Zanamivir

摘要：全球范围内，季节性流感病毒的感染每年导致300万至500万例严重疾病和29万至65万例呼吸道死亡。自20世纪30年代发现流感病毒可以在受精卵中培养以来，已经开发了各种流感疫苗，包括灭活裂解型和亚单位型、重组和减毒活疫苗。然而，这些疫苗提供的保护率相当低，特别是在非常年幼的儿童和老年人中。在这篇综述中，我们描述了流感疫苗开发的历史、疫苗诱导的免疫反应以及应用的佐剂。此外，我们提出了提高所有年龄组流感疫苗有效性的未来发展方向。这包括开发一种基于对免疫系统的理解，诱导平衡的辅助性T细胞1型和2型免疫反应的流感疫苗，以及开发一种广谱流感疫苗，即使在流感病毒特有的抗原漂移和变化的情况下也能提高效果。如果能够实现安全有效的佐剂的开发，可以预见一个更光明的未来。 1.引言 流感病毒属于正黏液病毒科，其基因组由负义RNA片段组成。它们被分为A、B、C和D型，后者于2011年4月从表现出流感样症状的猪中分离出来。在人类中，主要是A型和B型引起疾病，A型比B型引起的疾病更为严重。流感A病毒根据其表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性进一步分类，共有18种HA和11种NA血清型。自20世纪70年代以来，流感B病毒仅分化为两个抗原上可区分的谱系，即山形和维多利亚谱系。目前流行的人类流感病毒主要是A/H1N1和A/H3N2以及B/山形和B/维多利亚谱系。每年，季节性流感在全球造成300万至500万例严重疾病和29万至65万例呼吸道死亡。死亡率和严重病例在65岁以上的老年人和5岁以下的儿童以及免疫抑制人群中更高。用于治疗流感的抗病毒药物包括奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和巴洛沙韦。然而，疫苗接种被认为是控制流感最有效的方法。通过持续的抗原漂移，即表面抗原的点突变积累，流感病毒可以逃避免疫，这就是为什么每年都需要接种疫苗的原因。自20世纪40年代以来，季节性流感疫苗一直在稳步发展，目前市场上的预防性疫苗在类型（全病毒、裂解、重组和亚单位灭活，以及减毒活疫苗）和生产所用的基质（受精卵或细胞）上有所不同。 美国疾病控制和预防中心的一项疫苗有效性研究表明，尽管与流行株抗原匹配，但它们的保护率仍然很低（40%-60%）。令人关注的是，疫苗在非常年幼的儿童（6-35个月）和老年人（>65岁）中不有效地引发免疫反应，这两个年龄组更容易感染流感病毒，并且死亡率更高。因此，迫切需要为所有年龄段提供有效的流感疫苗。 2.流感疫苗的开发历史和疫苗诱导的免疫反应 2.1.流感疫苗开发的历史 流感病毒的培养方法在20世纪30年代得到发展。1933年，通过将从患者喉洗液中获得的标本通过鼻内滴入的方式，将人类流感病毒传播给雪貂。1935年，威尔逊·史密斯提出了一种在受精卵的卵黄囊膜中培养流感病毒的方法。这种方法产生的病毒浓度比以前基于从感染动物的肺部提取病毒的方法要高得多。受精卵至今仍用于生产流感疫苗。此外，自20世纪30年代中期以来，已经开发了使用细胞和培养基的培养方法。随着能够分离和培养流感病毒，流感疫苗的研究开始了。从20世纪30年代中期到40年代初，通过监测抗体产生，研究了从受精卵的羊水或感染动物器官提取物中获得的活化和甲醛灭活的流感病毒在动物和人类中的疫苗效果。发现疫苗与流行株之间的抗原匹配对于保证疫苗效力很重要，而且无论是灭活还是未灭活的病毒，浓缩疫苗比未浓缩疫苗更有效。1942年，在临床研究中评估了由受精卵生产的由PR8型流感A型和Lee型流感B型组成的灭活全病毒双价流感疫苗诱导的免疫反应。1943年，美国武装部队流感委员会进行的更大规模的临床研究表明，包括A型亚型PR8和Weiss株以及B型Lee株的灭活全病毒三价疫苗对流感有保护作用。通过临床试验确定了疫苗剂量，1945年，第一种灭活流感疫苗（IIV）在美国获得许可。 自20世纪40年代在受精鸡卵中开发第一种灭活全病毒疫苗以来，IIV的生产方法不断改进，20世纪50年代，使用受精卵的当前IIV生产过程得以发展。IIV包括全病毒疫苗、通过洗涤剂裂解的病毒和进一步纯化的亚单位疫苗，由表面抗原HA和NA组成。全病毒疫苗，第一种开发的IIV，即使在未预先免疫的个体中也能诱导良好的免疫反应。然而，人们对热原性和不良反应感到担忧。为了克服这些问题，20世纪60年代，通过用乙醚或洗涤剂处理病毒，开发了裂解病毒疫苗，使它们对儿童安全。20世纪70年代，主要基于HA和NA的纯化亚单位流感疫苗得到了发展，进一步提高了安全性并减少了反应原性。 自20世纪30年代以来，通过在雪貂和小鼠或受精卵中连续传代制备的减毒活流感疫苗（LAIV）也得到了研究。这些宿主范围变异疫苗可以保护人类免受流感侵害，而不会引起流感症状。然而，它们有一些缺点，包括低病毒滴度和在保持恒定的减毒和抗原性水平方面的困难。20世纪60年代，采用了一种新的方法，通过在受精卵中连续低温传代来减毒流感病毒，产生了冷适应的、温度敏感的变异株。由于冷适应的温度敏感流感病毒在较低温度下复制得最好，病毒复制在鼻腔而不是在呼吸道进行。这些病毒比以前的减毒方法更安全，并能诱导免疫反应。因此，它们作为LAIV的供体病毒得到了进一步发展。 作为RNA病毒，流感病毒缺乏校对活性，因此遗传上不稳定；因此，抗原突变发生的频率很高。为了提高流感疫苗的保护率，准确预测将流行的流感病毒并生产含有这些毒株的疫苗是很重要的。为此，世界卫生组织（WHO）的全球流感监测和应对系统自1952年以来一直在进行全球流感监测，基于监测结果，WHO每年都会宣布北半球（2月）和南半球（9月）的推荐流感病毒疫苗成分。 最初，世界卫生组织推荐了三种流感病毒株，包括A/H1N1、A/H3N2以及B/维多利亚或B/山形谱系中的任一种，用于三价疫苗；然而，由于两个B谱系的共同循环频率很高，现在建议在四价流感疫苗中同时包含B/维多利亚和B/山形谱系。然而，由于灭活疫苗和减毒活疫苗是使用推荐的候选病毒生产的，如果预测不准确，它们将因抗原不匹配而无效。因此，正在积极研究广谱或通用流感疫苗。这些疫苗类型针对流感病毒的保守区域，如HA的茎部、M2e、M1或核蛋白，而不是免疫显性的、可变的和特定于毒株的HA球形头部（图1）。这些疫苗是通过使用病毒载体、DNA载体、类病毒颗粒（VLP）、纳米颗粒或直接刺激T细胞的肽制备的。其中，纳米颗粒和VLP平台在完成2020年的III期临床试验（NCT04120194、NCT03301051和NCT03739112）时显示出最明显的效果。纳米颗粒（Novavax）和VLP流感疫苗（Medicago）均显示出诱导交叉反应抗体和T细胞反应的结果。 图1 广谱或通用流感疫苗的靶标。广谱或通用流感疫苗针对能够引发广泛交叉免疫反应的抗原。由HA茎部和M2离子通道（M2e）的外域诱导的抗体，这些是高度保守的区域，可以介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。针对HA茎部的抗体具有中和作用；而针对M2e的抗体则没有。M1和NP蛋白拥有保守区域，并且是内部蛋白。因此，它们主要诱导细胞毒性T细胞反应。 2.2.流感疫苗生产的基质 尽管使用受精卵的传统方法仍然在全球范围内主要使用，但它有显著的缺点。基于鸡蛋的疫苗可能会引起对白蛋白的过敏反应，当对受精卵的需求突然增加时，例如在大流行期间，供应可能不足，妨碍及时生产疫苗。最重要的是，特别是在H3N2的情况下，连续在受精卵中传代病毒可能导致抗原位点的鸡蛋适应性突变，从而导致抗原性改变，从而降低疫苗的有效性。为了克服这些缺点，开发了基于细胞培养的疫苗生产技术。使用的细胞系包括Solvay和Seqirus（前身为Novartis）的Madin-Darby犬肾（MDCK）、Sanofi Pasteur（前身为Crucell）的PER.C6、Baxter的Vero以及Protein Science（重组HA）和Novavax（VLP疫苗）的Sf9昆虫细胞与杆状病毒载体相结合。因此，流感疫苗的开发正逐渐从传统的基于鸡蛋的平台转向细胞培养（图2），尽管需要努力提高后者的产量并降低生产成本。 图2 流感疫苗基质从受精卵到细胞的演变。在20世纪30年代，开发了在受精卵中培养流感病毒的方法，直到20世纪50年代，使用受精卵制造流感疫苗的方法不断得到发展。自从20世纪50年代末建立了MDCK细胞系以来，揭示了流感病毒可以在各种细胞如MDCK和Vero细胞中培养的事实，并且逐渐地，制造流感疫苗的基质开始从受精卵转向细胞。MDCK，即Madin-Darby犬肾细胞系。 2.3.FDA批准的流感疫苗及其触发的免疫反应 疫苗触发的免疫反应根据接种物是灭活抗原还是活病毒而有所不同。在灭活病毒疫苗的情况下，通过吞噬作用被抗原呈递细胞（APCs），如树突细胞，吞噬的灭活细胞外抗原。然后在APCs的溶酶体中将抗原降解为肽段，肽段通过主要组织相容性复合体（MHC）II分子呈现在APCs表面。MHC II-抗原复合物被T辅助（Th）细胞识别，也称为CD4+ T细胞，这导致未激活的Th细胞激活。激活的Th细胞进一步分化为T辅助1（Th1）细胞、Th2细胞、Th17细胞、滤泡Th（Tfh）细胞、诱导性调节性T细胞（iTregs）等。 在各种CD4+效应T细胞亚群中，Th1、Th2和Th17细胞在防御病原体方面发挥主要作用。Th1细胞诱导细胞介导的免疫反应，分泌IFN-γ和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），激活巨噬细胞和中性粒细胞，通过增加吞噬作用和炎症来消除细胞内病原体。Th2细胞诱导体液免疫反应，主要分泌IL-4、IL-5和IL-13。最后，Th17细胞分泌IL-17和IL-22，这是促炎细胞因子，以及IL-21，从而刺激对细胞外病原体和真菌的免疫反应。 相比之下，活病毒或减毒活病毒疫苗感染细胞并在感染细胞的细胞质中产生病毒蛋白。病毒蛋白被蛋白酶体降解为肽段，肽段与MHC I分子复合物呈现在感染细胞表面。MHC I-抗原复合物被CD8+ T细胞识别，随后在其他信号和Th细胞帮助下分化为细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。树突细胞不易被病毒感染，但通过交叉呈递在激活CD8+ T细胞中发挥重要作用。在这一途径中，被病毒感染的细胞被树突细胞吞噬，导致病毒抗原在树突细胞的细胞质中释放。从蛋白酶体降解到呈递的后续过程与上述MHC I途径相同。当CTLs识别感染细胞上的MHC I-抗原复合物时，它们释放细胞毒素蛋白、穿孔素和颗粒酶，这些蛋白进入感染细胞并诱导凋亡。CTLs还可以通过CTLs上表达的Fas配体与目标细胞上表达的Fas的相互作用来杀死感染细胞。FDA批准了各种类型的流感疫苗（表1），它们引起不同的免疫反应。根据免疫反应诱导机制，流感疫苗大致分为IIVs和LAIVs，IIVs进一步分为全病毒、裂解和亚单位类型。 由于IIVs的活性物质是三个（三价IIVs）或四个（四价IIVs）灭活抗原，接种的抗原主要通过MHC II途径呈现在APCs表面，因此将主要刺激CD4+ T细胞；然而，IIV接种后的免疫反应尚未完全了解。如上所述，CD4+ T细胞可以分化为几种亚型，但IIV主要刺激Th2免疫反应，诱导体液免疫反应而不是细胞免疫反应。IIV诱导的血凝抑制滴度与流感特异性抗体相关，在成人中提供50%的流感感染保护率。然而，IIV不有效地诱导粘膜免疫和细胞免疫，这在呼吸道病毒感染中起着重要作用。与IIV不同，LAIVs通过鼻内途径给药。它们感染上呼吸道的细胞，并通过MHC I途径更有效地处理，从而诱导粘膜免疫和细胞免疫。此外，LAIVs在CD4+ T细胞的情况下很好地激活Th1免疫反应。尽管LAIV可以被认为是流感的理想疫苗类型，因为它诱导平衡的Th1/Th2免疫反应，但它存在安全问题，不能在非常年幼的儿童和免疫受损的个体中给药。此外，由于禽流感病毒在人类上呼吸道的嗜性大于下呼吸道，因此不易开发针对禽流感病毒的LAIVs。 3.流感疫苗佐剂开发的现状 3.1.流感疫苗佐剂的必要性 佐剂是增强疫苗免疫反应的制剂，通过每剂使用较低量的抗原，诱导更高的抗体产生和更持久的保护，从而减少疫苗生产的负担。 与季节性流感病毒不同，引起大流行的流感病毒是新的重配或变体病毒，人类对其没有预先存在的抗体，因此导致更高的死亡率。非佐剂化的H5N1和H7N9大流行流感疫苗诱导的免疫反应较弱，可能是因为大多数人对这些亚型没有预先存在的免疫力，并且大流行疫苗不是每年接种。因此，大流行流感疫苗通常使用佐剂，特别是因为它们可以改善因慢性病、肥胖、HIV感染或移植治疗而免疫功能低下的个体的免疫反应。此外，与未添加佐剂的IIV不同，添加佐剂的IIV可以提供平衡的Th1/Th2免疫反应和粘膜免疫，从而保护免受流感感染。 3.2.批准的流感疫苗佐剂的免疫机制 目前流感疫苗中使用的佐剂包括磷酸铝（AlPO4）凝胶、氢氧化铝（Al[OH]3）、AS03和MF59。最古老和最常用的佐剂是AlPO4和Al(OH)3，通常称为铝佐剂（尽管严格来说，铝佐剂指的是硫酸钾铝钾[KAl[SO4]2]）。含有MF59或AS03的流感疫苗是比铝佐剂更晚开发的油包水乳液佐剂，分别在1997年和2009年获得批准。这些佐剂比铝佐剂在IIVs中更有效。美国FDA批准的三种H5N1大流行流感疫苗中有三种含有AS03或MF59佐剂。第三种疫苗不含佐剂，但含有比含佐剂疫苗多12-24倍的HA（表2）。FDA批准的含MF59的佐剂化季节性流感亚单位疫苗（Seqirus，FluAd®）旨在用于老年人（>65岁），他们的免疫反应比年轻成人差（表2）。 尽管铝佐剂长期以来一直被广泛用作佐剂，但其机制仍然未知。最初，人们认为铝佐剂通过所谓的抗原储存效应，通过缓慢且持续地将抗原暴露给APCs来增强免疫反应。然而，最近的研究表明，铝佐剂还可以招募包括中性粒细胞和单核细胞在内的各种类型的先天免疫细胞到注射部位，从而激活先天免疫反应。有关细胞和分子机制的研究报告称，铝佐剂通过APCs吞噬铝佐剂导致的吞噬体不稳定化，触发NLRP3炎症体的激活，从而分泌促炎细胞因子IL-1β。此外，铝佐剂在注射部位引起坏死，导致损伤相关分子模式的释放，如尿酸和DNA，这些分子激活NLRP3炎症体。铝佐剂可以通过前列腺素E2的产生增强免疫反应，前列腺素E2参与诱导Th2免疫反应，通过ITAM-Syk-PI3Kδ信号传导。这些结果表明，铝佐剂诱导Th2反应而不是Th1反应。 MF59是一种由角鲨烯和两种表面活性剂聚山梨醇酯80（Tween 80）和山梨醇三油酸酯（Span 85）组成的油包水佐剂。自1997年首次在欧洲流感疫苗中应用以来，进行了大量的研究以阐明其免疫增强机制。MF59没有储存效应，这一发现表明，即使在抗原注射前24小时至注射后1小时内注射，它也显示出佐剂效应。相反，MF59在注射部位激活单核细胞、巨噬细胞和粒细胞，导致趋化因子的分泌，随后是免疫细胞的招募，增加抗原摄取，单核细胞分化为未成熟树突细胞，以及增强抗原运输到引流淋巴结。MF59诱导的单核细胞分化为未成熟树突细胞有助于它们迁移到引流淋巴结，在那里它们刺激T细胞和B细胞，从而增强适应性免疫反应，对接种的疫苗抗原产生平衡的Th1/Th2反应。此外，MF59佐剂化的抗原在免疫小鼠的淋巴结的各种细胞上呈现，包括B细胞、单核细胞和中性粒细胞，而铝佐剂化的抗原只在树突细胞上呈现，表明MF59在增强免疫反应方面比铝佐剂更有效。MF59导致注射部位的肌肉细胞释放ATP，并通过MyD88发挥其佐剂功能。在动物模型中，局部施用apyrase水解ATP导致对MF59佐剂化的三价IIV的T细胞反应和血凝抑制滴度降低。因此，ATP在MF59佐剂功能中起着重要作用；然而，确切的信号传导途径需要进一步研究。 AS03是一种由聚山梨醇酯80（Tween 80）和两种可生物降解的油，角鲨烯和α-生育酚组成的油包水佐剂，α-生育酚是维生素E的最可利用形式。饮食中的维生素E补充具有免疫刺激作用。因此，α-生育酚表现出类似佐剂的功能，而MF59组分本身并不具有佐剂效应。在小鼠中进行的研究表明，当抗原与缺乏α-生育酚的AS03一起施用时，免疫反应减弱。与MF59不同，AS03需要与抗原在空间和时间上共定位才能作为佐剂发挥作用。与MF59类似，AS03促进免疫细胞招募到注射部位，以及抗原摄取和运输到引流淋巴结。具体来说，AS03在局部和短暂地增加NF-κB，并增强细胞因子释放和免疫细胞招募。随后，激活的抗原负载的APCs在引流淋巴结中激活CD4+ T细胞，这些细胞直接刺激抗原特异性B细胞。因此，AS03通过诱导大量记忆B细胞和抗体分泌浆细胞来加强免疫反应。 3.3.流感疫苗佐剂的开发现状 佐剂在全球范围内被广泛研究。下面，我们讨论了除铝佐剂、MF59和AS03之外，已经进入临床试验的流感疫苗佐剂的机制和免疫反应，包括TLR配体、细胞因子以及微乳液和纳米乳液。此外，还有一些免疫刺激剂，其作用机制尚不完全清楚。在这些研究中，TLR激动剂和配方是最被研究的（表3）。 TLR通过识别病原体相关分子模式来刺激先天免疫反应。根据其定位，它们被分类为细胞表面TLR和细胞内TLR。细胞表面TLR，包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，主要识别来自微生物膜的成分。细胞内的TLR，定位在内体中，包括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，识别自身和非自身核酸。鉴于各种TLR可以识别独特的配体，几种TLR激动剂作为佐剂正在进行临床试验。TLR4激动剂AS01和AS04已获得许可，而其他TLR4激动剂，包括葡萄糖基脂质佐剂、单磷酸脂质（MPLA）和LPS，正在积极研究中。此外，dsRNA、flagellin、imiquimod和CpG分别作为TLR3、TRL5、TLR7和TLR9激动剂正在开发中。 MF59和AS03等乳液颗粒有时与其他物质如皂苷、DNA和MPLA结合。具有不同成分和比例的各种乳液型佐剂正在进行临床试验。其他颗粒类型，如病毒体或VLP，也可能具有佐剂功能。一些作用机制尚不清楚的免疫刺激剂也在研究中。细胞因子在小鼠中刺激Th1免疫反应和B淋巴细胞分化，但在I期临床试验中未显示出佐剂效应。因此，开发一个能够准确预测佐剂效应的非临床系统非常重要。在最近的一项研究中，一种与单链RNA佐剂配制的IIV诱导了对异源流感病毒感染和粘膜免疫反应的交叉保护。其详细机制和安全性方面还有待研究。 4.流感疫苗开发的发展方向 4.1.流感疫苗的现状和相关不良事件 目前市场上的流感疫苗可以用于非常年幼的儿童（≥6个月大），尽管每种产品的推荐接种年龄不同，而且它们大多数是灭活疫苗。它们主要诱导Th2免疫反应，并导致对接种的流感病毒株产生特异性抗体，从而提供免疫保护。然而，过去十年调查的流感疫苗的有效性并不高，平均保护率为42%（范围，19%-60%），并且在幼儿和老年人中通常更低。 为了克服幼儿和老年人的低抗体产生率，疫苗制造商已经将儿童（≥6个月大；Flulaval Trivalent/Quadrivalent, Fluarix Quadrivalent, Fluzone Quadrivalent）的季节性流感疫苗的标准HA抗原含量提高了两倍，老年人（≥65岁；Fluzone High-Dose）提高了四倍，或者使用了佐剂（仅适用于老年人；FLUAD）。这些产品已获得FDA许可，并且已经证明了改进的效力或有效性。然而，增加抗原生产的需要可能会给制造商带来负担，特别是在大流行等紧急情况下。 或者，如前所述，可以通过接种LAIV而不是IIV来增强对流感疫苗的免疫反应，或者采用新策略，例如使用皮内途径而不是注射（Sanofi Pasteur的Fluzone® Intradermal流感疫苗），因为皮肤富含APCs。尽管是相同的IIV，皮内途径与肌肉注射途径相比，使用更少的HA抗原（每株9微克）诱导了非劣的保护性免疫反应。然而，使用这些方法的FDA许可产品也尚未适用于幼儿或老年人。LAIV FluMist适用于2-49岁的人群，而Fluzone intradermal是皮内注射的，适用于18-64岁的人群。 与流感疫苗相关的不良事件从轻微症状，如注射部位的红斑、头痛、发烧、恶心和肌肉痛，到不寻常的事件，如严重过敏反应、格林-巴利综合征和眼呼吸道综合征。大多数与流感疫苗相关的不良事件都是轻微的，容易恢复。然而，针对2009年H1N1流感大流行的Pandemrix疫苗被认为与嗜睡症有关，这种由Pandemrix引起的嗜睡症与自身免疫疾病有关，但机制仍然未知。 4.2.流感疫苗开发的发展方向 对于流感疫苗，血清保护、血清转换和几何平均滴度比是考虑作为商业产品获得批准的标准。在评估疫苗的有效性时，重点是Th2免疫反应，而不是Th1免疫反应。然而，Th1和粘膜免疫反应在防御呼吸道病毒（如流感病毒）方面也起着重要作用。因此，一种在所有年龄组，包括婴儿和老年人中诱导平衡的Th1/Th2免疫反应的流感疫苗，包括细胞介导和抗体反应以及涉及分泌型IgA的粘膜免疫反应，可以显著降低流感的死亡率和发病率。 如前所述，已经尝试使用各种平台（包括病毒载体、DNA载体、VLP或肽疫苗）来提高流感疫苗的效力，这些平台预计将克服当前流感疫苗的局限性，例如通过诱导更强的Th1反应和记忆反应。此外，考虑到流感疫苗株的抗原性几乎每年都会变化，并且由于抗原转移和漂移，各种流感亚型都可能引起爆发，因此正在积极研究通用流感疫苗。一种候选疫苗，包含来自流感A和B的九个保守表位的重组蛋白M-001，目前正在进行III期临床试验，预计将在2020年12月完成。基于mRNA的疫苗在SARS-CoV-2大流行期间证明了它们的潜力；因此，它们也值得考虑用于流感大流行。基于mRNA的流感病毒疫苗在小鼠中显示出保护效果，在人类临床试验中显示出免疫原性反应和安全性，并通过诱导流感病毒HA茎部特异性抗体产生交叉保护效果。AS03和MF59等佐剂已经应用于流感疫苗。然而，由于流感疫苗每年接种，因此应该大力开发新的佐剂，这些佐剂具有良好的安全性，适用于重复接种和效力，如基于RNA的佐剂。这些佐剂容易降解，如TLR3或TLR7/8配体，并且与其他在体内长时间停留的佐剂相比相对安全。 5.结论 流感疫苗相当复杂。它们根据疫苗类型（如IIV与LAIV）、接种年龄以及诱导免疫反应的机制不同而诱导不同的免疫反应，这些机制尚未完全阐明。大多数许可的疫苗主要诱导Th2型免疫反应，在幼儿和老年人中诱导的免疫反应比成人弱。因此，需要努力开发能够诱导更强大和更平衡的Th1/Th2免疫反应的流感疫苗，这基于我们对随年龄变化的免疫系统的理解。 目前对流感疫苗的批准标准，侧重于Th2反应，将需要相应修改，以包括确认T细胞介导的保护。通过使用佐剂也可以实现更好的免疫反应，因此，应该开发更安全、更有效的佐剂。最后，用于预测疫苗和佐剂免疫反应的有效和可靠的工具将极大地有助于提高对流感病毒感染的保护率，不仅在成人中，而且在幼儿和老年人中也是如此。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：流感病毒是最重要的人畜共患病原体之一，能够引起严重症状，有潜力造成大量死亡和巨大的经济损失。疫苗接种仍然是预防流感病毒感染的最佳选择。已经开发了不同类型的流感疫苗，包括减毒活病毒疫苗、灭活全病毒疫苗、病毒体疫苗、裂解病毒疫苗和亚单位疫苗。然而，它们存在一些限制，如相对较高的制造成本和长时间的生产周期，某些疫苗在特定人群中的中等效力，以及缺乏交叉反应性。这些问题是需要解决的。在这里，我们总结了不同类型流感疫苗开发和应用的最新进展，包括病毒载体流感疫苗的最新发展。我们还描述了基于重组流感病毒作为病毒载体的其他疫苗的构建。本综述文章提供的信息可能会促进安全高效新型流感疫苗的开发。 1.引言 流感病毒是一种包膜RNA病毒，其病毒基因组由8个节段的负义单链RNA组成，编码10种核心蛋白，包括聚合酶基础2（PB2）、聚合酶基础1（PB1）、聚合酶酸性（PA）、血凝素（HA）、核蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M1和M2）以及非结构蛋白（NS1和NS2），以及其他一些功能性辅助蛋白，如聚合酶基础1-F2（PB1-F2）、聚合酶基础1 N40（PB1N40）、聚合酶酸性-X（PA-X）等。由PB1、PB2和PA组成的聚合酶三聚体复合体与病毒RNA和NP蛋白形成RNA核蛋白（RNP），负责病毒RNA的转录和复制。HA、NA和M2蛋白嵌入病毒颗粒的外层包膜中，其中HA和NA易于暴露，因此是两种主要的免疫原性蛋白。在感染过程中，HA在病毒进入步骤中发挥重要作用，如附着和穿透。HA也是流感病毒表面的主要抗原糖蛋白，可以刺激宿主产生中和抗体反应。NA负责切割细胞表面存在的末端唾液酸残基，从而促进子代病毒从感染细胞中释放，并在流感病毒的传播中发挥重要作用。根据HA和NA的抗原多样性，流感病毒被分类为18个HA亚型（H1-H18）和11个NA亚型（N1-N11）。 根据世界卫生组织的估计，全球约有300万至500万人感染流感，导致大约29万至65万例因严重呼吸系统疾病相关并发症而死亡。然而，流感病毒感染通常会导致一种常见的季节性疾病，其特征是较轻的临床表现，如发热、喉咙痛、肌肉无力和一系列相对轻微的呼吸道症状（包括咳嗽和流鼻涕）。大多数患者在一周内从这些症状中恢复；然而，在某些人群亚组中，如老年人、儿童、孕妇和免疫抑制疾病患者，流感病毒感染可能非常严重，可能导致死亡。在20世纪，已经记录了4次流感病毒感染的大流行，包括1918年H1N1大流行（也称为西班牙流感）、1957-1958年H2N2大流行（亚洲流感）、1968-1969年H3N2大流行（香港流感）和2009年的另一次H1N1大流行（墨西哥或猪流感）。据估计，1918年西班牙流感在全球造成了约20亿感染和2100万死亡。在1957-1958年，H2N2亚型流感病毒的爆发起源于亚洲，然后传播到全球，造成约100万至400万人死亡。十年后，由H3N2亚型流感病毒引起的另一次流感大流行起源于香港，导致全球100万至300万人死亡。最新的2009年墨西哥或猪流感大流行是由H1N1亚型流感病毒引起的，影响了214个国家，造成约20万人死亡。除了主要包括H1N1和H3N2的人类流感病毒外，一些流感病毒还可以感染其他动物物种，包括猪流感H1N1、H3N2和H1N2，以及H5、H7和H9亚型的禽流感病毒。值得注意的是，在上述流感大流行中，有几次是由禽源性流感病毒的跨物种传播引起的，如西班牙流感H1N1、亚洲流感H2N2和香港流感H3N2病毒。 目前，有几种治疗流感病毒感染的治疗方法。三类抗流感病毒药物可以分类为病毒M2离子通道阻断剂和神经氨酸酶抑制剂（NAIs）。首批获准用于治疗流感病毒感染的抗病毒药物是金刚烷胺和金刚乙胺，这两种小分子药物来自金刚烷药物类别。这两种药物通过作为病毒M2离子通道的抑制剂，通过施加静电阻碍，阻止H+流通过M2通道进入病毒颗粒，从而抑制病毒复制。由于M2离子通道被阻断，病毒核糖核蛋白的传递被阻止。尽管金刚烷胺和金刚乙胺是最早的两种获准抗流感药物，流感病毒迅速进化为具有药物耐药表型的病毒变体，通过在M2的跨膜域的氨基酸位置27、30、31和34处获得突变。在药物治疗后2-3天，30%-50%的患者中可以观察到病毒耐药株。自从金刚烷耐药病毒出现以来，针对流感病毒神经氨酸酶的抑制剂已经被开发出来。扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦是N-乙酰神经氨酸（2,3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸）的衍生物，是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NAIs。这些NAIs结合到NA的活性位点，竞争性地抑制NA与其底物N-乙酰神经氨酸的结合。由于这种抑制，NA不能再从宿主蛋白中切割N-乙酰神经氨酸，从而阻止病毒从细胞表面膜释放。正如预期的那样，在接受这些NAIs治疗的患者中，流感病毒的NA中发生了自然突变。已经描述了两种对NA抑制剂的耐药机制。第一种涉及NA酶催化位点内的突变，破坏了它与药物的直接相互作用。第二种涉及HA的突变，减少了对其受体的亲和力，从而补偿了药物对NA活性的影响。最常见的观察到的突变，如流感A病毒N1 NA亚型的H275Y和N295S（N1编号）；流感A病毒N2 NA亚型的R292K和E119V（N2编号）和流感B病毒的R152和D198N，是赋予NA抑制剂耐药性的NA突变，以减少唾液酸酶活性和/或稳定性。除了上述两种主要的抗流感治疗药物外，还发现了一些新的抗病毒抑制剂，如聚合酶抑制剂（例如法匹拉韦和利巴韦林）、HA抑制剂（例如RO5464466、阿比多尔、MBX2329和MBX2546）、NP抑制剂（例如萘普生和姜黄素）和宿主靶向剂（例如DAS18），它们也可以作为对抗流感病毒感染的额外治疗选择。 尽管有几种治疗药物可用于抗流感治疗，但接种流感病毒疫苗仍然是预防和控制流感病毒传播的最有效方法之一，可以显著降低流感病毒感染的发病率和相关医疗并发症。常用的流感疫苗包括灭活流感疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位流感疫苗、病毒体流感疫苗、减毒活流感疫苗和重组病毒载体流感疫苗。在这篇综述中，我们讨论了不同流感疫苗的优缺点，病毒载体流感疫苗的开发，以及其他使用流感病毒作为载体的病毒疫苗的构建，以提供开发有效和安全新型流感疫苗的重要见解。 2.不同类型的流感疫苗及其优缺点 流感疫苗是预防和控制流感病毒感染的重要措施。目前，商业化和实验性的流感疫苗主要包括灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗、病毒体流感疫苗、减毒活疫苗和重组活病毒载体疫苗。 2.1.减毒活流感疫苗（LAIV） 减毒活流感疫苗是通过流感病毒基因组中自然发生的突变产生的毒力较低的流感病毒株，或者是通过在病毒易感细胞、胚胎鸡蛋中多次传代所谓的亲本流感病毒，或其他使病毒毒力降低的过程，即不太可能在实验感染动物中引起重大疾病的病毒。选择毒力较低的流感病毒株作为候选疫苗，进一步在人类志愿者中进行测试，然后才能被FDA考虑批准作为人类流感疫苗使用。这种类型的流感疫苗株具有低毒力和致病性，但仍允许病毒在接种后相对较短的时间内感染和增殖。LAIV主要包括流感A(H1N1)、A(H3N2)亚型和流感B病毒的维多利亚系。根据迄今为止公布的数据，LAIV的鼻内接种可以诱导粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫。特别是，LAIV诱导的细胞免疫反应，如高交叉反应性CD8+ T细胞反应和IFN-g+ T细胞反应，在学龄儿童和婴儿中比成人更好。随着反向遗传技术的进步，即在实验室环境中使用称为质粒的圆形DNA片段来工程化病毒的分子方法，许多研究中使用手动删除或替换病毒的毒力基因，以减弱病毒的毒力或工程化病毒携带一个或多个所需的外源基因。使用这些现代技术，可以产生三价和四价LAIV，分别表达三种或四种流感病毒HA基因。四价LAIV已被证明对美国2-17岁儿童提供有效的保护效果。在中国，首个三价LAIV（长春百克生物科技有限公司，中国）于2020年获得市场批准。然而，考虑到LAIV仍然可以在接种者中复制，因此可能通过称为遗传逆转的过程将其基因组演变为亲本样病毒，这可能允许它在人类群体中传播，LAIV可能对公共卫生构成潜在风险。因此，需要更多的研究来调查这些LAIV的安全性，然后才能广泛使用。 2.2.灭活全病毒疫苗 在20世纪40年代，由Thomas Francis Jr., MD和Jonas Salk, MD领导的密歇根大学研究小组开发了第一种基于灭活流感A病毒的流感疫苗，并在1945年获得军用许可。他们的疫苗使用受精鸡蛋的方法至今仍用于生产大多数流感疫苗。这种方法涉及在鸡胚（或真核细胞）中培养病毒以允许病毒增殖，然后通过加热或用化学试剂（主要是甲醛）处理来灭活病毒，以减弱病毒的感染细胞和增殖能力。然后添加佐剂以增强最终疫苗配方的免疫原性。灭活全病毒疫苗配方中包含的灭活流感病毒被剥夺了毒力和传播能力，同时保留了病毒表面蛋白抗原（如HA和NA）提供的完整抗原性。因此，灭活全流感病毒疫苗具有高安全性、保持完整病毒抗原组分、高免疫原性、提供长期免疫保护以及无毒力逆转风险的优点。如前所述，反向遗传方法的进步已经彻底改变了制备灭活全流感病毒疫苗的过程，该疫苗由已知毒力基因被删除或以某种方式操纵以灭活病毒的重组流感病毒组成。除了人类使用，灭活全流感病毒疫苗也是预防家禽行业禽流感病毒（AIV）感染的重要工具。 中国预防禽流感的流感疫苗主要是灭活全病毒疫苗。2018年，中华人民共和国农业农村部批准的六种灭活禽流感疫苗产品主要针对AIV的H5和H7亚型。这六种疫苗包括重组禽流感病毒（H5+H7）三价疫苗和灭活疫苗（H5N2株rSD57+株rFJ56, H7N9株rGD76）。这些疫苗株使用H5N2亚型流感病毒株（D7）作为病毒基因组骨架（提供六个内部病毒基因）和来自H5N1、N5N6和H7N9突变病毒株的HA和NA基因。这些重组疫苗株是通过使用反向遗传技术产生的，针对在中国家禽养殖场主要传播的几种病毒，包括携带2.3.2.1d和2.3.4.4d亚型HA基因的H5亚型病毒，以及在家禽中产生高免疫效应的H7N9病毒。同样，由哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院新批准的重组疫苗，由灭活的重组禽流感病毒（H5+H7）三价疫苗（H5N1株Re-11+株Re-12和H7N9株H7-Re3）组成，也是通过反向遗传技术产生的。值得注意的是，这些AIV灭活疫苗不仅可以预防家禽中的AIV感染，而且对人类公共卫生也大有裨益。自2013年开始，H7N9亚型AIV造成了数百例人类病例死亡，因此被认为是中国的一个主要公共卫生威胁。然而，在2017年9月将H5/H7二价灭活流感疫苗引入家禽业以控制H7N9流感病毒感染后，家禽中H7N9病毒的流行率大幅降低，并且使用这种疫苗对鸡进行免疫接种在预防人类感染H7N9病毒方面也非常有效，事实上，在H5/H7二价疫苗广泛使用后的两年内，仅有4例人类H7N9病例报告，与2016年10月1日至2017年9月30日记录的人类H7N9病例数量相比减少了99.5%。 灭活全流感病毒疫苗可以在体内诱导体液免疫，并产生高滴度的特异性IgG抗体。然而，这种疫苗对不同基因型或亚型的病毒交叉免疫保护效果并不理想。此外，还有其他一些缺点，包括相对较低的抗体产生率、相对较低的细胞免疫应答诱导效果，以及更多免疫剂量可能给接种动物带来过大的压力。还有报道指出，灭活全人类流感病毒疫苗可能会引起儿童高热，因此不推荐12岁以下儿童使用。随着疫苗生产工艺的进步，全人类流感病毒疫苗的生产已逐渐被淘汰。相比之下，裂解病毒疫苗和亚单位疫苗的开发和应用取得了进展，这些疫苗可以提供相当和有益的免疫效果，并具有更高的安全性。 图1、五种常用流感疫苗的组成：(A) 减毒活流感疫苗，(B) 全病毒灭活疫苗，(C) 裂解病毒流感疫苗，(D) 亚单位流感疫苗，以及 (E) 病毒体流感疫苗。这五种不同的流感疫苗在活性、抗原成分和结构组织上有所差异，这些差异影响了疫苗的免疫原性和保护效力。该图是用 Biorender.com 创建的。 2.3.裂解病毒流感疫苗 裂解病毒流感疫苗是基于灭活全流感病毒疫苗制备的。选择合适的裂解剂和条件破坏病毒包膜并裂开病毒颗粒。裂解剂以及病毒的核酸和大分子量蛋白被丢弃，而活性抗原组分（HA和NA）和部分M和NP蛋白（增强免疫反应）得以保留。这种疫苗配方可以集中并增加一定体积疫苗中活性抗原蛋白的水平，这可以在最大程度上刺激抗体产生效果，同时大大减少由病毒颗粒其他组分可能引起的不必要副作用。因此，裂解流感疫苗比灭活全流感疫苗更安全。目前，中国市场上已经批准的这类疫苗包括三价灭活流感疫苗（IIV3）和四价灭活流感疫苗（IIV4）。裂解流感疫苗是IIV3的主要组成部分，而所有的IIV4都是裂解流感疫苗。先前的研究表明，对于6个月以上儿童接种裂解病毒免疫接种，具有令人满意的保护效果，2011-2012年接种数据显示，36-59个月和6-35个月儿童接种IIV3的保护效果分别为58.2%和49.6%。此外，其他研究也表明，IIV4对流感B病毒的免疫原性高于IIV3。IIV4主要包括流感A(H3N2)、A(H1N1)亚型，以及流感B病毒的维多利亚和山形株。血凝抑制（HI）阳性转化率作为衡量接种个体血清中能中和流感病毒的抗体存在的标志，HI的几何平均滴度（GMT）平均增长率，以及疫苗免疫后血清抗体保护率均达到预期，表明疫苗具有高免疫原性。 2.4.亚单位流感疫苗 传统的亚单位疫苗是基于裂解病毒疫苗制备的，其中HA和NA抗原蛋白进一步提取、纯化和浓缩。然后，添加相应的佐剂以制备最终的亚单位疫苗配方。或者，随着基因工程技术的进步，分子克隆技术已被应用于构建亚单位流感疫苗。简言之，通过限制性内切酶消化和连接过程，将流感病毒的主要抗原蛋白基因（如HA和NA）克隆到蛋白表达质粒中。将工程质粒转移到原核或真核细胞中，以产生HA或NA蛋白抗原，然后进行浓缩和纯化，添加相应的佐剂以获得最终的亚单位疫苗（严格意思上的亚单位疫苗）。常用的IIV3疫苗包括一些通过这种方法制备的疫苗。例如，Influvac®（Solvay Pharmaceuticals BV, Weesp, The Netherlands）和Agrippal®（Chiron SRL, 现为Novartis Vaccines, Viaflorentina, Italy）疫苗在健康儿童、成人和老年人中显示出良好的免疫原性、安全性和耐受性。由于孕妇极易感染流感病毒，特别为孕妇设计了三价流感亚单位疫苗Agrippal S1和Grippol Plus，这些疫苗符合药品委员会（CPMP）标准，并已显示出为孕妇提供高滴度抗体以及长达6个月的婴儿免疫保护效果。除了人类使用，也广泛研究了猪和家禽的亚单位流感疫苗。Hernandez等同事使用杆状病毒载体系统表达猪流感病毒（SIV）HA蛋白与猪IgG2a Fc结合，可以为猪提供有效的抗H1N1 SIV效果和高滴度血清抗体，并减少肺损伤。此外，Song等同事评估了重组HA1-2亚单位疫苗对禽源H7N9流感的免疫原性，并发现含佐剂的灭活疫苗候选物可以在小鼠中诱导有效的HA1-2特异性体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。值得注意的是，它们有一些缺点，包括相对较低的免疫原性、所需的疫苗剂量大和高生产成本，所有这些都需要进一步改进。 2.5.病毒体流感疫苗 病毒体是重组流感病毒包膜，由HA、NA和病毒磷脂组成。它们的颗粒结构使病毒体保持病毒膜融合和细胞结合能力，这可以增加与亚单位和裂解病毒疫苗相比的免疫原性。病毒体可以将封装的货物送入抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并随后诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答。然而，由于缺乏佐剂，病毒体在激活APCs和触发交叉呈递方面的效率不高，这限制了CTL免疫的诱导。因此，添加合适的佐剂可以克服这一缺点。Dong等同事开发了一种新型流感疫苗配方，该配方由含有Toll样受体4（TLR4）配体单磷酸脂质A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA-Ni的病毒体组成。体外研究表明，含MPLA的病毒体比未加佐剂的病毒体更能强烈激活APCs，并且用含MPLA的病毒体免疫小鼠，病毒NP附着可以促进NP特异性CTLs的启动。病毒体也被用作短肽抗原的传递系统。Soema等同事构建了含有保守的人类HLA-A2.1流感T细胞表位M158-66的病毒体。在HLA-A2转基因小鼠中评估了这些肽装载病毒体的免疫原性和保护效果。在小鼠和树突状细胞培养中研究了病毒体的传递特性。用含肽病毒体和佐剂CpG-ODN 1826免疫HLA-A2.1转基因C57BL/6小鼠，增加了肽特异性CTLs的数量。用含佐剂的肽装载病毒体免疫接种减少了小鼠在异源流感病毒挑战后的体重损失。 自20世纪70年代首次提出病毒体流感疫苗以来，经过20多年的发展，流感病毒体疫苗已积累了足够的临床实验数据，并由此产生了两种产品Epaxal®和Inflexal®，它们分别由瑞士伯尔尼瑞士血清和疫苗研究所在1994年和1997年生产。其中，Inflexal®是一种适用于所有年龄组的佐剂流感疫苗，它在健康和免疫功能低下的老年人、成人和儿童中均显示出良好的免疫原性。它能够诱导B细胞反应并产生病毒抗原特异性抗体。然而，一项临床研究未能证明其能够诱导针对嵌入病毒体的两个肽段（CTL靶标抗原）的CD8+ T细胞。这一缺陷表明的是病毒体技术的局限性，还是仅仅反映了目标抗原选择的非最优性，目前尚不清楚。与灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗和病毒体疫苗类似，主要诱导B细胞介导的体液免疫。未来的研究需要开发能够同时诱导细胞免疫和体液免疫的流感疫苗，如前述的减毒活流感疫苗和下文描述的活病毒载体疫苗。 活病毒载体流感疫苗利用基因工程技术将流感病毒的抗原蛋白（s）整合到不同类型的病毒基因组中，使得这种重组病毒能够在接种宿主体内持续增殖，以确保流感病毒抗原蛋白（s）的高水平表达。这随后在接种个体中诱导特定的抗流感免疫效应和/或非特异性先天免疫效应。常用的病毒（或病毒载体）以将流感蛋白抗原引入接种宿主包括但不限于腺病毒载体、沙粒病毒载体、新城疫病毒载体、杆状病毒载体和疱疹病毒载体。与前述的减毒活流感疫苗（LAIV）类似，活病毒载体疫苗的优点包括其能够诱导针对免疫原蛋白的强烈体液和细胞适应性免疫应答，以及其能够利用宿主细胞机制表达所需的抗原蛋白。因此，这些特性可以同时诱导体液和细胞免疫应答，在相对短的时间内产生抗体，维持长时间的免疫保护，从而可以发挥高效的免疫效应。此外，活病毒载体疫苗还可用于进一步构建多价疫苗或多组分疫苗，从而减少疫苗产品开发的时间，简化接种过程，并提高不同基因型病毒株之间的交叉保护效果。 由于上述优点，活病毒载体流感疫苗具有良好的发展前景，逐渐成为许多新型疫苗生产研究的热点，包括流感疫苗。我们将在下文描述疫苗开发中使用的不同类型的病毒载体及其优缺点。 3.病毒载体流感疫苗 病毒载体流感疫苗是指利用基因工程技术将流感病毒的抗原蛋白（s）整合到另一种病毒的基因组中，这使得这种重组病毒能在接种宿主体内持续增殖，以确保流感病毒抗原蛋白（s）的高水平表达。这随后在接种个体中诱导特定的抗流感免疫效应和/或非特异性先天免疫效应。常用的病毒（或病毒载体）以将流感蛋白抗原引入接种宿主包括但不限于腺病毒载体、沙粒病毒载体、新城疫病毒载体、杆状病毒载体和疱疹病毒载体。与前述的减毒活流感疫苗（LAIV）类似，活病毒载体疫苗的优点包括其能够诱导针对免疫原蛋白的强烈体液和细胞适应性免疫应答，以及其能够利用宿主细胞机制表达所需的抗原蛋白。因此，这些特性可以同时诱导体液和细胞免疫应答，在相对短的时间内产生抗体，维持长时间的免疫保护，从而可以发挥高效的免疫效应。此外，活病毒载体疫苗还可用于进一步构建多价疫苗或多组分疫苗，从而减少疫苗产品开发的时间，简化接种过程，并提高不同基因型病毒株之间的交叉保护效果。 由于上述优点，活病毒载体流感疫苗具有良好的发展前景，逐渐成为许多新型疫苗生产研究的热点，包括流感疫苗。我们将在下文描述疫苗开发中使用的不同类型的病毒载体及其优缺点。 图2、复制缺陷型腺病毒载体流感疫苗的工作原理。携带流感病毒HA基因的复制缺陷型腺病毒载体能够诱导产生高滴度的血凝抑制(HI)抗体。该图是用 Biorender.com 创建的。 3.1.腺病毒载体流感疫苗 腺病毒载体疫苗使用腺病毒作为载体，通过将其与腺病毒基因组结合，表达感兴趣的病原体的保护性抗原蛋白的转基因。腺病毒载体疫苗具有几个优点，包括高水平的抗原蛋白转基因表达，以及同时诱导体液和细胞免疫应答的能力。它们也是安全的，易于制备，不需要佐剂。目前，它们被广泛开发作为预防性疫苗。 腺病毒载体疫苗策略已被用于尝试开发通用流感疫苗。由于流感病毒包括许多基因型（或亚型），并且可以通过自然遗传突变和/或基因组重排（称为抗原漂移和抗原移位）相对快速地进化，因此同时为个体提供针对不同流感病毒的保护的疫苗生产面临真正的挑战。开发通用流感疫苗是解决这一重要问题的重要方法。为此，已构建腺病毒载体流感疫苗以表达流感病毒蛋白的保守抗原区域，如HA2的茎区、嵌合HA、M2e、NP及其T/B细胞表位，因为这些主要蛋白抗原对各种亚型的流感病毒显示出高度的免疫原性和免疫保护效果。例如，Tutykhina等同事构建了一种携带流感病毒保守M2和NP抗原表位的重组腺病毒载体（Ad5-tet-M2NP），该载体能够诱导高水平的CD8+和CD4+ T细胞产生，表明接种这种重组病毒载体疫苗可以诱导针对流感病毒的强效T细胞介导的免疫应答。接种这种活腺病毒载体疫苗的小鼠在8个月后能够产生高水平的效应记忆CD44+CD62- T细胞，并对五种流感病毒（H9N2、H1N1、H5N2、H2N3和H3N2）显示出有效的长期保护效果。Hassan等同事构建了一种不同的活腺病毒载体疫苗，包含H5N1流感病毒的保守抗原表位，包括由M2外域（M2e）、血凝素（HA）融合域（HFD）、核蛋白的T细胞表位（TNP）和HA a-螺旋域（HaD）组成的多表位（ME）。这种腺病毒载体ME疫苗诱导了体液和细胞免疫应答，减少了接种小鼠肺部的流感病毒滴度，并显示出相对良好的免疫保护效果，能够抵抗H5、H7和H9流感病毒的挑战。然而，用Ad-ME载体疫苗免疫的小鼠在挑战后的肺部流感病毒滴度仍然显著高于匹配的HA对照疫苗接种动物，这表明最佳的抗体介导保护可能需要结构完整的HA免疫原。因此，还可以基于所谓的计算优化广谱反应原（COBRA）概念，计算设计表达结构完整、全长HA作为免疫原的其他类型的基于Ad的疫苗。 目前，5型腺病毒（Ad5）是最常用的人腺病毒（AdV）载体。Wu等同事构建了一种复制缺陷的重组AdV（rAd5-avH1HA），在单轮细胞感染后能够表达H1N1流感病毒（A/swine/Zhejiang/199/2013株）的HA蛋白。作者表明，这种疫苗能够诱导产生高滴度的中和抗体，并显著减少接种的BALB/c小鼠鼻腔和肺部的挑战流感病毒的复制。由于大多数人对Ad5具有自然免疫力，非人源重组腺病毒载体，如牛腺病毒（BAdV），也越来越多地受到研究人员的关注。例如，Ekramy等同事使用BAdV-3构建了一种重组腺病毒载体流感疫苗BAd-H5HA，表达H5N1亚型禽流感病毒的HA基因，并在小鼠中比较了与HAdV类型C5（HAdV-C5）载体H5N1疫苗（HAd-H5HA）的免疫效果。他们首次发现，低剂量（1×106 PFU）肌肉注射BAd-H5HA可以在小鼠中诱导强烈的体液和细胞免疫应答，并提供针对异源H5N1病毒的有效免疫保护。相比之下，HAd-H5HA需要较高剂量（1×108 PFU）才能达到相当的免疫效果。 3.2.沙粒病毒载体流感疫苗 沙粒病毒是一类具有双节段RNA基因组的包膜RNA病毒。沙粒病毒包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、拉沙病毒（LASV）、胡宁病毒（JUNV）、马丘波病毒（MACV）、皮钦德病毒（PICV）等。这些沙粒病毒（也称为哺乳动物沙粒病毒）可以通过感染啮齿动物的粪便、尿液、血液或唾液传播给人类，它们是沙粒病毒的自然宿主。由LASV、JUNV和MACV等致病性人类病毒引起的严重出血热是主要的感染相关症状。相反，许多其他沙粒病毒，如PICV，在感染后不引起人类和哺乳动物的任何临床表现，因此被认为是非致病性的（即无害的）偶然宿主。同样，LCMV通常不会对普通人群构成严重健康威胁，因为大多数LCMV感染的病例都是无症状或轻微的。 先前的研究表明，沙粒病毒在感染的早期主要感染重要的免疫细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，这使它们成为疫苗开发的理想病毒载体，因为它们靶向这些能够自然增强对抗原蛋白免疫应答的抗原呈递细胞（APCs）。已有几项研究利用反向遗传技术生成携带感兴趣抗原蛋白的重组LCMV。Emonet等同事开发了一种三质粒反向遗传系统来生成三节段LCMV。通过该系统恢复的重组LCMV能够同时携带多达两个感兴趣的抗原蛋白的转基因。2018年6月，专注于肿瘤学和传染病创新活性免疫疗法的临床阶段生物技术公司Hookipa Biotech AG（“Hookipa”）和研究型生物制药公司Gilead Sciences, Inc.（“Gilead”）宣布了一项研究合作和许可协议，授予Gilead对Hookipa的TheraT®和Vaxwave®沙粒病毒载体技术的独家权利，用于乙型肝炎病毒（HBV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）两种主要慢性传染病的指示。值得注意的是，基于LCMV载体并表达人类乳头瘤病毒16型（HPV16）E7和E6开放阅读框（ORFs）的非致癌性融合蛋白作为模型肿瘤相关抗原的TheraT®载体，以及基于PICV的类似病毒结构，目前正在作为HPV16阳性头颈癌的重复原始增强免疫策略进入临床1期测试。这是首次在人类（FIH）第1期（剂量递增）/第2期（剂量扩展）多国、多中心、开放标签研究中包括140名HPV16+确诊癌症参与者。虽然这在使用LCMV等沙粒病毒载体作为治疗性肿瘤疫苗方面迈出了重要一步，但值得注意的是，约5%的人类人群显示出先前接触LCMV的证据，因此存在预先存在的（LCMV）载体免疫问题。此外，尽管大多数获得性LCMV感染是无症状或轻微的，但先天性LCMV感染可能非常严重，可能导致自然流产和胎儿死亡，或引起脑功能障碍。最近的报告还表明，LCMV感染免疫受损个体也可能导致一些严重的医疗并发症。在极少数情况下，LCMV感染可能导致某些形式的神经系统疾病，如无菌性脑炎、脑炎、脑膜炎或甚至在健康个体中引起小头畸形，因此必须谨慎使用。 PICV与LCMV具有相似的病毒基因组结构，但与全球发现的LCMV不同，其宿主是普通家鼠属Mus musculus。PICV仅在南美洲哥伦比亚的皮钦德谷特有的稻大鼠属oryzomys albigularis中发现。与LCMV不同的是，PICV在人类中不会引起疾病。Dhanwani等同事构建了一个PICV的三质粒反向遗传系统，并用它来开发PICV载体流感疫苗。当将A型流感病毒（HA和/或NP）的抗原蛋白转基因插入重组PICV载体疫苗（rP18tri）时，这些PICV载体流感疫苗可以有效地在接种的小鼠中诱导针对HA和NP的特异性体液和适应性免疫应答，并能提供持久的、有效的保护效果，使接种的动物能够抵御致命的小鼠适应株流感病毒（PR8）。此外，对PICV的中和抗体（nAb）反应水平非常低。这种免疫逃避现象部分可以用Pichinde病毒粒子表面膜上的糖蛋白（GPC）高度糖基化来解释，这使得病毒无法被nAbs识别。因此，PICV载体疫苗比LCMV载体疫苗具有一个主要优势，即PICV基疫苗可以克服初次加强免疫期间抗载体免疫的问题。尽管仍处于开发的早期阶段，但PICV载体已被证明相对安全，可以避免由于PICV仅在哥伦比亚自然发现而预先存在的免疫力，并且已显示出作为开发新型流感和其他病原体疫苗的病毒载体的巨大潜力。 最近的一项研究表明，基于PICV和LCMV的病毒载体可以被设计来传递肿瘤相关抗原，如HPV16 E6和E7基因的非致癌性融合蛋白，在异源原始增强方案中可以有效诱导肿瘤特异性CTL（CD8+ T细胞）反应，消除已建立的实体肿瘤并保护接种的小鼠免受肿瘤再挑战。沙粒病毒家族成员可以诱导强烈的CTL反应和低水平的中和抗体，这有助于克服其他病毒载体中常见的抗载体免疫问题，例如痘病毒和腺病毒载体。基于这些激动人心的新发现，已经建立了一种新的基于沙粒病毒的免疫治疗策略。 图3、不同类型病毒载体及其疫苗的优势、劣势以及应用。该图是用 Biorender（Biorender.com）创建的。 3.3.新城疫病毒载体流感疫苗 新城疫病毒（NDV）是一种单股负链RNA病毒，属于副黏液病毒科，其基因组从3'端至5'端依次编码六个结构蛋白（NP、P、M、F、HN和L）。NDV基因组能够被改造以稳定表达大片段的感兴趣转基因（4.5 kb或更大），并且能够表达超过3种不同的非NDV蛋白。理论上，任何插入NDV两个蛋白编码序列之间的外源基因都可以被表达。先前研究表明，当外源基因插入NDV P和M基因之间时，表达水平最高。 NDV能够感染不同哺乳动物的呼吸道上皮细胞，如家禽、人类、猪、小鼠和非人灵长类动物（NHPs）。NDV能够激活宿主的局部粘膜免疫，诱导产生高效的体液和细胞免疫应答。此外，NDV的整个复制周期都在细胞质中进行，从而最小化了病毒基因组与宿主基因组之间重组的风险。NDV载体疫苗的应用可以通过喷雾和/或将疫苗加入饮水等大规模免疫方法进行。另一个优点是NDV在鸡胚中高效增殖，有利于重组NDV载体疫苗的大规模生产。因此，NDV载体已成为人类和动物疫苗开发的重要对象。 人类不是NDV的自然宿主，因此NDV对人类不太致病。此外，已经证明NDV与已知的多种人类副黏液病毒（如呼吸道合胞病毒RSV和人类副流感病毒hPIV）的氨基酸同源性和相似性较低，因此人类对这些其他呼吸道病毒的免疫对NDV的影响有限。Bukreyev等同事构建了一种表达人类副流感病毒3型（HPIV3）HN蛋白的重组NDV，随后将其作为活病毒载体疫苗（106.5 PFU）用于非洲绿猴和恒河猴的鼻内和气管内接种。活重组NDV载体HPIV3疫苗仅在接种动物的呼吸道复制。28天后进行第二次免疫。结果显示，接受活重组NDV载体HPIV3疫苗免疫的动物的中和抗体血清滴度显著高于接受野生型HPIV3免疫的动物。为了评估NDV载体疫苗对人类流感病毒的有效性，Nakaya等同事使用NDV Hitchner B1株作为病毒载体，将人类流感A/WSN/33病毒的HA基因插入NDV P和M基因之间，构建了rNDV/B1-HA疫苗。结果表明，重组NDV载体流感疫苗能够在接种的小鼠中诱导产生强大的体液免疫应答，通过高水平的针对流感病毒HA蛋白的抗体滴度提供对A/WSN/33病毒的保护效果。DiNapoli等同事研究了NDV载体疫苗对非洲绿猴高致病性禽流感病毒（HPAIV）的免疫效果，他们用活重组NDV载体疫苗（10 PFU）表达H5N1 HPAIV HA蛋白（NDV-HA）对动物进行免疫。两次疫苗接种后，诱导产生了高滴度的中和抗体，并在呼吸道诱导产生了高水平的粘膜免疫球蛋白IgA反应。这些发现表明，NDV载体流感疫苗可能对人类使用具有潜力。 新城疫和禽流感都是严重威胁家禽业的重要传染病。因此，通过疫苗接种预防这两种疾病具有特别的意义。构建高效的新城疫和禽流感二价疫苗可以减少疫苗生产成本和通过多种疫苗给动物带来的不利压力。NDV载体AIV疫苗是解决这一问题的策略之一。Ma等同事构建了一种表达A/chicken/Iowa/04-20/2015 (H5N2)病毒HA蛋白的重组NDV病毒，用作流感疫苗候选物。作者发现，无论是活NDV载体流感疫苗还是灭活NDV载体流感疫苗都能在接种后两周诱导产生针对H5N2 HA蛋白和NDVLaSota株的中和抗体。然而，活NDV载体流感疫苗的免疫原性低于灭活NDV载体流感疫苗。此外，这些疫苗对高致病性H5N2 A/turkey/Minnesota/9845-4/2015病毒的复制显示出效果，这通过接种动物的有限病毒脱落证明。免疫鸡的血清还能在病毒挑战后中和高致病性H5N1和H5N8病毒。在另一项研究中，Xu等同事将H9亚型AIV HA蛋白的外域与NDV F蛋白的跨膜域和细胞质尾区融合，构建了重组NDV载体流感rmNA-H9F疫苗候选物。接种后，这种疫苗能够保护鸡免受致死剂量的NDV和AIV H9N2的挑战，并诱导产生高水平的NDV-HI、H9-HI和分泌型IgA。 尽管NDV载体AIV疫苗已经在实验室实验中显示出显著的积极免疫效果，但存在针对NDV的母源抗体可能会减少NDV载体疫苗的有益免疫效果。为了解决这个问题，一些研究小组建议使用嵌合NDV载体。通过用具有不同血清学特性的禽副黏液病毒2型（APMV-2）的对应物替换NDV F和HN蛋白的外域构建了嵌合NDV载体（NDV株BeaudetteC）。这绕过了针对NDV的预先存在的母源抗体，并为HPAI病毒提供了有效的保护。Chowdhury等同事也使用这种方法构建了表达H7 HA蛋白保守序列的重组嵌合NDV载体。他们的发现显示，由于母源抗体的影响，4周龄鸡在异源初次加强免疫策略后没有诱导出高滴度的NDV LaSota特异性抗体。然而，通过NDV/HA异源初次免疫后，H7中和抗体的滴度已经超过了16 HI，这可以保护肉鸡和火鸡免受H7N8 HAPI的侵害，同时也减少了病毒脱落。 3.4.杆状病毒载体流感疫苗 杆状病毒是一种感染昆虫细胞的病毒，因此，只有无脊椎动物能被这种病毒感染。Autographa californica多重囊核多角体病毒（AcMNPV）是研究实验室中最常用的杆状病毒。AcMNPV是一种大型双链DNA病毒，基因组为133.9 kb，包含156个开放阅读框（ORFs）。AcMVPV的基因组较大，因此有足够的位置插入感兴趣的外源基因以在病毒感染的细胞中表达。在过去的三十年中，为了这个目的，杆状病毒表达载体系统（BEVS）不断优化。在过去的十年中，基于BEVS的疫苗研究逐渐增加，有7种商业化产品已获批准用于人类，其中包括人类乳头瘤病毒疫苗、流感疫苗、前列腺癌疫苗和脂蛋白脂酶缺陷疫苗。 随着BEVS的不断进步，这些技术也被应用于构建杆状病毒载体流感疫苗。Influenza-Flublok Quadrivalent，一种四价重组杆状病毒载体流感疫苗，配方每0.5 mL剂量含有180 mg，每种流感病毒株的HA含量为45 mg：A/Hawaii/70/2019(H1N1)、A/Minnesota/41/2019（类似A/Hong Kong/45/2019的病毒）(H3N2)、B/Washington/02/2019和B/Phuket/3073/2013，可用于2020-2021年流感季节的人类疫苗接种。Flublok Quadrivalent是一种用于主动免疫以预防由甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的疾病的疫苗。它已于2017年获批用于18岁及以上人群。Influenza-Flublok的三价版本于2013年获得许可，但后来被四价版本取代。与灭活流感疫苗相比，Flublok配方中相对较高的流感抗原水平可以增强疫苗的免疫原性并减少局部反应原性。此外，Liu等同事评估了另一种基于BEVS的H5亚单位疫苗（A/goose/Guangdong/1/96），发现这种疫苗可以保护BALB/c小鼠以及无特定病原体（SPF）和商业肉鸡，因此可以作为人类和动物候选H5流感疫苗株。此外，Yu等同事使用BEVS构建了一种重组杆状病毒载体BmNPV-CMV/THB-P10/CTLT疫苗，该疫苗包含H1HA、H9HA和H7HA AIV亚型的T淋巴细胞表位（CTLT）的融合密码子优化序列，以及H1HA、H9HA和H7HA AIV亚型的Th和B细胞表位（THB）的融合密码子优化序列，然后用于小鼠和鸡的免疫。他们的发现表明，疫苗可以在两种动物中激活流感病毒特异性的体液和细胞反应，表明疫苗可以作为针对不同亚型AIV的通用疫苗。尽管BEVS具有作为疫苗开发有吸引力的载体平台的独特特性，但考虑到与BEVS相关的因素，如蛋白质复杂性、翻译后修饰、规模和成本，它并不适用于所有疫苗产品开发。应用杆状病毒载体疫苗作为常用疫苗载体平台的主要限制是缺乏人类免疫的安全指南。需要进一步研究以成功将技术整合到现实生活情况中。还需要在哺乳动物系统中建立完整的杆状病毒基因表达，以进一步增强基于杆状病毒的疫苗的安全性。杆状病毒可能是具有作为潜在疫苗的一些有吸引力属性的下一代流感疫苗。 3.5.疱疹病毒载体流感疫苗 疱疹病毒是一种具有大型双链DNA基因组的病毒，大小范围约为125到240 kbp。这些疱疹病毒在宿主范围上受到限制，例如，禽类疱疹病毒只能感染禽类。有几种疱疹病毒载体可用，包括火鸡疱疹病毒（HVT）、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）和鸡马立克氏病病毒（MDV）。MDV疫苗已经在养禽业中使用了40多年，因为它可以诱导对抗马立克氏病的终身免疫。HVT已被用作病毒载体来表达各种抗原蛋白，如AIV的HA蛋白和NDV的F蛋白。已有几种基于HVT载体的商业疫苗表达H5亚型AIV的HA蛋白，如Vectormune® AI [CEVA Animal Health, Lenexa, KS, USA (www.vectormune-ai.com)]。这种疫苗为火鸡和家鸭提供了针对H5亚型HPAI的有效免疫保护。Kapczynski等同事构建了一种表达2.2 H5N1 AIV HA蛋白的重组HVT载体AIV疫苗，该疫苗在鸡接种后对H5N1和H5N2 HPAIV挑战产生了显著的保护效果，使动物的存活率达到80%-95%。此外，接种HVT载体AI疫苗的鸡的脾T淋巴细胞能够识别MHC匹配的目标细胞感染H5、H6、H7或H9 AI病毒。Li等同事使用细菌人工染色体（BAC）克隆技术构建了另一种表达H7N1 HPAIV HA基因（rHVT-H7HA）的重组HVT载体疫苗。接种rHVT-H7HA可以诱导产生H7特异性免疫反应，帮助鸡抵御高致病性H7N1病毒的感染，并显著减少病毒脱落。Liu等同事还使用BAC克隆技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了一种表达H9 HA蛋白的重组HVT载体疫苗。接种rHVT-H9可以在接种后35天诱导鸡产生体液和细胞免疫反应，这通过针对H9的高滴度中和抗体HI和激活IFN-g+ CD4+和IFN-g+ CD8+ T细胞证明。当接种的动物在接种后35天受到H9N2 AIV挑战时，在鸡的气管和肛门拭子中在挑战后3天和5天没有观察到病毒脱落。此外，在接种鸡的器官（气管、肺、脾和肾）中没有检测到H9N2病毒。这些发现表明，HVT作为禽流感疫苗开发的病毒载体具有前景。然而，疱疹病毒载体的一些缺点，如高水平的预先存在的抗载体免疫、通过卵内途径提供完全保护所需的相对较长时间以及宿主细胞终身感染可能造成的风险，可能会阻碍这种病毒载体在疫苗开发中的考虑。 流感疫苗的开发包括季节性流感疫苗和通用流感疫苗两个主要方向。季节性流感疫苗针对每年流行的流感病毒株进行设计，而通用流感疫苗则旨在提供针对多种流感病毒株的广泛保护。 4.季节性流感疫苗和通用流感疫苗的开发 许多前述的病毒载体疫苗已被证明是安全且具有免疫原性的，它们能够激活针对感兴趣抗原蛋白的体液和细胞免疫反应，无论是在局部粘膜部位还是系统性地。因此，病毒载体疫苗可以克服传统灭活疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗的一些固有缺点。然而，这些疫苗的长期有效性和安全性仍需要进一步研究。流感疫苗开发中真正的挑战是如何应对流感病毒频繁的抗原漂移和抗原转变，以及流感病毒的快速突变率。为了克服这个问题，最近的努力集中在改进流感病毒的流行预测，以开发能够与预测的季节性病毒紧密匹配的疫苗候选物，以及开发能够对多种流感病毒株提供广泛保护效果的通用流感疫苗。 4.1.季节性流感疫苗的开发 流感监测是一项全球性的公共卫生活动，每年在全球范围内进行。世界卫生组织（WHO）自1952年起组织了这一协调的全球性努力，以追踪流感病毒感染，最初称为全球流感监测网络（GISN），2011年更名为全球流感监测与响应系统（GISRS），并扩展到包括113个成员国的143个机构。根据这一流感病毒监测系统的主要两种方法，通过综合征监测系统从门诊或医院收集信息，以监测当地社区流感疾病的新出现，而循环流感病毒株的病毒学特征则由实验室监测系统收集。每年两次，全球季节性流感病毒循环的所有收集到的信息都会被GISRS整合、分析，并提供给适当的当局，用于季节性流感疫苗株的选择和通用流感疫苗的开发。自20世纪50年代以来的几十年里，流感病毒疫苗株的选择依赖于年度血清学检测的数据，这些数据提供了免疫系统对当前循环流感病毒的反应的表型测量。然而，血清学检测有一定的缺点，包括劳动强度大、实验室间数据不一致，以及数据不公开和/或难以解释或扩大规模。因此，这些方法只能应用于分析一小部分流感病毒。因此，迫切需要开发基于监测数据的流感病毒持续进化分析工具，并为选择具有更广泛保护潜力的流感疫苗株提供建议。系统发育树或进化树是用于可视化循环流感病毒遗传进化的工具之一。多年来，研究人员开发了多个类似的工具来生成系统发育树并分析循环流感病毒的遗传进化。其中一种方法称为Nextflu（https://bedford.io/projects/nextflu/），这是一个由Neher和Bedford设计的在线可视化工具。Nextflu可以实时跟踪循环流感病毒的进化，特别是人类季节性流感病毒的进化。用户可以通过可视化循环流感病毒株的遗传和流行病学特征来分析季节性流感循环模式，这可以为即将到来的流感季节提供预测。同样，人群水平流感病毒序列的AD图结合了系统发育推断和祖先特征状态重建的信息，这是一种依赖于使用最大简约法将生物体的特征状态映射到系统发育树上的方法，以识别可能处于定向选择下的等位基因和相关遗传变化。除了系统发育树，抗原图或抗原图也是重要的分析工具。抗原图已经使用A型（H3N2）人类流感病毒的数据开发，并常规用于分析WHO流感监测网络的全球数据，作为流感疫苗株选择过程的一部分。抗原图基于反映病原体抗原特性的血清学数据。流感病毒的抗原特性通常基于对病毒分离物进行的血凝抑制（HI）数据，这些数据针对特定株的感染后雪貂抗血清进行测试。通过使用上述工具可视化流感病毒的自然进化，研究人员可以构建统计学习模型来解释抗原差异并预测流感病毒的下一步进化。例如，Steinbrück及其同事结合AD图和抗原树分析了2002年至2007年收集的流感A型（H3N2）的HA基因的进化，并成功预测了H3N2病毒在回顾性测试场景中的抗原进化。 尽管能够预测下一个季节性流感病毒株，但通常需要大约一年的时间来完成流感疫苗株的选择，并通过疫苗生产、发布和分发过程。然而，在这段时间里，循环的流感病毒可能会进一步变异，使其与选定的疫苗株不相似，正如最近的例子所示，预测的H3N2病毒流感疫苗，这种病毒与其他季节性流感病毒相比，进化得特别快且不可预测，并在2004年至2019年过去十五个流感季节中的六个季节中，使季节性流感疫苗与自然循环的H3N2株不匹配。此外，季节性流感疫苗刺激的抗体水平可能只能在相对较短的时间内维持，然后在流感季节结束前降至亚保护水平。这些问题可能会使预测和生产最佳季节性流感疫苗的能力复杂化，因此可能需要其他方法（例如，通用流感疫苗的开发）来生产覆盖不同流感病毒株的更广泛流感疫苗。 4.2.通用流感疫苗的开发 通用流感疫苗旨在提供针对甲型和乙型流感病毒的保护，而不受它们已知的血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）或其他病毒基因或基因片段的抗原漂移和移位的影响。目前，通用流感疫苗开发的几种常见靶点包括HA蛋白的保守茎部结构域、M2离子通道（M2e）的外域以及内部蛋白核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）。 由于流感病毒的茎部区域位于病毒粒子表面的一个不易被中和抗体接近的区域，因此它受到宿主免疫系统的选择压力较小，因此在不同流感病毒之间高度保守。因此，针对HA蛋白的这个保守茎部区域，可以合理地假设能够诱导出针对流感病毒内部亚型、不同亚型之间以及不同群组之间的广泛反应性抗体。 已经探索了包括生成具有HA头部高度糖基化、"无头"HA、仅表达茎部的长α螺旋（LAH）结构域以及开发嵌合和马赛克HA以诱导针对茎部的抗体等不同策略的候选通用流感疫苗。通过这些策略开发的一些通用流感疫苗已进入人体临床试验，并显示出一些令人鼓舞的结果。例如，一项包括65名参与者的I期临床试验结果表明，他们接受了两次不同组合的嵌合HA活流感病毒、灭活流感病毒或灭活流感病毒加佐剂的免疫接种，显示出诱导抗茎部H1抗体的证据。更令人鼓舞的是，结果显示，在接受了两次嵌合HA灭活和佐剂流感病毒疫苗的参与者中，诱导的抗茎部抗体在1.5年内比基线高出4倍以上。 其他尝试生产通用流感疫苗的方法涉及以流感病毒M2e蛋白为靶点。虽然由流感病毒M2e蛋白诱导的特异性中和抗体可以通过补体或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性与感染病毒的宿主细胞上的M2e结合，但一些研究表明，接种个体中M2e特异性血清抗体滴度迅速下降。这种弱抗原免疫原性的例子，再加上大多数诱导的抗体是非中和抗体，突出了通用流感疫苗开发过程中的一些挑战。因此，建议通过研究更保守的流感病毒抗原（或某些病毒抗原的保守区域）与使用适当的佐剂和其他增强抗原免疫原性的方法相结合，以及/或研究将通用流感疫苗与其他已知疫苗联合使用，这些方法可能有助于增强产生针对不同流感病毒株的更持久和广泛保护性的HA/NA中和抗体的潜力。 通用流感疫苗的开发是一个复杂的过程，需要综合考虑病毒的保守抗原、疫苗设计策略、佐剂的选择以及免疫程序的优化等多个方面。随着对流感病毒以及宿主免疫应答机制的深入了解，未来有望开发出能够提供广泛保护的通用流感疫苗。 5.重组流感病毒作为疫苗载体的开发 反向遗传系统可用于实验室中生成重组流感病毒，这是将其作为疫苗载体的基础。流感病毒(IAV)感染可以诱导CD4+和CD8+ T细胞产生细胞因子，这些细胞因子进而促使CD4+ T细胞分化为Th1或Th2细胞。Th1细胞参与CD8+细胞毒性T细胞介导的免疫应答，识别并破坏病毒感染细胞，抑制病毒复制和增殖。另一方面，Th2细胞可以激活B细胞，促进中和抗体的产生，从而参与宿主的体液免疫。减毒活流感疫苗(LAIV)在感染早期也能诱导粘膜免疫。 近年来，重组流感病毒已被用作病毒载体。将外源基因以不同的克隆策略插入流感病毒基因组，可能会产生不同的免疫应答。例如，一些研究表明，当外源基因插入流感病毒HA或NA的基因片段时，重组流感病毒载体疫苗能够介导针对外来蛋白的强烈中和抗体应答。相反，将外源基因插入流感病毒内部蛋白（例如NP和M1）或编码核糖核蛋白（例如PB2、PB1和PA）的基因片段，可以诱导针对外来蛋白的CD8+ T细胞应答。 图4、研发针对流感病毒血凝素（HA）茎部的通用流感疫苗的策略：超糖基化HA、无头HA、长α螺旋（LAF）片段、嵌合HA和马赛克HA。该图是用 Biorender.com 创建的。 基于这些发现，Isakova-Sivak等同事构建了两种重组活流感病毒载体腺病毒疫苗(LAIV-AdV)，通过将AdV的T细胞表位插入授权的冷适应H7N9 LAIV病毒的全长NA基因和截短的NS1基因的ORF中。使用这种LAIV-AdV疫苗免疫，可在C57BL/6J小鼠中诱导相对较强的流感病毒特异性抗体和细胞介导的免疫，足以保护接种动物免受致病性H7N9流感病毒和人AdV5感染。此外，Matyushenko等同事构建了两种重组LAIV载体疫苗，通过将编码RSV M2蛋白T细胞表位的基因插入H7N9亚型流感病毒的神经氨酸酶(NA)或非结构蛋白(NS1)中。这两种重组LAIV载体疫苗都能同时保护小鼠免受流感病毒和RSV感染，并在接种和挑战动物的肺部及肺组织驻留记忆T细胞(TRM)亚群中激活流感和RSV特异性CD4+和CD8+ T细胞应答。 尽管取得了这些积极的结果，重组流感病毒载体疫苗的安全性和有效性仍需进一步研究和改进。作为减毒活流感病毒，当用作病毒载体时，它仍能复制，因此存在与流通的野生型流感病毒发生基因重组和重配的可能性。此外，当病毒载体疫苗在实验室或接种个体中连续传代时，可能会丢失外源基因。 6.结语 许多病毒载体流感疫苗已被证明是安全和具有免疫原性的，能够激活针对局部粘膜位点或系统性抗原蛋白的体液和细胞免疫应答。这些病毒载体流感疫苗因此可以克服传统流感亚单位疫苗、灭活疫苗和减毒疫苗的一些固有缺点。到目前为止，已经研究了许多病毒载体流感疫苗，其中一些显示出可接受的有效性水平。这些新型病毒平台和技术为人类、家畜以及伴侣和外来动物的许多疾病提供了快速、高效和成本效益的疫苗生产方式。然而，这些疫苗的长期有效性和安全性仍需进一步研究。流感疫苗开发中的一个真正挑战是如何应对频繁的抗原漂移和移位，以及这些病毒的快速变异率。解决这一棘手但重要问题的潜在解决方案是通过优化预测下一种主要流感病毒株的方法，以便开发出具有最大保护价值的更好的季节性疫苗，和/或通过开发仍在深入研究和开发阶段的通用流感疫苗。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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