Thyrotropin Alfa(Sanofi)

Genzyme（健赞）是一家通过生物酶起家的biotech公司，总部位于美国马塞诸塞州的波士顿，于2011年并入赛诺菲。与众多biotech所不同的是，Genzyme并不以强大的生物技术著称，是一家靠化学技术起家、多元化的公司，业务涵盖治疗药物、精细化工品、诊断产品和诊断服务。虽然没有领先的生物技术，但Genzyme发展成为市值仅次于Genentech、Amgen和吉利德的biotech巨擘，其背后的经营策略引人深思，也值得广大初创型biotech公司参考。 一、Genzyme的诞生 Genzyme成立于1981年，由Tufts大学的生物酶学家Henry Blair、哈佛大学的化学家George Whitesides和风险投资家Sheridan Snyder联合创办，由Sheridan Snyder出任董事长兼CEO。Genzyme虽然是“基因”和“酶”的缩写，但起初并不是一家真正意义上的生物技术企业，而是一家研究酶水解和化学结构修饰的生化企业。Henry Blair基于他的专业研究，从美国独立卫生院（NIH）拿到一份研究合同——为NIH的研究人员供应葡萄糖脑苷脂酶（一种治疗戈谢病的酶）。一开始，Genzyme只供应从胎盘中提取的天然葡萄糖脑苷脂酶，但NIH研究人员发现，天然酶分子太大，几乎无法透过细胞，疗效也很差。后来，NIH决定对天然葡萄糖脑苷脂酶进行水解后化学结构修饰，并与Genzyme签下了研发合同。 在风险投资的帮助下，Genzyme在成立后不久就收购了Whatman Biochemicals，次年又兼并了Koch-Light Lab，快速地形成了精细化学品、原料药的供应能力。除了生产和销售原料药与精细化工品，Genzyme还开发了一款胆固醇氧化酶，并基于这种酶开发了一种诊断试剂，用于胆固醇检测。尽管1983年的Genzyme，估值已达1亿美元，但公司运营却差强人意。种子投资者Oak Investment Partners为了加强监管，向公司派遣了董事兼总裁Henri Termeer。Termeer虽是经济学背景，但在Baxter公司工作了10年，且职位已上升到执行副总裁。Baxter是一家主营血浆制品的公司，被称为biotech企业家的摇篮。Termeer长期与血浆制品打交道，他深知蛋白、凝血因子、酶等血浆制品的临床需求，但也清楚提取源产品的病毒风险，所以他的一大商业抱负就是通过基因工程生产这些产品。因这种商业抱负，Termeer最终决定加入这家初创公司。 Termeer刚到达公司时，Genzyme只是一个有11个雇员、办公室租住于波士顿红灯区的小公司。为了公司的长远发展，Termeer致力于引导公司的战略方向由诊断用酶向治疗用酶转变，美国《孤儿药法案》的实施，大大增加了这种战略的可行性。早期的Genzyme，虽然每年可以通过销售诊断用酶获得几百万美元的收入，但并不足以支撑公司的持续运营。为此，Termeer不得不四处找钱，就如他后来回忆的那样，他竭尽所能、并尝试用各种新方法融资。因为Termeer高超的融资技巧和高效的融资，Genzyme在行业的寒冬时节却有持续不断的资金涌入，让这家原本不被看好的“biotech”公司得以存活并发展。 1985年，Termeer被任命为CEO。作为公司的掌舵人，他的愿景是将这家初创公司打造为一家多元化的，能够同时供应多种药品、诊断产品、医疗器械和特种化学品的集团。为了发掘战略性的商业机会，Termeer建立了一个由麻省理工学院和哈佛大学科学家组成的咨询委员会，为了找到有效的融资方式，他咨询了多位著名的风险投资家。1988年，Termeer接任了Genzyme的董事长，在他的苦心经营下，这家名不见经传的小公司最终发展成为全球知名的biotech巨头。 二、成为真正的生物技术公司 在成立之初，Genzyme并没有生物技术，而是一家酶化学修饰、酶生产和销售的公司。尽管当时的热门是利用基因工程技术开发高市场潜力的酶或激素，但Termeer并不想跟Genentech、Amgen等公司抢“风头”，而是选择了利基战略——重点发展市场吸引力不高、却容易销售的产品，即治疗罕见病的酶。1986年，Genzyme首次公开募股（IPO），募集到资金2820万美元。为了将Genzyme 包装为一家令人信服的“biotech”公司，Termeer在招股书中重点强调“NIH正在利用其蛋白质水解物修饰技术生产的酶开展戈谢病和法布里病的临床试验”。然而相比那些拥有领先生物技术的biotech公司，Genzyme的股票显得有些相形见绌——Genetics Institute和Cytogen Corp与Genzyme在同一个月上市，但市值很快就说明了一切。为了与真正的“生物技术”挂钩，行业分析师建议Genzyme与Integrated Genetics (IG)合并，但这一提议遭到了IG公司的拒绝。 Ceredase（Alglucerase）是Genzyme首个与NIH联合研发的新药项目，1984年，一位NIH研究人员的孩子使用了Ceredase后显示出不错的疗效，但后来在7名受试者参与的临床试验中却以失败告终，原因是给药剂量太低。由于戈谢病在当时还没有有效的治疗方案，尽管Ceredase不被众人看好，但Genzyme和NIH都愿意继续研究。1985年3月，FDA授予了Ceredase孤儿药资格，NIH的临床研究也在持续推进。1987年1月，新的临床试验数据让Termeer看到了希望，为了支持Ceredase的临床试验开发，Termeer通过有限合伙的方式专项融资1000万美元，并为此成立了一家专门从事罕见病药物研发的子公司。 1987年下半年，美国biotech股市大跌，Genzyme为了应对寒冬而进行了业务调整，剥离了Koch-Light Lab，创始人Henry Blair也离开了公司。然而此时，IG公司陷入了财务危机，除了资本市场的周期性转冷，其产品开发也出现了问题。1988年，IG公司董事长Robert Carpenter下定了出售的决心。经过Termeer的软磨硬泡，成功说服了IG公司的董事会，仅用价值3150万美元的股票就收购了这家公司。1989年，两家公司完成合并，Genzyme因此获得了生物技术，成为了名副其实的biotech公司。 三、Genzyme的多元化 Termeer的雄心是打造一家多元化的公司，1989年，Genzyme建立了诊断业务，形成了药品（主要是克林霉素）、诊断产品（诊断酶等）、精细化工品（透明质酸等）和诊断服务四大业务，总营收3410万美元。1987-1995年是美国生物技术领域的投资低谷，大量烧钱的biotech公司变得无以为继，而多元化的Genzyme却屡屡成功融资，或许是因为该公司拥有稳定的收入来源，也或许归功于Termeer精妙的融资策略。1989年，Genzyme获得两笔重要的融资，一笔来自公开募股（融到3910万美元），一笔来自有限合伙开发透明质酸新适应症（预防术后粘连）的专项资金（融到3680万美元）。1990年，Genzyme将六款在研的医疗产品打包至Neozyme I Corp并单独IPO，实现了大规模融资，1991年，Genzyme又将诊断服务业务打包至IG lab然后单独IPO，成功募集到1410万美元，1992年，Termeer再次故技重施，通过组建Neozyme II进行了公开募股。 由于长时间的资本寒冬，越来越多的biotech公司陷入了财务危机，甚至到达破产的边缘，这为Termeer带来了大量的“捡漏”机会——通过收购优质资产迅速扩充管线和储备技术。由于Termeer精妙地融资策略，Genzyme的资金非常充裕。另外，FDA在1991年4月批准了Ceredase，这是治疗戈谢病的首个药物，虽然这种病的患者非常少，但该产品在上市后的第一个完整财年就卖出了一亿多美元。在新产品的支持下，Genzyme的销售额飞速增长，股价也水涨船高。 资金充裕、股价上升，Termeer不仅可以大兴土木（新建总部和工厂）、大规模投资研发、快速布局国际业务、还能放开手地收购廉价资产。1992-1994年间，Termeer为强化精细化工品业务而收购了Enzymatix、Sygena等公司，为了强化诊断业务而收购了Genecore、Vivigen、Virotech等公司，为配合在研透明质酸的管线建设而收购了BioSurface Technology。除此以外，Termeer还通过收购Medix Biotech、TSI Inc、Omni Res等公司而布局了全新的赛道。到90年代中期，Genzyme通过收购，新进入了单克隆抗体、细胞治疗、基因检测和基因治疗等多个领域。 虽然Ceredase的价格创下了美国的天价药纪录——人均年治疗费高达15万美元，但利润并不理想。一是Ceredase的生产成本太高，平均一个患者的年治疗剂量需要从两万个胎盘中提取，消耗原材料达27吨。二是胎盘不能无限制供应，产品的市场增长空间非常有限，尽管Genzyme努力扩大产能，但每年只能提供一两千人的治疗用药。在定价饱受质疑的情况下，通过涨价来增加利润的策略并不现实，唯一的办法就是通过基因工程技术把生产成本降下来。庆幸的是，与干扰素和红细胞生成素相比，重组Ceredase的技术难度要小很多，早在1984年，NIH的科学家就成功克隆了葡糖脑苷脂酶的基因序列。重组Ceredase（Cerezyme）很快就开发完成，并于1994年6月获得FDA批准。 90年代中后期，单抗技术基本发展成熟，美国biotech的股市也逐步回暖，但多元化的Cerezyme并不被资本市场看好。除了没有过硬的技术、研发管线储备不足、主营业务未处于热门赛道，该公司还面临着两大质疑——一是因Ceredase定价过高而遭到了媒体和民团的批评，二是Termeer花了大量融资买下一堆无法盈利的公司，虽然通过收购公司进入了多个领域，但营收却高度依赖患者总数不足两万人的戈谢病。 尽管饱受质疑，但Genzyme并没有放弃多元化，90年代后期，Termeer又收购了Peptimmune、Cell Genesys、PharmaGenics、Deknatel Snowden Pencer等多家公司。1997年，促甲状腺素α(Thyrogen)开发步入尾声，为了搭建以Thyrogen为基础的抗肿瘤管线，Termeer收购了PharmaGenics，并组建了Molecular Oncology（分子肿瘤）部门。为了强化以透明质酸为基础建立的组织修复业务，Termeer在2000年收购了BioMatrix，并整合为Biosurgery（生物外科）部门。而原有的药品、诊断性产品、诊断服务统一归到Genzyme General部门。在2000年的营收中，Genzyme General、Biosurgery和Molecular Oncology分别占83%、16%和1%。 除了多元化，Genzyme在90年代后期的另一重要战略就是加强研发，广泛合作。由于广泛的外延式研发，虽然研发投入强度远低于Genentech等技术型biotech公司，但回报却十分丰厚。1998年，Genzyme与GelTex公司联合研发的司维拉姆（Renagel）获得了FDA的批准，Termeer迎来了第二个现金牛。除了与GelTex合作，Genzyme还与BioMarin联合开发Aldurazyme，与西奈山医学院联合开发Fabrazyme，与Biogen联合开发β干扰素…… 四、Genzyme的飞速发展 Genzyme在90年代布局了大量的新技术，但回报却不理想，虽然涉足了癌症、帕金森病、心血管疾病等多个热门领域，但始终无法建立起竞争优势，相反，营收越来越依赖罕见病。司维拉姆是除酶以外，最能拿得出手的产品，为了独享司维拉姆的权益，Termeer在2000年出价10亿美元收购了GelTex。然而遗憾的是，司维拉姆的销售表现迟迟无法兑现Termeer向投资者许下的承诺，加之Fabrazyme的上市申请遇到了麻烦，股票在2002年出现了暴跌。 跨世纪的几年是制药行业资本重组的高潮，而股价暴跌的Genzyme很容易成为他人的盘中餐。Termeer为了防止被收购，开启了买买买的模式。为了强化透析产品管线，Termeer用6亿美元为代价接管了Bone Care，获得了度骨化醇（Hectorol）的销售权。为了强化抗肿瘤管线，Termeer相继吞并了SangStat、Ilex Oncology、AnorMED、Bioenvision等公司，合计交易额高达25.3亿美元，获得了兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（Thymoglobulin）、阿伦单抗（Campath）、普乐沙福（Mozobil）和氯法拉滨等产品的销售权。为了打造生物外科部门，Genzyme在整合Biomatrix之后又以1.5亿美元的价格收购了Novazyme。为了强化诊断业务，Termeer还拿下了Wyntek Diagnostics和IMPATH的肿瘤诊断业务，两笔交易合计约3亿美元。此外，Genzyme还收购了一家科技公司Myosix，以强化细胞治疗技术。 随着兼并企业的不断增多，Genzyme各业务的销售体量逐步扩大。2003年4月，Fabrazyme和Aldurazyme相继获得了FDA批准，虽然经历了一定挫折，但终苦尽甘来。2006年4月，Myozyme也成功获批上市，Genzyme建成了当时最强大的罕见病治疗产品管线。与此同时，Cerezyme也在不断刷新销售纪录，最高年销售额超过了12亿美元。 鉴于出色的业绩表现和清晰的战略，这家模式异类的“biotech”公司逐渐得到了资本市场的认可，股价止跌反升，2007年的市值仅次于Genentech、Amgen和吉利德，成为全球第四大biotech巨头。 五、Genzyme的瓶颈 2000-2007年是Genzyme的飞速发展期，短短7年间，总营业收入翻了4倍有余。2007年以后，Genzyme再未发动大规模的兼并，仅向拜耳先灵购买了多发性硬化药物alemtuzumab的商业权益。2010年，Termeer将基因诊断业务以9.25亿美元的价格打包出售，而剩余的业务整合为Personalized Genetic Health（个人基因健康）、Renal and Endocrinology（肾病和内分泌）、Biosurgery（生物外科）、Hematology and Oncology（血液病与肿瘤）和Multiple Sclerosis（多发性硬化）五大业务部门。 个人基因健康业务主要经营罕见遗传病的酶，产品包括Cerezyme、Fabrazyme、Myozyme和Aldurazyme，以及环太平洋地区代销Shire公司的Elaprase。这些产品在全球范围内仅有几千到几万名潜在患者，治疗市场完全依赖高昂的价格支撑。一旦出现竞争性产品而导致降价或使用者减少，销售额就会快速萎缩。事实正如此，五大酶品种在2010年的合计销售额仅为16.5亿美元，相比2008年下降了6亿多美元。肾病和内分泌业务是第二大营收来源，但司维拉姆、度骨化醇、促甲状腺素α的适用患者群也非常小，2010年的销售额为10.7亿美元，业务发展似乎也遇到了瓶颈——仅实现了6%的增幅。血液与肿瘤和生物外科是Genzyme花了大价钱打造的业务部门，2010年的销售额分别为6.8亿美元和5.8亿美元，虽然增长强劲，但发展空间非常有限。多发性硬化部门几乎名存实亡，2010年没有产生销售额。 尽管业务部门众多，Genzyme的营收和利润却高度依赖罕见病，而该业务又出现了研发管线匮乏的危机——处于晚期开发阶段的项目仅有Eliglustat和mipomersen，且mipomersen还是一个技术不成熟的产品。然而令投资者更为恼火的是，Genzyme的产品生产也出了问题——2009年，波士顿工厂因病毒污染而被迫停工。这导致大量患者被迫停药或减量用药，进而引发了用药患者的严重不满，而在此期间，FDA批准了Shire公司的Vpriv（velaglucerase alpha）。尽管Genzyme在向FDA缴纳了1.75亿美元的罚款后恢复生产，但患者大量流失导致收入和股价双重大跌，商誉也受到了严重影响。因为该事件，Termeer遭到了大量的投资者起诉，董事会内部也产生了激烈的争斗，有的人认为Termeer无法带领公司走出危机，也有的人认为Genzyme应该卖掉与罕见病无关的业务。 一方面，Genzyme没有强大的技术储备，且主营业务的发展已入瓶颈；另一方面，董事会的矛盾让Termeer失去了对公司的控制权，择机出售或许是最好的选择。2010年，赛诺菲安万特向Genzyme发来了收购邀约，2011年初，双方的交易谈成，最终以201亿美元的价格成交。 六、小结与讨论 Genzyme是为数不多的、多元化的biotech公司。因为多元化，它熬过了行业寒冬，但也因为多元化，它陷入了瓶颈。80年代末和90年代初，美国biotech公司集体被看衰——基因工程技术可发掘的商业机会越来越少，而单抗、反义寡核苷酸等技术远不能商业化，加之大量的biotech出现，行业开始内卷——股市大跌，企业融资极其困难，Genzyme却因有稳定的收入而屡屡成功融资。90年代后期，Genzyme为了防止被兼并而加大了多元化力度，但长期的多元化使得该公司并没有建立起技术优势，各个业务也没能形成统治地位，这是后来步入瓶颈的关键原因。 Genzyme是典型不依赖领先生物技术起家的biotech公司（相似的公司还有吉利德和Celgene），因为高效的融资和广泛的合作，不但熬过了资本的寒冬，而且成功找到了“出路”。就如Termeer回忆录中说的那样，没有融资经验和商业背景的科学家创办企业是非常挑战的，如果不懂得资本运作、没有清晰的融资目标、不了解融资交易结构、没有合适的融资形式、或缺乏卓越的谈判技巧，融资过程会非常困难或陷入被动。因此，对于一家将长期持续亏损的初创型biotech公司而言，技术固然重要，但融资才是决定它是否能够成功的第一要素。 Termeer掌管Genzyme长达26年，是掌舵同一家biotech公司时间最长的职业经理人之一，但Termeer也饱受争议。Termeer对Genzyme的早期成功起到了至关重要的作用，但后期的领导策略并不利于企业的进一步发展。作为一个经济学家，他的经营能力的确很强，但在技术创新和药品质量风险方面的认知存在不足，最终导致了Genzyme的发展瓶颈，这也是投资人认为他不能领导企业走出困境的主要原因。 参考文献：略 本文节选自新版《跨国药企成功启示录》（相比老版本更新了数据，增加15家biotech公司），任何媒体、公众号、网站转载本文都会被起诉侵权。作者：魏利军，北京药眼信息咨询有限公司创始人，著有《跨国药企成功启示录》、《仿制药企兴衰启示录》和《制药企业的战略与产品管线》，从事产品线规划、产品立项和战略策划相关的工作十余年，担任过多个企业的产品战略顾问。如对本文有建议或发行内容有错误，请不吝赐教，作者微信Voyager88 药事纵横征稿启事

摘要:中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生产的人类治疗性抗体约占批准的80%。为了实现更好的细胞生长和高产重组蛋白，通常使用连续批培养（fed-batch culture）技术来生产CHO细胞中的重组蛋白。根据细胞培养中营养物质消耗的需求，添加含有多种组分的培养基可以影响细胞生长的特性，并提高重组蛋白的产量和质量。连续批培养的优化应与培养环境参数、添加物组成和添加策略等综合因素相结合。目前，为了保持生产的灵活性并满足生物治疗过程的即将到来的需求，正在探索过程强化（PI）。本文综述了CHO细胞培养、连续批培养中的添加物组成、连续批培养环境参数、添加策略、连续批培养中的代谢副产物、恒化器培养以及强化连续批培养。 关键点 • 综述了CHO细胞中的连续批培养。 • 连续批培养已成为重组蛋白生产的通用技术。 • 连续批培养促进了CHO细胞中重组蛋白的生产。 引言 近年来，随着医药市场上重组治疗蛋白（RTPs）的需求不断增长，包括重组抗体，RTPs的生产迅速发展。已有超过120种重组抗体获得了欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，市值数千亿美元。一份报告估计，到2025年，单克隆抗体（mAbs）的市值将超过3000亿美元。在重组蛋白表达系统中，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是RTP生产的首选细胞，因为它们具有几个优势：①不易受到人类病毒感染，安全性高；② RTPs具有与人类细胞相似的翻译后修饰；③高密度CHO细胞可以适应悬浮培养，使用化学定义无血清培养基（CD-SFM）并在培养基中分泌蛋白质。 目前，哺乳动物细胞培养中的mAbs生产主要在大规模生物反应器中通过连续批处理进行。CHO细胞通常在连续批模式下培养，以实现最大细胞密度和产品滴度，可以是连续添加或一次性添加。初始细胞生长由基础培养基支持。在连续批培养中添加浓缩的饲料培养基以补充营养物质并延长培养时间。饲料培养基可以避免营养物质的限制，并可以促进重组蛋白的更高产量。连续批处理后，细胞在静止相中的培养时间比批处理培养长。连续批培养需要了解细胞生长和细胞代谢的特性，以及影响RTPs质量和产量的关键过程参数。CHO细胞在指数生长期快速生长，加速消耗葡萄糖和氨基酸，导致乳酸和铵的积累。在连续批培养中，温度、pH和其他过程参数也会影响抗体表达和质量属性。连续批培养可以提高CHO细胞中RTPs的表达和生产，但传统的一次性饲料输送也会导致代谢副产物的积累。因此，合理的饲养策略非常重要。连续批培养已将重点放在降低RTP生产成本上，这已成为制药工业的研究重点。 CHO细胞培养 贴壁CHO细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基中于37℃、5% CO2条件下生长。选择SFM进行悬浮培养，支持从贴壁培养到悬浮培养模式的转变。基础培养基用于贴壁培养，包括来自胎牛的血清成分。血清成分复杂，容易受到污染。SFM分为普通无血清培养基、无异种血清培养基、无动物源培养基、无蛋白培养基和化学定义无血清培养基。当涉及到细胞悬浮培养时，SFM可以有效避免血清培养引起的缺点，如污染和纯化困难。 批处理培养是指在一次性添加SFM后，可以在一次收获重组蛋白的培养方法。由于培养时间短和采样时细胞密度不满意，RTP生产不理想。连续批模式改善了RTP生产。据报道，在连续批培养中mAb滴度已达到超过10 g/L。近年来，连续批处理已成为大规模生产RTPs的重要生产过程。然而，保持细胞的高生产力和蛋白质的质量属性仍然是一个挑战。因此，连续批培养已从仅仅高产重组蛋白转变为高产和高质量的双重目标。 连续批培养中的饲料组成 优化关键饲料组成和组分浓度对工艺开发至关重要。在连续批工业中，使用偏最小二乘回归（PLSR）或多元线性回归（MLR）的拉曼光谱法被应用于监测和控制葡萄糖和氨基酸的浓度。除了拉曼光谱法，液相色谱-质谱联用（LC–MS）被认为是分析氨基酸和无机盐。首次，脂质组学分析已用于连续批培养中脂质鉴定和脂质定量。此外，饲料组成已与细胞代谢调节联系起来，以证明连续批培养（图1）。 图1 CHO细胞中的连续批培养。通过转染将感兴趣的基因（GOI）引入CHO细胞。阳性CHO细胞用于摇瓶培养。然后，CHO细胞和饲料培养基被添加到生物反应器中。在连续批培养模式下，监测和控制营养物质以实现RTPs的产量和质量。RTPs的生产由连续批系统指示。 饲料培养基的成分与SFM相似，包括氨基酸、碳源、无机盐、微量元素、维生素、脂质以及腐胺和酵母水解物等（表1）。 氨基酸 在上游过程优化中，氨基酸是主要关注点之一。在批处理培养中，氨基酸消耗殆尽，这对RTP生产不利。氨基酸的添加与三羧酸循环（TCA循环）有关。TCA循环依赖于替代代谢物来补充中间体。来自饲料培养基的氨基酸可以通过细胞质和线粒体之间的转换被导向TCA循环。此外，氨基酸的分解代谢是TCA循环的供应。饲料培养基中的氨基酸是有限的。与提高细胞健康相关的AMP与嘌呤核苷酸循环有关。来自TCA循环的苹果酸和甘氨酸积累。细胞增殖对5 mM以上的氨浓度有负面影响，而氨来自氨基酸的水解。因此，控制氨基酸的添加可能减少副产物的积累。尽管细胞可以合成非必需氨基酸，但细胞生长和重组蛋白的表达仍然依赖于饲料培养基中的氨基酸。 N-乳酰亮氨酸（Lac-Leu）和N-乳酰异亮氨酸（Lac-Ile）可以分别替代未修饰的亮氨酸和异亮氨酸。Lac-Leu和Lac-Ile提高了在培养基中的溶解度。添加2倍浓缩饲料培养基，其中包含上述两种N-乳酰氨基酸（Lac-AA）的70%混合物，与添加1倍浓缩饲料培养基相比，重组蛋白的产量增加了58%。Schmidt等人发现2倍浓缩培养基减少了饲料培养基的体积。根据代谢通量分析（MFA），Xing等人优化了饲料培养基以在CHO细胞中生产抗体融合蛋白（B1）。降低了丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸的浓度，而增加了蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸的浓度。最终，在连续批培养中B1蛋白滴度提高了27%。Fouladiha等人使用计算建模方法设计了CHO细胞的饲养策略。为了研究CHO细胞中mAb生产的效应，通过Plackett-Burman（PB）设计分析了15种代谢物。结果表明，经过苏氨酸处理后，mAbs的产量可以显著提高2倍。Hecklau等人报告说，S-硫酸化L-半胱氨酸（SSC）替代半胱氨酸，在连续批培养中非常稳定；补充SSC的饲料培养基延长了细胞活性，并使产品滴度提高了78%。同时，这种策略减少了铵（NH4+）的积累。Zhang等人利用高浓度酪氨酸和低浓度酪氨酸实验组，他们在生物反应器中培养表达抗CD20 IgG1的CHO细胞。除了含有酪氨酸的饲料培养基外，高浓度酪氨酸组还添加了88 mM酪氨酸溶液。高浓度酪氨酸促进了细胞生长，降低了生物反应器培养环境的渗透压，并增加了mAbs的产量。 氨基酸是饲料培养基的关键组成部分，它们的浓度和性质可以影响连续批培养中RTPs的产量和质量。参与连续批培养的氨基酸需要严格的设计。然而，由于溶解度的限制，一些高浓度氨基酸容易沉淀。改性氨基酸基于原始结构。我们需要全面考虑CHO细胞的特点，并建立最佳的添加策略。 碳源 葡萄糖是指数生长期TCA循环的主要碳源，并且在指数生长期的后期迅速消耗。然而，葡萄糖消耗导致丙酮酸和乳酸的积累，这会导致细胞生长受到抑制。Wilkens等人发现，3.6 g/L的葡萄糖浓度缩短了CHO细胞培养时间，并且在120小时后乳酸浓度达到了2.7 g/L。尽管1.08 g/L的葡萄糖和2.52 g/L的半乳糖都被用来减少乳酸的积累，并且在向CHO细胞培养中添加1.08 g/L的葡萄糖和2.52 g/L的半乳糖时，组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的产量增加了100%，但在160小时后葡萄糖的最终浓度接近零，并且细胞活性降低。在细胞培养过程中，需要将最低葡萄糖浓度控制在2 ~ 3 g/L。 谷氨酰胺是细胞指数生长期早期的次要碳源，但它增加了乳酸水平（Kirsch et al. 2022）。研究发现，当半乳糖以40%的替代比例补充，并且葡萄糖碳源被替代时，CHO细胞中Fc融合蛋白的表达增加了43%，并且细胞的总唾液酸含量增加了37%。转染GLUT5果糖转运蛋白的CHO细胞在连续批培养系统中培养，并且添加了含有14.5 g/L果糖的饲料培养基。果糖改善了细胞生长，并减少了乳酸的积累。Wlaschin等人指出，CHO细胞有能力通过表达GLUT5果糖转运蛋白来替代碳源。 根据培养基中的葡萄糖含量，可以向CHO细胞培养基中添加高浓度葡萄糖溶液。由于高浓度的碳源也会导致代谢副产物积累，因此应严格控制碳源的浓度。适当的替代碳源可以避免葡萄糖消耗后副产物抑制细胞生长。 无机盐和微量元素 连续批培养还需要无机盐来调节细胞培养环境中的pH和渗透压。Zhu等人使用2L生物反应器进行连续批培养，他们添加Na+来控制渗透压和二氧化碳分压（pCO2）。140~160 mmHg的pCO2和400 mOsm/kg的渗透压使CHO细胞的活细胞密度（VCD）降低了18%，但这些因素明显增加了蛋白B1的产量。在细胞培养中，以亚硒酸钠形式存在的硒（Se）可以保护细胞免受氧化损伤。Zhang等人发现，在添加亚硒酸钠的14天连续批培养中，VCD超过了1×107细胞/mL，产量约为3 g/L。 Gangwar等人发现，Zn、Cu、Fe和Mn影响电荷异质性，并减少细胞培养中代谢副产物的积累。Fe、Mn和Ni增强酸性变体，而Cu抑制它。Zn减少了碱性变体。Chung等人发现，存放了7周的饲料培养基中的硫酸亚铁（Fe2+）可以减少电荷异质性，但它提高了CHO细胞表达的mAb的产量。Graham等人发现，生物反应器中添加的50和100 μM锌离子（Zn2+）促进了CHO细胞中β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的产生，并使GUS的比活性增加了2倍。饲料培养基中5 μM的硫酸铜（Cu2+）获得了11.9±0.6 g/L的最终mAb滴度，以表达IgG1在CHO细胞中，这比传统连续批培养的最终mAb滴度高出4.8倍。 维生素 维生素增强了CHO细胞的生产力，并影响电荷异质性。Gangwar等人还指出，维生素可以抑制酸性变体，同时增强碱性变体。Hou等人发现，增加维生素C和烟酰胺的喂养速率可以将CHO细胞中的磷酸化水平降低到3%，并将羟基化水平降低到9.4%。添加包括0.005 g/L维生素B2、0.0035 g/L吡哆醇（维生素B6）、0.03 g/L吡哆醛（维生素B6）、0.0985 g/L叶酸和0.024 g/L维生素B12在内的B族维生素可以提高细胞包装体积（PCV）和抗体滴度。Lee等人在表达重组人因子II（rhFII）的CHO细胞的4天连续批培养中添加了10 g/L的维生素K溶液，该溶液用13%的聚山梨醇酯20（PS20）制备。当维生素K的最终浓度为0.1 mg/L时，γ-羧基谷氨酸（Gla）水平降低。 脂质 乙醇胺是哺乳动物细胞膜磷脂结构的组成部分之一。对于CHO细胞中TNFR-Fc的生产，添加补充乙醇胺和脂质的饲料培养基，最大VCD为4.3×106细胞/mL，抗体滴度为378 mg/L，是批处理培养的三倍。因此，脂质可以适当补充在饲料培养基中。 其他成分 腐胺对细胞生长至关重要。Zhang等人确认，通过PB设计设计的腐胺，显著增加了mAb的产量。在添加了41.67 mg/L腐胺浓度的饲料培养基后，观察到TNFR-Fc产量显著增加。Jardon等人发现，自噬对重组蛋白生产有负面影响。在连续批培养中，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）使t-PA产量比不加3-MA的对照组增加了2.8倍。自噬诱导肽（AIP），自噬蛋白Beclin 1的衍生物，通过调节细胞自噬，促进了CHO细胞中mAbs的生产。在连续批培养中添加3 µM的AIP，改善了人IgG1的表达水平，IgG1浓度超过了1200 µg/mL。酵母水解物（YE）使连续批培养中Fc融合蛋白（Fc）的产量提高了两倍，YE还增加了CHO细胞的大小和细胞内核苷酸含量。表达人mAb和Fab片段的CHO细胞在14天连续批培养中培养，在第2天添加了25 mg/L的脱氧尿苷。VCD和蛋白质产量都增加了。Takagi等人用脱氧尿苷、胸腺嘧啶和脱氧胞嘧啶收获了9.2 g/L的人mAb和超过4 g/L的Fab片段抗体。由于脱氧尿苷、胸腺嘧啶和脱氧胞嘧啶都是嘧啶核苷酸，外源性核苷可能为高效的抗体生产提供了一个平台，通过补救合成途径提供嘧啶核苷酸的前体。Aki等人筛选了4-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-N-(2,5-二氧吡咯啉-1-基)苯甲酰胺（MPPB）。MPPB处理的mAb浓度增加到1098 mg/L，比对照组的mAb浓度高出1.5倍。在连续批培养中的进一步研究促进了更多添加剂的发展，除了上述成分。 连续批培养环境参数 培养参数可以影响CHO细胞生长、重组蛋白表达、蛋白糖基化、细胞代谢物以及其他因素。生物反应器被设计用于CHO细胞中RTP生产的悬浮培养。细胞通过冷冻管或摇瓶扩增，然后在生物反应器中生长。对于连续批培养，生物反应器中的培养环境参数通常通过实验设计（DoE）或一次一个因素（OFAT）研究进行优化，如温度、溶解氧（DO）和pH。 培养温度 培养温度降低通常在指数生长期进行。为了减少细胞凋亡和促进抗体合成，将培养温度从37℃切换到29℃至35℃的较低温度范围。低温对整体细胞密度、细胞活性和细胞特异性生产力有积极影响。 Torres等人使用连续批培养过程培养表达人红细胞生成素（hEPO）的CHO细胞。他们观察到低温不仅提高了表达重组蛋白的CHO细胞的特异性生产力，还显著增加了编码未折叠蛋白反应的特定转录激活因子的基因，减少了蛋白质降解的可能性；低温也通过调节细胞周期增强了hEPO的表达。细胞培养温度可以显著影响CHO细胞中的VCD和蛋白表达。当在35℃、33℃和31℃下培养表达抗CD20 mAb的CHO细胞，并在第3、6、9天添加饲料培养基时，35℃可以增加细胞密度和抗CD20 mAb的表达。Stiefel等人研究了从37℃降至30℃的温度变化对CHO细胞中miRNA表达的影响。低温条件通过上调与抑制凋亡、促进细胞生长和CHO细胞蛋白生产相关的miRNAs的表达，增加了IgG产量。因此，低温是细胞培养中最常见的因素之一。 渗透压 营养物质补充和代谢副产物积累能够在连续批培养的后期阶段增加细胞外渗透压。营养物质和碱性补充都可以增加培养环境的渗透压。在连续批过程中，NaCl维持高渗透压。它增加了mAb的滴度，减少了半乳糖基化，并增加了高甘露糖基化（man5）的比例。Xiao等人发现，持续喂养导致渗透压低于450 mOsm/kg，将高甘露糖基化降低到5%以下，并将mAb的产量提高到10 g/L。Lee等人研究了高渗透压对CHO细胞蛋白糖基化的影响。渗透压在添加甜菜碱后超过400 mOsm/kg，CHO细胞中Fc融合蛋白的唾液酸化减少。无机盐和高饲料体积可能导致连续批培养中的高渗透压。尽管高渗透压增加了CHO细胞的细胞特异性生产力（qp），但它增加了高甘露糖的比例并抑制了CHO细胞的生长。Romanova等人对高渗透压暴露的CHO细胞和对照细胞进行了蛋白质组研究，并在连续批培养的第2、6、8天分别收集细胞样本。高渗透压暴露细胞组和对照细胞组在第2、6、8天的全蛋白裂解物通过西方印迹法进行分析。Septins蛋白在经过高渗透压处理后的第6天明显上调约2-3倍，在第8天上调约1-3倍。 CHO细胞暴露于高浓度饲料培养基会导致渗透压超过300 mOsm/kg，这在细胞生理学、形态学和蛋白质组方面都有所增加。在连续批培养中，适当的添加剂可以获得可行的渗透压。此外，还使用了有效的喂养策略来避免高渗透压。 pH 细胞培养的pH需要优化，以生产高质量的重组蛋白。CHO细胞生长的pH范围在7.2到7.6之间。在3L生物反应器中培养表达针对血管内皮生长因子（VEGF-MA）的mAb的CHO细胞，并优化了培养条件。通过添加碳酸氢钠来调节pH。当pH值设定为7.10时，VEGF-MA的产量增加到4.1 g/L，电荷异质性、糖基化水平和蛋白纯度分别为26.1%、59.1%和95.1%。在设计连续批培养中的pH时，需要遵循CHO细胞的标准pH范围。如果细胞培养的pH维持在6.8以下或7.6以上，CHO细胞生长会受到负面影响。细胞培养的pH通常通过CO2和无机盐相互作用来调节，以改善CHO细胞生长，可以实现大规模重组蛋白生产。 溶解氧 DO是大规模工艺中的关键环境参数之一，影响细胞生长和重组蛋白生产。CHO细胞中的大多数DO值通常在20%到50%之间。Ventini等人报告称，当DO值在连续批培养模式中为20%时，最终重组促甲状腺激素（rTSH）滴度为1.6 mg/L。为了提高人IgG1 mAb的产量和质量，Mahé等人将DO值调整到40%，在连续批培养中，表达人IgG1 mAb的CHO细胞被培养，并添加了醋酸铜和柠檬酸铁。在14天的连续批培养中，mAb的产量达到了10 g/L以上，醋酸铜和柠檬酸铁减少了man5含量和mAb的酸性电荷变体，并增加了G1F的比例。 饲养策略 除了调整饲料培养基的组成和设置合理的工艺参数外，还有必要设计和开发有效的饲养策略，以生产高产和高质量的重组蛋白。饲养策略应该考虑控制标准和饲养方式。通过控制标准，将一种或两种主要营养物质的浓度保持在理想水平。根据化学计量饲养组成，其余营养物质被添加到培养系统中。饲养策略通常分为两种添加方法：连续饲养和一次性饲养。一次性饲养具有操作简单、设备要求低和生产成本低的优点。一次性饲料输送策略增加了CHO细胞中mAbs的表达，是大规模哺乳动物细胞培养中最广泛使用的连续批培养方法。然而，大量添加饲料培养基会导致代谢副产物的积累和渗透压的增加。连续饲养可以解决上述两个问题，它可以根据营养物质的消耗调整饲养速率，维持营养物质的浓度。因此，连续饲养在细胞培养方面具有更多的优势。 为了促进CHO细胞中抗HER2 mAb的高表达，饲养4在第3、5、7和9天以初始培养体积的5%添加。在连续批培养中，峰值VCD为17.1×106细胞/mL，mAb产量达到437 mg/L。为了提高CHO细胞中表达人鼠嵌合抗表皮生长因子受体变异体III（EGFR vIII）抗体C12的表达，采用了连续饲养策略，从第3天开始向生物反应器中添加饲料培养基。与传统的一次性饲养方法相比，连续饲养方法减少了细胞代谢副产物的比例、培养渗透压和高甘露糖型，提高了CHO细胞的VCD和活性，抗体产量超过10 g/L。Horvat等人使用连续饲养来优化连续批培养过程，培养CHO细胞。从第4天开始，补充浓度超过400 g/L的葡萄糖溶液，以保持最终葡萄糖浓度低于5.55 mmol/L。从第5天开始，连续添加含有丝氨酸的饲料培养基。连续饲养可以降低细胞培养的渗透压和甘露糖基化比例，但增加了mAb产量。如果CHO细胞的VCD和细胞活性在指数生长期的后期或静止初期呈下降趋势，则应在细胞培养中添加饲料培养基。良好的饲养策略对RTP生产有积极影响。 在连续批培养中引入了监测和控制系统，保持关键细胞营养物质在理想水平。一次性饲料输送策略广泛用于连续批培养，但它不能将培养基浓度调整到细胞不同代谢阶段的动态营养物质消耗率。 拉曼光谱用于监测营养物质和副产物（葡萄糖、乳酸和氨基酸）。动态饲养策略用于通过拉曼光谱控制饲料培养基的输送。在开发的早期阶段，Domján等人建立了一个考虑细胞代谢行为和营养物质消耗的偏最小二乘（PLS）校准模型。随后，营养物质被维持在理想水平。对于CHO细胞中mAb的生产，Eyster等人开发了拉曼光谱来控制连续批培养中的乳酸和葡萄糖，并建立了预测葡萄糖和乳酸浓度的PLS模型。在细胞代谢、生产力和产品质量方面评估了三种饲养策略。通过将乳酸控制在2 g/L，铵水平降低了68%，而mAb的半乳糖基化水平增加了约50%。 连续批培养中的代谢副产物 在细胞培养的后期阶段，连续批培养通常储存乳酸和铵等副产物。高浓度的代谢副产物对细胞生长和抗体表达有害。葡萄糖通过运输蛋白GLUT1转移到CHO细胞的细胞质中，并通过糖酵解产生大量丙酮酸。部分丙酮酸使用乳酸脱氢酶进一步转化为乳酸。为了培养表达Fc融合蛋白的CHO细胞并减少连续批培养中乳酸的积累，使用半乳糖作为碳源以减少乳酸的积累。表达抗HIV抗体VRC01的CHO-K1细胞在连续批培养中培养。从第3天开始每天添加饲料培养基。细胞接种后12小时，向CHO细胞培养基中添加10 mM和30 mM NH4Cl。与对照组相比，用30 mM NH4Cl处理的组的VCD和培养时间显著减少，乳酸、葡萄糖、铵和谷氨酰胺等副产物积累。特别是，铵对抗体滴度和细胞特异性生产力有负面影响。 向CHO细胞添加TCA循环中间体，包括α-酮戊二酸（α-KG）、苹果酸和琥珀酸，可以减少连续批培养中乳酸和铵的积累，并提高细胞特异性生产力和抗体滴度。Xiao等人设计了连续批培养中的连续饲养策略。他们发现，由于在7-L生物反应器中大量营养饲料培养基的添加，连续饲养减少了乳酸和铵的积累。最终，促进了C12抗体的生产。在连续批培养中，应避免副产品的产生。对于连续批培养来说，选择有效的饲养策略以减少代谢副产品积累的可能性和浓度是明智的。 恒化器培养 为了提高RTPs的细胞特异性生产力，成功的策略需要在培养基中操纵培养温度和葡萄糖浓度。不幸的是，细胞培养的变化影响特定生长速率，特别是在这两个操作变量中。为了在CHO细胞中生产重组人组织型纤溶酶原激活剂（rh-tPA），Vergara等人利用恒化器培养，并设置了三组关于20 mM、30 mM和40 mM葡萄糖浓度的饲料培养基。总共40 mM葡萄糖限制了细胞生长，但它提高了rh-tPA的细胞特异性生产力和处于G2/M期的细胞。此外，当温度条件为33°C时，葡萄糖消耗和乳酸产生率降低。Vergara等人指出，降低特定生长速率与高饲料葡萄糖迅速提高CHO细胞中的蛋白生产力。 强化连续批 在生物制造行业，与传统连续批相比，强化工艺需要更多的时间来开发。Schulze等人在15 mL和250-mL生物反应器中进行了标准连续批（sFB）和强化连续批（iFB）工艺，起始时分别添加4%（体积/体积）饲料培养基A和4%（体积/体积）饲料培养基B。最终葡萄糖浓度为5 g/L。通过N-1灌注接种的细胞浓度达到1×108细胞/mL，用于iFB。在15 mL生物反应器中，两个iFB分别以2.5和5×106细胞/mL接种，来自N-1灌注。与传统的sFB工艺相比，在更短的过程时间内达到了类似的滴度，但空间-时间产量（STY）分别通过2.5和5×106细胞/mL方法显著提高了16%和36%。在250-mL生物反应器中，以5×106细胞/mL接种的iFB在48小时后添加了2.5 mM丁酸（BA）。与传统的5×106细胞/mL接种的iFB相比，通过BA处理后，通过提高STY 50%发现了关键性能指标（KPI）。通过BA补充，平均细胞特异性生产力从25提高到37 pg/细胞/天。 讨论 RTPs正在快速发展。每年大约有40种新抗体被引入。如何实现RTPs的高水平表达和生产是一个挑战，限制了RTP药物的开发。这些是提高RTP生产和质量的最新策略，例如优化基因序列、表达载体和糖基化。一份报告显示，pembrolizumab的生物仿制药开发可以由质量设计（QbD）指导。QbD是生物仿制药开发的有效但具有挑战性的方法，因为过程中、质量和效力之间的复杂关系。为了确保mAbs生产的临界质量属性（CQAs），QbD强调了对生产过程的理解。Jafar-Aghaei等人发现了一个由QbD指导的制药测量，以在连续批培养中进行Pembrolizumab生物仿制药候选PSG-024（Keytruda®）。目前，Keytruda®已成为治疗性mAbs的王牌。尽管Handlogten等人指出，高于1 g/L的葡萄糖浓度已经带来了10 g/L的mAb滴度，但他们仍然指出一次性饲养存在缺陷。最近，通过在连续批平台过程中使用12 g/L的葡萄糖浓度，达到了4 g/L的最终mAb滴度；同时，最终葡萄糖浓度为5 g/L。这种葡萄糖饲养策略也有效地促进了细胞生长。Komuczki等人提出，低细胞密度下超过2.5 mM的半胱氨酸可以抵消氧化应激，但Komuczki等人提出，高半胱氨酸浓度与更高的细胞浓度可以抵消氧化应激。Wang等人报告称，在14天连续批培养中，将温度调整至33℃，对提高产品滴度产生了影响，并将100%的标准化滴度设定为第14天的最高滴度。连续批优化是可行的，尽管如此，优化所有过程参数是不可能的，因为资源和时间有限。 在COVID-19的背景下，生物仿制药将进入市场，这取决于强大且可扩展的制造以及出色的生产力。PI是涉及过程策略的关键趋势。随着灌注和其他过程的进步，连续批培养已经越来越多地被研究。目前，连续批培养仍然有改进的空间。 总结和展望 总体而言，连续批培养已经收获了高产和高质量的蛋白质生产，延长了细胞培养时间。在连续批培养中，饲料培养基是连续还是间歇补充的。近年来，连续批培养取得了相当大的进展。饲料组分优化对于过程开发仍然是必要的。同时，连续批培养应考虑培养参数、营养物质消耗和代谢副产品积累等。随着对CHO细胞中RTP生产的深入探索，我们在未来仍然需要考虑这些指标，例如细胞生长、RTPs的产量和质量。然而，连续批培养在过程开发方面存在缺陷，选择最佳参数是具有挑战性的，包括温度、pH、溶解氧、基础和饲养培养基以及添加剂。探索一系列优秀的过程参数受到有限因素的制约。随着多组学、新的监测和分析技术、人工智能以及其他方法的广泛应用，强化连续批培养将进一步改进重组蛋白生产的产量和质量。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。