它可以增加消费者对可用疫苗的知识。此外，开发适用于成人的联合疫苗也是一种缓解“胳膊”受限问题的方案。目前美国只有一种成人百白破疫苗是联合疫苗，但预计未来将有更多疫苗，包括流感&新冠联合疫苗、流感&RSV联合疫苗等。然而这些解决方案能否成功取决于公众的接受程度，随着疫苗接种犹豫程度的增加，公众接受度预计将成为成人疫苗接种的一个主要障碍。08   |总 结中国的成人疫苗市场无论是研发、销售还是公众观念，均远远落后于美国。全文研究的为未来十年美国的成人疫苗市场状况，对于中国来说以上预测或预期事件可能发生在未来10年以后，但一些迹象已经出现。无论如何，美国作为国际市场的风向标，已经给我们规划了未来方向——随着我国出生率持续低迷，儿童疫苗市场已经处于需求相对过剩状态，尽管有新的儿童疫苗上市，但也很难插入到原有拥挤的接种程序里。成人疫苗市场已经开始被市场所看好和布局，但市场的培育需要时间，预防接种服务模式、支付模式、医防融合等方面也都需要进行“腾笼换鸟”式的改革。内容出处：NPJ Vaccines. 2024 Feb 9;9(1):27. doi: 10.1038/s41541-024-00809-z.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

基于细胞培养的载体疫苗和病毒治疗药物的生产越来越受到人们的关注。所使用的载体不仅截留了感染细胞的能力，而且还诱导了强大的免疫反应。使用两种基于重组水泡性口炎病毒（rVSV）的构建体，我们对集成的封闭式一次性灌流系统进行了概念验证研究，该系统允许连续的病毒收获和澄清。使用悬浮 BHK-21 细胞以及水疱性口炎病毒和新城疫病毒 (rVSV-NDV) 的融合溶瘤杂交体，利用改良的交替切向流装置 (mATF) 或切向流深层过滤 (TFDF) 系统进行细胞截留。由于前者的中空纤维具有较大的内腔（0.75 mm；孔径0.65μm），因此可以防止感染过程中形成的多核合胞体造成的膜阻塞。然而，病毒颗粒被完全截留。相比之下，TFDF过滤单元（内径3.15 mm，孔径2-5μm）不仅可以实现高活细胞密度（VCC，16.4-20.6×10 ^6 cells/mL），而且可以连续收获和澄清载体。与优化的批次工艺相比，在澄清的滤液中获得了高11倍的传染性病毒滴度（最大7.5×10 9 TCID 50 /mL）。使用HEK293-SF细胞和表达绿色荧光蛋白的rVSV载体，灌流培养实现的最高VCC为11.3×10 ^6 cells/mL，滤液中感染性病毒滴度高达7.1×10 10 TCID 50 /mL。不仅可以连续收获，还可以进行澄清。虽然单位细胞病毒产量相对于作为对照的批次工艺有所下降，但获得了增加的时-空产量。关键点•使用 TFDF 灌流系统生产病毒载体使时-空产量提高 460%•使用 TFDF 系统可以连续收获和澄清病毒•TFDF 灌流系统在建立强化载体生产方面具有巨大潜力在对抗传染病的不懈追求中，在细胞培养中生产的重组载体疫苗在过去十年中受到了欢迎。与其它疫苗平台相比，基于病毒载体的疫苗保留了感染细胞的能力，从而通过增加体液和细胞免疫来诱导强大的免疫反应。基于腺病毒载体的SARS-CoV-2 疫苗成功大规模应用及其针对多种传染病的潜在应用，推动了开发新型重组载体疫苗以及改进当前生产工艺的巨大研究努力（到 2023 年将占全球疫苗研发领域的 14%）。其中一种载体基于重组水泡性口炎病毒（rVSV）。由于其广泛的向性、高滴度的快速复制动力学、低病毒致病性、人类中罕见的预先存在的抗载体免疫力以及易于基因操作，rVSV 在疫苗和溶瘤应用中受到欢迎。将 rVSV 的天然糖蛋白替换为任何目的糖蛋白，可以递送外源抗原，从而为疫苗应用引发强大的体液和细胞免疫，同时降低与生产相关的生物安全标准（例如，针对高致病性病毒）。使用 rVSV 生产平台生产的各种候选疫苗已显示出对埃博拉病毒、SARS-CoV-2、马尔堡病毒、拉沙病毒、安第斯病毒、乙型肝炎病毒、鼠疫耶尔森氏菌、呼吸道合胞病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、尼帕病毒、寨卡病毒、人乳头瘤病毒、动物模型中的流感病毒的预防效果；有些正在临床试验中进行测试。尽管预防功效得到充分证明，但目前只有一种基于 VSV 的扎伊尔埃博拉病毒疫苗 (rVSV-ZEBOV) 于 2019 年获得 FDA 和 EMA 批准。rVSV 作为溶瘤药物的使用特别令人感兴趣，因为其高致细胞病变性、快速复制周期、不整合到宿主基因组中、IFN 敏感性、选择性感染和有效诱导肿瘤细胞凋亡，满足病毒疗法的所有关键特征。进一步的基因修饰方法，例如用异源融合糖蛋白假型化先天糖蛋白，生成可以递送基于融合的病毒繁殖的嵌合构建体，进一步增强基于 rVSV 的构建体的溶瘤能力。一种基于 rVSV 的新型构建体含有新城疫病毒 (NDV) 的融合突变蛋白，并在各种肿瘤模型中显示出有希望的临床前功效。为了满足前所未有的需求以及许多基于 rVSV 的疗法所需的高输入剂量，需要强化当前基于批次的生产策略。与传统的贴壁生产相比，在化学成分确定的培养基中使用悬浮细胞系可以设计更容易规模放大的工艺，以获得更高的细胞密度和更小的占地面积。通过建立灌流培养，用新鲜培养基不断更换营养耗尽的培养基，同时使用细胞截留装置将细胞截留在生物反应器中，甚至可以获得更高的细胞密度。灌流模式下的工艺强化可提高病毒滴度、单位细胞病毒产量 (CSVY)、时-空产量 (STY) 和单位体积病毒生产率 (VVP)，已针对不同病毒和载体（例如寨卡病毒、甲型流感病毒（IAV）、慢病毒载体（LV）、腺相关病毒（AAV）、rVSV-COV-2、改良安卡拉痘苗病毒）进行了详细阐述。然而，通过瞄准更高的细胞密度，CSVY可能会降低（高细胞密度效应），从而降低STY和VVP。对于高细胞密度培养，广泛采用基于膜的系统，即交替切向流（ATF）和切向流过滤（TFF）组件。这些系统的一个主要缺点是过滤器污染的风险（尽管 ATF 具有自清洁反冲功能）和病毒颗粒截留，这会导致病毒在细胞环境中的生物反应器内积聚，直到完全收获生物反应器培养液。由于病毒释放通常会导致细胞裂解，细胞碎片和 DNA 随着时间的推移而增加，同样增加了培养液的粘度，并进一步增加了膜堵塞的风险。由于细胞蛋白酶的释放、病毒颗粒对细胞碎片的吸附以及病毒温度敏感性，在生物反应器内长时间停留会对病毒感染性产生负面影响。此外，rVSV-NDV 等融合溶瘤构建体会在灌流培养物中形成大型多核合胞体（>100 μm），可能会阻塞常用中空纤维膜的小尺寸管腔。克服这一问题的一种方法是使用非膜系统，例如声学过滤器或倾斜沉降器；然而，这些系统通常很复杂或与工业规模的生物反应器不兼容，并且细胞截留效率较低。或者，可以使用允许病毒颗粒通过的膜。最近，这一点已在利用与 ATF 系统连接的管状膜（VHU，孔径约 10 μm）生产 IAV 缺陷型干扰颗粒中得到证实。使用切向流深层过滤 (TFDF) 灌流组件（孔径 2–5 μm），已显示可以连续收获 LV 和 AAV。这使得感染性病毒颗粒的停留时间更短，并且可以立即将收获的材料储存在冷却罐中，以提高病毒稳定性，从而提高病毒产量和生产率。例如，使用用于 IAV 生产的声学沉降器进行连续病毒收获，相对于使用带有 PES（孔径0.2 μm）的中空纤维膜的灌流运行，将 CSVY 和 VVP 提高了 1.5 倍。此外，TFDF 组件可以将连续病毒收获和澄清结合在一个步骤中，减少单元操作数量，从而节省时间和金钱。总而言之，这可以实现上游（病毒生产）和下游工艺（病毒纯化）的直接整合，进一步降低成本，同时提高灵活性和生产力。在这项研究中，我们评估了 TFDF 灌流系统作为新型细胞截留装置的适用性，以及在单次操作中实现灌流培养和连续收获过滤以及澄清（降低浊度）的适用性。将两种不同的基于 rVSV 的载体（一种诱导经典的细胞病变效应，另一种介导细胞融合反应）的生产工艺强化与优化的批次工艺进行比较。详细的试验操作和结果，请参考原文。用于灌流培养的 TFDF 设置方案，具有手动调整 (I) 或自动 (II) 灌流控制。BHK-21 细胞通过 Levitronix 磁力离心泵以单向流连续泵入 30 cm 2 TFDF 组件（孔径 2–5.0 μm）。分别使用天平和 KrosFlo 的集成流量传感器控制进料和入口的流量。对于细胞生长期，滤液流量可以手动调节（I，使用 KrosFlo 控制器）或控制（II，使用电容探针）。较大的橙色圆圈表示细胞，黑色椭圆表示病毒颗粒，虚线表示不同类型的信号传输。使用配备 3-L 模块化适配器并连接到 mATF 的 SB10-X，在灌流模式下，在 BHK-21 细胞中生产 rVSV-NDV。以0.9×10 ^6 cells/mL接种BHK-21细胞，并在批次生长期后56小时开始灌流。随着时间的推移手动调整灌流速率。对于细胞截留，使用 0.65 μm mPES 中空纤维膜。一旦达到44.5×10 ^6 cells/mL的VCC （MOI为1E-4），进行感染，将温度降低至34℃，并暂停灌流4小时。A VCC（实心符号）和活性（空心符号）。B单位细胞灌流速率（实心符号）和灌流速率（虚线，收集的滤液重量除以 WV）。C在生物反应器（实心符号）和滤液（空心符号）内测量的感染性病毒滴度。使用与 TFDF 系统连接的 3-L STR 在灌流模式下在 BHK-21 细胞中生产 rVSV-NDV 的关键工艺参数。BHK-21细胞以0.8×10 ^6 cells/mL接种，并在批次生长期后46-51小时使用TFDF组件（孔径2-5μm）开始灌流。第一次 TFDF 运行（TFDF1，紫色方块）是手动调整的，而第二次 TFDF 运行（TFDF2，粉色圆圈）是根据电容探针测量的生物量进行控制。一旦达到14×10 ^6 cells/mL的VCC （MOI为1E-4），进行感染，温度降至34℃，并暂停灌流1-2小时。A活细胞密度（实心）和活性（空心）。B单位细胞灌流速率（实心）和灌流速率（虚线，收集的滤液重量除以 WV）。C生长和感染过程中 TFDF 膜的细胞截留效率（实心）和浊度降低（空心）。D细胞生长和感染阶段的跨膜压 (TMP)。虚线表示感染时间。BHK-21 细胞在TFDF1（紫色方块）和 TFDF2（粉色圆圈）灌流模式下生成的 rVSV-NDV。在反应器（实心）和滤液（空心）中测量的A感染性病毒滴度 (TCID 50 /mL)、C双链 DNA (μg/mL) 和E总蛋白 (mg/mL)的时间进程。TFDF 膜允许通过滤液连续收获 rVSV-NDV。B、D、F将滤液收集在多个部分（“收获瓶 1-4”）中，每 12-24 小时更换一次，以防止病毒感染性丧失。瓶 1 指从 0 至 24 hpi 收集的滤液，瓶 2 指 24–36 hpi，瓶 3 指 36–48 hpi，瓶 4 指 48–60 hpi。“最终收获”是指在最终收获步骤中回收的材料（浓度1，洗滤；最终浓度2）。“累计”是指所有瓶子的累计产量和最终收获量。使用不同生产模式和工艺的 rVSV-NDV 溶瘤病毒效力值的比较。在 48 hpi 时测定了Huh7 肿瘤细胞的活性，包括批次模式（红色三角形）、声学沉降器灌流（AS1，蓝色实心三角形；AS2，空心蓝色三角形）和 TFDF 灌流（TFDF1，紫色方块；TFDF2，粉色圆圈）。非线性回归分析后，从剂量反应曲线确定IC 50和log IC 50值。所有值均以三次重复的平均值报告，其中n =3。在 HEK293-SF 细胞中以批次模式生产 rVSV-GFP。使用一个摇瓶（SF 1，50 mL WV，红色圆圈）、一个 1 L STR（STR 1，700 mL WV，浅绿色方块）和一个 3 L STR（STR 2，2100 mL，深绿色方块）进行三批生产运行）。细胞以0.3–0.4×10 ^6 cells/mL接种并培养至1.1–1.3×10 ^6 cells/mL。感染前，温度从 37°C 降至 34°C。细胞以 1E-3 的 MOI 被感染。A VCC（实心符号）和活性（空心符号）。B传染性病毒滴度（TCID 50 /mL）。使用与 TFDF 系统连接的 3-L STR 在灌流模式下在 HEK293-SF 细胞中生产 rVSV-GFP。循环在接种前开始。HEK293-SF细胞以0.8×10 ^6 cells/mL接种，并在批次生长24小时后使用TFDF组件（孔径2-5μm）开始灌流。随着时间的推移手动调整灌流速率。感染前，温度降至34°C。以1E-3的MOI感染细胞(10×10 ^6 cells/mL)，并暂停灌流1小时。A活细胞密度（实心）和活性（空心）。B单位细胞灌流速率（实心）和灌流速率（虚线，收集的滤液的重量除以 WV）。C生长和感染期间 TFDF 膜的细胞截留效率（实心）。D反应器（实心符号）和滤液（空心符号）中的感染性病毒滴度 (TCID 50 /mL) 相对于感染后时间 (h) 进行绘制。渗透线显示的最后时间点 (31 hpi) 是指最终收获步骤。讨论第一种基于 rVSV 的疫苗，即埃博拉病毒疫苗 Ervebo®，已于 2019 年获得批准（EMA 2019；FDA 2019）。此外，用于疫苗和溶瘤应用的多种基于 rVSV 的构建体目前正在进行临床试验。因此，无论用途如何，开发高产量的生产平台对于满足临床试验和市场需求都至关重要。与传统载体平台相比，rVSV-NDV 诱导合胞体给生产工艺带来了额外的挑战。在这项概念验证研究中，我们评估了 TFDF 系统在强化高细胞密度生产方面的通用性，适用于两种不同的基于 rVSV 的构建体（rVSV-NDV 和 rVSV-GFP），以实现连续的病毒收获和澄清。使用 mATF 生产 rVSV-NDV中空纤维膜的产物截留是基于 ATF 的细胞培养生产的一个众所周知的挑战，它阻止了病毒颗粒等的连续收获。为了评估中空纤维膜用于生产形成大型多核合胞体的融合溶瘤病毒的适用性，选择了市售的 0.65 μm mPES 膜，其内腔尺寸比之前观察到的合胞体 (120–140 μm) 大，连接到 mATF，并表征病毒截留。膜材料对产物截留的影响尚未完全阐明。虽然一些研究发现，由于负电荷密度较高，使用聚砜 (PS) 膜的抗体截留率比聚醚砜 (PES) 和 mPES 更明显，但其它研究报告了更有利的理化和结构特性 (PS 膜开放的孔结构和高孔隙率，即使在 0.34 μm 的低孔径值下也能收获黄热病病毒颗粒（~50 nm）)。除了膜材料之外，孔径大小对于产物截留也起着至关重要的作用。令人惊讶的是，与较低孔径（例如 0.2 μm）相比，具有较高孔径（例如 0.65 μm）的膜通常表现出更高的产物截留率。较大孔径更明显的异质孔隙分布会增加污染的敏感性，因为沿膜的滤液通量的变化使得较大的孔隙容易沉积颗粒和浓差极化。此外，由病毒诱导的细胞裂解引起的小尺寸细胞碎片（0.2-0.5 μm）可以进入较大的膜孔，导致膜堵塞和产物滞留，但不会进入较小的膜孔。使用 HEK293 细胞进行 rVSV-NDV ATF 生产时，使用 0.2 μm PES 中空纤维膜，在观察到第一次合胞体形成后，即在 18 hpi 时，导致膜完全堵塞。因此，膜的选择主要基于内部纤维腔而不是孔径或材料。与使用 0.2 μm PES 膜 (0.8 L/min) 的初始 ATF 运行相比，选择了更高的中空纤维内部流速 (1.5 L/min)，以通过提高剪切应力，增加膜上的反冲洗，并防止或阻碍合胞体的形成。令人惊讶的是，所产生的 5490 s-1 剪切速率不会影响细胞生长，因为高VCC 值44.5×10 ^6 cells/mL 达到了 0.031 1/h 的高细胞特异性生长速率，也没有阻止合胞体的形成。然而，正如之前用声学沉降器观察到的那样，形成的合胞体较小（直径最大为 75 μm），允许进入较大的纤维，这可能防止完全堵塞。然而，高中空纤维流速与1.91 L/h/m 2的低滤液通量的组合并没有阻止膜对rVSV-NDV的截留。18 hpi 时，97% 的感染性病毒已被截留，这进一步凸显了使用中空纤维膜连续收获病毒颗粒的挑战。使用 TFDF 生产 rVSV-NDV作为概念验证，我们开始利用 TFDF 系统作为细胞截留装置，用于灌流和随后的连续收获过滤。性能通过细胞生长、TMP、生物反应器和滤液浊度以及病毒渗透性的量化来表征。TFDF 系统的使用使 BHK-21 细胞能够获得高 VCC，尽管剪切应力大大降低，但与 mATF 系统相比，其生长行为相似。由于之前实验中在非常高的 VCC 下获得的 CSVY 较低，因此感染的目标细胞密度大幅降低。与之前报道的批次培养相比，所有灌流培养的代谢摄取率均略有增加。剪切应力的增加，特别是在 ATF 和 TFF 系统中，已被确定为底物吸收率增加的原因之一。通过电容探针控制灌流速率并没有改善整体工艺性能，但在整个生长阶段稳健地保持稳定的 CSPR 值（图3），从而减少了 15% 的培养基消耗。与 TFDF1 的手动灌流控制相比，由于部分过度补料，CSPR 值较高，葡萄糖水平无法稳定维持，在感染前降至 5 mM 以下。TFDF2 生长速率的略微增加很可能导致葡萄糖摄取增加，从而增加乳酸形成。为了支持更高的 VCC，应增加 CSPR 的设定点以用于未来的电容控制运行。深层过滤（DF）与切向错流过滤（TF）的组合提供了多种好处，例如膜表面的剪切、最大限度地减少过滤器内颗粒的沉积，同时允许在 DF 的通道内捕获一些颗粒，而不会阻塞通过同一通道的液体流动。即使在病毒感染后，两次 TFDF 运行的 TMP 值也较低（低于 0.3 psi），细胞截留效率较高（>99%），滤液浊度较低（降低>95%），表明颗粒突破最小。先前的研究已经证明了 TFDF 系统连续收获 AAV 和 LV 的适用性。正如预期的那样，我们还在同时采集的生物反应器和滤液样品中实现了相同密度的感染性病毒。对于两次运行，计算出的感染性病毒穿过膜的百分比都超过 100% 是不可能的，只有在滤液样品中测得的滴度高于生物反应器样品时才能实现。虽然与理论产量相比仅得出 78% 的总回收率，但这很可能是由于在室温下储存收获物时部分功能损失，以及 TCID 50测定本身的相当大的误差（±0.3 log）。蔗糖对蛋白质和有囊膜病毒载体的稳定作用是众所周知的，然而，它主要作为冷冻保护剂，或者只是复杂储存配方的一小部分。因此，过早添加蔗糖可能不足以防止降解，应优先将收获的大部分料液直接冷却至 4°C。在病毒生产方面，我们的强化 TFDF 工艺在滤液中实现了迄今为止报道的最高感染性病毒滴度 5.6–7.5x10 ^9 TCID 50 /mL。与优化的批次工艺相比，VCC 增加了 5 至 6 倍，但感染性病毒滴度甚至高出 11 倍以上。此外，CSVY 提高了一倍，STY 提高了 460%（5.6 倍），并且达到了类似的 VVP。最后，将 TFDF 运行与使用相同细胞系、但不同细胞截留装置的其它灌流培养进行比较。与 AS 和 ATF 灌流相比，TFDF 系统中达到的最大滴度分别高出3倍和 1.5 倍。这也反映在 VVP 和 STY 方面，对于 TFDF 运行，它们始终高出两倍以上。令人惊讶的是，随着各个系统 VCC 的增加，CSVY 急剧下降。对于 ATF 培养，达到最高 VCC 44.5×10 ^6 cells/mL，获得最低 CSVY，清楚地表明存在“高细胞密度效应”。造成这种效应的一个主要原因通常是营养物质的缺乏或抑制性铵和葡萄糖的积累。一项研究表明，铵和乳酸浓度分别为 2-3 mM 和高于 20-30 mM，会对病毒生产力和细胞生长产生负面影响。然而，在任何运行中都没有观察到营养限制或乳酸和铵积累到过高浓度。这表明其它原因，包括非监测代谢物或未知细胞因素的限制或积累，可能发挥了作用，并有待进一步研究。另一个原因可能是合胞体的形成，根据所使用的系统，观察到合胞体发生差异延伸。如果细胞不融合，病毒复制可能会更有效，因为我们观察到，尽管溶瘤水平相似，但使用非融合 VSV 时，在溶瘤应用中会产生更高的滴度；然而，悬浮培养系统中是否也是如此，尚不完全清楚，需要进一步研究。无论如何，应该非常仔细地考虑三种灌流系统的直接比较，因为各种生产参数是不同的。为了公平比较，重新评估应包括相同的生物反应器设置和相似的感染细胞密度。然而，对于我们的概念验证研究来说，这超出了范围。融合溶瘤病毒和合胞体的形成给过程控制和生产过程的放大带来了新的挑战。我们假设细胞融合取决于三个因素：高 VCC、低剪切应力和长细胞间接触时间。所有三个因素的组合最有可能促进大型多核合胞体的形成。批次模式生产与低VCC（高达3.2×10 ^6 cells/mL）、低剪切应力和短细胞间接触时间相关，并且不会导致合胞体的形成。使用 ATF 或 TFDF 系统进行生产可实现高 VCC（高达 44.5×10 ^6 cells/mL）；然而，剪切率急剧增加（高达 5490 1/s），并且细胞与细胞的接触时间很短，导致小尺寸合胞体的形成。AS 等截留系统结合了高 VCC（高达 29.7×10 ^6 cells/mL）、低剪切率（约 340 1/s）和较长的细胞间接触时间。声场和再循环回路（3-12 分钟，促进大型多核合胞体的形成。在批次模式下，通过在低 VCC 下补充 CaCl 2诱导聚集来增加细胞间接触，但不会导致合胞体的形成，突出了所有三个因素的复杂相互作用。未来的研究可以考虑调查悬浮培养中合胞体形成的实际原因，以更好地控制其形成。然而，生产过程中悬浮培养物是否形成合胞体与病毒固有的融合性无关，因为融合蛋白在其基因组内编码，需要表达才能进行感染。尽管如此，还是进行了效力测定，以评估生产方式以及生产过程中合胞体的形成或不形成对病毒诱导溶瘤能力的潜在影响。正如所预期的，溶瘤效力不受生产模式或合胞体发生的影响（图5）。批次和灌流模式下的 rVSV-GFP 生产为了使我们的概念验证研究更进一步，我们还想评估基于 rVSV 的载体的高产病毒生产工艺的 TFDF 性能，以使用模式载体 rVSV-GFP 作为疫苗的可能应用。与批次模式下的 STR 1 工艺相比，使用灌流模式和 TFDF 组件的工艺强化使 VCC 提高了6倍，达到 11.3×10 ^6 cells/mL，STY 提高了 1.9 倍，从而缩小了生物反应器的占地面积。然而，与 STR 批次相比，观察到 VVP 降低了 3.3 倍以上，CSVY 降低了 1.6 倍以上。如前所述，这种下降很可能是由于“高细胞密度效应”。由于既没有观察到受监测营养物质的限制，也没有观察到抑制性副产物的积累，很明显，这种灌流工艺肯定还有优化的空间，希望能获得更高的 VCC。目前，该灌流运行只是概念验证运行，仅用于评估 TFDF 系统。下一步可以设想测试不同的补料方案、培养基成分或添加物。使用 TFDF 组件，我们能够直接收获 rVSV-GFP 颗粒，同时通过深层过滤进行澄清并完全回收。我们的概念验证研究以及 LV和 AAV的数据似乎表明，用于灌流中连续收获病毒的 TFDF 将在下一代工艺中发挥重要作用，也可能适用于其它病毒。此外，所有 HEK293-SF 细胞均截留在生物反应器内，从而实现全部产能。与批次生产（0.034至0.028 1/h）相比，使用TFDF组件的灌流培养显示出略低的单位细胞生长速率（0.022 1/h），这表明这里还有改进的空间，需要进一步优化。如前所述，将收获物冷却至 4 °C 可提高病毒稳定性。事实上，我们发现最终收获批次的回收率为 103.5%。总体而言，TFDF 组件作为我们测试的基于 rVSV 的载体和细胞系的灌流系统表现出了非常好的性能。此外，连续的病毒收获以及通过 TFDF 组件一步进行的澄清可以简化工艺操作，并有助于为未来开发一种集成的、可放大的（高达 2000 L）且经济的工艺。原文：S. Göbel, L. Pelz, C. A. T. Silva, et al., Production of recombinant vesicular stomatitis virus-based vectors by tangential flow depth filtration. Applied Microbiology and Biotechnology, 2024.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。