Congenital Ichthyosiform Erythroderma

摘要：登革热病毒（DENV）通过感染的伊蚊传播给人类，引起的疾病从轻微的登革热到致命的登革休克综合征不等。不同DENV血清型或不同黄病毒之间相似保守的结构和序列导致了交叉反应的发生，随后是抗体依赖性增强（ADE）。迄今为止，能够提供针对不同DENV血清型感染的有效保护的疫苗仍然是最大的挑战。因此，深入研究对于开发有效和有效的治疗药物至关重要。此外，黄病毒的交叉反应性导致临床环境中的误诊，可能会导致适当干预管理的延迟。因此，迫切需要具有高特异性和敏感性的准确诊断，以便及时诊断并为DENV感染的个体提供早期治疗。在这篇综述中，将讨论DENV感染治疗平台中中和抗体、抗病毒药物和疫苗候选物的最新发展。此外，还将介绍抗原隐蔽表位的发现、分子模拟原理以及单链或单域抗体在DENV应用方面的进展。 1.引言 登革热病毒感染是热带和亚热带地区最常见的蚊媒传播疾病之一，全球每年约有1亿至4亿感染病例。目前，DENV感染在非洲、东地中海、美洲、东南亚和西太平洋等国家流行。全球登革热流行的分布表明，登革热感染的爆发正在全球范围内发生（图1）。根据最近的WHO报告，2020年感染病例的增加使得DENV成为COVID-19之后最严重的病毒性疾病。在这些国家中，菲律宾、越南、印度、哥伦比亚和巴西报告了最多的DENV感染病例。导致蚊子传播疾病在全球传播的主要因素之一是快速的城市化和不适当的基础设施规划，这可能导致无效的病媒控制管理。此外，商务团队或个人旅行也促进了这些蚊子传播疾病在他们从一个地方到另一个地方旅行时传播到新环境中。2013年，在马来西亚沙捞越发现了一种新发现的DENV血清型。最初，这起DENV病例被认为是DENV4的森林登革热感染，涉及蚊子Aedes nivalis和非人类灵长类动物之间的传播。经过一系列遗传验证过程，它被确定为新的DENV5血清型，主要发生在东南亚的森林中。尽管DENV5的实际传播途径仍不清楚，但可能导致其出现的因素可能是由于森林株到人类株的遗传变化、DENV的高变异频率和大规模的森林砍伐。这种新的DENV5血清型与另外4种现有血清型在系统发育上有明显的不同，表明DENV的新出现正在进行中，预示着可能会有更多的病毒出现，这可能是由于气候和生态系统的变化导致的动物源性传播。到目前为止，针对DENV感染的特定治疗药物或疫苗仍然不可用。原因之一是DENV和其他黄病毒之间通常发生的交叉反应，因为黄病毒在包膜蛋白（E）上呈现的相似保守结构。如前所述，DENV E蛋白与ZIKV E蛋白的同源性高达50%，因此，在第二次感染任何黄病毒科成员时，由于免疫系统产生的交叉反应性抗体的特异性和数量，会发生交叉反应随后是ADE。此外，不同黄病毒如寨卡病毒（ZIKV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）或不同DENV血清型的共感染总是呈现类似的起始症状，因此可能导致临床诊断管理的复杂化。为了解决这个问题，准确且快速的诊断工具对于早期药物治疗至关重要。在这篇综述中，将重点讨论DENV感染问题，如由于不同血清型DENV感染和不同黄病毒感染导致的交叉反应、ADE、免疫逃避和商业诊断试剂盒的限制。此外，将回顾和介绍不同的诊断和治疗方法的最新进展，以建议可能解决交叉反应问题的方法。事实上，潜在的治疗剂和诊断标记的发现永远不会结束，直到产生特定的、敏感的诊断标记和疫苗或治疗剂，它们在治疗DENV感染方面既敏感又有效。 图1. 2020年和2021年全球登革热疫情。受影响的国家包括孟加拉国、菲律宾、越南、印度、马尔代夫、印度尼西亚、新加坡、哥伦比亚、巴拉圭、秘鲁、肯尼亚、斐济、库克群岛、留尼汪岛、斯里兰卡、泰国、苏丹、毛里塔尼亚、东帝汶、也门、尼泊尔、马约特岛、厄瓜多尔和巴西。 1.1.登革热病毒基因组和结构 DENV是来自黄病毒科的黄病毒属。通常，如登革热休克综合征（DSS）和登革热出血热（DHF）等严重症状可能由四种抗原性不同的DENV血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4）中的任何一种连续感染引起。DENV是一种小的二十面体包膜病毒，由11 kb的正单链RNA组成，其成熟的包膜结构称为病毒粒子，包含三种结构蛋白，包括衣壳（C）、包膜（E）和膜（M），以及七种非结构（NS）蛋白，如NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5（图2）。结构蛋白主要参与病毒组装。例如，C蛋白与RNA相互作用以组装核衣壳。成熟病毒粒子的形成需要M蛋白的帮助，M蛋白在识别不同黄病毒感染的不同类型免疫反应中很重要。它也是DENV的主要组成部分，作为表面蛋白，协助病毒附着和融合在宿主细胞膜上。除此之外，M蛋白可以通过寡聚化形成结构病毒粒子。另一方面，非结构蛋白和细胞蛋白对于病毒基因组的复制、翻译、封装和病毒蛋白的正确折叠至关重要，所有这些都发生在与粗面内质网相关的细胞质中。 图2. DENV基因组和NS1蛋白结构域图。病毒基因组经过翻译产生单一多聚蛋白。多聚蛋白处理后，通过蛋白水解裂解产生病毒蛋白。对于NS1，涉及DENV病理学的三个结构域包括β-卷、翼状结构域和β-梯。 1.2.登革热病毒的生命周期 人类通常通过感染的蚊子如埃及伊蚊或白纹伊蚊感染登革热病毒（DENV）。DENV在感染的第一天就会针对树突状细胞（DCs）和巨噬细胞。从其他综述中总结，DENV生命周期包括病毒进入和附着、病毒和内体膜融合、核衣壳释放、蛋白合成和处理、RNA复制、核衣壳形成、病毒组装、病毒成熟，最后是成熟DENV粒子的释放。对于宿主细胞附着，DENV E蛋白将与目标细胞的细胞因子如树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3抓取非整合素（DC-SIGN）、甘露糖受体、硫酸肝素等相互作用。接下来，DENV通过网格蛋白介导的内吞作用进入目标细胞，内体隔室内的低pH值允许DENV与内体膜融合。在酸性内体环境的帮助下，RNA基因组从解包的核衣壳释放到细胞质中进行蛋白处理和复制。最初，RNA基因组作为mRNA并进行翻译以产生病毒蛋白。RNA基因组的复制发生在病毒诱导的细胞内膜上，称为复制复合体，由病毒RNA、病毒蛋白和宿主细胞因子组成。这个复合体在内质网（ER）膜上形成，也有助于保护复制产物免受宿主先天免疫系统的识别。核衣壳形成后，DENV粒子开始组装，当它进入ER腔时形成未成熟的DENV粒子。在跨高尔基体网络（TGN）的分泌途径中，DENV的成熟需要通过类胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的作用将前膜/膜（prM/M）切割成M蛋白，以释放成熟和传染性的DENV。为了避免过早的DENV膜在病毒粒子从感染细胞释放之前与宿主细胞融合，pr将继续与E二聚体结合，包裹疏水融合环。最后，成熟的DENV一旦释放到细胞外空间，pr最终会从病毒粒子表面脱离。 1.3.临床表现 登革热感染包括发热期、危重期和恢复期。发热期通常持续一周，症状包括高热、流感样症状、头痛、呕吐和关节痛。危重期也称为生命威胁期，会出现血浆渗漏和内出血等更严重的症状。在恢复期，随着血管通透性的恢复，症状会减轻。DENV感染可以引起一系列广泛的症状。在第4天至第10天的潜伏期内，疾病可能是无症状的或表现为称为登革热（DF）的轻微急性发热疾病，而危重期通常从第3天至第7天开始。登革出血热（DHF）伴随着异常的血管通透性，可能会导致突发性低血容量休克，称为登革休克综合征（DSS），这是感染严重登革热患者的危重阶段。DENV感染可能导致不同程度的严重性，这取决于血清型、遗传变异和病毒毒力。不同的登革热血清型可能因其结构差异和病毒复制率而对病理产生不同的影响。此外，核苷酸的变化，如氨基酸突变或替换，会影响病毒毒力，因为核苷酸的变化最终会导致不同的病毒-宿主相互作用和传播能力。 2.关于DENV未解决问题的综述  在这一部分，简要回顾了涉及先天和适应性免疫反应的免疫反应。我们还回顾了一些未解决的问题，如DENV的免疫逃避、DENV血清型内的交叉反应、不同黄病毒间的交叉反应、不同的抗体依赖性增强（ADE）机制及其影响。第4.2节将讨论当前诊断试剂盒的限制。 2.1.对DENV感染的免疫反应 树突状细胞（DCs）是病毒颗粒入侵期间先天和适应性免疫反应之间的连接。它负责上调促炎细胞因子和共刺激分子的表达，这有助于激活人体免疫反应。因此，当NS1通过调节相关基因表达干扰其成熟和迁移时，DCs将无法刺激Th1细胞分泌IFN-γ。为了确保灭活流感病毒NS1，抗病毒药物必须能够恢复宿主的抗病毒反应，如与IFN产生相关的先天免疫，并限制病毒复制。DCs将目标抗原扩展到T细胞，如CD8+和CD4+，作为引流淋巴结（LNs）中先天免疫反应的起点。激活的皮肤肥大细胞在激活招募细胞毒性细胞如CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞到感染部位中起着至关重要的作用，以刺激病毒终止，同时控制引流LNs中的感染。CD8+ T细胞可以直接通过靶向登革蛋白（如NS3）的各种变异，借助激活的CD4+ T细胞来终止感染细胞（Mathew等人，1996）。CD8+ T细胞通常关注非结构蛋白，而CD4+ T细胞更多地关注衣壳、包膜和NS1表位。CD4+ T细胞的作用包括帮助B细胞反应，协助从CD8 T细胞中提取记忆反应，并提供细胞毒性效应，以及Mapalagamage团队回顾的专门CD4+ T细胞的许多其他功能。补体系统的激活对于在先天免疫反应的早期阶段阻断病毒感染很重要。然而，DENV的免疫逃避可以通过NS1实现，当它与不同补体激活途径（如经典途径和凝集素途径）中的相应补体组分相互作用时。这将导致补体组分的功能改变，并抑制补体介导的反应。通过这些策略，DENV增加了其生存和病毒复制的机会。此外，NS1和NS4B之间的相互作用将通过与双链RNA共定位来调节RNA复制。 DENV的病毒复制在早期通常由干扰素（IFNs）的产生控制，这是第一道防线。一旦病毒进入人体皮肤，TLRs和C型凝集素受体（CLRs）作为模式识别受体（PRRs），由免疫哨兵产生，会识别DENV的存在。PRRs的激活通过产生IFNs和肿瘤坏死因子（TNF）激活人体的抗病毒先天反应。TLR-3和TLR-7的激活将导致产生IFN-α和IFN-β，这对于抑制DENV感染很重要。IFNs与IFN受体之间的结合反应将触发Janus激酶-信号转导和激活转录因子（JAK-STAT）途径，进一步增强效应蛋白的产生高达100单位。除了IFNs，包括视黄酸诱导基因1（RIG-I）和螺旋酶黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）在内的细胞内传感器也是负责病毒RNA识别的第一线防御，它们也有助于产生IFN-β。激活的RIG-I在检测到病毒RNA后会被转移到线粒体，与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用。RIG-I和MAVS之间的相互作用将进一步导致MAVS聚集，充当免疫信号体，启动核因子κB（NF-κB）和转录因子IRF3，诱导转录因子转移到细胞核后产生I型IFN。 2.2.DENV逃避免疫系统 DENV逃避免疫系统通常发生在抑制免疫反应激活途径的情况下。例如，DENV设法通过抑制MAVS途径来绕过人类的第一道防线。一种策略是通过干扰NS3蛋白阻断RIG-I进入线粒体。除了NS3，NS4A也能通过结合MAVS的半胱天冬酶激活和招募域（CARDs）来抑制RIG-I和MAVS之间的结合。病毒逃避宿主病原体识别受体的另一种方式是通过干扰TLR-3抗病毒信号的激活。另一方面，DENV也能够通过几种机制抑制干扰RNA（RNAi）途径，这是产生先天抗病毒反应的重要途径。亚基因组黄病毒RNA（sfRNA）将从病毒RNA的3′-非翻译区产生，以防止Dicer酶切割双链RNA。通过表达NS4B调节宿主RNAi/microRNAs途径，RNAi途径将受到干扰，从而促进DENV的复制。NS5可以通过阻断转录复合体PAF1C的招募来影响IFN的产生，以阻止IFN刺激基因（ISGs）的产生。此外，DENV还可以通过几种机制影响IFN机制的功能。例如，非结构蛋白NS2B/3能够通过中断IFNα/β诱导途径来下调抗病毒反应，而其他非结构蛋白如NS2A、NS4A和NS4B可以通过部分阻断STAT信号途径来影响细胞间的IFN信号传导。 2.3.不同DENV血清型间的交叉反应和不同黄病毒间的交叉反应 所有DENV血清型的NS1蛋白共享相似的序列高达70%，并且其序列与其他黄病毒也有40-50%的相似性。因此，不同血清型DENV之间以及DENV与其他黄病毒之间总会发生交叉反应。根据在巴西发生的DENV-1和DENV-2的共感染以及在索马里、台湾和中国检测到的DENV-2和DENV-3的共感染，Araújo, F. M.和他的团队表明埃及伊蚊可能被不同病毒的组合感染，或者它们可能有能力同时传播多种病毒。正如Wenming等人（2005）所假设的，如果一个地方存在多种血清型，那么通过感染蚊子传播DENV-2和DENV-3的共感染可能会发生。此外，也有报道DENV和寨卡病毒（ZIKV）以及DENV和基孔肯雅病毒（CHIKV）之间的共感染。 与DENV类似，寨卡病毒（ZIKV）也是一种正单链RNA病毒，源自黄病毒科。寨卡病毒感染通常显示非特异性的临床症状，如结膜炎、轻度发热、头痛和皮疹，这很容易与其他黄病毒感染如登革热和基孔肯雅病混淆。此外，ZIKV感染还可能影响孕妇，导致胎儿畸形和婴儿出生缺陷，如小头畸形。一个最初被检测为登革热病毒感染的旅行相关病例，由于NS1抗原测试的假阳性结果，后来被怀疑为急性寨卡病毒感染。当ZIKV对先前感染过另一种黄病毒感染（如DENV）的患者造成二次感染时，这个人可能体内有DENV背景免疫，并在DENV检测中呈阳性结果，导致IgM测试的交叉反应。然而，如果ZIKV是初次感染，IgM测试中的交叉反应会很低。正如George等人所报告的，先前感染过ZIKV的患者会有更高水平的DENV-2原发病毒血症，随后与严重DENV感染相关的变化。这是因为ZIKV感染触发的高浓度DENV交叉反应性抗体对DENV-2的中和效果很低，导致DENV-2交叉反应性抗体反应的非中和浓度。这些反应还增加了从DENV-1、3或4获得异型血清型感染的机会，这意味着对ZIKV的预先存在的免疫反应可能会诱导所有DENV血清型的ADE。 2.4.ADE的机制和影响 ADE的第一种机制被称为内在ADE，其中DENV免疫复合物的内化将通过抑制细胞内抗病毒反应增加感染细胞的“爆发大小”。DENV可以通过与亚中和抗体形成DENV-抗体复合物并通过抗体介导的吞噬作用进入宿主细胞。当2个巨噬细胞Fcγ受体配对并诱导白介素-10（IL-10）产生时，它将导致偏向T辅助细胞-2（Th2）反应，由于RIG-I/MDA5和JAK-STAT途径的抑制，导致释放的1型干扰素、白介素12、干扰素γ和TNF变得下调。简而言之，内在ADE通过改变先天免疫系统和细胞内机制来增强病毒复制。 另一种ADE机制是外在ADE。两种常见的ADE机制是Fc受体（FcR）依赖性ADE和C1q依赖性ADE（图3）。FcR依赖性ADE是广泛病毒感染（如HIV、流感A、登革热和埃博拉）的最常见机制。具有FcR的细胞，如单核细胞、B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，很容易被病毒-抗体复合物附着，因为抗体的Fc区域将与细胞表面的FcR结合，导致病毒附着到细胞表面的增加。一旦DENV-免疫复合物抑制负责产生白介素-12（IL-12）、干扰素γ（IFN-γ）、TNF-α和一氧化氮自由基（NO）的抗病毒免疫反应，IL-6和IL-10的表达将被激活，并刺激病毒颗粒的传播，导致感染细胞和病毒颗粒的增加，随后发生ADE。 图3. 抗体依赖性增强（ADE）的不同机制。病毒进入可以通过不同的途径，在(A) Fc受体或(B) C1q受体的帮助下被吞噬进入细胞膜，并进一步引起ADE。 C1q依赖性ADE机制是补体经典途径的启动，这在埃博拉病毒（EBOV）感染中很常见。在这种机制中，ADE是通过补体蛋白C1q和C1q受体（C1qR）来促进的，它在大多数哺乳动物细胞中被区分出来，尽管FcRs在免疫系统中完全表达，包括B细胞、中性粒细胞和单核细胞或巨噬细胞。 当病毒与非中和抗体或亚中和水平的抗体结合时，这将有助于病毒进入并进一步增强病毒感染，这可能是二次感染。这种情况指的是抗体依赖性增强（ADE）。最初，预先存在的抗体可以通过阻止DENV与细胞表面的天然受体之间的结合来中和同源DENV感染，但它将允许异型登革病毒进入并穿过初次感染途径，导致由于高病毒负荷而发生ADE。 通过多年感染后刺激免疫记忆产生的交叉反应性抗体可以中和多种DENV血清型。这些抗体通常具有较差的中和活性，并倾向于附着在可用性低的免疫显性表位上，导致ADE和交叉反应的更高比率。正如Mongkolsapaya等人所报告的，异型记忆和交叉反应性CD4+T细胞的存在将在二次感染的免疫回忆反应期间加剧感染。 在异型血清型二次感染期间由抗体反应诱导的非中和抗体可能导致内在ADE，这可能导致更严重的登革热感染。这种类型的ADE与外在ADE相比，可以在感染的早期阶段大大增强病毒复制。这是因为它能够逃避先天免疫反应，并通过抗体介导的内化自由迁移，不容易被内源性干扰素途径检测到。 3.针对DENV感染的治疗剂  3.1.中和抗体及其机制  中和抗体在抑制DENV包膜（E）蛋白的功能位点与宿主细胞相互作用中发挥重要作用。高度中和的抗体通常结合在E蛋白上容易接近且暴露在病毒粒子表面的表位上。然而，非中和抗体，包括亚中和水平的中和抗体，当它们结合到DENV粒子时，可能会导致ADE。 以西尼罗河病毒的中和机制为例，该机制被称为“多重打击”模型，与使用抗体“包被”病毒粒子模型的其他病毒的中和也类似。中和效果取决于中和抗体的浓度。对于潜在的中和抗体达到中和的最小化学计量学，大约需要30个抗体占据一个病毒粒子。可能影响中和抗体与病毒表位之间相互作用的因素包括病毒表位的可接近性、抗体浓度和结合亲和力。 被中和抗体包被的病毒粒子的传染性可以通过不同方式被阻断，其中之一是通过抗体的Fab臂交叉链接病毒粒子，以形成大的交叉链接病毒/抗体聚集体，这可以通过降低可以感染细胞的病毒粒子浓度来阻止病毒粒子的传播。除了交叉链接，抑制E蛋白构象变化和受体结合可以避免病毒粒子与内体膜之间的膜融合，从而允许病毒基因组释放到细胞质中。一些中和抗体可能具有双重活性，可以阻断膜融合，同时中断受体结合机制，从而阻断病毒通过内体进入。当预连接测定格式中中和抗体的中和滴度超过后连接中的中和滴度时，总体中和可能会发生，并允许对DENV粒子进行双重保护。 关于中和逃逸的问题，可以通过利用针对不同表位的潜在中和单克隆抗体（mAbs）混合物来解决，以阻断突变逃逸。Wang等人的研究表明，通过LALA突变工程化的重组四价对称抗体在小鼠模型中通过中和从每个亲本抗体单独发展出来的逃逸突变体，非常有效地抑制了ZIKV感染，逃逸突变体的生长被抑制。 3.2.针对DENV感染的潜在中和抗体 DENV的E蛋白始终是开发中和抗体的主要关注点。每个DENV E蛋白的外域由三个独特的域组成，如域I（EDI）、II（EDII）和III（EDIII），它们连接在一起作为二聚体存在。通常，中和表位位于EDI内的铰链区、EDII末端和EDIII侧面。在与E蛋白三种域匹配的中和小鼠单克隆抗体（mAbs）中，大多数强烈中和的mAbs识别EDIII的表位和A链。潜在的中和抗体通过与病毒粒子表面的E二聚体交叉链接，靶向成熟病毒粒子上的暴露四聚体结合位点，从而抑制构象变化，阻止融合膜的形成。 1A1D-2是一种中和抗体，可以通过阻断EDIII位置来防止E蛋白的构象变化和膜融合的形成。Gandham和他的团队开发了硫代适体（DENTA-1），利用中和抗体1A1D-2的中和机制针对EDIII，因为其出色的结合特性。由于过滤结合测定表明硫代适体能够紧密地结合在DENV-2 EDIII上，DENTA-1有很大可能表现出与1A1D-2相同的中和效果。对于静态下的成熟病毒粒子，中和抗体与EDIII的结合区域位于非表面暴露的β−1链，这表明未暴露区域可以很容易地与溶剂接触，并通过靶向结合区域来增强抗体的中和活性。Deng等人的另一项研究也证明，特异性结合EDIII的抗体2B8能够抑制DENV血清型2在BHK细胞上的附着。 Dejnirattisai及其团队报道了发现广泛中和抗体的潜力，这种抗体有可能中和所有DENV血清型。他们发现，针对包膜二聚体表位（EDE）的mAbs能够与针对融合环表位（FLE）的抗体相比，更有效地中和感染人类细胞和昆虫细胞的DENV。原因之一可能是由于抗EDE抗体的能力，它们可以在不同的成熟阶段识别具有不同prM浓度的DENV，与依赖于prM存在进行融合环结合的抗FLE抗体不同。 除此之外，工程化抗体如双特异性抗体的发现也是开发针对DENV的治疗性抗体的一种流行方法。将两个具有特定功能的mAbs结合起来产生双特异性抗体（DVD-1A1D-2A10），已被发现保留并表现出亲本活性。这种双特异性抗体能够在DENV早期感染期间阻断病毒附着和融合过程，因为它由能够与EDIII相互作用以抑制DENV在宿主细胞上的附着的1A1D亲本抗体组成，以及另一个能够与EDII域结合以干扰病毒粒子和内体膜之间融合过程的2A10亲本抗体。具有双重阻断功能的优势，病毒附着和融合的阻断可能同时发生，或者可以抑制其中任一过程，作者预测，这可能更有效地抑制DENV感染。DENV E蛋白在病毒附着和融合过程中分别具有转变为二聚体和三聚体结构的能力，然而双特异性抗体由于其亲本活性的优势，能够同时结合EDII和EDIII域，从而避免E蛋白结构的变化。此外，这种双特异性抗体在1.33 µM的浓度下还显示出完全的中和活性，与其各自的亲本抗体相比，在相同浓度下仅显示出70%的中和效果。双特异性抗体的产生非常有希望被开发成针对DENV的治疗性抗体。 3.3.抗病毒肽 作为抗病毒剂之一，肽类抑制剂旨在通过影响病毒蛋白的功能来中断DENV生命周期。抗病毒肽可以通过几种途径抑制DENV感染，如（i）识别宿主细胞受体以阻止病毒进入，避免宿主细胞与病毒蛋白结合，（ii）靶向结构蛋白，通过阻止宿主细胞与病毒之间的结合来防止病毒进入，（iii）靶向非结构蛋白，主要处理抑制病毒复制。然而，抗病毒肽作为有效治疗药物使用存在一些缺点，如稳定性弱和生物利用度有限。解决这些问题的方法之一是应用化学修饰来改变肽的物理化学性质，另一种方法是通过突变分析改进抗病毒肽的性质。 一些抗病毒肽靶向登革热蛋白酶，如NS2B-NS3，它参与病毒多聚蛋白的切割，以在成熟时释放结构和非结构蛋白。Ltc 1在高温（40°C）下表现出更好的抑制能力，降低了感染细胞中的病毒载量。因此，Ltc 1可能通过抑制NS2B-NS3蛋白酶的活性来干扰DENV的生命周期。还有其他针对NS2B-NS3蛋白酶的抑制剂，有潜力被开发为抗病毒剂。 Hrobowski及其团队建议，可以使用模拟II类融合蛋白高度保守区域的肽来阻断病毒进入和融合。他们鉴定了一种肽抑制剂DN59，模拟DENV E蛋白的茎域，能够以低浓度抑制DENV-2感染。它在20 µM时显示出最高的抑制活性100 ± 0.5%，其IC50记录在大约10 µM。它还对DENV-2感染显示出极好的特异性，以低浓度超过99%的抑制活性抑制斑块形成。除了对DENV-2具有抑制活性外，这种肽抑制剂还对西尼罗河病毒（WNV）显示出抑制效果，由于它们具有相似的保守区域，因此它可能作为黄病毒的广谱肽抑制剂。进一步的研究表明，这种肽抑制剂对所有DENV血清型都有抑制效果，IC50在2到5 µM之间。有趣的是，他们还发现DN59能够破坏病毒膜并释放病毒基因组。基因组在用DN59处理后完全从E蛋白中分离出来，因为它在病毒膜上形成孔洞，由于其与脂质体囊泡的强烈相互作用并破坏脂质双层，导致病毒失去感染性。 此外，MLH40肽的模拟能力使其能够通过模拟M蛋白外域的螺旋疏水茎区和保守的疏水环来中断DENV M-E相互作用，当它结合到DENV时会引起同源二聚体E蛋白结构的改变，从而抑制所有类型的DENV的病毒感染。 DENV C蛋白与脂滴（LDs）之间的相互作用对于登革病毒颗粒的形成很重要。利用分子模拟的原理，肽可以通过模拟C蛋白无序的N端区域，包括NML + R基序（被认为是LD-C蛋白的相互作用位点）来抑制DENV颗粒的形成。还有另一种发现涉及DENV C蛋白的抗病毒机制。一种名为ST148的复合抑制剂显示出抑制DENV复制的潜力，它与两个衣壳二聚体“接吻”相互作用，形成一个抑制剂结合的衣壳四聚体，这可能在病毒感染新细胞之前或期间发生。含有这种复合抑制剂的病毒在感染新细胞时的核衣壳解包过程中会有故障效果。这将进一步导致C蛋白和RNA基因组的降解。因此，这种机制可能是未来抗病毒方法的有用见解。 另一方面，Kaptein和合作研究者鉴定了一种有前途且有效的泛血清型DENV抑制剂，称为JNJ-A07。它是一种靶向NS3和NS4B相互作用的抑制剂。NS3-NS4B复合物的形成是病毒复制的重要部分，因此该抑制剂通过在细胞质环上引起构象变化来阻断复合物的形成。他们的研究表明，抑制NS3和NS4B之间的相互作用显示出有前途的抗病毒机制和很好的抑制效果。这种抑制剂具有良好的药代动力学，并且对不同的21种基因型和血清型组合显示出有前途的抑制活性。 3.4.疫苗开发和针对DENV感染的潜在疫苗候选物 由于其四种抗原性不同的血清型可能引起的复杂感染，疫苗的开发一直是登革热治疗的巨大挑战。一种DENV血清型的初次感染将导致长期同型保护，但对其他血清型的短期异型保护，因此一个人在第二次异型感染期间可能会面临疾病加重。通过在二级淋巴组织中形成生发中心（GC），在滤泡辅助T细胞（Tfh）的帮助下，产生长期抗体分泌浆细胞对于开发有效的登革热疫苗很重要。 到目前为止，全球唯一授权的疫苗是Dengvaxia（CYD-TDV），它是一种活体嵌合、减毒和四价疫苗，由非结构黄热病17D株病毒骨架组成，结合了四种DENV血清型的结构前膜（prM）和包膜（E）基因。然而，Dengvaxia仅适用于9至16岁之间的感染人群。 其他疫苗候选物仍在通过不同阶段的临床试验，从第一阶段到第三阶段。正在进行第三阶段临床试验的疫苗候选物包括TV003/TV005（NCT01506570）和TDV/DENVax/TAK003（NCT02302066）。疫苗候选物TDEN-LAV（NCT01702857）仍在进行第二阶段临床试验，TDEN-PIV（NCT01666652）和D1ME100/TVDV（NCT00290147）目前处于第一阶段临床试验阶段，而V180（DEN-80E）（NCT01477580）已完成第一阶段临床试验。 Graham及其团队最近开发了一种新的活体减毒四价疫苗（DLAV），在接种疫苗后的8到14天内迅速产生DENV特异性多功能T细胞，并至少保留6个月。此外，DLAV还诱导效应记忆T细胞重新表达CD45RA（TEMRA），在接种疫苗后1年内保持其高频率。这表明这种疫苗诱导的免疫保护非常有希望。 在先前的研究中，Pinto团队展示了基于E蛋白的DNA疫苗（pE1D2）和基于NS1的DNA疫苗（pcTPANS1）都能在免疫小鼠模型中诱导免疫保护。在他们最近的研究中，他们更感兴趣的是找出两种DNA疫苗候选物组合所能诱导的保护性免疫。他们的研究表明，用pE1D2+pcTPANS1 DNA疫苗接种的小鼠由于结合的免疫反应而获得了出色的免疫保护。即使在DENV-2的致命挑战之后，pE1D2+pcTPANS1免疫的小鼠也没有发现病态，由于免疫反应的加强，它们也没有表现出感染的临床迹象。 所有上述讨论的潜在治疗剂总结在表1. 4.DENV诊断 在登革热诊断中，提供高特异性定量评估的传感器对于更好的监测和早期检测很重要。用于DENV诊断的常见检测方法之一包括酶联免疫吸附测定（ELISA）。这种测定有一些限制，如昂贵的测试套件和需要几个小时才能检测到目标兴趣。除此之外，在急性阶段使用病毒分离来诊断DENV感染既耗时又需要非常熟练地处理细胞培养或动物模型。对于逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法，它能够在发热阶段检测早期DENV感染，但也耗时且程序复杂。免疫层析测定法也常用于DENV检测，特别是应用了金纳米颗粒偶联抗体作为捕获蛋白的测定法。金纳米颗粒（AuNPs）是由于其稳定性、无毒性、生物相容性和易于与许多生物分子功能化等优点而在侧流测定中应用的有前途的纳米材料。 由于感染患者血清中NS1抗原水平高，使其成为许多商业免疫测定类型（如侧流快速测定和ELISA试剂盒）中一个有前途的生物标志物，因此NS1的检测已被应用于许多类型的单克隆或多克隆抗体基础免疫测定。与病毒RNA相比，病毒抗原在登革热感染患者的血液中循环时间更长，因此在RT-PCR中病毒RNA不可检测时，检测NS1抗原更受青睐。 图4说明了初次和二次感染期间NS1抗原、IgM和IgG的水平。在初次感染期间，从第0天起就可以检测到NS1抗原，并且在第4天会获得一个小高峰。即使NS1和IgM从感染的第3天到第9天同时存在，抗原检测也不会受到IgM存在的影响。另一方面，IgM的检测只能在发病后3到4天进行，并且从第5天起在血清中会保持持续量。从症状发作后第10到15天起，才能有效检测IgG。通常，IgG检测测定会用于根据IgG水平区分初次和二次感染。这是因为IgG只有在初次感染后几周或几个月才会显著提高。在二次感染期间，由于其快速的记忆反应，从第3天起就可以检测到IgG，这导致早期IgG水平高。 图4. 原发性和继发性登革热感染的NS1、IgM和IgG水平。(A) 在原发性感染期间，从第0天起可以检测到NS1，从第3天起可以检测到IgM，而IgG只能在第10天起检测到。(B) 对于继发性感染，IgG水平用于区分原发性和继发性感染，因为在急性期由于快速的免疫记忆IgG反应，IgG水平非常显著。 4.1.当前商用诊断试剂盒 NS1的检测是早期诊断DENV感染的有效方法，一旦发热开始，由于其在早期阶段出现，即在第0天至第9天内，第6至10天可以检测到最大水平。在Alcon等人的研究中，从症状发作的第一天开始，NS1抗原在血清中循环，长达9天，NS1的浓度从第0天的0.04lb/mL增加到第7天的2.00 lb/mL，而恢复期血清样本从第8天开始的浓度为0.04 lg/mL。对于二次感染，NS1在血淋巴中的浓度约为0.01至2 lb/mL，且在恢复期血清样本中未检测到。因此，大多数商用试剂盒侧重于检测NS1作为DENV诊断的生物标志物，因为它在早期阶段有可检测的显著量。 根据S. D. Blacksell及其团队的评估，商用NS1抗原现场诊断测试的敏感性和特异性分别在48.5%至58.6%和92.5%至99.4%之间。根据Osorio L.团队对不同商用NS1诊断测试的敏感性和特异性进行的比较，SD BIOLINE™ NS1/IgM/IgG检测提供最高的检测敏感性，高达80.7%，其次是SD BIOLINE™ NS1/IgM（78.4%）和第二代Pan E™（71.1%）。还有其他研究对不同类型的商用诊断试剂盒进行了审查。 商用SD Bioline Dengue Duo检测是常见的诊断测定，包括2种评估测试，用于检测患者血清中的DENV NS1和抗-DENV IgG或IgM。它的益处在于对DENV IgM和IgG的额外评估，增加了检测敏感性，这对NS1检测测定是补充的。SD Duo测试的改进敏感性再次通过比较NS1/IgG/IgM的联合检测和每个单独生物标志物的检测得到证明。NS1/IgG/IgM测试显示最高的敏感性（90.65%），其次是IgG测试（90.06%），NS1测试（87.50%）和最后是IgM（60.515）。将两个或更多登革热生物标志物（如NS1与IgM或NS1与IgM和IgG）的组合似乎对诊断试剂盒的整体性能有改善作用，从53.5%提高到88.7%和从60.61%提高到90.65%。 然而，无论是IgG还是IgM检测的单独阳性结果也可以表明过去几个月的感染，这只能被视为推定诊断。此外，当IgM测试作为单一生物标志物使用时，其敏感性被报道为低，从IgM测试获得的阴性结果不能完全排除登革热感染的嫌疑，因此IgM测试更适合用于检测近期感染，而不是作为急性感染诊断的标志。 4.2.当前诊断测试的限制 在Jayathilaka及其团队的研究中，大多数特异性检测NS1的抗体是针对高度保守的NS1区域，这导致与JEV和WNV的交叉反应超过65%。NS1抗体的产生可能是由于其他黄病毒的感染，并在DENV的二次感染期间增加到更高的抗体滴度。此外，RDTs中的假阳性通常是由于先前由任何类型的黄病毒或不同登革热血清型感染的残留抗体引起的，这在流行区经常发生。 Chung提到，商用诊断试剂盒似乎存在高变异性，范围从37%到98.9%，这可能是由于在二次感染期间，特别是在病毒血清型2、血清型4的发热开始后，随着时间的推移，敏感性降低，血清中发现大量DENV反应性IgG时，这一点在Osorio等人（2010）的研究中得到证明，即在二次感染的发热开始4天后和严重感染的情况下，检测敏感性降低。与诊断试剂盒的时间依赖性敏感性相关的是，疾病的持续时间据说会影响诊断试剂盒的敏感性，因为Guzman团队的研究报告称，与后期收集的血清样本相比，试剂盒在测试亚洲患者的急性血清样本时更为敏感，这些样本是在疾病初期的前3至4天内收集的。 此外，诊断试剂盒的敏感性也因不同类型的DENV血清型而异。在Guzman等人（2010）的研究中，Platelia试剂盒对DENV-2的敏感性最低，与其他血清型相比，诊断试剂盒对不同血清型的敏感性差异可能与不同血清型和同一血清型不同来源的特定NS1表位有关。 尽管有各种商用DENV诊断试剂盒的可用性，但仍存在一些现有的限制，如表2所列。 4.3.改善DENV诊断和发现有前景的诊断标记 Nascimento等人的研究发现，抗登革热NS1 IgG和IgG3有潜力被开发为长期DENV感染的生物标志物，而不是通常用于检测急性感染的生物标志物，如IgA和IgM抗体。这可能是因为它们在感染症状出现后的第一周内持续存在，有助于早期检测，并且检测窗口期更长，即在症状出现后4至6个月内。相比之下，NS1抗原检测的检测时间限于发病后的前几天，以最大化检测灵敏度。 生物功能化的锥形光学纤维可作为DENV诊断中的无标签定量诊断工具，因为它具有快速检测时间、简单过程、便携式可用性和易于制造的优点。在二次感染的早期，IgG抗体的存在量会比初次感染时更高，因此为抗体通过抗原生物受体的捕获提供了更高的可能性。Mustapa及其团队专注于通过在锥形多模光纤（TMMF）上固定DENV NS1抗原来检测抗NS1 IgG抗体。他们确定生物功能化的TMMF能在5分钟内检测到100 pg/mL的抗体，其灵敏度可达7 × 10-6a.u/pg/mL。这种生物功能化的TMMF可被用于DENV诊断，以获得更好的灵敏度和快速诊断结果。 Mustapa及其团队最近的研究是改进TOF的生物传感性能，通过整合纳米材料如聚酰胺胺（PAMAM）树状分子。这是一种超支化大分子，当集成到TOF中时，可以作为活性层。这种策略可能会增加TOF传感器的活性位点，以便于目标抗原的附着，主要是由于PAMAM树状分子的极性功能，它能够在其边缘锚定蛋白质并改善蛋白质装载。他们的研究将PAMAM树状分子集成到TOF传感器中作为活性层，以增强抗体吸收，从而在固定过程中为DENV-2 E蛋白的结合提供更多的活性位点。这种改进的PAMAM集成TOF传感器显示出与Kd值为1.02 ×10-10M的传感亲和力，比他们之前的研究更好。这可能是因为使用了PAMAM，它提供了更多的结合位点，并为E蛋白附着提供了更大的表面积。他们的研究证明，将PAMAM树状分子作为活性层在生物功能化的TOF传感器中大大增强了其在识别DENV E蛋白方面的性能。 之前，许多工作已经进行了利用血清型特异性抗体在DENV诊断测定中的应用，但这些方法在区分所有DENV血清型方面效果不佳。与其使用杂交瘤技术产生的抗体，不如使用来自人类天然噬菌体展示库的血清型特异性抗体，据报道它们可以通过与单一泛反应性捕获抗体结合来进行多重诊断，因为它们具有特定的表位。这些表位与NS1中最易接近的表位之一的翼状结构域表位不同。因此，使用来自人类天然噬菌体展示库的血清型特异性抗体的应用可能为解决DENV血清型鉴别的挑战提供了思路。 研究人员成功地产生了能够检测所有DENV血清型和ZIKV的杂交瘤抗体，且不会与小鼠免疫接种的重组DENV1、DENV2、DENV3、DENV4和重组ZIKV蛋白发生交叉反应。有效的检测仅适用于在急性期收集的血清样本，因为这是NS1和RNA都可检测的阶段。杂交瘤抗体对血清型特异性测试和泛DENV测试的检测限从1到20 ng/mL不等，而20 ng/mL是ZIKV NS1检测的检测限。 含有高浓度IgG的血清样本可能会导致NS1抗原与IgG形成免疫复合物而无法被检测，这进一步影响了诊断试剂盒的灵敏度。IgG的高水平通常存在于二次登革热感染患者的血清样本中。对于一些血液传播病毒如乙型和丙型肝炎，解离的抗体-抗原免疫复合物在早期诊断中起着重要作用。根据Koraka及其团队的说法，NS1抗原和IgG形成的免疫复合物需要被分解，以检测二次感染患者血清中NS1的存在。 针对病毒的sdAb研究越来越受欢迎，他们发现sdAb可以作为治疗和诊断领域的有前途的工具。纳米抗体是指具有最小分子大小的抗原结合片段，大约为15 kDa。它可以从鲨鱼和骆驼科动物（如羊驼和驼）中获得，这些动物没有轻链。纳米抗体的一个例子是单域抗体（sdAb），它由互补决定区（CDRs）组成，如CDR1、CDR2和CDR3。CDR3是一个不寻常的环，它长且延伸，能够穿透并结合到抗原的裂缝中，使其在目标结合上具有高亲和力。sdAb具有极高的热稳定性，高达95°C，并能在热变性过程中重新折叠，保持其结合亲和力。sdAb的热稳定性可以是解决使用传统mAb进行快速诊断测试时遇到的问题的方案之一。 具有特定结合亲和力的人类单链可变抗体片段（HuScFv）针对NS1的R和E域，被证明在暴露于HuScFv时，通过干扰细胞内NS1的产生和恢复宿主先天免疫活性，有效减少流感病毒感染的宿主细胞中的病毒复制。众所周知，具有Fc区域的抗NS1抗体会以某种方式诱导补体介导的细胞溶解，这可能加剧DENV感染。因此，首个专注于完全针对NS1的HuScFv的抗体开发被报道。这种HuScFv不包含Fc区域，并且比传统的IgG小得多。HuScFv与NS1的结合能力，无论是在天然形式还是分泌形式，表明它可能能够中断NS1的作用。这项研究表明，通过HuScFv和NS1之间的相互作用，可以中断病毒复制过程，因为病毒释放减少了。 与商用试剂盒SD Bioline Dengue Duo、固定mAb试剂盒和固定VHH抗体试剂盒相比，固定VHH抗体试剂盒在3种诊断试剂盒中实现了最高的特异性（99.50%），其对重组NS1的检测限为4.5 ng/mL，远低于固定mAb试剂盒（9 ng/mL）。从固定VHH抗体试剂盒获得的检测限不仅在急性期循环NS1的检测限范围内（10 ng/mL至50 µg/mL），而且远低于该范围，表明该试剂盒对检测低水平的DENV2 NS1具有显著的灵敏度。Fatima及其团队还使用表位绘图来识别VHH抗体和mAb的潜在表位。他们发现，两种类型的所有结合肽都有与NS1抗原的氨基酸序列从位置224到232相对应的同源区域。His和Trp几乎出现在每个克隆中，表明这两种氨基酸对抗体结合至关重要，特别是His残基。这种固定VHH抗体试剂盒是一个非常有前景的诊断工具，与其在效率、灵敏度、特异性和结合亲和力方面相比固定mAb试剂盒的优势。 基因工程改造可以应用于单域抗体（sdAb）以提高免疫分析的检测限。将sdAb作为捕获蛋白在与复杂基质的大总面积发生共价相互作用时存在局限性。它的小分子大小在与广泛的结合界面结合时会遇到困难，这将进一步影响目标蛋白的检测和分析的灵敏度。一种有趣的方法是通过蛋白质工程改造sdAb，获得二聚体形式的SpyTag融合sdAb，通过固定在SpyCatcher涂层微球上形成SpyCatcher/SpyTag对。应用SpyCatcher/SpyTag对有助于显著增加与非定向sdAb相比，所有DENV血清型污染的人血清中NS1的检测信号。检测限提高至5倍的增加是SpyTag融合sdAb在DENV诊断和其他蛋白质捕获应用中的有希望的结果。 上述讨论的主题的启示性部分总结在表3中。 5.结论  DENV的广泛传播早已是一个长期的公共卫生问题，随着COVID-19大流行的爆发，一些亚洲国家将需要面对双重负担，特别是对经济和卫生部门的影响。更令人担忧的是，大多数COVID-19病例从轻到中度疾病，与登革热感染常见的症状（如发热和皮疹）相似，因此存在很高的可能性，COVID-19病例和登革热病例可能会被误诊，或者一个人可能会同时感染两种病毒，就像DENV和其他黄病毒一样。此外，也有报道称在印度尼西亚、泰国和新加坡等国家存在交叉反应的案例。到目前为止，由于不同DENV血清型和不同黄病毒的感染导致的交叉反应问题仍未解决。此外，也存在更高的可能性发生ADE状况，并恶化病情。除了这些问题，DENV逃避免疫反应的习惯也是有效控制DENV感染时需要考虑的因素之一。为了解决交叉反应问题，已经持续进行了许多方法来发现有用和潜在的抗病毒药物、中和抗体和疫苗候选物，它们可以有效地发挥作用。这些方法包括基因工程的应用、纳米抗体的衍生、分子模拟、抗原隐蔽表位的发现、结构研究和抑制机制。此外，开发更敏感和特定的诊断替代品也非常需要，以解决当前商用诊断试剂盒的限制，以便能够快速和早期诊断黄病毒或其他新出现的烈性病毒，以便对感染患者进行立即的临床管理。纳米抗体衍生物和抗体工程等方法在开发敏感和特定的生物标志物检测器方面是一个有趣的想法。有趣的是，NS1可能作为DENV检测的潜在生物标志物，因为许多生物标志物检测器可以如上所述特别针对NS1抗原。总之，治疗和诊断方面的开发为未来的发展提供了有用和有趣的想法。

摘要：RNA分子的生产、修饰和细胞传递方面的最新进展促进了基于RNA的治疗学的扩展。对RNA生物学的不断深入理解也引发了RNA治疗学的相应增长。在这篇综述中，将讨论五类基于RNA的治疗学的一般概念，包括基于RNA干扰的疗法、反义寡核苷酸、小激活RNA疗法、环状RNA疗法和基于信使RNA的治疗学。此外，我们还提供了已经获得监管批准或目前正在临床试验中评估的基于RNA的治疗学的概述，以及这些技术面临的挑战。基于RNA的药物在临床试验中显示出积极的结果，并有能力解决以前“无法成药”的靶点，这为实现其全部临床潜力提供了巨大的希望，作为一种颠覆性的治疗技术。 1.  引言 从1961年发现信使RNA（mRNA）到2021年首个mRNA疫苗获批上市，已经过去了60年。在这60年的时间里，RNA领域发生了巨大的发展。1977年，Roberts和Sharp发现了RNA剪接，并因此获得了1993年的诺贝尔生理学或医学奖。1982年，Cech发现了四膜虫RNA的自剪接核酸酶，并与Altman共同获得了1989年的诺贝尔化学奖，因为他们的发现。这一发现为RNA领域翻开了新的一页，RNA分子被公认为具有复制和催化双重功能的生物分子。1993年，Ambros发现了第一个微小RNA（miRNA）; 1998年，Fire和Mello发现了RNA干扰（RNAi）现象，并获得了2006年的诺贝尔生理学或医学奖。RNAi成为了基因功能研究的重要工具，20年后，首个RNAi药物成功获批上市。1999年，Ramakrishnan、Steitz和Yonath完成了核糖体晶体结构，证明了核糖体作为一种核酸酶，并因此获得了2009年的诺贝尔化学奖。2011年，Charpentier和Doudna发现了CRISPR基因编辑技术，并因此获得了2020年的诺贝尔化学奖，揭示了sgRNA引导的DNA切割作为关键的基因治疗工具。RNA分子短短60年的历史产生了五个与RNA科学发现相关的诺贝尔奖，这突显了它在化学和生物领域的重要性，并强调了它作为一种不可替代的技术，将彻底改变医学。 基于RNA的药物主要分为两大类：（i）通过化学方法合成的寡核苷酸药物，如反义寡核苷酸（ASOs）、siRNAs（小干扰RNA）和RNA适体；（ii）通过体外转录合成的大分子RNA药物，如mRNA药物。全球近108种寡核苷酸药物进入临床管道，包括ASOs、siRNAs、适体、单导向RNA（sgRNAs）和miRNAs。此外，全球还有56种mRNA药物也进入临床管道。截至本文撰写之日，全球共有16种核酸药物获批上市，见表1。随着Biogen和Ionis开发的Nusinersen的推出，世界上首个治疗脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的寡核苷酸药物出现，目前是销售额最高的寡核苷酸药物。 表1 全球上市的基于RNA的药物 由于大分子结构和负电荷，寡核苷酸药物容易被核糖核酸酶降解，难以穿透细胞膜，2008年至2013年因安全问题和递送系统问题而陷入低谷。药物递送在保护RNA结构、增加靶向能力、降低给药剂量和减少毒副作用方面起着至关重要的作用。随着关键递送系统的技术突破，寡核苷酸药物行业迎来了蓬勃发展。RNAi治疗是治疗遗传疾病和“无法成药”靶点的重要策略。siRNA和miRNA是有意义的基因沉默工具；四种siRNA药物候选已经获批，然而许多miRNA药物大多因安全问题而终止，只有五个候选药物继续进入临床开发，没有一个进入III期临床试验。siRNA和miRNA药物之间最大的区别是它们的作用机制。siRNAs是完全互补的靶向基因沉默序列，进入体内作用于特定的目标基因。相比之下，一个miRNA可以调节成百上千个基因，一个基因也可以被许多不同的miRNAs调节。因此，很难指定miRNA来调节一个特定的基因，并可能导致意想不到的副作用。只有解决miRNA药物的特异性问题，miRNA才能在临床环境中应用。 作为一种具有巨大潜力的技术平台，基于mRNA的治疗可用于传染病预防、肿瘤免疫治疗、蛋白质替代治疗，甚至基因编辑。mRNA的治疗途径可分为三类：预防性疫苗、治疗性疫苗和治疗药物。Pfizer和BioNTech开发的Comirnaty，以及Moderna开发的Spikevax，分别于2020年12月获得美国食品药品监督管理局（FDA）的紧急使用授权，以预防由SARS-CoV-2引起的COVID-19。2021年，Comirnaty和Spikevax的销售额分别达到368亿美元和177亿美元。这两种疫苗在全球大流行病的预防中大放异彩，标志着mRNA技术正式进入商业化时代。 RNA分子长期以来被认为在细胞过程中发挥着重要作用，从基因调控和表达到酶促反应。RNA治疗学是一个迅速扩大的药物和治疗类别，从实验室到临床实践的速度前所未有。最初认为RNA分子由于其不稳定性和相对较短的半衰期，将是一种较差的治疗剂。然而，随着稳定化学的进步和对其瞬时特性的应用，RNA分子作为治疗剂在临床上显示出价值。在这里，我们简要回顾了五类基于RNA的治疗：（i）基于RNAi的治疗，（ii）ASO治疗，（iii）小激活RNA（saRNA）治疗，（iv）环状RNA（circRNA）治疗，和（v）基于mRNA的治疗，以及其在后期临床开发中的药物候选。有数百种寡核苷酸和mRNA药物候选正在进行发现和临床前开发，目前有超过150种寡核苷酸药物和mRNA治疗正在进行临床试验。2018年和2020年是RNAi和mRNA领域的里程碑，因为基于RNA的治疗获批上市。随着更多的RNA治疗正在开发中，RNA基础治疗的未来是光明的。 2.  RNAi基治疗 近几十年来，小非编码RNA的发现及其在基因调控中的作用彻底改变了RNA生物学领域。RNAi最初由Andrew Fire和Craig Mello描述，他们因对RNAi的贡献而获得了诺贝尔生理学或医学奖。他们在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现了由外源RNA介导的基因沉默机制。像siRNA这样的小非编码RNA形成称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的复合物，它指导目标信使RNA(mRNA)的降解，如图1所示。RNAi的转录后基因沉默机制使其成为通过抑制基因的特定碱基序列来控制基因表达的强大工具，彻底改变了药物的发现和开发。 图1 siRNA生物生成的示意图，用于沉默目标mRNA。siRNA前体是一个双链RNA，可以由病毒、转座子或其他来源在内源或外源产生。前体被酶切割，以便正确装载Argonaute蛋白，并由一个双链RNA结合蛋白协助，这允许导向链与Argonaute结合，随后乘客链被排出。最后，沉默活动可以通过目标结合和切割发生。 鉴于RNAi的特异性和效力，许多基于RNAi的策略已经开发出来用于治疗目的，包括siRNA和miRNA治疗，它们在临床试验中作为医疗干预药物显示出有希望的结果。截至2021年底，已有四种RNAi药物获得欧洲委员会(EC)和FDA的批准和授权，为RNAi治疗的有效性和安全性提供了概念验证。siRNA和miRNA治疗的作用机制及其候选药物的例子将在讨论中。 3.  siRNA治疗 2018年，美国FDA和欧洲药品管理局(EMA)批准了patisiran(ONPATTRO; Alnylam Pharmaceuticals)，这是一种siRNA药物，用于治疗由遗传性转甲状腺素(hATTR)淀粉样变性引起的多发性神经病变的成年患者。这种siRNA药物是首个获批的基于RNAi的治疗药物，标志着RNAi治疗的新时代。目前，已有四种siRNA药物获批上市，还有许多正在进行临床试验，如表2所示。 表2 已批准上市或正在进行/已完成2期和3期临床试验的代表性siRNA药物列表 siRNA属于dsRNA类分子。顾名思义，siRNA的长度很短，大约为18到25个核苷酸(nt)，每个链的3'端有无两个悬出的磷酸化碱基。siRNA治疗的机制利用了其自然能力，即通过Argonaute 2(Ago2)的催化域切割完全互补的mRNA的特定序列。设计成模仿Dicer切割的合成siRNA，称为"Dicer-ready" siRNA，可以被传递到感兴趣的细胞并直接被Ago2-RISC复合物识别和装载，使其作为药物特别有吸引力。通过设计所需效力和特异性的siRNA序列针对目标mRNA，可以沉默疾病引起的mRNA。 最新获批用于治疗ASCVD和HeFH的siRNA药物inclisiran(LEQVIO; Novartis)，是一种首创的N-乙酰半乳糖胺(GalNac)修饰的siRNA共轭物，显示出显著降低血浆胆固醇水平。动脉粥样硬化被描述为一种慢性动脉炎症性疾病，导致慢性斑块积聚阻塞血管，导致狭窄和组织缺氧，是ASCVD的主要原因。动脉粥样硬化的发病机制复杂; 然而，已知它与增加的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平有关。Inclisiran针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/半胱氨酸蛋白酶9型(PCSK9)的mRNA; PCSK9是一种与LDL受体(LDLR)结合的丝氨酸蛋白酶，调节胆固醇和细胞质载脂蛋白B(ApoB)，发现它增加了血浆LDL浓度。通过抑制PCSK9的产生，降低的PCSK9 mRNA表达减少了LDLR的降解，并增加了LDL的摄取，以降低LDL-c的浓度。 2期和3期临床试验显示了inclisiran在ASCVD和HeFH患者中的有希望的结果。ORION-9试验(NCT标识符：NCT033907121)招募了482名HeFH患者; ORION-10试验(NCT标识符：NCT03399370)在1561名ASCVD患者中进行; ORION-11试验(NCT标识符：NCT03400800)招募了1617名ASCVD或其风险等价物患者。在这些3期试验中，患者在第1天、第90天、第270天和第450天接受了1.5毫升皮下注射，注射了284毫克的inclisiran(相当于300毫克的inclisiran钠)。 所有3期研究报告说已经达到了他们的主要疗效终点。上述三项随机临床试验(RCT)的汇总分析显示，与安慰剂组相比，每年两次剂量的LDL-c总体降低了51%，并将主要不良心血管事件率降低了24%。此外，发现inclisiran降低了总胆固醇、ApoB和非高密度脂蛋白胆固醇水平。因此，inclisiran通过每年两次剂量抑制肝脏PCSK9的产生，有效降低LDL-c水平，并维持这种效果。 除了inclisiran的疗效外，其安全性同样可接受。三项RCT的安全性概况与之前的研究一致，并且没有与异常肝功能、肌酸激酶水平和血小板计数相关。与安慰剂相比，注射部位不良事件在使用inclisiran时报告得更频繁。尽管inclisiran的表现显示出LDL-c和PSCK9水平的显著降低，但另一项三项研究的荟萃分析观察到，在心肌梗死风险方面，使用inclisiran的患者与安慰剂相比没有统计学上的显著差异。总体而言，inclisiran通过每年两次剂量抑制肝脏PCSK9的产生，显著降低LDL-c水平，同时展现出理想的安全性概况。inclisiran及其前驱siRNA药物的成功展示了siRNA导向的RNAi治疗的有希望的未来。这也是第一个用于治疗常见慢性病的小核酸药物。 4.  miRNA治疗 miRNA治疗作为一种治疗不同疾病的新型治疗剂，因其在发育中的作用而开始出现。如前所述，miRNA和siRNA都是能够通过转录后基因沉默靶向mRNA的小双链RNA分子。然而，它们的生物合成和作用机制不同。miRNA的生物合成始于核内，其基因转录受到严格调控，如图2所示。miRNA双链——由处理过的pri-miRNA产生的结果——与RISC结合形成miRISC，由成熟的miRNA引导进行目标识别。与siRNA不同，miRNA通过部分互补碱基配对与目标mRNA结合，抑制mRNA翻译而不是目标mRNA的裂解。 图2 miRNA生物生成和作用机制的示意图。前体miRNA（pre-miRNA）由位于细胞核中的初级miRNA（pri-miRNA）产生，它由末端环和不匹配组成。pre-miRNA进入细胞质，由Dicer酶切割末端环，生成miRNA双链。随后的过程与siRNA的生物生成相似，其中RISC与其RNA双链形成，并装载到Argonaute上进行链的选择。最后，成熟的miRNA准备就绪，可以与目标mRNA结合并促进其降解。 miRNA治疗的应用有两种方法：miRNA抑制和miRNA替代。miRNA抑制利用合成的单链RNA类似物，与目标miRNA的活性链互补，并作为miRNA拮抗剂(也称为anti-miRs或antagomiRs)抑制内源性miRNA，这在结构上类似于反义寡核苷酸。Anti-miRs最初由Krützfeldt等人描述，其中这些化学修饰的、胆固醇结合的、与目标miRNA互补的寡核苷酸的静脉注射降低了小鼠中miR-16、miR-122、miR-192和miR-194的水平。后一种方法采用合成miRNA(也称为miRNA模拟物)来模拟目标miRNA的功能，促使mRNA抑制。 miRNA模拟物可以像化学修饰的siRNA一样使用，具有与目标miRNA相同的导向链，它们被装载到RISC上以抑制下游内源性miRNA。由于其与典型miRNA的相似性，miRNA模拟物可能作为癌症管理的治疗剂，因为肿瘤抑制miRNA在癌症发展中的作用。然而，miRNA模拟剂的传递仍然存在挑战。 miRNA治疗的出现尚未转化为医疗干预的批准药物候选。迄今为止，有几种miRNA分子正在进行临床试验。然而，没有进入3期试验。目前，Regulus和Genzyme(Sanofi)开发的lademirsen(RG-012)正在进行2期试验的患者招募(NCT标识符：NCT02855268)。Lademirsen是一种anti-miR药物候选物，通过皮下给药来沉默Alport综合征患者的microRNA-21(miR-21)的功能。Alport综合征是一种X连锁遗传疾病，其特征是由胶原蛋白IV基因突变引起的慢性肾病。Gomez等人的临床前研究发现，化学修饰的anti-miR-21寡核苷酸与磷酸硫酯键和修饰的糖单元增强了对miR-21的亲和力，并改善了Alport神经病变小鼠模型的生存率。关于lademirsen的临床数据在本次审查时尚未发布。 除了lademirsen的临床开发外，MiRagen Therapeutics(现为Viridian Therapeutics)开发的remlarsen(MRG-201)已完成2期试验，用于治疗瘢痕疙瘩患者(NCT标识符：NCT03601052)。Remlarsen是一种microRNA-29(miR-29)模拟物，旨在治疗病理性纤维化。miR-29家族被发现在纤维化调节途径中发挥作用，其中miR-29的表达水平在纤维化疾病中较低。Remlarsen模拟miR-29以抑制纤维化的形成，如皮肤纤维化。Gallant-Behm等人的研究总结了在健康志愿者中皮下给药的remlarsen的1期临床数据，该药物候选物减少了切口皮肤伤口中的胶原蛋白表达和纤维母细胞增生的发展。此外，该候选物在1期研究中所有研究剂量中被认为是安全且耐受性良好的。1期结果表明，remlarsen可能是预防皮肤纤维化的有效的治疗；然而，尚未发布的2期临床结果在有瘢痕疙瘩病史的患者中可能具有更重大的临床意义。尽管miRNA药物有大量的临床前研究，但只有少数miRNA药物候选物进入临床开发，50%的miRNA药物在临床开发阶段经历了终止或暂停。在开发miRNA药物候选物时面临挑战，例如确定不同疾病特定的miRNA靶标及其精确传递，同时避免进入细胞时的降解。 RNAi基治疗，如siRNA和miRNA治疗，是一个不断发展的领域，对许多疾病具有巨大的治疗前景。RNAi药物面临一些挑战，如内体逃逸和传递到非肝脏和非肾脏组织。尽管目前只有四种siRNA治疗获得了监管批准，但预计不久的将来会有更多的siRNA治疗出现。RNAi治疗提供的广泛的临床应用和安全性概况加强了其潜力。 5.  反义寡核苷酸治疗 1978年，Zamecnik和Stephenson利用与Rous肉瘤病毒目标序列互补的13个核苷酸长的反义寡核苷酸（ASO），在体外展示了病毒复制的抑制，这为ASO作为治疗手段的潜力打开了大门。自这一发现以来，寡核苷酸药物的开发取得了显著进展。ASO是短的单链且高度修饰的核酸类似物，旨在针对特定序列的RNA进行降解。如图3所示，ASO有几种作用机制。目标RNA通常是核内的前体mRNA（pre-mRNA），ASO与多聚腺苷酸识别位点结合，利用核糖核酸酶（RNase）H阻止多聚腺苷酸化；ASO也可以结合到细胞质中mRNA的翻译起始位点，以抑制翻译。 图3 ASO作用机制的示意图。A. 细胞质中的ASO与目标RNA结合，导致RNase H切割，引发目标mRNA降解。B. 细胞质中的ASO也可以结合到mRNA上，阻止RNA结合蛋白复合体的结合，抑制目标mRNA的翻译。C. ASO可以进入细胞核，通过结合并阻断剪接位点或外显子/内含子序列来调节剪接，这些可以通过核糖核蛋白(RNP)复合体催化，以跳过或包含目标外显子。 ASO的化学修饰对其作为治疗药物的转化至关重要，这有助于提高稳定性、特异性并减少不良反应。通常，ASO在两个修饰的2'糖的两个侧翼区域之间具有磷酸硫（PS）键，形成骨架。PS部分保护寡核苷酸不受外切酶的降解并提高稳定性。这种设计呈现了一个中心PS寡核苷酸间隙，赋予了“gapmer”的名称，当RNA-DNA双链形成时，可以激活RNase H1对目标RNA进行切割。此外，磷酸二胺吗啉寡核苷酸（PMOs）的修饰也在ASO中广泛使用，其中六元的吗啉环取代了五元的核糖呋喃糖，骨架通过磷酸二胺连接。这种修饰也稳定了PMO对抗核酸酶的能力，但最小化了对互补目标RNA亲和力的降低。此外，另一种ASO的设计是RNase H独立或仅占用途径，其设计为空间上的障碍，以空间上抑制或防止目标RNA的翻译或剪接。一些ASO药物已经获得了FDA和EMA的批准，如表3所示。迄今为止，已有九种基于ASO的药物获得批准，用于商业用途，所有这些药物都治疗罕见疾病。然而，目前正在开发的ASO显示出ASO平台的应用正在向治疗其他常见病迈进。 表3 已批准上市或正在进行/已完成3期临床试验的代表性反义寡核苷酸药物列表 最近获批的基于ASO的药物casimersen获得了美国FDA的加速批准，用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）。DMD是一种X连锁隐性退行性神经肌肉疾病，由DMD基因中的移码或无义突变引起，该基因编码肌营养不良蛋白，这些突变抑制了功能性肌营养不良蛋白的产生。Casimersen利用基于PMO的策略，引起DMD基因中第45个外显子的跳跃，以绕过移码突变，允许内部截断但部分功能性肌营养不良蛋白的产生。在其1/2期研究中，PMO药物候选物在DMD患者中耐受性良好，适合进行第45个外显子跳跃。3期ESSENCE试验（NCT标识符：NCT02500381）的中期结果显示，所有可评估的接受casimersen的患者都显示出第45个外显子跳跃的增加；然而，由于其样本量小和正在进行的3期ESSENCE试验，很难确定casimersen改善运动功能的能力。开发ASO基药物以治疗神经肌肉疾病的剩余挑战是ASO在肌肉组织中的分布和摄取不足。除了罕见疾病，心血管疾病也是ASO的目标领域。与siRNA治疗类似，ASO药物候选物也在开发中，用于治疗心血管疾病。Pelacarsen是一种首创的GalNAc结合PS ASO，它针对载脂蛋白(a)（apo(a)）的mRNA，使用RNase H1依赖性切割。脂蛋白(a)（Lp(a)）是一种含有ApoB和apo(a)的LDL样脂蛋白，通过二硫键连接，已发现与心血管疾病风险增加有关。在其2期研究（NCT标识符：NCT03070782）中，对286名已建立心血管疾病和增加Lp(a)水平的患者，Tsimikas等人观察到通过皮下给药pelacarsen后，Lp(a)水平剂量依赖性降低了35至80%，并具有良好的安全性概况。鉴于pelacarsen在2期研究中取得了有希望的结果，心血管疾病的ASO药物候选物正在进行3期临床试验（NCT标识符：NCT04023552）。反义技术的进步推动了ASO的发展，证明了基于ASO的药物是一种多功能且安全的治疗方法。大量治疗更常见疾病的ASO候选物正处于晚期临床开发阶段，这将在不久的将来产生有意义的结果。ASO需要克服一些现有的挑战，以扩大其临床应用，例如有效靶向传递到其他组织并减少在其他器官的非靶向积累。随着新型传递平台的发展，ASO治疗更常见疾病的前景是乐观的。 6.  小激活RNA治疗 小双链RNA家族还包括小激活RNA（saRNA），首次由Li等人和Janowski等人报道。研究人员发现，这些21个核苷酸长的双链RNA靶向特定基因启动子，诱导了基因转录激活，并被命名为RNA激活（RNAa）。这两项研究描述了由小双链RNA介导的基因表达诱导的自然现象。Li等人描述了设计的21个核苷酸长的双链RNA与E-钙粘蛋白、p21和VEGF（血管内皮生长因子）基因的启动子区域互补，以序列特异性方式诱导基因表达，并依赖于Ago2，类似于RNAi。Janowski等人展示了通过互补双链RNA靶向其启动子区域诱导孕激素受体表达。此外，RNAa已被证明在多种哺乳动物细胞中保守。RNAi和RNAa在分子机制上存在相似之处，如图4所示。在RNAa中，saRNA被装载到Ago2蛋白中，形成RNA诱导的转录激活（RITA）复合物。RITA复合物由saRNA/Ago2复合物、RNA解旋酶A和与RNA聚合酶相关的蛋白CTR9组成，与RNA Pol II相互作用，触发转录启动和有效的延伸。RNAa在其分子动力学、基因组靶向能力和激活核内目标基因转录延伸方面具有独特性。 图4 saRNA作用机制的示意图。引入的saRNA被装载到Ago2蛋白中，随后Ago2切割链选择形成saRNA/Ago2复合物，并被转运到细胞核。活性的RITA复合物目标并结合到基因组目标位点的启动子区域，并与RHA和CTR9结合，通过RNA聚合酶II（RNAP II）介导的转录活性。 RNAa的发现以及saRNA的作用为选择性基因激活研究提供了新的见解。此外，saRNA本身作为上调基因表达的新型治疗方式，在具有抑制性转录或翻译活性的疾病中提供了新的可能性。开发saRNA作为治疗药物有几个优点，包括低免疫原性和位点特异性基因转录激活；然而，其缺点，如对RNase降解敏感性和非靶向效应，也是关键的挑战。目前，几个saRNA药物候选物正在开发中，如表4所示。尽管大多数候选物仍处于临床前阶段，但MiNA Therapeutics开发的MTL-CEBPA已经进入2期，与蛋白激酶抑制剂索拉非尼联合治疗乙型或丙型肝炎感染的晚期肝细胞癌（HCC）患者（NCT标识符：NCT04710641）。 表4 临床开发中的代表性小激活RNA治疗候选药物列表 MTL-CEBPA是一种首创的saRNA寡核苷酸，具有2′-O-Me修饰，由SMARTICLES脂质体纳米粒子封装，并通过静脉注射给药，治疗HCC患者。转录因子C/EBP-a是一种亮氨酸拉链蛋白，通过与髓系基因的启动子区域结合，启动并激活髓系基因表达，已知与肝细胞调节相关。在小鼠肿瘤模型中，研究人员发现髓系来源的抑制细胞中C/EBP-a的下调；C/EBP-a的上调抑制了肝癌小鼠模型中的肿瘤生长。MTL-CEBPA旨在通过诱导CEBPA基因的转录来上调C/EBP-a。在与肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎或肝转移相关的HCC患者中进行的MTL-CEBPA首次人体1期研究结果显示，saRNA药物候选物的安全性概况可接受，建议的初始剂量为130 mg m−2，并通过其药效学分析显示了目标参与。然而，其疗效概况有限：在24名可评估MTL-CEBPA单药疗效的患者中，只有1名患者观察到客观的肿瘤反应和部分反应。在7名患者中使用酪氨酸激酶抑制剂（索拉非尼、lenvatinib或regorafenib）治疗，观察到3名完全反应，2名病情稳定，1名部分反应。1期研究得出结论，MTL-CEBPA对HCC的预处理有助于为酪氨酸激酶抑制剂，如索拉非尼的治疗效应创造更易接受的肿瘤微环境。 除了2期的MTL-CEBPA加索拉非尼外，MiNA Therapeutics还在开发MTL-CEBPA与PD1检查点抑制剂pembrolizumab联合治疗晚期实体瘤患者，已进入1期（NCT标识符：NCT04105335）。 尽管MTL-CEBPA的1期临床结果有希望，但这种新型寡核苷酸治疗方式仍存在不确定性和挑战。在目标序列识别方面仍缺乏明确的机制理解；当涉及额外的DNA元素时，目标基因组的可访问性也不清楚。 7.  环状RNA治疗 除了前述的RNA治疗方法外，另一种新兴的RNA治疗因其显著的研究进展而受到关注。环状RNA（circRNA）是一类具有环状结构的非编码RNA，它们没有末端结构，例如5'帽和3'聚(A)尾部，主要存在于真核细胞中。1976年，Sanger等人首次在类病毒中发现circRNA，现在通过RNA测序发现circRNA在众多物种中高度保守。由于circRNA的环状特性，它们的稳定性可能优于线性RNA，因为它们能够抵抗各种RNA外切酶的降解。此外，Wesselhoeft等人证明了外源性circRNA的蛋白表达比未修饰和修饰的线性RNA持续时间更长。因此，鉴于它们的稳定性和在真核细胞中表达时无需修饰，circRNA为医学应用提供了有希望的应用前景。 与大多数线性RNA不同，circRNA的生物生成涉及外显子的反向剪接，通过共价键将下游的“尾部”（3'）连接到上游的“头部”（5'）。这种共价键的形成使circRNA具有自然能力，能够抵抗主要的RNA降解途径。鉴于circRNA的异常稳定性，其调控和周转在管理其丰度方面非常重要。最近，更多的研究阐明了circRNA的周转机制，其中特定的circRNA，如CDR1as，可以通过完全互补的miRNA结合，然后通过Ago2介导的切割来降解；响应病毒感染的RNase L也可以降解circRNA；高度结构化的circRNA可以通过结构介导的RNA降解来调节。也就是说，需要额外的研究来确定circRNA的分子途径。 与其他RNA治疗方法一样，circRNA作为调节基因表达或携带模块化效应的潜在治疗方法而出现。合成的circRNA已被成功地证明在真核细胞中具有强大且稳定的翻译。Wesselhoeft等人设计了自剪接的前体RNA，使用间隔序列优化了圆环化效率，并能够圆环化长达5 kb的各种长度的RNA。经过工程化的高效液相色谱（HPLC）纯化的circRNA发现，与对照组相比，其翻译效率高达97%。此外，这种纯化的circRNA可以逃避细胞RNA传感器，如Toll样受体和RIG-I，同时提供比未纯化的circRNA更稳定的蛋白表达。此外，circRNA也可以与LNP配制而成，以实现在小鼠和恒河猴中有效的体内传递和翻译。最近，Qu等人展示了一种针对SARS-CoV-2的circRNA疫苗，编码了三聚体RBD的刺突蛋白，为动物提供了足够的保护。此外，他们还展示了使用合成circRNA表达SARS-CoV-2中和抗体和hACE2诱饵来中和假病毒颗粒。 最后，工程化circRNA的另一个应用是RNA编辑，其中循环ADAR招募RNA被用来招募本地ADAR1或ADAR2酶，将特定的腺苷碱基改变为肌苷，以执行精确的内源性RNA编辑。除了工程化circRNA外，circRNA治疗的另一种方法是利用基于circRNA的适体，其中一种名为Tornado（twister优化的RNA，用于持久过表达）的表达系统执行RNA圆环化，并产生能够结合蛋白的RNA适体。尽管在circRNA的研究和应用方面取得了显著进展，但大多数候选物目前仍处于发现阶段或临床前开发阶段。截至本文撰写之日，尚无circRNA治疗候选物进入临床试验。circRNA提供了几种有希望的医学和研究应用，从治疗药物和蛋白替代疗法到预防性疫苗。还应注意，circRNA的另一种潜在治疗方法是使用其他方法（如CRISPR-Cas9或siRNA）调节本native circRNA，以及使用本native circRNA进行生物标记或海绵治疗各种疾病，包括癌症、心血管疾病和神经系统疾病。最后，开发合成circRNA作为治疗剂仍存在许多挑战，例如控制circRNA的表达水平以避免由于其异常稳定性而持续过度表达，大规模生产高纯度的人工circRNA，以及circRNA的靶向传递。因此，进一步的研究伴随着临床研究可能解决和克服这些挑战。尽管如此，从线性RNA治疗方法（如基于mRNA的治疗方法）中获得的理解可以转化为基于circRNA的治疗方法，并为开发circRNA作为治疗剂提供宝贵的见解。 8.  基于信使RNA的治疗 与前面描述的RNA不同，信使RNA（mRNA）是一种生命的关键分子，是一种与DNA反义链互补的单链RNA。顾名思义，mRNA是细胞核中编码蛋白质的DNA翻译和细胞质中蛋白质生产之间的信使。鉴于mRNA在作为分子生物学中心法则中介的蛋白质生产中的关键作用，为这一类新药开发了几种治疗策略，包括基于mRNA的疫苗和mRNA替代疗法。Wolff等人首次描述了在动物中成功引入体外转录（IVT）mRNA。在过去十年中，该领域取得了显著进展，使mRNA治疗成为治疗传染病和癌症等疾病的有希望的模式。 基于mRNA的治疗方法具有许多优势，例如相对较低的插入突变风险，以及在功能性方面无需进入细胞核。此外，mRNA的短暂性质为在需要时更临时地表达蛋白质提供了好处。通过将化学修饰的mRNA引入细胞的细胞质中，可以表达遗传疾病中减少或抑制的蛋白质，以类似于天然蛋白质的方式。此外，这种mRNA也可以用作预防性疫苗，在这种情况下，mRNA可以编码特定的外来抗原，以引发针对传染病的保护性免疫；或者作为治疗性疫苗，以启动免疫系统刺激细胞介导的反应，以靶向肿瘤。 8.1.  mRNA疫苗 疫苗接种预防疾病，是防止传染病传播最有效的公共卫生干预措施之一。疫苗的广泛使用导致了许多传染病的完全根除，并减少了全世界脊髓灰质炎、麻疹和其他疾病的发病率。在过去的几个世纪里，疫苗学随着传统疫苗方法的出现而发展，如减毒活疫苗和灭活疫苗，为一系列疾病提供了持久的保护。尽管传统疫苗方法取得了进展，但在疫苗开发中仍存在挑战，以满足当前的医疗需求，如新出现的传染病病原体具有更好的能力来逃避适应性免疫反应或需求细胞免疫反应。此外，面对新出现的病毒，有必要采用能够快速开发和大规模生产并具有理想特性以广泛分发的疫苗方法。 还需要针对非传染病的疫苗，传统疫苗方法可能不适用。因此，开发更具适应性和效力的疫苗平台至关重要。最近在mRNA疫苗方面的进展，如mRNA序列工程、大规模生产开发和有效的传递方法，进一步加速了该疫苗平台的开发。 9.  预防性疫苗 如前所述，mRNA疫苗可用于预防性或治疗性目的。mRNA设计、制造和传递方法的最新进展使mRNA疫苗成为传统方法的有吸引力的替代品。对于预防性目的，合成的mRNA编码抗原被传递到细胞质中，一旦表达，就能在不穿越核膜屏障的情况下引发免疫反应，如图5所示。有两种主要类型的体外转录（IVT）mRNA，它们都模仿内源mRNA结构：非复制型mRNA和自增强型mRNA。前者结构包括5'帽、5'非翻译区（UTR）、编码抗原的开放阅读框、3'UTR和聚A尾部；自增强型mRNA还包含病毒复制机制，如复制酶基因，以表达依赖RNA的RNA聚合酶，这允许细胞内RNA扩增和充足的抗原表达。 图5 mRNA疫苗作用机制的示意图。mRNA疫苗包含脂质纳米颗粒(LNP)包裹的mRNA序列（绿色），通过肌肉注射进行注射。封装的mRNA编码感兴趣的抗原（蓝色），被肌肉细胞摄取并在细胞的细胞质中表达。内源性产生的抗原被分泌并运送到局部淋巴结，这刺激了细胞介导的免疫和体液免疫，如分化的B细胞分泌抗体（紫色）。mRNA疫苗方法通过主动免疫提供保护，而不包含实际病毒或细菌的部分。 从DNA模板转录的mRNA携带遗传信息，指导细胞内蛋白、膜蛋白和细胞外蛋白的翻译和生产。同样，mRNA疫苗的核心原则是传递编码信息，如抗原蛋白，以在细胞内翻译。从而有效激活细胞免疫和体液免疫，如图6所示。 图6 mRNA疫苗在抗原呈递细胞(APCs)中诱发免疫的示意图。APCs通过内吞作用摄取mRNA疫苗后，mRNA在核糖体中被翻译成抗原肽，并刺激细胞免疫反应。蛋白酶体复合物将抗原肽处理成更小的肽表位，这些表位可以通过主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类呈现在细胞表面，具体取决于APC的类型。MHC I类呈现的表位被CD8+细胞毒性T细胞识别，以激活并杀死感染细胞。MHC II类呈现的表位被CD4+辅助T细胞识别，这些细胞促进B细胞的激活和中和抗体的产生，并通过吞噬细胞启动体液免疫反应。 除了与内源mRNA的相似性外，mRNA疫苗还能表达复杂的抗原，没有包装限制。利用基因序列信息的无细胞制造过程允许快速、可扩展的生产，以迅速应对任何新出现的传染病。经过多年的mRNA治疗研究和投资，解决了其药理学方面的许多挑战，如稳定性和效力。 随着2020年1月严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行的爆发及其完整基因组的发布，对SARS-CoV-2的有效疫苗的开发竞赛开始了。结果，针对SARS-CoV-2开发了多种疫苗，包括几种基于RNA的疫苗，如表5所示。Moderna开发的Spikevax和Pfizer及BioNTech开发的Comirnaty迅速获得了FDA的紧急使用授权（EUA）和EMA的条件性市场授权（CMA）。目前，只有Comirnaty获得了FDA的批准。这些mRNA疫苗展示了它们高效力和理想的安全性概况，以前所未有的速度被开发和施用。此外，这些疫苗的开发验证了基于mRNA的平台，并激发了对mRNA治疗应用的巨大吸引力。 表5 针对COVID-19的基于RNA的疫苗在临床试验中或已批准的列表 2019冠状病毒病（COVID-19）是由SARS-CoV-2病毒引起的一种高度传染性的病毒感染性疾病，已导致全球健康危机，对世界造成了灾难性影响。为了应对全球大流行，辉瑞和BioNTech开发的Comirnaty（BNT162b2或Tozinameran）是首个获得FDA批准的用于预防性指示的mRNA疫苗。Comirnaty疫苗是一种修饰的核苷酸mRNA，编码SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白，并由脂质纳米颗粒包裹，允许S抗原的表达。SARS-CoV-2 S蛋白是一种I型融合糖蛋白，是病毒的主要表面蛋白和中和抗体的主要靶标。S蛋白对病毒及其感染至关重要，因为它能够显著的结构重排，将病毒和宿主细胞的细胞膜融合，将其病毒基因组传递到目标宿主细胞进行感染。Comirnaty编码了SARS-CoV-2的前融合稳定和膜锚定的全长S蛋白，这保留了中和敏感表位，有效激发对S抗原的免疫反应 Comirnaty在临床试验中展现了高疫苗效力和良好的安全性。在其2/3期试验中，共有37,706名16岁以上的参与者接受了两次剂量为30微克的接种，两次接种间隔21天。在接种第一剂后，他们观察到对COVID-19有52%的疫苗效力，表明对疾病发作有初步保护作用；在接种第二剂后7天，对COVID-19的疫苗效力达到91%。总体而言，在这项2/3期试验中，所有参与者观察到95%的疫苗效力。此外，该研究还确认了其有利的安全性概况，其中反应原性事件，如疲劳、全身反应和淋巴结病，在出现几天内自行解决。在BNT162b2的早期1/2期研究中，评估了成年参与者的免疫原性，同样的剂量方案和时间表在参与者中引发了强劲的血清SARS-CoV-2中和滴度，在第二剂后7天，并在第二剂后一个月持续存在。最后，利用以色列大规模疫苗接种活动收集的数据进行的一项研究发现，接种两剂BNT162b2的3,159,136名参与者的结果显示与随机试验一致：预防有症状COVID-19的有效性为94%；预防住院的有效性为87%；预防严重COVID-19发作的有效性为92%。因此，mRNA疫苗BNT162b2证明了mRNA预防性疫苗作为一个有效的平台，以保护免受传染病的侵害，同时在反应原性和免疫原性之间显示出有利的平衡。 作为RNA病毒，SARS-CoV-2容易发生基因突变，使其进化，允许与野生型菌株相比具有不同属性的突变变种出现。对BNT162b2疫苗针对各种变种进行了多项初步研究，特别是对全球流行的高传染性B.1.617.2（Delta）和B.1.1.529（Omicron）变种。Tang等人通过匹配的测试阴性病例对照研究评估了BNT162b2针对Delta变种的实际效果，并得出结论，疫苗有效性降低至51.9%，防止有症状或无症状COVID-19。此外，Nemet等人的另一项初步实验室研究发现，两剂BNT162b2针对Delta和Omicron的中和效力显著降低，对这些变种的保护效力降低。需要注意的是，这些是初步结果，需要进一步研究以检查BNT162b2对特定变种的全面影响。也就是说，这些结果表明需要针对新出现的变种调整疫苗，这对于RNA基础的疫苗方法是可能的，因为它可以快速和可扩展地生产。除了COVID-19 mRNA疫苗外，还开发了针对其他传染病的mRNA疫苗，如呼吸道合胞病毒（RSV）、HIV-1、流感和寨卡病毒，这些疫苗已显示出有希望的临床前和临床结果。BNT162b2和mRNA-1273的批准和紧急授权为mRNA疫苗方法的安全性和效力提供了充分的证据，这加速了这种疫苗技术的发展，并为转变现代疫苗策略提供了乐观的前景。 10.  治疗性疫苗 除了mRNA预防性疫苗外，基于mRNA的疫苗还应用于癌症免疫疗法。mRNA癌症疫苗编码癌症抗原，如肿瘤相关自身抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA），以诱导针对肿瘤的特异性T细胞反应，从而实现肿瘤排斥。基于mRNA的方法在癌症免疫疗法中具有优势，因为它具有抗原传递和表达能力，以及通过mRNA设计激活先天免疫的佐剂功能。基于mRNA的癌症疫苗有两种方法：mRNA树突状细胞（DC）疫苗和mRNA直接癌症疫苗。 基于mRNA的DC疫苗涉及将TAA加载到DCs中，因为DCs具有呈递TAA并启动针对肿瘤的强大效应反应的能力。DCs的体外操作需要从患者的血液中分离出的造血前体细胞，并将转染的细胞重新输注到患者体内，这提供了一种个性化的治疗策略，因为DCs是患者衍生的。然而，这个过程也可能是昂贵和劳动密集型的，同时增加了一层复杂性。顾名思义，后一种方法涉及直接注射编码肿瘤抗原的mRNA，可以被局部细胞摄取以进行抗原呈递。目前，有几个癌症疫苗候选物正在进行临床开发，如表6所示。 表6 目前正在进行或已完成2期或3期临床试验的代表性基于RNA的癌症疫苗列表 在Kyte等人（NCT标识符：NCT01278940）的1/2期研究中，用自体肿瘤mRNA转染的黑色素瘤DC疫苗单独或与佐剂白介素-2（IL-2）一起使用，报告说在31名晚期黑色素瘤患者中有16名患者的肿瘤特异性T细胞免疫反应与生存期改善相关，并且安全性可接受。在另一项2期研究（NCT标识符：NCT03480152）中，一种编码20种不同新抗原的mRNA直接癌症疫苗，由自体癌症表达，并与LNP配制而成，被用于四名转移性胃肠道癌症患者。这种疫苗候选物被发现是安全的，并且诱导了针对预测新表位的突变特异性T细胞反应，使用肿瘤浸润性淋巴细胞；然而，由于患者数量有限，其临床疗效尚待确定。鉴于IVT mRNA技术的安全性、稳健性和相对较低的成本，使用mRNA疫苗的癌症免疫疗法的个性化是可能的，伴随着有希望的临床前数据和正在进行的临床试验。 除了预防性和治疗性mRNA疫苗外，LNP-mRNA技术最近在小鼠模型中用于短暂的抗纤维化嵌合抗原受体（CAR）T治疗。Rurik等人证明，含有修饰核苷的mRNA编码针对成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CARs，与CD5靶向LNPs配制而成，也称为靶向抗体/LNP-mRNA载体，可以定向传递到CD5细胞以表达功能性CAR T细胞。FAP是在活跃的组织重塑和急性心肌梗死后损伤中表达的细胞表面糖蛋白。鉴于FAP在心脏成纤维细胞中的强烈表达，它是激活的心脏成纤维细胞的可行靶标和标记。在他们的一系列概念验证实验中，Rurik等人成功证明了封装在靶向LNPs中的修饰mRNA能够传递到特定细胞类型，在体内产生功能性工程化T细胞。此外，这种传递产生了短暂有效的抗纤维化CAR T细胞，表现出肌动蛋白吞噬作用。在高血压小鼠心脏损伤和纤维化模型中，58%的CD3+ T细胞是FAPCAR+，表明在CD5/LNP-FAPCAR注射的小鼠中成功转导了FAPCAR mRNA。最后，用CD5/LNP-FAPCAR治疗的小鼠显示出改善的心脏功能和减少的间质纤维化。通过针对特定细胞类型的LNPs，修饰mRNA治疗可能会扩大其应用范围，创造出一种可扩展且相对便宜的通用治疗的可能性，具有工程化免疫功能的能力。 10.1.  mRNA作为蛋白质替代疗法 体外转录（IVT）mRNA的另一个直接应用是蛋白质替代疗法，其中IVT mRNA编码所需的蛋白质，并在目标细胞中表达以实现治疗目的。因此，以蛋白质表达不足或异常蛋白质产生为特征的疾病，如遗传性疾病，可能从蛋白质替代疗法中受益。基于mRNA的蛋白质替代疗法的优势在于其能够表达几乎所有的蛋白质，包括分泌蛋白、细胞内蛋白和跨膜蛋白。蛋白质替代疗法的临床试验主要集中在遗传性代谢性疾病上，如表7所示。 表7 临床开发中的代表性基于mRNA的蛋白质替代疗法列表 在蛋白质替代疗法的临床研究中，由于其特征是必需酶的缺乏，导致酶的缺乏导致过量的代谢产物，从而产生临床表现，因此遗传性代谢性疾病是研究的重点。上述候选药物的临床数据尚未公布。因此，需要进一步证据来证明蛋白质替代疗法的安全性和有效性。除了代谢性疾病外，蛋白质替代治疗方法也被应用于血液疾病，如血友病A和B。Ramaswamy等人使用LNP配方的mRNA编码人凝血因子IX（hFIX）治疗血友病B的FIX缺陷小鼠模型，证明了他们的传递平台LUNAR在小鼠模型中的安全性和有效性；以及传递到肝脏的FIX蛋白的治疗产生。对于这种模式，仍然存在挑战，如传递方法。目前，mRNA蛋白质替代疗法的传递方法主要针对肝脏、肺和心脏。因此，需要进一步开发传递策略以传递到其他器官。 除了传递编码缺失或异常蛋白质的mRNA外，还开发了与单导向RNA（sgRNA）和编码CRISPR相关蛋白9（Cas9）的mRNA配伍的疗法。Cas9是一种相关的内切核酸酶，能够进行双链DNA断裂，并通过与导向RNA结合形成核糖核蛋白复合物。通过传递与目标基因互补的特定sgRNA以及Cas9 mRNA，可以通过Cas9对目标基因进行切割以实现基因沉默，从而实现体内基因编辑。多个药物候选物正在使用基于RNA的CRISPR-Cas9基因编辑策略进行临床开发，以治疗遗传性疾病。Intellia Therapeutics开发的NTLA-2001是一种基于CRISPR-Cas9的体内基因编辑疗法，目前正在1期临床试验（NCT标识符：NCT04601051）中用于治疗转甲状腺素（ATTR）淀粉样变性——一种罕见的、进行性的疾病，其特征是异常的转甲状腺素（TTR）蛋白的错误折叠积累。候选药物NTLA-2001由与目标TTR基因互补的sgRNA和Cas9蛋白的修饰mRNA序列配制而成，通过LNP传递到肝脏。临床前研究和首次人体中期临床数据分析显示，在动物模型和遗传性ATTR患者中血清TTR浓度降低，证明了TTR的持久靶向敲除。这些研究为体内基于RNA的CRISPR-Cas9基因编辑作为有希望的治疗策略提供了临床证据和概念验证。 在过去几年中，mRNA疫苗领域取得了关键进展，证实了基于mRNA的治疗的可行性。制造方法和传递材料的进步加速了mRNA治疗的发展。尽管基于mRNA的治疗的临床数据令人鼓舞，但仍需要针对特定细胞类型靶向的传递材料的挑战，以及需要进一步深入理解mRNA治疗的机制，以最小化不良事件并提高效力。 11.  结论和未来展望 RNA治疗学是一个迅速发展的领域，正在经历快速扩张。目前已有超过十五种基于RNA的治疗方法获得监管批准，更多的研究进入后期临床开发阶段。这个强大且多功能的平台能够解决当前治疗方法无法满足的许多医疗需求。由于RNA治疗的基本挑战，如传递、稳定性和免疫原性已得到解决，RNA药物的开发正在迅速增长。仍然有改进和优化的空间，如特定细胞类型的传递、提高内体逃逸和增强效力。 然而，RNA活性和传递平台的持续发现和增加的机制理解为RNA治疗的前景提供了乐观的展望。GalNAc-siRNAs和mRNA疫苗的最新成功，以及CRISPR的潜力，预示着RNA治疗学新时代的到来。

摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。