Thyrotropin Alfa(Sanofi)

摘要:中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生产的人类治疗性抗体约占批准的80%。为了实现更好的细胞生长和高产重组蛋白，通常使用连续批培养（fed-batch culture）技术来生产CHO细胞中的重组蛋白。根据细胞培养中营养物质消耗的需求，添加含有多种组分的培养基可以影响细胞生长的特性，并提高重组蛋白的产量和质量。连续批培养的优化应与培养环境参数、添加物组成和添加策略等综合因素相结合。目前，为了保持生产的灵活性并满足生物治疗过程的即将到来的需求，正在探索过程强化（PI）。本文综述了CHO细胞培养、连续批培养中的添加物组成、连续批培养环境参数、添加策略、连续批培养中的代谢副产物、恒化器培养以及强化连续批培养。 关键点 • 综述了CHO细胞中的连续批培养。 • 连续批培养已成为重组蛋白生产的通用技术。 • 连续批培养促进了CHO细胞中重组蛋白的生产。 引言 近年来，随着医药市场上重组治疗蛋白（RTPs）的需求不断增长，包括重组抗体，RTPs的生产迅速发展。已有超过120种重组抗体获得了欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，市值数千亿美元。一份报告估计，到2025年，单克隆抗体（mAbs）的市值将超过3000亿美元。在重组蛋白表达系统中，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是RTP生产的首选细胞，因为它们具有几个优势：①不易受到人类病毒感染，安全性高；② RTPs具有与人类细胞相似的翻译后修饰；③高密度CHO细胞可以适应悬浮培养，使用化学定义无血清培养基（CD-SFM）并在培养基中分泌蛋白质。 目前，哺乳动物细胞培养中的mAbs生产主要在大规模生物反应器中通过连续批处理进行。CHO细胞通常在连续批模式下培养，以实现最大细胞密度和产品滴度，可以是连续添加或一次性添加。初始细胞生长由基础培养基支持。在连续批培养中添加浓缩的饲料培养基以补充营养物质并延长培养时间。饲料培养基可以避免营养物质的限制，并可以促进重组蛋白的更高产量。连续批处理后，细胞在静止相中的培养时间比批处理培养长。连续批培养需要了解细胞生长和细胞代谢的特性，以及影响RTPs质量和产量的关键过程参数。CHO细胞在指数生长期快速生长，加速消耗葡萄糖和氨基酸，导致乳酸和铵的积累。在连续批培养中，温度、pH和其他过程参数也会影响抗体表达和质量属性。连续批培养可以提高CHO细胞中RTPs的表达和生产，但传统的一次性饲料输送也会导致代谢副产物的积累。因此，合理的饲养策略非常重要。连续批培养已将重点放在降低RTP生产成本上，这已成为制药工业的研究重点。 CHO细胞培养 贴壁CHO细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基中于37℃、5% CO2条件下生长。选择SFM进行悬浮培养，支持从贴壁培养到悬浮培养模式的转变。基础培养基用于贴壁培养，包括来自胎牛的血清成分。血清成分复杂，容易受到污染。SFM分为普通无血清培养基、无异种血清培养基、无动物源培养基、无蛋白培养基和化学定义无血清培养基。当涉及到细胞悬浮培养时，SFM可以有效避免血清培养引起的缺点，如污染和纯化困难。 批处理培养是指在一次性添加SFM后，可以在一次收获重组蛋白的培养方法。由于培养时间短和采样时细胞密度不满意，RTP生产不理想。连续批模式改善了RTP生产。据报道，在连续批培养中mAb滴度已达到超过10 g/L。近年来，连续批处理已成为大规模生产RTPs的重要生产过程。然而，保持细胞的高生产力和蛋白质的质量属性仍然是一个挑战。因此，连续批培养已从仅仅高产重组蛋白转变为高产和高质量的双重目标。 连续批培养中的饲料组成 优化关键饲料组成和组分浓度对工艺开发至关重要。在连续批工业中，使用偏最小二乘回归（PLSR）或多元线性回归（MLR）的拉曼光谱法被应用于监测和控制葡萄糖和氨基酸的浓度。除了拉曼光谱法，液相色谱-质谱联用（LC–MS）被认为是分析氨基酸和无机盐。首次，脂质组学分析已用于连续批培养中脂质鉴定和脂质定量。此外，饲料组成已与细胞代谢调节联系起来，以证明连续批培养（图1）。 图1 CHO细胞中的连续批培养。通过转染将感兴趣的基因（GOI）引入CHO细胞。阳性CHO细胞用于摇瓶培养。然后，CHO细胞和饲料培养基被添加到生物反应器中。在连续批培养模式下，监测和控制营养物质以实现RTPs的产量和质量。RTPs的生产由连续批系统指示。 饲料培养基的成分与SFM相似，包括氨基酸、碳源、无机盐、微量元素、维生素、脂质以及腐胺和酵母水解物等（表1）。 氨基酸 在上游过程优化中，氨基酸是主要关注点之一。在批处理培养中，氨基酸消耗殆尽，这对RTP生产不利。氨基酸的添加与三羧酸循环（TCA循环）有关。TCA循环依赖于替代代谢物来补充中间体。来自饲料培养基的氨基酸可以通过细胞质和线粒体之间的转换被导向TCA循环。此外，氨基酸的分解代谢是TCA循环的供应。饲料培养基中的氨基酸是有限的。与提高细胞健康相关的AMP与嘌呤核苷酸循环有关。来自TCA循环的苹果酸和甘氨酸积累。细胞增殖对5 mM以上的氨浓度有负面影响，而氨来自氨基酸的水解。因此，控制氨基酸的添加可能减少副产物的积累。尽管细胞可以合成非必需氨基酸，但细胞生长和重组蛋白的表达仍然依赖于饲料培养基中的氨基酸。 N-乳酰亮氨酸（Lac-Leu）和N-乳酰异亮氨酸（Lac-Ile）可以分别替代未修饰的亮氨酸和异亮氨酸。Lac-Leu和Lac-Ile提高了在培养基中的溶解度。添加2倍浓缩饲料培养基，其中包含上述两种N-乳酰氨基酸（Lac-AA）的70%混合物，与添加1倍浓缩饲料培养基相比，重组蛋白的产量增加了58%。Schmidt等人发现2倍浓缩培养基减少了饲料培养基的体积。根据代谢通量分析（MFA），Xing等人优化了饲料培养基以在CHO细胞中生产抗体融合蛋白（B1）。降低了丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸的浓度，而增加了蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸的浓度。最终，在连续批培养中B1蛋白滴度提高了27%。Fouladiha等人使用计算建模方法设计了CHO细胞的饲养策略。为了研究CHO细胞中mAb生产的效应，通过Plackett-Burman（PB）设计分析了15种代谢物。结果表明，经过苏氨酸处理后，mAbs的产量可以显著提高2倍。Hecklau等人报告说，S-硫酸化L-半胱氨酸（SSC）替代半胱氨酸，在连续批培养中非常稳定；补充SSC的饲料培养基延长了细胞活性，并使产品滴度提高了78%。同时，这种策略减少了铵（NH4+）的积累。Zhang等人利用高浓度酪氨酸和低浓度酪氨酸实验组，他们在生物反应器中培养表达抗CD20 IgG1的CHO细胞。除了含有酪氨酸的饲料培养基外，高浓度酪氨酸组还添加了88 mM酪氨酸溶液。高浓度酪氨酸促进了细胞生长，降低了生物反应器培养环境的渗透压，并增加了mAbs的产量。 氨基酸是饲料培养基的关键组成部分，它们的浓度和性质可以影响连续批培养中RTPs的产量和质量。参与连续批培养的氨基酸需要严格的设计。然而，由于溶解度的限制，一些高浓度氨基酸容易沉淀。改性氨基酸基于原始结构。我们需要全面考虑CHO细胞的特点，并建立最佳的添加策略。 碳源 葡萄糖是指数生长期TCA循环的主要碳源，并且在指数生长期的后期迅速消耗。然而，葡萄糖消耗导致丙酮酸和乳酸的积累，这会导致细胞生长受到抑制。Wilkens等人发现，3.6 g/L的葡萄糖浓度缩短了CHO细胞培养时间，并且在120小时后乳酸浓度达到了2.7 g/L。尽管1.08 g/L的葡萄糖和2.52 g/L的半乳糖都被用来减少乳酸的积累，并且在向CHO细胞培养中添加1.08 g/L的葡萄糖和2.52 g/L的半乳糖时，组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的产量增加了100%，但在160小时后葡萄糖的最终浓度接近零，并且细胞活性降低。在细胞培养过程中，需要将最低葡萄糖浓度控制在2 ~ 3 g/L。 谷氨酰胺是细胞指数生长期早期的次要碳源，但它增加了乳酸水平（Kirsch et al. 2022）。研究发现，当半乳糖以40%的替代比例补充，并且葡萄糖碳源被替代时，CHO细胞中Fc融合蛋白的表达增加了43%，并且细胞的总唾液酸含量增加了37%。转染GLUT5果糖转运蛋白的CHO细胞在连续批培养系统中培养，并且添加了含有14.5 g/L果糖的饲料培养基。果糖改善了细胞生长，并减少了乳酸的积累。Wlaschin等人指出，CHO细胞有能力通过表达GLUT5果糖转运蛋白来替代碳源。 根据培养基中的葡萄糖含量，可以向CHO细胞培养基中添加高浓度葡萄糖溶液。由于高浓度的碳源也会导致代谢副产物积累，因此应严格控制碳源的浓度。适当的替代碳源可以避免葡萄糖消耗后副产物抑制细胞生长。 无机盐和微量元素 连续批培养还需要无机盐来调节细胞培养环境中的pH和渗透压。Zhu等人使用2L生物反应器进行连续批培养，他们添加Na+来控制渗透压和二氧化碳分压（pCO2）。140~160 mmHg的pCO2和400 mOsm/kg的渗透压使CHO细胞的活细胞密度（VCD）降低了18%，但这些因素明显增加了蛋白B1的产量。在细胞培养中，以亚硒酸钠形式存在的硒（Se）可以保护细胞免受氧化损伤。Zhang等人发现，在添加亚硒酸钠的14天连续批培养中，VCD超过了1×107细胞/mL，产量约为3 g/L。 Gangwar等人发现，Zn、Cu、Fe和Mn影响电荷异质性，并减少细胞培养中代谢副产物的积累。Fe、Mn和Ni增强酸性变体，而Cu抑制它。Zn减少了碱性变体。Chung等人发现，存放了7周的饲料培养基中的硫酸亚铁（Fe2+）可以减少电荷异质性，但它提高了CHO细胞表达的mAb的产量。Graham等人发现，生物反应器中添加的50和100 μM锌离子（Zn2+）促进了CHO细胞中β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的产生，并使GUS的比活性增加了2倍。饲料培养基中5 μM的硫酸铜（Cu2+）获得了11.9±0.6 g/L的最终mAb滴度，以表达IgG1在CHO细胞中，这比传统连续批培养的最终mAb滴度高出4.8倍。 维生素 维生素增强了CHO细胞的生产力，并影响电荷异质性。Gangwar等人还指出，维生素可以抑制酸性变体，同时增强碱性变体。Hou等人发现，增加维生素C和烟酰胺的喂养速率可以将CHO细胞中的磷酸化水平降低到3%，并将羟基化水平降低到9.4%。添加包括0.005 g/L维生素B2、0.0035 g/L吡哆醇（维生素B6）、0.03 g/L吡哆醛（维生素B6）、0.0985 g/L叶酸和0.024 g/L维生素B12在内的B族维生素可以提高细胞包装体积（PCV）和抗体滴度。Lee等人在表达重组人因子II（rhFII）的CHO细胞的4天连续批培养中添加了10 g/L的维生素K溶液，该溶液用13%的聚山梨醇酯20（PS20）制备。当维生素K的最终浓度为0.1 mg/L时，γ-羧基谷氨酸（Gla）水平降低。 脂质 乙醇胺是哺乳动物细胞膜磷脂结构的组成部分之一。对于CHO细胞中TNFR-Fc的生产，添加补充乙醇胺和脂质的饲料培养基，最大VCD为4.3×106细胞/mL，抗体滴度为378 mg/L，是批处理培养的三倍。因此，脂质可以适当补充在饲料培养基中。 其他成分 腐胺对细胞生长至关重要。Zhang等人确认，通过PB设计设计的腐胺，显著增加了mAb的产量。在添加了41.67 mg/L腐胺浓度的饲料培养基后，观察到TNFR-Fc产量显著增加。Jardon等人发现，自噬对重组蛋白生产有负面影响。在连续批培养中，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）使t-PA产量比不加3-MA的对照组增加了2.8倍。自噬诱导肽（AIP），自噬蛋白Beclin 1的衍生物，通过调节细胞自噬，促进了CHO细胞中mAbs的生产。在连续批培养中添加3 µM的AIP，改善了人IgG1的表达水平，IgG1浓度超过了1200 µg/mL。酵母水解物（YE）使连续批培养中Fc融合蛋白（Fc）的产量提高了两倍，YE还增加了CHO细胞的大小和细胞内核苷酸含量。表达人mAb和Fab片段的CHO细胞在14天连续批培养中培养，在第2天添加了25 mg/L的脱氧尿苷。VCD和蛋白质产量都增加了。Takagi等人用脱氧尿苷、胸腺嘧啶和脱氧胞嘧啶收获了9.2 g/L的人mAb和超过4 g/L的Fab片段抗体。由于脱氧尿苷、胸腺嘧啶和脱氧胞嘧啶都是嘧啶核苷酸，外源性核苷可能为高效的抗体生产提供了一个平台，通过补救合成途径提供嘧啶核苷酸的前体。Aki等人筛选了4-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-N-(2,5-二氧吡咯啉-1-基)苯甲酰胺（MPPB）。MPPB处理的mAb浓度增加到1098 mg/L，比对照组的mAb浓度高出1.5倍。在连续批培养中的进一步研究促进了更多添加剂的发展，除了上述成分。 连续批培养环境参数 培养参数可以影响CHO细胞生长、重组蛋白表达、蛋白糖基化、细胞代谢物以及其他因素。生物反应器被设计用于CHO细胞中RTP生产的悬浮培养。细胞通过冷冻管或摇瓶扩增，然后在生物反应器中生长。对于连续批培养，生物反应器中的培养环境参数通常通过实验设计（DoE）或一次一个因素（OFAT）研究进行优化，如温度、溶解氧（DO）和pH。 培养温度 培养温度降低通常在指数生长期进行。为了减少细胞凋亡和促进抗体合成，将培养温度从37℃切换到29℃至35℃的较低温度范围。低温对整体细胞密度、细胞活性和细胞特异性生产力有积极影响。 Torres等人使用连续批培养过程培养表达人红细胞生成素（hEPO）的CHO细胞。他们观察到低温不仅提高了表达重组蛋白的CHO细胞的特异性生产力，还显著增加了编码未折叠蛋白反应的特定转录激活因子的基因，减少了蛋白质降解的可能性；低温也通过调节细胞周期增强了hEPO的表达。细胞培养温度可以显著影响CHO细胞中的VCD和蛋白表达。当在35℃、33℃和31℃下培养表达抗CD20 mAb的CHO细胞，并在第3、6、9天添加饲料培养基时，35℃可以增加细胞密度和抗CD20 mAb的表达。Stiefel等人研究了从37℃降至30℃的温度变化对CHO细胞中miRNA表达的影响。低温条件通过上调与抑制凋亡、促进细胞生长和CHO细胞蛋白生产相关的miRNAs的表达，增加了IgG产量。因此，低温是细胞培养中最常见的因素之一。 渗透压 营养物质补充和代谢副产物积累能够在连续批培养的后期阶段增加细胞外渗透压。营养物质和碱性补充都可以增加培养环境的渗透压。在连续批过程中，NaCl维持高渗透压。它增加了mAb的滴度，减少了半乳糖基化，并增加了高甘露糖基化（man5）的比例。Xiao等人发现，持续喂养导致渗透压低于450 mOsm/kg，将高甘露糖基化降低到5%以下，并将mAb的产量提高到10 g/L。Lee等人研究了高渗透压对CHO细胞蛋白糖基化的影响。渗透压在添加甜菜碱后超过400 mOsm/kg，CHO细胞中Fc融合蛋白的唾液酸化减少。无机盐和高饲料体积可能导致连续批培养中的高渗透压。尽管高渗透压增加了CHO细胞的细胞特异性生产力（qp），但它增加了高甘露糖的比例并抑制了CHO细胞的生长。Romanova等人对高渗透压暴露的CHO细胞和对照细胞进行了蛋白质组研究，并在连续批培养的第2、6、8天分别收集细胞样本。高渗透压暴露细胞组和对照细胞组在第2、6、8天的全蛋白裂解物通过西方印迹法进行分析。Septins蛋白在经过高渗透压处理后的第6天明显上调约2-3倍，在第8天上调约1-3倍。 CHO细胞暴露于高浓度饲料培养基会导致渗透压超过300 mOsm/kg，这在细胞生理学、形态学和蛋白质组方面都有所增加。在连续批培养中，适当的添加剂可以获得可行的渗透压。此外，还使用了有效的喂养策略来避免高渗透压。 pH 细胞培养的pH需要优化，以生产高质量的重组蛋白。CHO细胞生长的pH范围在7.2到7.6之间。在3L生物反应器中培养表达针对血管内皮生长因子（VEGF-MA）的mAb的CHO细胞，并优化了培养条件。通过添加碳酸氢钠来调节pH。当pH值设定为7.10时，VEGF-MA的产量增加到4.1 g/L，电荷异质性、糖基化水平和蛋白纯度分别为26.1%、59.1%和95.1%。在设计连续批培养中的pH时，需要遵循CHO细胞的标准pH范围。如果细胞培养的pH维持在6.8以下或7.6以上，CHO细胞生长会受到负面影响。细胞培养的pH通常通过CO2和无机盐相互作用来调节，以改善CHO细胞生长，可以实现大规模重组蛋白生产。 溶解氧 DO是大规模工艺中的关键环境参数之一，影响细胞生长和重组蛋白生产。CHO细胞中的大多数DO值通常在20%到50%之间。Ventini等人报告称，当DO值在连续批培养模式中为20%时，最终重组促甲状腺激素（rTSH）滴度为1.6 mg/L。为了提高人IgG1 mAb的产量和质量，Mahé等人将DO值调整到40%，在连续批培养中，表达人IgG1 mAb的CHO细胞被培养，并添加了醋酸铜和柠檬酸铁。在14天的连续批培养中，mAb的产量达到了10 g/L以上，醋酸铜和柠檬酸铁减少了man5含量和mAb的酸性电荷变体，并增加了G1F的比例。 饲养策略 除了调整饲料培养基的组成和设置合理的工艺参数外，还有必要设计和开发有效的饲养策略，以生产高产和高质量的重组蛋白。饲养策略应该考虑控制标准和饲养方式。通过控制标准，将一种或两种主要营养物质的浓度保持在理想水平。根据化学计量饲养组成，其余营养物质被添加到培养系统中。饲养策略通常分为两种添加方法：连续饲养和一次性饲养。一次性饲养具有操作简单、设备要求低和生产成本低的优点。一次性饲料输送策略增加了CHO细胞中mAbs的表达，是大规模哺乳动物细胞培养中最广泛使用的连续批培养方法。然而，大量添加饲料培养基会导致代谢副产物的积累和渗透压的增加。连续饲养可以解决上述两个问题，它可以根据营养物质的消耗调整饲养速率，维持营养物质的浓度。因此，连续饲养在细胞培养方面具有更多的优势。 为了促进CHO细胞中抗HER2 mAb的高表达，饲养4在第3、5、7和9天以初始培养体积的5%添加。在连续批培养中，峰值VCD为17.1×106细胞/mL，mAb产量达到437 mg/L。为了提高CHO细胞中表达人鼠嵌合抗表皮生长因子受体变异体III（EGFR vIII）抗体C12的表达，采用了连续饲养策略，从第3天开始向生物反应器中添加饲料培养基。与传统的一次性饲养方法相比，连续饲养方法减少了细胞代谢副产物的比例、培养渗透压和高甘露糖型，提高了CHO细胞的VCD和活性，抗体产量超过10 g/L。Horvat等人使用连续饲养来优化连续批培养过程，培养CHO细胞。从第4天开始，补充浓度超过400 g/L的葡萄糖溶液，以保持最终葡萄糖浓度低于5.55 mmol/L。从第5天开始，连续添加含有丝氨酸的饲料培养基。连续饲养可以降低细胞培养的渗透压和甘露糖基化比例，但增加了mAb产量。如果CHO细胞的VCD和细胞活性在指数生长期的后期或静止初期呈下降趋势，则应在细胞培养中添加饲料培养基。良好的饲养策略对RTP生产有积极影响。 在连续批培养中引入了监测和控制系统，保持关键细胞营养物质在理想水平。一次性饲料输送策略广泛用于连续批培养，但它不能将培养基浓度调整到细胞不同代谢阶段的动态营养物质消耗率。 拉曼光谱用于监测营养物质和副产物（葡萄糖、乳酸和氨基酸）。动态饲养策略用于通过拉曼光谱控制饲料培养基的输送。在开发的早期阶段，Domján等人建立了一个考虑细胞代谢行为和营养物质消耗的偏最小二乘（PLS）校准模型。随后，营养物质被维持在理想水平。对于CHO细胞中mAb的生产，Eyster等人开发了拉曼光谱来控制连续批培养中的乳酸和葡萄糖，并建立了预测葡萄糖和乳酸浓度的PLS模型。在细胞代谢、生产力和产品质量方面评估了三种饲养策略。通过将乳酸控制在2 g/L，铵水平降低了68%，而mAb的半乳糖基化水平增加了约50%。 连续批培养中的代谢副产物 在细胞培养的后期阶段，连续批培养通常储存乳酸和铵等副产物。高浓度的代谢副产物对细胞生长和抗体表达有害。葡萄糖通过运输蛋白GLUT1转移到CHO细胞的细胞质中，并通过糖酵解产生大量丙酮酸。部分丙酮酸使用乳酸脱氢酶进一步转化为乳酸。为了培养表达Fc融合蛋白的CHO细胞并减少连续批培养中乳酸的积累，使用半乳糖作为碳源以减少乳酸的积累。表达抗HIV抗体VRC01的CHO-K1细胞在连续批培养中培养。从第3天开始每天添加饲料培养基。细胞接种后12小时，向CHO细胞培养基中添加10 mM和30 mM NH4Cl。与对照组相比，用30 mM NH4Cl处理的组的VCD和培养时间显著减少，乳酸、葡萄糖、铵和谷氨酰胺等副产物积累。特别是，铵对抗体滴度和细胞特异性生产力有负面影响。 向CHO细胞添加TCA循环中间体，包括α-酮戊二酸（α-KG）、苹果酸和琥珀酸，可以减少连续批培养中乳酸和铵的积累，并提高细胞特异性生产力和抗体滴度。Xiao等人设计了连续批培养中的连续饲养策略。他们发现，由于在7-L生物反应器中大量营养饲料培养基的添加，连续饲养减少了乳酸和铵的积累。最终，促进了C12抗体的生产。在连续批培养中，应避免副产品的产生。对于连续批培养来说，选择有效的饲养策略以减少代谢副产品积累的可能性和浓度是明智的。 恒化器培养 为了提高RTPs的细胞特异性生产力，成功的策略需要在培养基中操纵培养温度和葡萄糖浓度。不幸的是，细胞培养的变化影响特定生长速率，特别是在这两个操作变量中。为了在CHO细胞中生产重组人组织型纤溶酶原激活剂（rh-tPA），Vergara等人利用恒化器培养，并设置了三组关于20 mM、30 mM和40 mM葡萄糖浓度的饲料培养基。总共40 mM葡萄糖限制了细胞生长，但它提高了rh-tPA的细胞特异性生产力和处于G2/M期的细胞。此外，当温度条件为33°C时，葡萄糖消耗和乳酸产生率降低。Vergara等人指出，降低特定生长速率与高饲料葡萄糖迅速提高CHO细胞中的蛋白生产力。 强化连续批 在生物制造行业，与传统连续批相比，强化工艺需要更多的时间来开发。Schulze等人在15 mL和250-mL生物反应器中进行了标准连续批（sFB）和强化连续批（iFB）工艺，起始时分别添加4%（体积/体积）饲料培养基A和4%（体积/体积）饲料培养基B。最终葡萄糖浓度为5 g/L。通过N-1灌注接种的细胞浓度达到1×108细胞/mL，用于iFB。在15 mL生物反应器中，两个iFB分别以2.5和5×106细胞/mL接种，来自N-1灌注。与传统的sFB工艺相比，在更短的过程时间内达到了类似的滴度，但空间-时间产量（STY）分别通过2.5和5×106细胞/mL方法显著提高了16%和36%。在250-mL生物反应器中，以5×106细胞/mL接种的iFB在48小时后添加了2.5 mM丁酸（BA）。与传统的5×106细胞/mL接种的iFB相比，通过BA处理后，通过提高STY 50%发现了关键性能指标（KPI）。通过BA补充，平均细胞特异性生产力从25提高到37 pg/细胞/天。 讨论 RTPs正在快速发展。每年大约有40种新抗体被引入。如何实现RTPs的高水平表达和生产是一个挑战，限制了RTP药物的开发。这些是提高RTP生产和质量的最新策略，例如优化基因序列、表达载体和糖基化。一份报告显示，pembrolizumab的生物仿制药开发可以由质量设计（QbD）指导。QbD是生物仿制药开发的有效但具有挑战性的方法，因为过程中、质量和效力之间的复杂关系。为了确保mAbs生产的临界质量属性（CQAs），QbD强调了对生产过程的理解。Jafar-Aghaei等人发现了一个由QbD指导的制药测量，以在连续批培养中进行Pembrolizumab生物仿制药候选PSG-024（Keytruda®）。目前，Keytruda®已成为治疗性mAbs的王牌。尽管Handlogten等人指出，高于1 g/L的葡萄糖浓度已经带来了10 g/L的mAb滴度，但他们仍然指出一次性饲养存在缺陷。最近，通过在连续批平台过程中使用12 g/L的葡萄糖浓度，达到了4 g/L的最终mAb滴度；同时，最终葡萄糖浓度为5 g/L。这种葡萄糖饲养策略也有效地促进了细胞生长。Komuczki等人提出，低细胞密度下超过2.5 mM的半胱氨酸可以抵消氧化应激，但Komuczki等人提出，高半胱氨酸浓度与更高的细胞浓度可以抵消氧化应激。Wang等人报告称，在14天连续批培养中，将温度调整至33℃，对提高产品滴度产生了影响，并将100%的标准化滴度设定为第14天的最高滴度。连续批优化是可行的，尽管如此，优化所有过程参数是不可能的，因为资源和时间有限。 在COVID-19的背景下，生物仿制药将进入市场，这取决于强大且可扩展的制造以及出色的生产力。PI是涉及过程策略的关键趋势。随着灌注和其他过程的进步，连续批培养已经越来越多地被研究。目前，连续批培养仍然有改进的空间。 总结和展望 总体而言，连续批培养已经收获了高产和高质量的蛋白质生产，延长了细胞培养时间。在连续批培养中，饲料培养基是连续还是间歇补充的。近年来，连续批培养取得了相当大的进展。饲料组分优化对于过程开发仍然是必要的。同时，连续批培养应考虑培养参数、营养物质消耗和代谢副产品积累等。随着对CHO细胞中RTP生产的深入探索，我们在未来仍然需要考虑这些指标，例如细胞生长、RTPs的产量和质量。然而，连续批培养在过程开发方面存在缺陷，选择最佳参数是具有挑战性的，包括温度、pH、溶解氧、基础和饲养培养基以及添加剂。探索一系列优秀的过程参数受到有限因素的制约。随着多组学、新的监测和分析技术、人工智能以及其他方法的广泛应用，强化连续批培养将进一步改进重组蛋白生产的产量和质量。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

This article will continue to review the antitumor targets of the GPCR family and the therapeutic drugs that have been marketed. 05 SMOThe Smoothened (SMO) receptor is a key signal transduction receptor in the Hedgehog signaling pathway and belongs to the GPCR family, featuring the classical seven-transmembrane domain structure. The SMO receptor plays a vital role in the activation of the Hedgehog signaling pathway. The discovery of the Hedgehog signaling pathway dates back to 1980 when Christiane Nüsslein-Volhard and Eric Wieschaus, during their research on the embryonic development of fruit flies, identified gene mutations affecting the segmental development of the Drosophila larvae through genetic screening. These genes were later named Hedgehog genes because their mutant flies' embryos had a spiky appearance reminiscent of hedgehogs. The Hedgehog signaling pathway is highly conserved evolutionarily, playing significant roles not only in fruit flies but also in vertebrates, including in processes such as cell differentiation, cell proliferation, cellular senescence, tumorigenesis, malignant transformation, and tumor resistance. With further research, scientists have identified that the Hedgehog pathway involves a series of proteins, particularly core components that include two membrane proteins, Patched and Smoothened (SMO), along with three transcription factors (Gli1/2/3). The activity of the Hedgehog signaling pathway is regulated by multiple mechanisms, and abnormal pathway activity is associated with various diseases, including birth defects and tumors. In the absence of a Hedgehog ligand, the SMO receptor is inhibited by the Patched (PTCH) receptor, which acts as a tumor suppressor protein that restricts SMO activity and prevents signal transduction. When Hedgehog ligands such as Sonic Hedgehog (Shh), Indian Hedgehog (Ihh), or Desert Hedgehog (Dhh) bind to the PTCH receptor, this inhibition is released, leading to the accumulation and activation of SMO within the cell. Activation of SMO further triggers downstream signaling pathways, particularly the activation of the GLI (Glioma-associated oncogene) family of transcription factors. These transcription factors exist in a repressive form when the signaling pathway is inactive, and upon SMO activation, they are dephosphorylated and converted into an active form, which then enters the nucleus to activate the expression of Hedgesten target genes. Vismodegib (brand name Erivedge™), an oral SMO receptor antagonist, was developed by Genentech and approved by the FDA in January 2012 in the United States. It is primarily used for the treatment of locally advanced or metastatic basal cell carcinoma, especially in patients who are not suitable for surgery or radiation therapy. In 2009, Genentech first disclosed the early drug discovery data of the SMO receptor antagonist candidate drug GDC-0449. Researchers used mouse embryonic fibroblasts harboring a luciferase reporter gene plasmid and performed high-throughput screening downstream of Gli binding sites. When the Hedgehog signaling pathway in these cells was stimulated, the activity of luciferase could be measured optically. Hedgehog pathway antagonists reduce the strength of this signal, leading researchers to obtain lead compounds. Subsequent SAR (Structure-Activity Relationship) studies yielded the candidate drug GDC-0449. At a low dose of 12.5 mg/kg, GDC-0449 was able to completely regress tumors in an orthotopic xenograft mouse model of medulloblastoma that entirely depended on the Hedgehog signaling pathway. Between 2009 and 2012, the Genentech team published two clinical research papers consecutively in the New England Journal of Medicine, reporting the efficacy and safety of Vismodegib in treating advanced basal cell carcinoma. The results showed that among 33 patients with metastatic basal cell carcinoma, the independently assessed response rate was 30%. Among 63 patients with locally advanced basal cell carcinoma, the independently assessed response rate was 43%, with 13 patients (21%) achieving a complete response. The median duration of response for both groups was 7.6 months. In terms of safety, over 30% of patients experienced adverse reactions such as muscle spasms, hair loss, taste disturbances, weight loss, and fatigue. It was reported that 25% of patients experienced severe adverse reactions; 7 patients died due to adverse reactions. Sonidegib (NVP-LDE225), developed by the Novartis team, is a SMO receptor antagonist also used for the treatment of locally advanced, recurrent basal cell carcinoma post-surgery and radiation, or in cases unsuitable for surgery and radiation. Sonidegib works by inhibiting a mechanism known as SMO activation, thereby blocking the Hh signaling pathway and exhibiting antitumor activity across various animal models. In a transgenic mouse pancreatic tumor model, tumors in mice treated with Sonidegib were reduced by 95% compared to untreated mice. In 2014 and 2015, the Novartis team published clinical research papers detailing trial data for Sonidegib used in patients with advanced or metastatic basal cell carcinoma. In the primary efficacy analysis cohort, 20 out of 55 patients (36%) receiving 200 mg of Sonidegib achieved an objective response, and 39 out of 116 patients (34%) receiving 800 mg of Sonidegib achieved an objective response. Among the 200 mg Sonidegib group, 18 of 42 patients (43%) with locally advanced basal cell carcinoma achieved an objective response via central review, and 2 out of 13 patients (15%) with metastatic disease also achieved an objective response. In the 800 mg Sonidegib group, 35 out of 93 locally advanced patients (38%) obtained an objective response through central review, and 4 out of 23 metastatic disease patients (17%) also achieved an objective response. Compared to the 800 mg group, the 200 mg group experienced fewer adverse events leading to dose reduction or treatment discontinuation. The most common grade 3-4 adverse events were elevated creatine kinase and increased lipase levels. In the 200 mg group of 79 patients, 11 (14%) experienced severe adverse events; in the 800 mg group of 150 patients, 45 (30%) experienced severe adverse events. Overall, the benefit-risk ratio of 200 mg Sonidegib provides a new treatment option for patients with advanced basal cell carcinoma. In June 2015, the U.S. FDA approved Sonidegib for the treatment of adult basal cell carcinoma. In 2021, Sonidegib was approved for market in Mainland China, becoming the first SMO receptor antagonist approved in China. Following the market entries of Genentech's Vismodegib and Novartis's Sonidegib Phosphate, Pfizer's SMO antagonist drug, Glasdegib Maleate, was approved in 2018 for the treatment of patients with acute myeloid leukemia. The representative molecular formula for SMO antagonists is as follows: 06 TSHRThe Thyroid-Stimulating Hormone Receptor (TSHR) is a gene that encodes a GPCR controlling the metabolism of thyroid cells. This protein acts as a receptor for thyroid-stimulating hormone (TSH) and thyroxine. In addition to the thyroid, TSHR expression has also been confirmed in various tissues including the brain, bone marrow, peripheral blood, and bones. Thyroid-stimulating hormone (TSH) is a pituitary hormone that stimulates the production of thyroid hormones by the thyroid gland. TSH is primarily synthesized in the thyrotroph cells of the anterior and nodular portions of the pituitary gland. Additionally, hematopoietic cells in the bone marrow, particularly monocyte/macrophage precursors, have also been shown to be a source of TSH. TSH binds to TSHR in the thyroid, stimulating the production and release of thyroid hormones. TSH is a non-covalently linked heterodimeric glycoprotein composed of alpha and beta subunits. The alpha subunit is common with other glycoprotein hormones, such as luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone, while the beta subunit is unique to each hormone. TSH signaling can stimulate the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF), leading to angiogenesis and accelerating genomic instability in thyroid cancer. The tumorigenic role of TSH in thyroid cancer has been established. Many patients with differentiated thyroid cancer undergo radioactive iodine ablation postoperatively to remove residual normal thyroid tissue. Several non-randomized studies suggest that radioactive iodine ablation can reduce mortality and recurrence rates. Thyrotropin alfa is a recombinant form of thyroid-stimulating hormone, developed by Genzyme, and was initially approved by the U.S. FDA in 1998 as a diagnostic tool for managing patients undergoing recurrence monitoring of well-differentiated thyroid cancer. This product helps to enhance the sensitivity of tests while allowing patients to avoid potential debilitating symptoms associated with thyroid hormone withdrawal. In 2008, the FDA approved a new supplementary indication for Thyrotropin Alfa for use in conjunction with radioactive iodine to ablate or destroy residual thyroid tissue in patients who have undergone thyroidectomy for cancer. A study published in the New England Journal of Medicine in 2012 demonstrated that low-dose radioactive iodine combined with thyrotropin alfa is as effective as high-dose radioactive iodine, with a lower incidence of adverse events. In the diagnosis and treatment of thyroid cancer, the use of Thyrotropin alfa enhances the uptake of radioactive iodine by these cells, thereby improving the effectiveness of radioactive iodine treatment or enhancing the clarity of imaging during radioactive iodine scans, helping physicians to more accurately assess the status of the disease. Outside of thyroid cancer, the incidence of prostate cancer, lung cancer, and colorectal cancer has been linked to low levels of TSH. For example, various mutations such as missense mutations, nonsense mutations, silent mutations, frameshift deletions, and in-frame deletions have been observed in cancers like colorectal cancer, skin cancer, and thyroid cancer. 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