The main goal of this study is to compare the Haemophilus influenzae type b antibody response in American Indian / Alaska Native (AI/AN) infants to two licensed vaccines: Vaxelis and PedvaxHIB.

开始日期2022-01-27

申办/合作机构

Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

[+1]

NCT01545375

/ Completed临床2期

Study to Determine Protective Efficacy Against Otitis Media and Assess Safety of an Investigational Pneumococcal Vaccine 2189242A in Healthy Infants

The purpose of this study is to 1) demonstrate the protective efficacy against acute otitis media (AOM), 2) assess safety of the GlaxoSmithKline (GSK) Biologicals' pneumococcal vaccine GSK2189242A in Native American infants aged less than 24 months, living in the southwestern US, in and around the Navajo and White Mountain Apache reservations, and 3) evaluate the impact on acute lower respiratory tract infections (ALRI) up to the second year of life.

开始日期2012-05-21

申办/合作机构

GSK Plc

NCT01337167

/ Completed临床3期

A Phase III Randomized, Open-Label, Active-Comparator Controlled Clinical Study to Evaluate the Safety, Tolerability, and Immunogenicity of V419 in Infants When Given at 2, 4, and 6 Months Concomitantly With Prevnar 13™ and RotaTeq™

This is a study to assess the safety, tolerability, and immunogenicity of V419 (PR5I) when administered as an infant series at 2, 4, and 6 months of age followed by a toddler dose of DAPTACEL™, Prevnar 13™ and PedvaxHIB™ at 15 months of age. The study will determine whether subjects who receive V419 have a similar immune response to the vaccine compared to subjects who receive licensed component vaccine controls.

开始日期2011-04-19

申办/合作机构

Merck Sharp & Dohme Corp.

[+1]

100 项与 b型流感嗜血杆菌结合疫苗(Merck Sharp & Dohme) 相关的临床结果

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100 项与 b型流感嗜血杆菌结合疫苗(Merck Sharp & Dohme) 相关的转化医学

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100 项与 b型流感嗜血杆菌结合疫苗(Merck Sharp & Dohme) 相关的专利（医药）

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项与 b型流感嗜血杆菌结合疫苗(Merck Sharp & Dohme) 相关的文献（医药）

2024-10-01·Pediatrics

Haemophilus influenzae Type b Vaccine Immunogenicity in American Indian/Alaska Native Infants

Article

作者: Keck, James ; Clichee, Demetria ; Hurley, Chloe ; Thomas, Mary ; Farrenkopf, Brooke Amara ; Hammitt, Laura L. ; Beaudry, Jeanette ; Damon, Shawnell ; Weatherholtz, Robert ; Miernyk, Karen ; Christensen, Loretta ; Zeger, Scott ; Jackson, Bianca D. ; Singleton, Rosalyn ; VanDeRiet, Dan ; Simons, Brenna ; Zylstra, Sarah ; Luna, Juan ; Steinberg, Jonathan ; Chukwuma, Uzo

OBJECTIVESAmerican Indian and Alaska Native (AI/AN) infants historically experienced a disproportionate burden of invasive Haemophilus influenzae type b (Hib) disease, especially early in life. PedvaxHIB vaccine is preferentially recommended for AI/AN infants because it elicits protective antibody levels postdose 1. Vaxelis, a hexavalent vaccine that contains the same Hib conjugate as PedvaxHIB but at lower concentration, is recommended for US children, but postdose 1 Hib immunogenicity data are needed to inform whether a preferential recommendation should be made for AI/AN infants.METHODSWe conducted a phase IV randomized, open-label, noninferiority trial comparing postdose 1 immunogenicity of Vaxelis to PedvaxHIB in AI/AN infants. Participants were randomized to receive a primary series of PedvaxHIB or Vaxelis. Serum samples collected 30 days postdose 1 were tested for anti-Hib immunoglobulin G antibody by enzyme-linked immunosorbent assay. The anti-Hib immunoglobulin G geometric mean concentration (GMC) ratio (Vaxelis/PedvaxHIB) was estimated by constrained longitudinal data analysis. Noninferiority was defined a priori as the lower bound of the 95% confidence interval (CI) of the GMC ratio ≥0.67.RESULTSA total of 327 of the 333 infants enrolled in the study were included in the per-protocol analysis. The postdose 1 anti-Hib GMC was 0.41 µg/mL (95% CI 0.33–0.52) in the Vaxelis group (n = 152) and 0.39 µg/mL (95% CI 0.31–0.50) in the PedvaxHIB group (n = 146). The constrained longitudinal data analysis GMC ratio was 1.03 (95% CI 0.76–1.39).CONCLUSIONSPostdose 1 immunogenicity of Vaxelis was noninferior to PedvaxHIB. Our findings support the use of Vaxelis in AI/AN children, a population with elevated risk of Hib disease.

2023-07-01·Journal for ImmunoTherapy of Cancer

Pattern recognition receptor agonists in pathogen vaccines mediate antitumor T-cell cross-priming

Article

作者: Kim, Kristy ; Brown, Brian D ; Merad, Miriam ; Rose, Samuel A ; Yellin, Michael ; Pantsulaia, Gvantsa ; Oreper, Daniel ; Svensson-Arvelund, Judit ; Marsh, Henry ; Jhunjhunwala, Suchit ; Upadhyay, Ranjan ; Moussion, Christine Carine ; Brody, Joshua D ; Aleynick, Mark

BackgroundCancer immunotherapies are generally effective in patients whose tumors contain a priori primed T-cells reactive to tumor antigens (TA). One approach to prime TA-reactive T-cells is to administer immunostimulatory molecules, cells, or pathogens directly to the tumor site, that is, in situ vaccination (ISV). We recently described an ISV using Flt3L to expand and recruit dendritic cells (DC), radiotherapy to load DC with TA, and pattern recognition receptor agonists (PRRa) to activate TA-loaded DC. While ISV trials usingsyntheticPRRa have yielded systemic tumor regressions, the optimal method to activate DCs is unknown.MethodsTo discover optimal DC activators and increase access to clinical grade reagents, we assessed whether viral or bacterial components found in common pathogen vaccines are an effective source ofnatural PRRa(naPRRa). Using deep profiling (155-metric) of naPRRa immunomodulatory effects and gene editing of specific PRR, we defined specific signatures and molecular mechanisms by which naPRRa potentiate T-cell priming.ResultsWe observed that vaccine naPRRa can be even more potent in activating Flt3L-expanded murine and human DCs than synthetic PRRa, promoting cross-priming of TA-reactive T-cells. We developed a mechanistically diverse naPRRa combination (BCG, PedvaxHIB, Rabies) and noted more potent T-cell cross-priming than with any single naPRRa. The naPRRa triplet—as part of Flt3L-primed ISV—induced greater intratumoral CD8 T-cell infiltration, T-cells reactive to a newly defined tumorous neoantigen, durable tumor regressions.ConclusionsThis work provides rationale for the translation of pathogen vaccines as FDA-approved clinical-grade DC activators which could be exploited as immune-stimulants for early phase trials.

2023-05-02·Vaccine

Newborn medication adherence and childhood under-immunization in military beneficiaries.

Article

作者: Vereen, Rasheda J ; Aden, James K ; Drumm, Caitlin M

BACKGROUNDThe American Academy of Pediatrics recommends birth doses of vitamin K, erythromycin ointment, and the hepatitis B vaccine, but the relationship between birth medication administration and childhood immunization compliance is understudied. The objective of this study is to evaluate rates of newborn medication administration, and risk factors for refusal in military beneficiaries and determine the relationship between medication refusal and under-immunization at 15 months.METHODSA retrospective chart review was completed for all term and late preterm infants born at Brooke Army Medical Center, San Antonio, TX, from January 1, 2016, to December 31, 2019. The electronic medical record was queried for birth medication administration, maternal age, active-duty status, rank, and birth order. Childhood immunization records were extracted for all patients who continued care at our facility. A patient was considered completely immunized if they had received at least 22 vaccines by 15 months: three doses of the hepatitis B vaccine [Pediarix^TM], two doses of the rotavirus vaccine [Rotarix^TM], four doses of the DTAP vaccine [Pediarix^TM and Acel-Immune^TM], three doses of Haemophilus influenza B vaccine [Pedvaxhib^TM], four doses of pneumococcal [Prevnar 13^TM], three doses of IPV [Pediarix^TM], one dose of measles, mumps, and rubella [MMR^TM], one dose of varicella [Varivax^TM] and one dose of hepatitis A vaccine [Harvix^TM].RESULTSSeven thousand one hundred and forty infants were included; 99.3% received vitamin K, 98.8% received erythromycin ointment, and 93.8% received the hepatitis B vaccine. Refusal of the erythromycin ointment and hepatitis B vaccine was associated with older maternal age and higher birth order. Childhood immunization records were available for 607 infants; 7.2% (n = 44) were under-immunized by 15 months, with no infants being non-immunized. Refusal of the hepatitis B vaccine (RR: 2.9 (CI 1.16-7.31)) only at birth was associated with a higher risk of being under-immunized.CONCLUSIONSRefusal of the hepatitis B vaccine in the nursery is associated with a risk of being under-immunized in childhood. Obstetric and pediatric providers should be aware of this association for appropriate family counseling.

项与 b型流感嗜血杆菌结合疫苗(Merck Sharp & Dohme) 相关的新闻（医药）

2024-08-11

·生物制品圈

外膜囊泡疫苗平台

摘要:外膜囊泡（OMVs）是许多革兰氏阴性细菌在生长过程中自发释放的，是细菌的重要毒力因子，帮助它们在恶劣的环境条件下生存。天然OMVs是细菌自然释放的，其产量对于疫苗制造来说太低，需要化学处理（去污剂提取）或遗传操作，从而产生膜抗原的通用模块（GMMAs）。多年来，OMVs的特性和属性使它们成为疫苗开发的可行平台。目前已有几种OMV疫苗获得许可，主要用于预防由B型脑膜炎奈瑟菌（MenB）和b型流感嗜血杆菌（Hib）引起的脑膜炎。还有几种针对其他革兰氏阴性细菌的OMV候选疫苗处于临床开发阶段，这些细菌是OMVs的来源，但也针对异源靶标，在这些靶标中OMVs被用作载体（例如2019年冠状病毒病[COVID-19]）。将OMVs用于非自身来源靶标的开发是OMV技术的重大进步，通过能够递送蛋白质或多糖抗原，提高了其多功能性。其他进展包括可以进行的一系列遗传修饰，以提高其安全性，减少反应原性，并增加免疫原性和保护效果。然而，仍然存在重大挑战，例如识别用于在OMV表面高含量表达异源蛋白的通用工具。在这里，我们概述了迄今为止OMV疫苗的进展，特别讨论了已获许可的基于OMV的疫苗和处于临床开发的候选疫苗。本文还描述了临床前研究的最新趋势，主要集中在遗传操作和化学偶联方面，以将OMVs用作异源蛋白质和多糖抗原的载体。还讨论了使用OMVs的剩余挑战和未来研究的方向。关键点外膜囊泡（OMVs）是疫苗开发的一种可行平台，目前已有一些基于OMV的疫苗获得许可并处于临床使用中。OMVs在使用上有着悠久而丰富的历史，特别是在针对脑膜炎奈瑟菌和b型流感嗜血杆菌的疫苗中，并且已经产生了大量支持使用这一平台来对抗许多其他病原体的临床前数据。最近的趋势是将OMVs用作异源蛋白质和多糖抗原的载体，支持多组分疫苗的开发。 1. 引言外膜囊泡（OMVs）是许多革兰氏阴性细菌在生长过程中自发释放的，可能是由于细胞生长和外膜生物合成之间的不平衡，导致多余的膜材料以OMVs的形式释放。已有多项研究报告了OMVs在增强细菌在恶劣环境中的存活能力以及向宿主细胞传递毒力因子和DNA方面的作用。OMVs似乎参与了细菌的致病过程，帮助生物膜形成，并在宿主中或土壤中增加存活率。此外，OMVs支持细菌抵抗抗生素，并促进细菌之间抗生素抗性的转移。 OMVs模仿细菌的外部，类似于一种没有致病能力的病原体，并含有多种表面暴露的抗原。OMVs还含有与病原体相关的分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）、肽聚糖、脂蛋白和鞭毛，这些成分具有自我佐剂性。此外，OMVs的粒径有助于被抗原呈递细胞（APCs）摄取，有助于向相应的T细胞呈递，并由滤泡树突细胞（FDCs）激活特定抗原的B细胞，从而诱导适应性免疫反应。基于这些原因，过去几年中，OMVs一直被视为疫苗开发的一种多功能平台。细菌自然释放的OMVs被称为天然OMVs（nOMVs），但对于许多细菌来说，这种释放水平对于疫苗制造来说太低。为了提高产量，已使用去污剂（例如脱氧胆酸）从整个细菌中化学提取OMVs，结果产生了称为去污剂提取的OMVs（dOMVs）的类囊泡聚集体，这些聚集体是不溶性外膜蛋白。通常丢弃含有自发囊泡的发酵上清液，然后进行OMV的提取。可以引入超声步骤以获得更小且更均匀大小的dOMVs，也简化了无菌过滤。使用去污剂大大减少了LPS和脂蛋白的含量，从而降低了反应原性并提高了OMV的耐受性。然而，这种方法也导致了重要的保护性脂蛋白抗原的丢失，并损害了囊泡的完整性，并使得最终制剂被胞质蛋白污染。可以通过遗传操作改变细菌的OMV特性（例如产量、内毒素性、蛋白质含量），并将其归类为突变衍生的OMVs（mdOMVs）或膜抗原的通用模块（GMMAs）。通常引入突变以破坏外膜与内膜以及周质中的肽聚糖层之间的联系。为了实现这一目的，已经采取了不同的策略。一种常见的方法是删除大多数革兰氏阴性细菌中存在的Tol-Pal系统的tolR基因。在大肠杆菌中使用nlpI的删除改变了肽聚糖动态；在流感嗜血杆菌、霍乱弧菌和大肠杆菌中破坏VacJ/Yersinia复发ABC（ATP结合盒）运输系统，导致磷脂在体外膜的外层积累。删除lpp、mltA（gna33）、rmpM、ompT、pagL、大肠杆菌共同抗原、degP和virk也会导致细菌外膜过度脱落。由于天然释放的OMVs中LPS含量很高，因此引入了额外的突变以减少内毒素性。这通常是通过修改脂质A结构来实现的，特别是减少脂质A的酰链和磷酸基团的数量，影响其识别/触发Toll样受体（TLR）4的能力，并减少与脂质A相关的炎症反应。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中使用了MsbB（lpxM）、HtrB（lpxL）和PagP（分别向脂质A添加肉豆蔻酰、月桂酰或棕榈酰链）的酰基转移酶的删除；在脑膜炎奈瑟菌中使用了lpxL1和lpxL2的删除。与dOMVs相比，nOMVs和GMMAs的纯化更简单，所需的步骤更少。OMVs可以通过首先进行切向流过滤（TFF）与整个细菌分离，第二个TFF保留OMVs，同时去除可溶性蛋白质和其他低分子量杂质。在这篇综述中，我们提供了OMVs及其遗传修改版本GMMAs作为疫苗平台的概述，以呈现蛋白质或糖抗原，临床水平的关键成就，临床前研究中出现的趋势，以及该领域的未来展望。 2.已获许可的基于外膜囊泡（OMV）的疫苗目前有几种基于OMV的疫苗已获许可并在使用中。这些疫苗针对脑膜炎奈瑟菌，针对B型脑膜炎奈瑟菌（MenB）和b型流感嗜血杆菌（Hib）感染（表1）。 Bexsero（Bexsero是GSK集团拥有或许可使用的商标）中包含三种重组蛋白，从N. meningitidis（NZ98/254菌株）提取的OMV去污剂被指示用于预防由N. meningitidis B型引起的脑膜炎和脑膜炎球菌血症。该疫苗通过刺激产生识别疫苗抗原（NHBA、NadA、fHbp）和PorA的杀菌抗体而发挥作用，PorA是OMV的主要成分。Muzzi等人对脑膜炎抗原分型系统（MATS）的综述表明，该疫苗覆盖了81%至84%的MenB分离株。在几项临床试验中进行了测试，显示出良好的免疫反应，通过人体补体血清杀菌活性（hSBA）测量。在婴儿研究中，当OMV组分增加而重组蛋白保持不变时，免疫反应相应增加，以hSBA ≥5的比例和几何平均滴度（GMTs）衡量，这以剂量依赖性方式增加，在接受Bexsero中OMV全剂量的婴儿中最低（即25μg），在接受全剂量OMV的婴儿中最高。然而，系统反应原性的类似趋势并没有观察到，在接受四分之一、一半和全剂量OMV的接受者中观察到类似的反应原性概况。对于局部反应，含有OMV的四组分MenB疫苗接受者比接受不含OMV疫苗的个体有更高的发生率。此外，与单独的重组蛋白相比，含有OMV的疫苗在引起发热的频率上要高得多。该疫苗于2013年获得许可，适用于从2个月大的个体开始主动免疫，以预防由MenB引起的侵袭性脑膜炎（IMD）。已在17项研究中评估了疫苗的安全性，包括10项随机对照临床试验，涉及婴儿、儿童、青少年和成人，当与常规疫苗联合使用时（69-79%的对象），发热的频率更高，与仅接受常规疫苗接种的对象相比（44-59%），尽管大多数事件的严重程度轻至中度且持续时间短（大约1天）。尽管疫苗是使用免疫原性终点获得许可的，但在Bexsero引入英国后3年内，疫苗合格婴儿的MenB IMD病例减少了75%。相同的OMVs单独配方在新西兰MenB疫苗中，用于对抗该国由N. meningitidis B型引起的脑膜炎暴发。OMV疫苗在几项临床试验中进行了测试，显示出可接受的安全性概况，在接种三剂疫苗后显示出强烈的免疫反应。疫苗接种计划在2004年至2006年间在新西兰的不同地区分阶段进行，用于不同年龄组的婴儿常规疫苗接种，直到2008年。据估计，该疫苗的有效性为77%，预防了2004年7月至2008年12月期间估计210例MenB IMD及其后遗症。类似地，在挪威，1983年开发的dOMV疫苗用于对抗MenB，用于控制MenB疾病的暴发。该疫苗在1988年至1991年期间用于171,800名青少年，估计在10个月后有效性为87%，之后迅速下降，与血清细菌活性的降低相一致。该疫苗还在2006年至2009年期间用于控制法国诺曼底由相同B14:P1.7,16菌株引起的暴发，病例发病率从2006年的31.6/10万下降到2009年的5.9/10万。另一种基于dOMV的疫苗（VA-MENGOC-BC，古巴Finlay Institute）于1987年在古巴获得许可用于对抗MenB（VA-MENGOC-BC是古巴Finlay疫苗研究所的注册商标），在接下来的20年中成功将MenB疾病的发病率降低了93-98%，最终使MenB不再成为古巴的公共卫生问题。2014年，该疫苗被Abivax收购，用于在亚洲和拉丁美洲国家的古巴以外地区分销。 Hib-OMPC是第一个被广泛许可的基于OMV的疫苗。它是一种高度纯化的b型流感嗜血杆菌（H. influenzae type b）荚膜多糖（多核糖核糖醇磷酸[PRP]），通过从B型脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis serogroup B）B11菌株的OMVs中用去污剂提取，与外膜蛋白复合物（OMPC）共价结合。在关键试验中，Hib-OMPC在3486名纳瓦霍婴儿（一个特别高风险的疾病人群）中显示出93-100%的效力，这些婴儿在2个月和4个月大时接种了疫苗。作为PedvaxHib（PedvaxHIB是默克夏普和多姆公司的注册商标）许可的疫苗，在接种第一剂后的1-3个月内，88%的婴儿诱导了抗PRP水平>0.15 μg/mL，在52%的婴儿中诱导了>1.0 μg/mL，几何平均滴度（GMT）为0.95 μg/mL；在第二剂和第三剂后分别上升到91%和60%。 PRP-OMPC在早期有Hib感染高风险的儿童中，在一剂后刺激强烈的免疫反应。然而，美国免疫实践咨询委员会（ACIP）建议，之前未接种疫苗的2-6个月大的婴儿应接受至少相隔2个月的两次PRP-OMPC剂量，以确保保护的持久性。他们还根据儿童的年龄推荐一剂或两剂给未接种疫苗的儿童。最终，PedvaxHib与乙型肝炎表面抗原（HbsAg）结合，并作为Comvax（在欧盟为Procomvax）许可。这种组合导致抗PRP抗体水平低于之前独立疫苗（Procomvax-EU/Comvax-US）报告的水平。Procomvax和Comvax是默克公司/MSD在欧洲的注册商标。在五项临床研究中，对1602名6周至15个月大的婴儿和儿童进行了Comvax（7.5 μg H. influenzae type b PRP，5 μg HBsAg）的免疫原性评估。在这些研究中，Comvax的免疫反应与使用单价疫苗PedvaxHib（7.5 μg PRP）和RECOMBIVAX HB（5 μg HBsAg）在不同部位接种，无论是同时还是相隔1个月进行比较。在之前未接种Hib或乙肝疫苗的婴儿中，Comvax的抗体反应在第二剂后显示出抗PRP水平>1.0 μg/mL的比例，与接受单价疫苗的受试者（72.4%）相似。该疫苗适用于由HbsAg阴性女性所生的婴儿，用于预防侵袭性Hib疾病和HBV感染，接种三剂，分别在2、4和12-15个月大时（MMR每周，CDC）。Procomvax于2009年由制造商退出欧洲市场，出于商业原因选择不更新市场授权。该决定与安全问题无关。单价疫苗还与白喉和破伤风类毒素、百日咳抗原、HbsAg和灭活脊髓灰质炎病毒结合，作为六价儿童疫苗（VAXELIS）。VAXELIS是MSP疫苗公司的注册商标。这种组合适用于6周大的婴儿和幼儿的初次疫苗接种和加强疫苗接种，主要疫苗接种时间表为两到三剂，每剂至少间隔1个月。该疫苗的安全性概况与相同适应症的其他多价疫苗相当；然而，与肺炎球菌疫苗（Prevnar 13）的联合加强研究显示，两种疫苗的接受者中有高达52.5%的发热频率，尽管发热的强度轻至中等且持续时间短（<48小时）。总体而言，Hib PRP-OMPC疫苗的安全性与其他Hib疫苗相当，它们之间没有临床上显著的差异。 3.临床开发中的OMV疫苗外膜囊泡（OMVs）在呈现多种天然构型的抗原以及自我佐剂性方面具有优势，因此有许多基于OMV的疫苗正在进行临床开发，以对抗它们所衍生的病原体（表1）。 GMMAs在其表面自然展示O-多糖（图1），并且已被用作疫苗候选物，用于预防非伤寒沙门氏菌和志贺氏菌，目前正在进行临床试验。图1 展示在OMVs或GMMAs上的主要策略 GMMAs 膜抗原的通用模块，LPS 脂多糖，OMVs 外膜囊泡在小鼠中，显示在沙门氏菌鼠伤寒菌和沙门氏菌肠炎菌GMMAs上的O-多糖已被证明可以引发强烈的抗O-多糖免疫球蛋白（Ig）G抗体反应，水平与相应的CRM197结合物配制的铝佐剂所诱导的反应相当。有趣的是，GMMAs增强了IgG抗体亚型轮廓，并与蛋白质结合物相比，导致更大的血清杀菌活性。现在正在对欧洲成人进行一项I期试验（NCT05480800），测试S. typhimurium和S. enteritidis GMMAs的双价配方吸附在Alhydrogel上。这种配方还与一种针对S. typhi的糖结合疫苗（Typhibev）结合，后者的I期临床试验也已经启动（NCT 05480800）。第一个在临床试验中测试的基于GMMAs的疫苗是1790 GAHB的志贺氏菌宋内菌GMMA疫苗。GMMAs从一种基因工程改造的S. sonnei菌株中纯化，该菌株增加了脱落（ΔtolR），产生较少的反应原性五酰基化脂A（ΔhtrB），并稳定表达编码O-多糖的毒力质粒。S. sonnei GMMAs吸附在Alhydrogel上，在两项I期临床试验、一项扩展增强试验、一项IIa期临床试验中进行了测试，并最终在一项IIb期人类挑战感染模型（CHIM）试验中进行了测试。基于O-多糖的S. sonnei GMMAs已被证明在健康成人和疾病流行国家中耐受性良好且具有免疫原性，接种一剂疫苗后引发杀菌抗O-多糖IgG反应。值得注意的是，与初次免疫相隔3年的复种显示了疫苗诱导强大的记忆反应的能力。 1790GAHB在CHIM试验中未能显示临床效力，可能由于测试的O-多糖剂量低导致的免疫反应不足。然而，基于这些结果，已经开发了一种新的S. sonnei构建物，允许增加10倍的O-多糖剂量。这样的GMMAs已与志贺氏菌flexneri 1b、2a和3a GMMAs结合在一种4组分配方中，目前正在进行一项I/II期试验（NCT05073003）。还有流行病学证据表明，B型脑膜炎奈瑟菌OMV疫苗对淋病奈瑟菌有中等程度的效力，导致人们建议基于OMV的疫苗可能适合预防淋菌感染，既可以通过针对脑膜炎球菌B的疫苗（NCT04297436和NCT04415424），也可以与特定的N. gonorrhoeae GMMAs结合，正在进行临床试验（NCT05630859）。疫苗具有异源靶标，其中OMVs与另一种抗原结合，也在早期临床开发中，例如Intravacc BV开发的通过鼻内途径给药的针对2019年冠状病毒病（COVID-19；Avacc 10）的疫苗（NCT05604690）。 4.临床前研究中出现的趋势传统上，OMVs被提出用于对抗它们所衍生的病原体引起的疾病，其中一些已获得许可或正在进行临床开发，还有许多处于临床前阶段。免疫反应可以针对LPS而不是蛋白质成分，正如早期对自然释放的V. cholerae OMVs的研究所显示的那样，这些研究通过粘膜免疫引发了抗体反应，保护小鼠后代免受口服V. cholerae的挑战，并确保对两种流行病学上最相关的O1血清型的Inaba或Ogawa变体的交叉保护。OMVs未能与O139交叉反应。最近的研究已经展示了如何轻松进行遗传操作，以进一步提高OMV的安全性、免疫原性和保护效率。例如，已经显示破坏小的非编码RNA可以改善OMVs对小鼠模型中幽门螺杆菌感染的保护效率。使用鞭毛蛋白缺陷的S. typhimurium OMVs进行鼻内和腹腔免疫，有效地保护了异源S. choleraesuis和S. enteritidis的挑战，使用主要外膜蛋白缺陷的S. typhimurium突变体的OMVs进行免疫，增强了交叉保护。最近，OMVs也被提出作为异源抗原的递送系统。事实上，OMVs可以被修改以显示来自不同（甚至是系统发育上距离很远的）病原体（病毒、细菌、寄生虫）的蛋白质或多糖。 4.1.作为异源蛋白载体的OMVs 特别是，由大肠杆菌菌株产生的OMVs已被用作重组蛋白的递送系统。通过将抗原融合到分泌信号或周质蛋白上，已用于在囊泡腔中表达重组抗原（图1）。通过双精氨酸（Tat）信号序列，GFP在大肠杆菌OMVs的腔中表达。通过与丰富的外膜蛋白OmpA的周质侧融合，在大肠杆菌OMVs的腔中表达腔隙，已针对A组链球菌（例如，Slo，SpyCEP，SpyAD）、B组链球菌（例如，SAM_1372）和沙眼衣原体蛋白抗原进行了测试。肺炎链球菌表面粘附素A（PspA）通过与N末端β-内酰胺酶信号序列的融合，在鼠伤寒沙门氏菌OMVs的腔中表达。然而，为了更强的免疫反应，蛋白质定位在OMV表面应该更受青睐。只有少数研究报告了在OMV表面或囊泡腔中呈现相同抗原的直接比较。在V. cholerae OMVs中加载的大肠杆菌碱性磷酸酶PhoA，在小鼠鼻内免疫后引发了低免疫反应，可能因为酶位于OMV腔中的位置与表面相反。在Fantappiè等人的研究中，OMVs针对加载在大肠杆菌OMVs腔中的GAS和GBS蛋白诱导了高功能性抗体滴度，并且用Slo-OMV-和SpyCEP-OMV免疫的小鼠对GAS致死挑战有保护作用。同样，用PspA在鼠伤寒沙门氏菌OMVs腔中鼻内免疫的小鼠发展了抗原特异性血清抗体反应，而等剂量的重组PspA没有发展出可检测的反应。用重组OMV免疫的小鼠对肺炎链球菌挑战有保护作用。然而，建议进行额外的研究，以评估是否通过将抗原定位在OMV表面可以增强抗PspA免疫反应。Salverda等人证明，与具有OspA腔隙表达的构建物相比，在脑膜炎奈瑟菌OMVs表面表达的表面暴露的脂蛋白OspA导致强烈的抗OspA抗体反应，其中没有观察到抗原特异性抗体反应。Necchi等人也获得了类似的结果，他们直接比较了在S. typhimurium GMMAs内或化学连接在GMMA表面的N. meningitidis fHbp。在GMMAs腔中表达的fHbp引发的免疫反应极低，远低于在GMMA表面显示的相同抗原。作者还清楚地表明了需要在GMMAs上拥有fHbp（通过遗传操作或化学偶联），与fHbp与GMMAs物理混合相比，引发更强的杀菌反应。然而，在OMV表面表达异源蛋白相当具有挑战性，通常以低表达水平为特征，并且取决于抗原。已经提出了不同的表面蛋白表达策略。通常通过蛋白水解处理超出细胞表面的蛋白质可以通过防止蛋白水解来保留在OMV表面。感兴趣的蛋白质可以融合到膜相关蛋白上，例如自转运体的β-桶结构域（例如Hbp，AIDA）。大肠杆菌的自转运体血红蛋白酶（Hbp）被用来在鼠伤寒沙门氏菌OMVs上表达结核分枝杆菌蛋白和沙眼衣原体的主要外膜蛋白MOMP的表位。相同的系统被用来在沙门氏菌OMVs上展示两个肺炎链球菌蛋白抗原的高密度。用得到的OMVs进行鼻内免疫在小鼠肺炎链球菌定植模型中诱导了强大的保护，无需粘膜佐剂。这种抗原展示方法非常高效，但似乎仅限于小蛋白。Kim等人将几种异源蛋白融合到孔形成细胞毒素ClyA的C-末端。工程化的大肠杆菌OMVs显示绿色荧光蛋白（GFP），与ClyA遗传融合，与单独的GFP相比，在免疫小鼠中引发了更强的抗GFP抗体滴度。通过相同的表达系统，表达Acinetobacter baumannii Omp22的大肠杆菌OMVs比用更高剂量的重组Omp22蛋白配制的铝免疫接种诱导了显著更高的Omp22特异性抗体。通过融合到膜锚定的第二脂蛋白fHbp，实现了在脑膜炎奈瑟菌OMVs上的OspA表面表达。基于严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的重组、六脯氨酸稳定的、D614G刺突蛋白（mC-Spike）与脑膜炎OMVs的LPS结合肽序列mCramp（mC）融合的COVID-19亚单位疫苗，在金黄叙利亚仓鼠模型中，通过鼻内免疫，引发了高水平的中和抗体，并检测到粘膜反应。候选疫苗在仓鼠挑战模型中也具有保护作用。工程化的OMVs，结合来自SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合基序（RBM）的肽，也已经制成，并在小鼠中显示可引发中和抗体。 2009年大流行性流感A病毒（H1N1）株H1型血凝素（HA）与中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的受体结合域（RBD）的嵌合融合蛋白也已在大肠杆菌DH10ß的OMVs上表达，诱导小鼠产生免疫反应，保护免受流感挑战。已经提出了其他装饰OMVs表面异源蛋白的方法，其中抗原分别产生并在OMV生产后添加（图1）。在这些策略中，SpyTag-SpyCatcher系统使用链球菌表面蛋白的SpyCatcher结构域，该结构域识别一个相应的13氨基酸肽（SpyTag）。识别后，在SpyCatcher的一个赖氨酸侧链和SpyTag的一个天冬氨酸之间形成了共价异肽键。SpyTag在OMVs上表达，并用于与任何蛋白融合的SpyCatcher偶联。这种方法最近被用来将带有SpyTag的SARS-CoV2-Spike的RBD域偶联到展示Hbp并用SpyCatcher肽修饰的鼠伤寒沙门氏菌OMVs。候选疫苗在仓鼠模型中具有免疫原性和保护性。最近，提出了一种基于亲和素的疫苗抗原交联方法，其中生物素化蛋白链接到表面经过生物素结合蛋白重塑的OMVs的外部。在小鼠中测试得到的OMVs，引发了强烈的抗原特异性抗体反应。此外，化学偶联蛋白到OMVs也已被使用，目的是用异源蛋白抗原装饰OMVs，并有可能产生多组分疫苗。化学偶联是一种快速利用OMVs作为载体的方法，它允许在一定范围内更好地控制显示在囊泡上的抗原量和密度。来自不同病原体（N. meningitidis、Salmonella、Shigella）的OMVs已与不同蛋白（N. meningitidis fHbp、大肠杆菌SslE和FdeC、疟疾蛋白Pfs25、Pfs230和CSP等）链接，显示出OMVs上的抗原引发比单独蛋白抗原更强的功能性抗体反应。化学方法最近已扩展到病毒抗原（例如流感A病毒血凝素和狂犬病糖蛋白），证实了OMVs显著增加抗原特异性体液和细胞反应的能力。 4.2.糖偶联OMVs OMVs也被提出作为多糖的载体，从上述许可的Hib-OMPC结合疫苗开始，最初在动物中诱导抗体反应，并通过与TLR2结合触发细胞因子介导的反应。将Hib多糖偶联到B. pertussis的dOMVs也被证明是一种可行的方式，以诱导对百日咳和H. influenzae的双重反应。考虑到它们的生产和纯化的便利性，以及增强免疫反应的潜力，最近有许多例子报道了使用GMMAs作为多糖载体。 GMMAs可以作为化学链接多糖的载体，提供将多糖偶联直接到LPS/脂寡糖（LOS）或暴露在囊泡上的蛋白质的可能性（图1）。来自不同病原体（N. meningitidis A和C群、H. influenzae b型、A组链球菌碳水化合物和Salmonella typhi Vi）的各种结构多样的多糖已成功共价结合到GMMAs上，引发动物中强烈的抗多糖免疫反应。所引发的抗体水平和功能性受每个GMMA连接的糖数量的影响不大，尽管较低的糖负荷被证明更好地确保了GMMA暴露蛋白的免疫原性。另一方面，需要针对具体情况优化糖链长度，以获得强大的免疫反应。与蛋白质连接相比，LOS/LPS导向的偶联在诱导对多糖的强大功能性免疫反应方面也同样有效。 OMV和GMMA结合了展示多拷贝碳水化合物的能力，有利于B细胞激活，并以其在天然细菌环境中的呈现。此外，它们的尺寸对免疫刺激是最佳的，并且由于存在如TLR2和4等TLRs，它们促进了内在的佐剂属性。有趣的是，使用S. sonnei和S. typhimurium的GMMAs作为模型，观察到诱导的免疫反应是由FDC向相应B细胞的抗原呈递介导的。TLR4的参与被看作是诱导强烈抗体产生的关键，而TLR2的激活似乎在GMMA的免疫原性中没有发挥作用。除了化学偶联外，GMMAs和OMVs也可以被工程化以表达异源糖基，从而产生所谓的糖工程OMV（glyOMV）。不表达聚合O-多糖的大肠杆菌菌株已被基因改造，以在wbbL基因中插入异源多糖的生物合成操纵子，同时保持脂质A核心作为受体的生产。通过这种策略，异源糖基结构在内膜的细胞质侧合成，在天然未脱脂的焦磷酸载体（Und-PP）上组装，并通过内源性fippase Wzx的作用转移到周质侧。最后，内源性O-抗原连接酶‘WaaL’将组装好的多糖整体转移到脂质A-核心结构上。或者，工程化的糖基可以从头开始，一个残基接一个残基地组装，从内膜细胞质侧表达的截断的脂质A-核心的末端糖开始，然后以MsbA依赖的方式翻转到周质中。得到的LPS分子被运输到外膜，并通过Lpt蛋白复合物翻转到细胞外空间，使糖基工程化的脂质A-核心结构被转移到外膜并结合到囊泡中。由于可以在大肠杆菌中结合多种质粒编码的O-多糖生物合成途径，这种方法使OMV成为一个“即插即用”的平台，用于展示来自不同致病细菌的糖表位。使用这种策略，Chen等人产生了一组包含来自八种致病细菌的O-多糖的糖基工程OMVs（glyOMVs），包括高度致病的弗朗西斯菌属土拉热菌A型Schu S4菌株（创建ft-glyOMVs）。免疫两周后，ft-glyOMVs在小鼠中诱导了与天然ftLPS相比O-多糖特异性IgG水平高出两到三倍。小鼠免受F.tularensis Schu S4的致命挑战，以及与F. tularensis亚种holarctica B型菌株的挑战，这些菌株表现出具有相同结构的O-多糖。Ft-glyOMVs在皮下给药时还引发了保护性的IgA介导的粘膜免疫反应。 Price等人成功地将大肠杆菌OMVs工程化以表达肺炎链球菌的荚膜多糖。GlyOMVs诱导的血清IgG调理吞噬滴度与PCV13中相应的化学结合物相当。大肠杆菌OMVs还被糖基工程化以表达C. jejuni的七糖，显示出在接种的鸡中挑战后细菌定植减少。 Stevenson等人使用大肠杆菌的超囊泡化JC8031菌株，在OMV表面实现了PNAG多糖的高水平表达。在PNAG阳性JC8031细胞中表达S. aureus PNAG去乙酰化酶IcaB（dPNAG-glyOMV），以富含去乙酰化的PNAG的glyOMVs。用两种工程glyOMVs免疫小鼠，结果产生了高水平的PNAG特异性抗体，但只有由dPNAG-OMVs诱导的抗体能够在体外杀死两种不同的PNAG产生细菌物种（即，革兰氏阳性的S. aureus和革兰氏阴性的F. tularensis holoartica）。候选疫苗还在小鼠中诱导了对致命剂量的S. aureus和F. tularensis的保护。 Tian等人在沙门氏菌OMVs中生物合成了S. flexneri 2a O-多糖，研究表明，通过鼻内和腹腔免疫小鼠，OMV疫苗在血清中诱导了显著的特异性抗-志贺氏菌LPS抗体，在阴道分泌物和支气管肺泡灌洗液中诱导了IgA，并提供了对致病性S. flexneri 2a感染的显著保护。 5. 结论 OMVs在使用上有着悠久而丰富的历史，特别是在针对N. meningitidis和b型流感嗜血杆菌的疫苗中。已经产生了大量临床前数据，以对抗许多其他病原体，支持使用OMVs及其遗传修改版本（GMMAs）作为提供同源和异源蛋白和多糖抗原的有前途的、负担得起的平台。 OMVs的纳米尺寸被认为可以增强被APCs的摄取，其激活是通过TLRs识别OMVs上的多种PAMPs而发生的。B细胞激活是通过OMV表面表位的重复和OMVs的尺寸促进的，这允许它们直接进入淋巴系统。T细胞/B细胞合作对于产生高亲和力抗体的浆细胞和记忆B细胞至关重要。对OMV作用方式的更多研究将有助于更好地理解这类疫苗的免疫是如何诱导的，并有助于阐明所确定的机制是与平台相关的还是病原体特定的。 COVID-19大流行以及抗生素抗性的出现，正在催化基于新型囊泡的候选疫苗进入临床开发（表1）。同源脑膜炎奈瑟菌OMVs包含在许可的疫苗中，并且正在对源自它们的同源病原体进行GMMAs的临床研究。当前试验的数据，无论是安全性还是免疫原性，将关键地进一步支持使用该平台进行新型疫苗开发。该领域的当前进展集中在OMVs和GMMAs作为异源蛋白和多糖抗原的载体（图1）。使用这种技术开发的COVID-19疫苗（Avacc 10）正在进行临床测试。通过不同的新技术，包括化学偶联、分子工程和Spy-tag/Spy-capture，已经证明生成这种多组分囊泡是可行的。这些新方法将有助于简化针对各种不同病原体机制或甚至不同病原体的疫苗。我们预计，未来这类疫苗将取得显著进展，并将有更多的基于囊泡的疫苗可用，以帮助对抗新兴疾病和未满足的医疗需求。为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。名称：2024第三届新型疫苗研发峰会时间：2024年8月16-17日（周五-周六）地点：苏州（酒店定向通知）主办单位：四叶草会展、生物制品圈媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈会议费用：点击二维码即可查询。报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。大会日程已经确定的报告人识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

疫苗

2024-01-15

·生物制品圈

外源因子污染史和当前检测及去除的方法

1.什么是外源因子？世界卫生组织将外来物定义为"污染细胞培养物或来源材料的微生物，这些微生物无意中被引入生物制品的制造过程中。这是一个相当宽泛的定义，因此，可以被视为非确定因素的范围相当大。外来因子是复制因子，如真核生物、原核生物或病毒，另外还有朊病毒。不存在复制因子的污染毒素不被认为是外源性因子。外来因子不需要是已知的人类病原体，许多外来因子是通常被认为对人类无致病性的动物病原体。为了使产品安全不受外来剂的影响，任何存在的外来剂都需要灭活，如果产品不能灭活，则必须采取预防措施以确保不会发生污染。不确定因素对药品的污染会产生许多负面影响。最直接的影响是有人因受污染的产品而患病或受伤。污染可能导致药物或疫苗短缺，因为受污染的产品必须从市场上撤下，例如，由于检测到一种外源性病毒，唯一的轮状病毒疫苗被从市场上撤下了。从实际的角度来看，制药公司无法从受污染的、不安全的产品中获利。此外，需要建立公众对药品的信任，因为之前的外源性药物污染事件导致了消费者的不信任，因为质疑疫苗安全性的父母不太可能给孩子接种疫苗。甚至有一种被驳斥的阴谋论，认为脊髓灰质炎疫苗被一种外源性病毒污染，导致了人类免疫缺陷病毒(HIV)的大流行。2.被外源因子污染但放行的产品在许多情况下，在药品中发现了外来剂。本节旨在重点介绍一些特别有影响力的事件，或者让人们深入了解法规是如何制定的。这些污染事件的摘要包括在图1。图1 外源因子污染的时间轴本文按时间顺序列出了所讨论的每一个外源因子污染事件，并以检测到污染的年份为日期。2.1脊髓灰质炎疫苗中猴病毒40的检测1955年，美国采用了由默克公司生产的Salk灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)。用福尔马林灭活脊髓灰质炎病毒在恒河猴肾(RMK)细胞中培养产生IPV。1959年Eddy等人发现RMK细胞的裂解物中含有一种在仓鼠体内引起肿瘤发生的因子。基于这一研究，默克公司的研究人员在开发腺病毒疫苗的过程中，发现了一种IPV污染剂，可在非洲绿猴肾(AGMK)细胞中引起细胞病变，并将其鉴定为猿猴病毒40号(SV40)。到SV40被发现时，多达9800万美国人接种了可能受污染的IPV疫苗，尽管研究估计只有10 - 30%接种了IPV疫苗的人接种了受污染的剂次。有证据表明，IPV的福尔马林灭活程序能够灭活SV40，尽管效率不如RMK细胞，但默克公司开始使用AGMK细胞生产IPV，因为SV40不是AGMK细胞的内源性污染物。到1961年，美国政府要求所有脊髓灰质炎疫苗不含SV40，尽管没有官方召回被污染的IPV剂量。进一步的研究发现恒河猴是SV40的天然载体，因此在IPV的生产过程中，外源病毒在RMK细胞的整个培养过程中都存在。这种污染的影响已经得到了高度的研究。SV40是一种多瘤病毒，与人BK和JC病毒有亲缘关系。在实验室中，SV40引起肿瘤，并能使其T抗原蛋白细胞系永生化，这引起了人们对IPV污染导致疫苗接受者发生癌症的主要担忧。已经从多种人类癌症中分离出SV40抗原和DNA，这表明这些实验室发现具有潜在的临床相关性。尽管有证据表明SV40具有致癌能力，但许多关于IPV疫苗接种后癌症发病率的综述并未发现接种受污染的疫苗与癌症之间存在联系。Strickler等人进行了一项着眼于SV40相关癌症风险的回顾性队列研究，将暴露于受污染IPV的个体与未暴露于受污染IPV的个体进行了年龄比较，发现暴露于受污染疫苗与癌症发病率增加无关。瑞典一项针对70万人的研究测量了骨原性肉瘤、脑室管膜瘤和胸膜间皮瘤的发病率，发现暴露于受污染IPV的个体发病率没有增加[。美国国家科学院医学研究所2003年发表的一篇免疫安全评论得出结论，目前尚不清楚IPV中SV40的存在是否会直接导致任何疫苗接种者的癌症。然而，有证据表明，接种IPV的人血清转化为SV40，但尚不清楚这是由于病毒感染还是暴露于疫苗中存在的福尔马林灭活病毒抗原。IPV被SV40污染是确定一种新型内源性动物病毒可从细胞系制备过程携带到药品生产过程的首批实例之一。这导致政府监管机构要求对特别确定的外来病毒进行筛选，制造商改变了用于继续生产疫苗的细胞系。虽然污染的影响尚未完全了解，但它似乎没有对数千万受污染人口的健康产生可衡量的影响。2.2 减毒活疫苗中噬菌体的检测1973年，美国食品和药物管理局(FDA)报告称，多种减毒活疫苗(包括腮腺炎、麻疹和风疹(MMR)疫苗和口服脊髓灰质炎疫苗)中都存在噬菌体，即在细菌内感染和复制的病毒。这种污染最初是通过对胎牛血清(FBS)的不相关研究确定的，进一步的研究确定了使用胎牛血清进行细胞培养的疫苗的污染。最初，FDA的回应是成立了一个委员会，决定在确定噬菌体是否可以从疫苗生产中去除之前，允许受污染的疫苗继续在市场上销售。对从MMR疫苗中分离的噬菌体φV-1的研究没有发现该噬菌体对动物模型的影响，也没有发现接种后噬菌体的持久性。在非人灵长类动物中接种φV-1，尽管缺乏病毒持久性，但仍产生了强烈的血清抗体反应。当时，FBS的采集是在没有采用无菌技术的屠宰场进行的。从胎儿采集的血液通常被细菌污染，并使用过滤去除细菌。这种过滤能够去除相对较大的细菌，但允许噬菌体污染最终的FBS产品。在细胞培养中使用这种受污染的胎牛血清制备减毒活疫苗，导致给人接种的疫苗受到污染。在疫苗中发现噬菌体两年后，美国食品和药物管理局(FDA)推进了相关法规，要求用于细胞培养的FBS不含任何污染噬菌体，这导致屠宰场行业修改了他们的做法。当时人们还没有完全了解疫苗中噬菌体污染的影响。目前尚不清楚有多少人接触过受污染疫苗中的噬菌体，因为在发现这一发现时，减毒活疫苗已经使用了十多年。众所周知，噬菌体可以将毒素转移到细菌中，使其更具致病性，也有发表的研究证实了噬菌体在培养中能够将基因传递到细胞中。现在，虽然我们的疫苗被要求不含噬菌体，但噬菌体的生物学已经得到了更好的了解，并且被认为对人类的危害较小。最近，噬菌体甚至被FDA批准用于治疗严重的细菌感染。目前没有证据表明任何噬菌体污染直接对人类造成伤害，而且过去的疫苗污染很可能没有直接导致不良事件。2.3 减毒活疫苗中逆转录酶的检测1995年，在鸡胚成纤维细胞中培养了MMR减毒活疫苗和黄热病减毒活疫苗。当时，人们知道禽类逆转录病毒在鸡蛋中存在风险，FDA对疫苗中禽类逆转录病毒的检测有要求。Prya等人于1994年开发的一种方法能够检测逆转录酶活性，其灵敏度提高了106倍，称为PERT试验。PERT试验用于测试疫苗，它能够检测到传统方法无法检测到的逆转录酶的存在。具体而言，MMR和YF减毒活疫苗被发现具有逆转录酶活性，而在鸡细胞和鸡蛋中培养的灭活疫苗，如流感疫苗，未被发现具有逆转录酶活性。逆转录酶与鸡胚成纤维细胞有关，这是一种从鸡群中收获的原代细胞。进一步研究发现，逆转录酶活性与内源性禽逆转录病毒(EAV-0)和禽白血病病毒(ALV)核酸和颗粒的存在有关。尽管检测到逆转录病毒核酸，但进一步的研究未能从鸡胚成纤维细胞中分离出感染性病毒[26]。疫苗接种者的试验显示，原病毒没有整合到外周血淋巴细胞中，也没有ALV的血清转化。由于检测到逆转录病毒相关的逆转录酶，减毒活疫苗没有从市场上撤下。世卫组织的一个委员会指出，“疫苗可预防疾病的风险是真实的和可量化的，而鸡细胞衍生颗粒造成的风险是理论上的和遥远的。总的结论是，PERT试验能够检测出鸡胚成纤维细胞内源性的非传染性逆转录病毒的存在。此外，大多数人作为食物链的一部分暴露于禽类逆转录病毒，从健康家禽工人收集的血清已被证明具有抗禽类逆转录病毒的血清学活性。使用替代细胞系，如人类细胞，可以完全避免引入这些禽逆转录病毒成分，但鸡细胞衍生疫苗的长期安全记录允许继续使用含有低水平逆转录酶活性的产品。2.4 羊痒病疫苗污染传染性海绵状脑病(TSE)是一种由一种叫做朊病毒的传染性蛋白质引起的疾病。绵羊暴露于朊病毒可导致痒病，一种神经退行性疾病。有两例欧洲兽医疫苗导致痒病在接种过疫苗的绵羊中传播的记录。1946年Gordon报道了一例痒病感染病例。1934年，一种由福尔马林灭活的受感染绵羊组织组成的娄平病疫苗被开发出来，以保护绵羊免受蜱传黄病毒的侵害。接种疫苗两年后，英国的羊群开始出现痒病的症状，戈登接着得出结论，疫苗制备中的几只羊处于痒病的早期阶段，但没有出现症状。当时，痒病的致病因子尚不清楚，戈登能够使用受污染的疫苗确定痒病的感染因子在受感染羊的大脑和脊柱内。1997年，意大利也遇到了类似的情况，当时人们了解了痒病的致病因子。人们开发了一种疫苗，以保护绵羊免受传染性无乳症的侵害。无乳症是绵羊和山羊的一种疾病，由无乳支原体感染引起，影响产奶量。该疫苗是通过实验性地用无乳分枝杆菌感染绵羊，采集受感染的组织，然后用福尔马林灭活细菌来生产的。对于两种被痒病污染的疫苗，污染只能通过观察接种疫苗的动物的疾病来检测，之后不再接种疫苗。一项回顾性队列研究发现，在意大利接种受污染疫苗的省份，由于存在该病的继发性传播，瘙痒病发病率增加。这些痒病污染的实例突出了在药品中检测朊病毒污染的重要性。2.5 Hib疫苗中蜡样芽孢杆菌的检测2007年，由于在生产设备中检测到蜡样芽孢杆菌，超过100万剂b型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗被召回。这次召回导致Hib疫苗短缺，导致疫苗接种计划建议发生改变。Hib疫苗由默克公司生产，分别为PedvaxHIB和Comvax。PedvaxHIB是一种Hib荚膜多糖与脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白相连，以增加抗原性。Comvax是PedvaxHIB的一种配方，也包括乙肝抗原。PedvaxHIB是由Hib和脑膜炎奈瑟菌在发酵培养基中培养，然后纯化所需抗原生产的。在生产设备中检测到土壤细菌蜡样芽孢杆菌，但在最终疫苗产品中未检测到任何污染。此外，Huang等人的研究追踪了疫苗不良事件的报告，并没有发现默克公司召回批次与未召回批次相比，不良事件有任何增加。Hib疫苗批次的潜在蜡样芽孢杆菌污染不是源于动物制品的污染，而是由于设备缺乏消毒。这是一个例子，说明如何有许多途径，外源因子可以进入药品中。2.6 轮状病毒疫苗的PCV1污染2004年和2005年，两种轮状病毒疫苗——葛兰素史克(GSK)生产的Rotarix和默克(Merck)生产的RotaTeq被批准使用。疫苗是减毒活疫苗，病毒在AGMK和Vero细胞中连续传代，然后冻干。这两种疫苗都是给儿童口服的。Victoria等人在2010年的一项研究使用下一代测序(NGS)研究了包括Rotarix在内的多种疫苗的组成。Rotarix的测序没有在疫苗中发现任何少数病毒变体，但是有序列读数归因于猪圆环病毒-1 (PCV1)。聚合酶链反应(PCR)和芯片技术证实了轮状病毒体内存在PCV1。在这项研究发表后，GSK对用于制造疫苗的材料进行了进一步的调查。在生产过程的每个阶段都检测到PCV1 DNA，包括用于培养轮状病毒的初始Vero细胞库，这些细胞库是造成污染的原因。除了检测到PCV1 DNA外，在轮状病毒收获液和纯化原液中均检测到传染性PCV1，但在最终灌装的西林瓶中未检测到。疫苗的最终污染被认为是从Vero细胞库携带的，细胞库被来源于猪的胰蛋白酶污染，因为1983年最初生产细胞库时使用的胰蛋白酶没有进行常规辐照。基于GSK疫苗被污染的调查结果，默克公司进一步调查了他们的RotaTeq库存。默克公司在RotaTeq的原液和成品疫苗中发现了PCV1和PCV2 DNA的存在。仅有DNA片段被鉴定出来;在原液和成品中均未检出感染性病毒。默克公司得出结论，PCV DNA来自用于培养疫苗Vero细胞的辐照胰蛋白酶。在疫苗中检测到PCV1时，全世界已接种了超过1亿剂Rotarix或RotaTeq，导致严重的安全问题。PCV1是1974年首次报道的猪常见病毒，与任何兽医学疾病无关。PCV2于1998年首次分离出来，与猪的消瘦综合征有关。已知PCV1和PCV2都是细胞培养的常见污染物，但PCV1和PCV2都不会在人类中引起任何疾病。尽管如此，在发现PCV污染后，FDA暂时将rottarix和RotaTeq这两种唯一可用的轮状病毒疫苗从市场上撤下了大约两个月。FDA允许恢复疫苗的使用，并更新了标签，包括PCV1的存在，因为这两种疫苗都有很强的安全记录，没有证据表明PCV会导致人类疾病，而且疫苗的益处是巨大的。对接种疫苗的儿童的研究发现，接种疫苗后，PCV在一些儿童的粪便中排出，但接种疫苗并不导致PCV1的血清转化。Rotarix和RotaTeq仍然与PCV1列为成分一起使用。3.易受外来物质污染的产品类型所有制品都有来自环境、实验室或操作人员污染的外来物质污染的风险。随着这类污染的普遍风险，一些制造方法具有更高的风险，导致某些类型的产品更容易受到污染。在细胞培养中生产的产品，需要以动物为基础的试剂生产的产品，以及需要直接使用动物的产品，受到外源因子污染的风险最高。虽然许多制品是使用这些方法生产的，但疫苗、重组蛋白和单克隆抗体是广泛使用的产品，通常也是使用这些方法生产。在不使用细胞培养的情况下生产的疫苗、重组蛋白和单克隆抗体受到外来病原体污染的风险较低。重组蛋白可以通过发酵酵母产生，由于酵母不能支持病原体，因此被认为被外源因子污染的风险相当低。目前有研究使用发酵技术生产复杂的人类蛋白质，如单克隆抗体，在未来的许多实施确实降低了污染的风险。疫苗的生产方式多种多样，具有不同的病原体污染风险。有些疫苗是通过培养细菌生产的，这种方法和酵母发酵一样，具有较低的外来病毒污染风险。一般来说，减毒活疫苗比灭活疫苗更容易受到外来病原体污染，因为灭活的步骤也可以使外来病原体不具有传染性。然而，有些病毒和朊病毒对福尔马林灭活具有抗性，因此灭活产品仍然存在污染风险。活细胞产品，如嵌合抗原受体T细胞，由于最终材料的稳定性要求，也面临高风险的外源因子污染。由于细胞需要活给药，因此很难去除可能存在的任何外源因子，因为大多数纯化方法都会损害所需的细胞。活细胞产品的另一个复杂之处在于它们必须从宿主处收集，这导致了一个额外的潜在的外源性病原体污染源。4.外源因子污染的来源4.1 使用内源性外源因子的细胞系所有细胞系都是在某一时刻从宿主身上采集的，一些用于培养这些细胞系的细胞在采集时含有内源性的外源因子。在药物产品开发中使用这些细胞系可能导致外源因子污染最终产品。以这种方式引入的外源因子往往是收集细胞的物种的原生因子。例如，RMK细胞天然含有SV-40，多种用于重组蛋白表达的昆虫细胞系天然含有sf -横纹肌病毒，一种用于产生虫媒病毒的蚊子细胞系被蚊子细小病毒污染。原代细胞，如用于生产含有EAV-0和ALV的MMR疫苗的鸡胚成纤维细胞，也是一个潜在的外源因子污染来源。4.2 动物产品在细胞培养中的应用细胞培养需要复杂的材料，如生长因子、必需氨基酸和酶，由于成本或生产困难，这些材料都是从动物身上采集的。细胞培养中最常用的动物产品是从胎牛身上采集的胎牛血清和从猪胰腺中采集的胰蛋白酶。胎牛血清与牛病毒污染有关，如牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、有蹄类四细小病毒2型和牛肝病毒。胎牛血清收集方法不当也会导致细菌污染和噬菌体污染。已发现胰蛋白酶含有多种不同的猪源病毒，如PCV1和经典猪瘟病毒。动物产品收集技术的改变，以及使用前的过滤和辐照等处理，降低了外来物质污染的风险。4.3 利用动物直接生产一种产品有些产品不使用体外细胞培养，而是直接依靠动物或动物产品来生产药品。然后，这些动物的内源性传染因子会污染最终的药品。一个常见的例子是使用鸡蛋来培养用于疫苗的病毒。在鸡蛋中培养的产品中检测到禽类逆转录病毒。动物的另一个用途是通过实验性感染培养微生物。这可能导致动物感染的任何其他微生物以及可能存在于动物体内的任何朊病毒的传播。20世纪50年代至80年代的天花疫苗生产方法涉及收集牛痘病毒感染的动物皮肤，这使得产品具有较高的外源因子污染风险。4.4 环境污染实验室环境也可能是一个外来因素的来源。如果没有消毒，大多数表面上都有细菌。此外，实验室人员也可能是外源因子的来源，因为源自人体的微生物通常可以在细胞培养中复制。环境污染的一个常见例子是支原体，这是一种细菌污染物，通常来自实验室人员。在生产的各个阶段都需要适当的无菌技术，以防止环境的污染因子进入药品。5.常见的污染物有各种各样的因子可以作为外源因子。下面将讨论不同类型的污染剂，以及它们对药品的潜在影响。表1列出了选定的外源因子。5.1 细菌污染由于细胞培养基中含有细菌生长所必需的营养物质，因此细胞培养物经常会被细菌污染。细菌在环境中和实验室工作人员身上都很常见，如果不保持无菌条件，来自环境的细菌会污染细胞培养物或用于细胞培养的制品。有许多不同类型的细菌可以引起污染。通常，被污染的细菌在显微镜下可以看到，在宏观上可以看到浑浊的上清，或者通过培养基pH指示剂的变化可以检测到。支原体是细胞培养中非常常见的细菌污染物，对数千个细胞系的研究发现，约25%的细胞系被支原体污染。支原体属革兰氏阴性菌，基因组长度和尺寸都很小，大多数支原体基因组长度小于1mb，呈球形，长1 - 2 μm，宽0.1-0.2 μm。支原体的小尺寸允许它们通过0.2 μm的过滤器。通常支原体污染不能通过显微镜检测，因为细菌太小而无法观察，因此需要分子技术。市面上有许多用于检测细胞培养物中支原体的PCR检测方法。药品的细菌污染会对服用者造成有害影响。致病菌污染药品可直接导致感染。即使细菌被灭活方法杀死，细菌产生的毒素仍然可以保有毒性，导致不良反应。5.2 真核生物的污染物像细菌污染物一样，环境中也有真核生物可以在细胞培养条件下复制。由于细胞培养条件是为真核细胞系的复制而设计的，因此外源性的真核因子通常也可以复制。此外，虽然许多类型的细菌污染可以通过在培养基中添加抗生素来预防，但大多数杀死真核污染物的化合物也会杀死培养物中的目标细胞，尽管有可用的抗真菌化合物可用于细胞培养条件。最常见的真核污染物是真菌，但寄生虫如单细胞原生动物也可以污染细胞培养物。像细菌一样，真核生物的污染通常来自环境，由于真核生物的体积很大，因此通常可以通过显微镜检查检测到污染。真核生物污染药品可导致严重疾病。例如，大量被真菌污染的醋酸甲基强的松龙导致服用该药的患者出现真菌性脑膜炎。5.3 病毒污染物与可以在环境中发现的细菌和真核污染物不同，病毒污染物必须来自宿主。虽然实验室工作人员可能是污染病毒的源头，但大多数病毒是通过其他污染产品进入细胞培养的;从动物中分离出来的产品往往是病毒污染的来源。此外，有许多带有内源性病毒的细胞系可能导致污染。通常，这些内源性病毒在细胞系的永生化中起作用，并可整合到细胞基因组中。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和小鼠杂交瘤已被证明含有内源性逆转录病毒和病毒样核酸。由于污染病毒通常来自细胞培养中使用的动物产品，许多常见的外源性病毒来自生物制造中常用的动物物种。牛病毒很常见，因为使用血清;猪病毒很常见，因为使用胰蛋白酶;禽病毒很常见，因为在生物制造技术中使用鸡蛋。人类和非人类灵长类动物的病毒也是常见的污染物，通常起源于用于生产的细胞系的初始收集。人们还担心源自人类的病毒会污染医药产品。人类相关病毒可以通过使用人类来源的产品或通过受感染的实验室工作人员的污染进入细胞培养。由于其独特的生物学特性，在细胞培养中需要特别考虑逆转录病毒和逆转录病毒元件。逆转录病毒可以作为含有RNA的包膜病毒粒子存在，也可以作为整合到宿主细胞基因组中的DNA的原病毒存在。逆转录病毒也有致病的风险，因为它整合在宿主基因组的重要基因内，即使是具有整合酶的非复制性逆转录病毒制剂也有潜在的危险，尽管没有报道发生这种情况的实例。人们经常在环境和饮食中接触病毒，大多数病毒对人类没有影响;只有一小部分已知病毒对人类具有传染性。有证据表明，人们通过食物链或通过农业工作接触到多种动物病毒而没有任何疾病。尽管如此，大多数病毒在人类中的感染潜力尚不清楚，因此在评估药物产品的病毒污染时非常谨慎。5.4 朊病毒污染物朊病毒是一种完全由蛋白质组成的传染性非生物媒介。大多数哺乳动物产生一种叫做朊病毒蛋白(PrP)的蛋白质，它可以折叠成两种结构变体:PrPC和PrPSc。PrPC存在于健康个体中，而PrPSc存在于朊病毒疾病患者中。当PrPC暴露于蛋白质的PrPSc异构体时，PrPC可以转变为高度稳定的PrPSc异构体。当PrPSc在大脑内积累时，被称为TSE的神经系统疾病就会进展。PrPSc对热、清洁剂、福尔马林和高压灭菌具有很强的抗性，因此很难使感染蛋白失活。朊病毒存在于受感染动物的神经组织中，因此，无论何时将动物组织用于制药产品，都存在被污染的风险。暴露于朊病毒的人有患库鲁病、克雅氏病(CJD)、变异型CJD、致命性家族性失眠症和Gerstmann-Sträussler-Scheinker等TSE的风险，这些疾病每年在美国导致多达300人死亡。6.外源因子的检测方法基于能污染产品的外源因子的范围，有许多种类的实验通常都能用于外源因子的检测。下面描述了这些检测方法，以及它们通常使用的情况。表2列出了这些试验的摘要。表2 一种用于检测外源因子的测定方法的选择6.1 目视及显微检查虽然它们很小，但用肉眼或显微镜都可以观察到微生物的生长。细胞培养物被细菌或真菌污染可导致培养瓶内可见的生长，而浑浊的培养基通常是污染的迹象。在细胞培养过程中经常使用目视检查，因此它是一种廉价而快速的检测外源因子的方法。并非所有的外源因子都能在显微镜下看到;如果没有定向染色或使用电子显微镜，病毒甚至某些细菌都无法直观地观察到。尽管无法检测到许多类型的外源因子，但显微筛选仍然是检测外源因子的有用工具。6.2 培养细胞病变效应的检测虽然病毒太小，无法直接目测到，但可以观察到病毒复制对细胞的影响。通常，感染病毒的细胞会表现出某种形式的细胞病变效应(CPE)，这是由病毒引起的细胞形态变化。对于典型的体外CPE试验，将各种细胞系置于烧瓶中，然后用待测样品对每个细胞系进行挑战。在这一挑战之后，观察细胞，并可能进行继代培养，在大约一个月的时间内观察任何CPE的出现。CPE的常见例子包括合胞体的形成(细胞融合导致单个细胞具有多个细胞核)、细胞形状的改变、包涵体的发育、细胞变圆、细胞结块以及完全或次完全破坏。筛选CPE以检测外来病毒的优点是，该程序相对简单，费用低廉，并且不针对特定病毒，因为各种各样的病毒都可能导致某种形式的CPE。使用CPE试验的主要缺点是，一些外源性病毒只在可能不用于试验的特定细胞系中引起CPE，而其他病毒在细胞内复制时不会引起任何CPE。Berting等人报道了多种重要的外源病毒，包括牛病毒性腹泻病毒、柯萨奇病毒B3、鼠肝炎病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒和副流感病毒3，在CHO细胞中不会引起CPE。虽然大多数这些病毒不能在CHO细胞内复制，但副流感病毒3能够在CHO细胞内适度复制，而不产生任何CPE。然而，如果用小鼠星形胶质细胞代替CHO细胞，柯萨奇B3病毒能够复制并引起CPE，如细胞变圆、细胞质起泡和单层脱离，这表明需要用合适的细胞系进行测试。在筛选减毒活疫苗时，很难区分由疫苗的病毒成分引起的CPE或由污染剂引起的CPE，因此也有必要考虑正在测试的产品。此外，CPE试验只能筛选病毒的存在，而不能筛选其他类别的外来因子。与CPE检测类似的一种体外检测方法是血凝试验。许多病毒具有附着在红细胞表面的蛋白质，带有这些蛋白质的病毒悬浮液具有使红细胞聚集或凝集的能力。在血凝试验中，细胞被病毒感染，然后将红细胞加入悬浮液中。如果添加的红细胞凝集，则认为培养物血凝阳性，因此认为孔内有病毒。该试验能够在没有CPE的情况下检测病毒复制，但它需要在易感细胞系中培养一种外源性病毒。此外，并不是所有的病毒都有血凝作用，所以这种检测方法不能检测到所有类型的外源病毒。6.3 动物注射由于已知外源因子只能在高度特异性的体外条件下培养，因此体内动物试验已被用于筛选外源因子的污染。体内试验的主要优点是，试验是完全非靶向的，任何分类的外源因子都应该能够在动物体内引起疾病;动物试验是为数不多的能够检测朊病毒污染的方法之一。动物试验的主要缺点包括高成本和观察动物所需的大量时间。并非所有的外源因子都能在实验动物中引起疾病。许多危险的人类病原体，如艾滋病毒，由于其发病机制的高度特异性，无法在动物中引起疾病。此外，减少和替代动物的使用是科学的总体目标，因此使用数十只动物进行筛选在伦理上是不理想的。美国食品药品监督管理局(FDA)已经提出了使用动物进行外源性病毒检测的建议。建议使用成年小鼠、乳鼠、豚鼠、兔子和有胚胎的鸡蛋。每一种动物都被推荐用于检测不同类型的外源因子。对于成年小鼠，至少20只小鼠应腹腔和脑内接种该产品，并监测至少21天。如果低于80%的小鼠保持健康，则该产品不能使用。乳鼠的使用与成年小鼠相似，不同之处在于，乳鼠应观察14天，并将存活小鼠的组织传代到另外5只乳鼠中进行观察。对胚胎卵，接种10个卵，孵育3天。孵育后，应收集尿囊液，然后将其注射到一组新的卵中，再孵育3天。胚胎应在孵化后进行检查，卵的内容物应进行血凝试验，其中80%的卵应表现正常，不含血凝剂。还应完成对胚胎卵的额外筛选，其中另外10个卵接种该产品，然后孵育9天。胚胎在孵化后进行检查，产品通过测试，至少80%的胚胎正常。一般来说，每只在试验中死亡的动物都必须通过二次手段检测其组织中是否存在外源因子。Gombold等人对体内检测外源病毒的方法与体外方法进行了比较。用连续稀释的病毒培养液接种成年小鼠、乳鼠和有胚胎的鸡蛋，并确定体内技术能够检测到病毒的稀释度。在使用体内方法测试的11种外源病毒中，仅检测到6种。有趣的是，使用多种体外技术，所有11种外源病毒都被检测到，通常浓度远低于体内检测。这项研究对典型体内检测方法的敏感性提出了质疑，并强调了对潜在的替代筛选方法的需求。另一种可以使用的体内试验是抗体产生试验。在这个测试中，特定的无病原体动物接种被测试的产品。接种后，从这些动物身上收集血清，然后检测是否存在针对选定的外来因子的抗体。这种方法不需要动物受到外源因子的影响，因为抗体反应可以在不复制外源因子的情况下发生，但是由于抗体筛选是以有针对性的方式进行的，因此可以检测到的外源因子的数量是有限的。6.4 逆转录酶活性检测逆转录病毒的决定性特征是它能够将其RNA基因组逆转录为DNA，以便整合到宿主基因组中。负责这个过程的蛋白质叫做逆转录酶。通过检测RNA到DNA的转化，已经开发出检测逆转录酶存在的检测方法。如果检测到逆转录酶活性，则假定样品中存在逆转录病毒或逆转录病毒样元素。这些检测方法非常敏感，可以检测到低水平的逆转录病毒污染，但它们无法检测到其他形式的外源性病原体污染。一种检测逆转录酶存在的检测方法是产物增强逆转录酶(PERT)检测。在PERT分析中，将噬菌体RNA和互补引物添加到产物中并孵育。样品中的任何逆转录酶都会将噬菌体RNA转录成互补DNA (cDNA)。在孵育之后，进行PCR以充实任何存在的cDNA。添加到产物中的初始RNA将不会在此PCR步骤中被扩增。PCR扩增后，用Southern blot检测噬菌体cDNA的存在。随着方法的发展，荧光PERT (f-PERT)被开发出来，它使用qPCR检测cDNA以提高灵敏度。6.5 核酸靶向检测PCR是检测外源因子存在的一种高度敏感的方法。大多数外源因子具有可检测的核酸成分，因此PCR可用于检测病毒、细菌以及真核生物。要用PCR检测外源因子，首先必须从被测材料中提取核酸。提取后，加入目标引物和酶，然后在热循环器中孵育样品。所使用的引物的设计可以允许检测生物体的特定菌株，或者用于检测在生物体家族中保守的核酸序列。逆转录酶可以用来产生cDNA的PCR反应，允许PCR实验检测DNA或RNA。DNA通常通过扩增过程中探针水解产生的荧光来检测，这使得无需凝胶检测即可进行有效的DNA检测。从理论上讲，PCR方法能够检测到目标核酸的单个拷贝。在实践中，虽然不完美，但PCR能够以令人难以置信的高灵敏度检测外源因子核酸。Bae等建立了小鼠微小病毒、牛细小病毒和牛疱疹病毒的PCR检测方法，灵敏度分别为6.49 × 101、7.23 × 102和5.8 × 101 TCID50/mL，证明了PCR检测方法的高灵敏度。同样，Oh等人建立了逆转录酶PCR检测呼肠孤病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛副流感病毒的方法，报道的灵敏度分别为7.76 × 102、7.44 × 101和6.55 × 101 TCID10/mL。PCR通常用于检测细胞培养物的支原体污染，因为基于培养的方法可能需要长达两周的时间才能完成，而且由于细菌的大小，很难用显微镜方法检测。有许多支原体菌株可以污染细胞培养物，因此PCR测定的设计必须考虑到不同菌株之间序列的潜在差异。对于支原体的检测，引物可以瞄准基因组的保守区域，或者使用多个引物集来确保检测的敏感性。这些PCR方法已被证明是高度敏感的，Sung等人报道，他们开发的PCR方法能够在细胞培养基中检测到10 CFU/mL支原体。该方法具有灵敏度高、成本低、可在一天内完成的特点，是目前检测外源因子的首选方法之一。最近，多路复用技术的进步使得在一次PCR反应中可以检测到多种外源病毒，从而提高了样品筛选的速度。6.6 下一代测序外源因子核酸可以通过下一代测序(NGS)技术和PCR技术检测。由于NGS技术成本低、运行时间快、能够检测多种外源因子，因此目前正被探索作为检测外源因子的主要方法。由于NGS不需要靶向引物，它可以检测以前未识别的病毒，就像在环境筛选研究中经常做的那样，而且单一的NGS测定可以用来代替大量的PCR测定。NGS是指在传统Sanger测序方法之外发展起来的核酸测序方法，如杂交测序、合成测序、纳米孔测序、长读区测序等。这些方法在读取长度、读取次数和运行时间方面不断得到改进。NGS方法通常包括核酸的制备，核酸的测序，然后进行生物信息学分析。在文库制备方面，已经测试了许多选择，包括靶向DNA或RNA，富集外源因子核酸或耗尽宿主核酸的步骤。如果有特定的序列需要测序，则可以使用预定的引物进行靶向测序，或者对所有存在的核酸进行非靶向测序。有许多测序平台可以使用，包括Illumina, Oxford Nanopore Technologies, PacBio和Ion Torrent。生物信息学分析可以根据测序是否有针对性，或者你是否有针对性来修改。此外，还有一些序列数据库正在开发中，用于通过生物信息学分析检测外源病毒，如参考病毒数据库。Victoria等人完成了NGS在检测不定因子方面最值得注意的应用之一，当实验的计划目标是评估疫苗的序列时，NGS技术能够检测到外源病毒的存在。Victoria等人也对多种减毒活疫苗采用了类似的测序技术，并发现了禽白血病病毒和猿类逆转录病毒的污染。在这篇论文发表之后，许多其他研究小组已经证明了NGS技术检测外源病毒的能力。对于采用NGS平台来检测非确定因子，有一些需要克服的障碍。在大多数产品中，任何污染物都可能以极低的水平存在，特别是在含有细胞产物的产品中，并且可能需要排除宿主读取或富集污染物的方法来确保检测的灵敏度。另一个需要克服的挑战是一些测序技术所需的时间。虽然测序可以比传统的体内方法快得多，但一些NGS方法可能需要数天时间进行测序和分析，这限制了操作员的实用性。6.7 在检测外源因子时出现假阳性由于用于检测外源因子的检测方法的高灵敏度，假阳性是进行检测的小组主要关注的问题。由于额外的测试或增加的监管障碍，假阳性可能导致成本增加，因此希望确保低假阳性率。Nims等人强调，测试本身可能受到测试设备、测试试剂、测试操作人员或环境的污染。在许多研究领域中，有各种各样的实验室检测试剂污染导致假阳性的报道。与受污染的动物产品可能导致药品污染类似，使用受污染的牛血清可能导致BVDV血清学或分子检测的假阳性。如上所述，在细胞培养中生产的产品受到外源因子污染的风险较高，并且这种趋势持续到实验室试剂的生产。测试程序中使用的单克隆抗体的生产通常没有被测试的药品严格，因此可能出现假阳性。在没有污染的情况下，外源性试剂测试也可能产生假阳性。Talarico等人描述了一个假阳性检测事件，其中流感疫苗中包含的蛋白质能够引起哺乳动物红细胞的凝血。这一发现花了5个多月的时间才得到充分证实，导致疫苗生产的延误，而这本来可以通过更好地了解检测程序来避免。在检测外源因子时，有必要使用强有力的控制措施来避免检测的假阳性。7.防止外源因子污染的方法虽然本文描述了如何在药品中检测到外源因子，但最好是防止这些外源因子污染产品。这可以通过从产品中去除潜在的污染物或通过使用低风险的外源因子污染的制造方法来实现。7.1 灭活污染物传染性生物体易受各种灭活方法的影响，如热、辐射或化学处理。这些灭活方法通常用于原材料，以确保其安全，但偶尔也会用于产品本身。对原材料进行灭活的一些常见例子包括对牛胎牛血清和胰蛋白酶进行γ辐照，这是由生产材料的制造商进行的，并已被证明可以灭活污染病毒。除用于原材料外，辐照和热处理等灭活方法已被证明可有效地灭活生产过程中的外源因子。用高温短时间处理产品可以在不降解培养基结构的情况下使外源因子失活。同样，研究表明，紫外线辐射可以有效地使外源性因子失活，而培养基在培养CHO细胞时不会失去其有效性。另一种灭活外源性病原体的方法是将最终产品作为灭活产品，特别是福尔马林灭活疫苗交付。疫苗生产的一种常见做法是培养和纯化病毒，然后用福尔马林灭活病毒，作为疫苗使用。这种福尔马林灭活方法还可以灭活疫苗中可能存在的任何污染的外源因子。以前，当发现SV-40污染了一种灭活的脊髓灰质炎疫苗时，有证据表明甲醛也灭活了SV-40。7.2 采用cGMP生产程序FDA要求药品按照现行良好生产规范(cGMP)生产，以确保使用安全的生产方法。cGMP涵盖了人员、设施、设备、控制和记录等广泛的主题，并要求在产品生产的每个步骤都遵循安全的标准操作程序。不符合cGMP程序会导致产品被认为是掺假的。cGMP反映了安全生产的最低标准，是广泛的指导方针，每个工厂都可以根据需要进行调整。一般来说，使用cGMP保护产品在生产过程中不受外源因子的污染，并确保在污染发生时适当的检测方案到位。7.3 避免使用污染的试剂以前使用试剂的经验已经确定了避免污染的方法。在用于物料生产之前，可以对动物进行筛选，以确定是否存在针对常见外源因子的抗体，或者在使用前对物料进行分子方法筛选。可检测牛血清中是否存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体，该抗体的存在表明牛曾暴露于BVDV。物料也可以来自某些病毒没有自然传播的国家或地区。传统上，从新西兰和澳大利亚分离出来的FBS被认为比来自世界其他地区的FBS含有更少的外源因子。然而，最近的研究未能确定特定地理来源的FBS的优势，这表明这种做法不足以防止污染。7.4 避免使用动物/动物产品由于许多意外病原体污染的情况是通过使用受污染的动物产品发生的，因此避免使用动物产品可以降低意外病原体暴露的风险。这可以通过对制造过程进行轻微改变来实现:如果使用非贴壁细胞系，则不需要猪源性胰蛋白酶传代细胞。通过修改培养基也可以避免在培养中使用FBS，尽管所需的修改取决于所培养的细胞系。这种培养基被称为无动物源性培养基(AOF)、无血清培养基(SFM)或无异种培养基。目前受益于AOF或SFM的主要领域之一是间充质干细胞的培养，FDA已批准在涉及间充质干细胞培养的临床试验中使用SFM。使用无血清细胞培养技术是一种新兴的方法，随着成本的降低和方法的改进，它可能会被广泛采用。或者，如果产品可以设计成在非哺乳动物细胞培养中生产，那么外源因子污染的风险就会降低。与哺乳动物细胞培养相比，酵母或细菌的发酵受到外源因子污染的风险较小，因为酵母的病原体通常不是人类的病原体。通过对分泌的胰岛素原分子进行修饰，可以利用酿酒酵母发酵产生胰岛素。这种修改允许在发酵培养中生产重组人胰岛素，而不是从屠宰动物的胰腺中分离胰岛素。最近，在单克隆抗体生产领域也取得了类似的进展，允许通过毕赤酵母培养生产单克隆抗体。目前的努力集中在确保酵母产生的抗体的适当糖基化，以允许充分的功能，但进步可能导致单克隆抗体治疗生产不需要哺乳动物细胞培养。8.结语随着新疗法的发展，为了保证药品的安全性，需要有效地检测出外源因子。没有一种现有的方法能够持续地检测大范围的潜在污染外源因子。需要安全的生产过程和有效的样品筛选，以确保在人们面临不良健康事件风险之前预防或发现外来物质污染。原文来源：A history of adventitious agent contamination and the current methods to detect and remove them from pharmaceutical products识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

疫苗

2022-06-28

·PRNewswire

United States Human Vaccines Markets, 2018-2021 & Forecast to 2028: Approval/launches of the New Vaccines / Rising Focus on Immunization Programs / Increasing Investments and Government Support

DUBLIN, June 28, 2022 /PRNewswire/ -- The "United States Human Vaccines Market Size, Share, Top 45 Human Vaccines Brand In-depth Analysis, Emerging Trends, Current Analysis, Growth, Demand, Opportunity, and Forecast 2022 - 2028" report has been added to ResearchAndMarkets.com's offering. Amid the COVID-19 crisis, the United States human vaccines market is poised to grow by US$ 31,517 million by 2028, accelerating at a CAGR of 7% during the forecast period. The prominent factors that are expected to contribute to the growth of the United States human vaccines market: Increased Disease Awareness Approval/launches of the New Vaccines Rising Focus on Immunization Programs Increasing Investments and Government Support for the Vaccines Development The report contains a deep analysis of the United States human vaccines market size in terms of value. The report provides a clear insight into current and future developments of the United States vaccines market. The report also explores the detailed analysis, insights of the top 45 vaccines market assessment in the United States from 2018 to 2021, and forecasts to 2028. The report also details the latest information about the vaccine's pricing analysis, insights, and trends, and the regulatory framework of the United States human vaccines market. After conducting thorough research on the historical and current growth parameters, the growth prospects of the United States human vaccines market are obtained with maximum precision. This new 2022 market report provides a holistic analysis of the entire United States human vaccines market. The report offers the most up-to-date industry data on the actual market situation and future outlook for the United States' human vaccines market. The report also tracks and analyses competitive developments, including collaboration, partnership deals, distribution, exclusive and licensing agreements, new vaccine developments, and R&D activities in the market. The report also delivers an in-depth analysis of evolving market trends, drivers, and restraining forces that influence the growth of the market. The report also analyses detailed profiles of innovative and leading players with information on business overview, companies' vaccines portfolio, promising vaccines in the clinical development, and the newest developments The report will serve as a source for a 360-degree analysis, thoroughly integrating different models. This Newest and Comprehensive the United States Human Vaccines Market Research Report 2022 Delivers: Comprehensive Research Methodology of the United States Human Vaccines Market Detailed and Extensive Market Overview with Key Analyst Insights Insights about Market Determinants that are Stimulating the United States Human Vaccines Market To Analyze the Historical Growth in the Market Size of the United States Human Vaccines Market from 2018 to 2021 To Estimate and Forecast the Market Size of the United States Human Vaccines Market from 2022 to 2028 and Growth Rate until 2028 Detailed Insights of the Top 45 Human Vaccines Market Value Used in the U.S. with Six Years Forecast An Insightful Analysis of the Top 45 Vaccines Brand Market Share and Y-o-Y Growth Rate Delivers All-inclusive Insights on the Latest Pricing Analysis, Insights, and Trends Delivers an In-Depth Analysis of Evolving Market Trends, Drivers, and Restraints of the United States Human Vaccines Market An Insightful Investigation has been done on Promising Human Vaccines in the Clinical Development Delivers Comprehensive Insights into the Regulatory Framework of the United States Human Vaccines Market Tracks Competitive Developments, Approaches, Recent Industry Developments, Partnership, Collaboration Deals, Distribution, Exclusive, and Licensing Agreement A Comprehensive List of the Leading Companies along with the Analysis of their Current Vaccines Portfolio, Promising Human Vaccines in the Clinical Development, and Present Development The Report Helps Answer the Following Questions: What is the current scenario of the United States human vaccines market? What is the total market size and forecast (until 2028) of the United States human vaccines market? How big is the United States human vaccines market? At what CAGR is the U.S. human vaccines market projected to grow in the forecast period (2022-2028)? What are the leading human vaccines? What are their revenue potentials to 2028? Which human vaccine brand provides the highest market share? What is the regulatory framework in the United States vaccines market? What are the key factors driving the United States human vaccines market? What are the key challenges of the United States human vaccines market? What are the major deals and agreement happenings in the United States human vaccines market? What are the United States human vaccines pricing trends and analysis? What are the various human vaccines available in the United States? Who are the topmost market players? What are their happenings, current developments, and scenarios? How is the market predicted to develop in the future? Key Topics Covered: 1. Executive Summary 2. United States Human Vaccines Market Size and Forecast (2018 - 2028) 3. United States Human Vaccines Brand Market Share and Y-o-Y Growth (%), 2018 - 2028 4. Key Market Growth Drivers and Challenges in the United States Human Vaccines Market 4.1 Key Market Growth Drivers 4.2 Key Market Challenges 5. United States Top 45 Human Vaccines Market Value Analysis, Insights and Forecasts, 2018 - 2028 5.1 Daptacel 5.2 Quadracel 5.3 Kinrix 5.4 Vaxelis 5.5 IPOL 5.6 Vaqta 5.7 Havrix 5.8 Twinrix 5.9 Engerix B 5.10 PedvaxHIB 5.11 ActHIB 5.12 Hiberix 5.13 MenQuadfi 5.14 Tenivac 5.15 Imovax 5.16 FluMist Quadrivalent 5.17 Prevnar 13 5.18 Gardasil 9 5.19 Fluzone Quadrivalent 5.20 Flublok 5.21 Flucelvax Quadrivalent 5.22 Afluria Quadrivalent 5.23 Fluad 5.24 Varivax 5.25 Menactra 5.26 Proquad 5.27 Pneumovax 23 5.28 Fluarix 5.29 FluLaval 5.30 M-M-R II 5.31 Adacel 5.32 Boostrix 5.33 Bexsero 5.34 Menveo 5.35 Trumenba 5.36 Shingrix 5.37 Pentacel 5.38 Recombivax HB 5.39 Rotateq 5.40 Rotarix 5.41 Pediarix 5.42 Infanrix 5.43 Heplisav-B 5.44 TDVAX 5.45 BioThrax 5.46 Other Vaccines 6. United States Human Vaccines Pricing Analysis, Insights and Trends 7. Regulatory Framework of the United States Human Vaccines Market 8. Major Deals and Agreement Happenings in the Human Vaccines Market 8.1 Merger & Acquisitions 8.2 Collaboration Deals 8.3 Licensing Agreement 8.4 Exclusive Agreement 8.5 Distribution Agreement 8.6 Partnership Deals 9. Leading Companies in the United States Human Vaccines Market 9.1 Sanofi Pasteur 9.1.1 Business Overview 9.1.2 Human Vaccines Portfolio 9.1.3 Promising Human Vaccines in the Clinical Development 9.1.4 Recent Development 9.3 Merck 9.4 Pfizer 9.5 Seqirus (CSL Limited) 9.6 AstraZeneca 9.7 Dynavax Technologies Corporation 9.8 Emergent BioSolutions Inc. For more information about this report visit Media Contact: Research and Markets Laura Wood, Senior Manager [email protected] For E.S.T Office Hours Call +1-917-300-0470 For U.S./CAN Toll Free Call +1-800-526-8630 For GMT Office Hours Call +353-1-416-8900 U.S. Fax: 646-607-1904 Fax (outside U.S.): +353-1-481-1716 Logo: SOURCE Research and Markets

疫苗并购

100 项与 b型流感嗜血杆菌结合疫苗(Merck Sharp & Dohme) 相关的药物交易

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外链

KEGG	Wiki	ATC	Drug Bank
-	-	J07AG01	-

研发状态

10 条最早获批的记录,

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适应症	国家/地区	公司	日期
嗜血杆菌感染	美国	Merck Sharp & Dohme LLC	1989-12-20

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临床结果

适应症

分期

评价

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研究	分期	人群特征	评价人数	分组	结果	评价	发布日期


NCT04978818 (CTgov)	临床4期	嗜血杆菌感染	333	PedvaxHIB (PedvaxHIB Arm)	淵獵顧醖壓繭糧憲蓋選(顧齋襯淵繭衊選壓鑰鑰) = 壓鹽遞膚餘鏇蓋艱襯壓鏇蓋醖餘選艱醖範構願 (窪繭鹹願鬱網繭鹽積選, 衊繭艱鹽夢餘夢鑰蓋淵 ~ 廠鬱壓膚鏇網鬱鬱艱淵) 更多	-	2024-06-24
				Vaxelis (Vaxelis)	淵獵顧醖壓繭糧憲蓋選(顧齋襯淵繭衊選壓鑰鑰) = 製鑰簾選廠繭鏇鏇網壓鏇蓋醖餘選艱醖範構願 (窪繭鹹願鬱網繭鹽積選, 選醖齋膚廠製願糧襯鏇 ~ 蓋蓋餘蓋餘獵餘鹽醖醖) 更多
NCT01545375 (CTgov)	临床2期	链球菌感染 \| 耳感染 \| 中耳炎	1,806	Pneumococcal vaccine GSK2189242A+PedvaxHIB®+Prevnar 13® (dPly-PhtD Group)	廠衊構築夢艱顧醖願餘(範憲淵齋餘廠廠壓鹽構) = 鬱獵積鏇選簾淵選衊簾簾衊鏇膚遞淵淵淵窪壓 (糧鬱艱觸積鑰願積齋廠, 遞淵膚壓齋艱製憲餘繭 ~ 艱顧鏇鏇艱齋簾膚獵遞) 更多	-	2017-09-12
				Placebo+PedvaxHIB®+Prevnar 13® (Control Group)	廠衊構築夢艱顧醖願餘(範憲淵齋餘廠廠壓鹽構) = 鬱蓋衊衊鹹艱蓋製餘壓簾衊鏇膚遞淵淵淵窪壓 (糧鬱艱觸積鑰願積齋廠, 糧糧顧選鬱壓願鬱蓋齋 ~ 繭鏇糧積構選鹹繭製鬱) 更多
NCT01337167 (V419-005, CTgov)	临床3期	细菌感染 \| 病毒感染	1,473	DAPTACEL™+V419+PedvaxHIB™+RotaTeq™+Prevnar 13™ (V419)	範構簾憲觸積選憲窪窪(構餘淵網繭積積衊艱觸) = 築鏇觸餘範遞鹹鹹艱獵鹹繭壓夢鏇構衊遞窪糧 (製範簾構鏇製顧膚襯醖, 鬱窪選製窪獵繭鬱鏇鹹 ~ 膚願夢鏇製製醖遞壓顧) 更多	-	2016-03-16
				ActHIB™+DAPTACEL™+PENTACEL™+Recombivax HB vaccine+RotaTeq™+Prevnar 13™ (Control)	範構簾憲觸積選憲窪窪(構餘淵網繭積積衊艱觸) = 蓋衊窪鬱觸艱範糧觸糧鹹繭壓夢鏇構衊遞窪糧 (製範簾構鏇製顧膚襯醖, 鏇鑰顧製選願觸鬱顧築 ~ 淵願簾艱壓簾選衊衊鹽) 更多
NCT00289913 (V251-068, CTgov)	临床4期	甲型肝炎 \| 破伤风	1,274	Infanrix+PedvaxHIB+VAQTA (VAQTA™, PedvaxHIB™ and Infanrix™/ VAQTA™ (Stage 1))	襯淵製願鑰簾構夢膚淵(蓋積繭鬱衊廠選齋夢憲) = 淵製範積糧壓鹹繭積築鑰遞鬱鏇鹹遞壓齋襯襯 (鹹顧鹹醖選齋鹹選築衊, 醖蓋願築醖艱鹽窪構簾 ~ 窪簾範憲構鏇繭餘鹹觸) 更多	-	2011-07-07
				Infanrix+PedvaxHIB+VAQTA (PedvaxHIB™ and Infanrix™/ VAQTA™/ VAQTA™ (Stage 1))	襯淵製願鑰簾構夢膚淵(蓋積繭鬱衊廠選齋夢憲) = 顧選製廠廠夢鏇糧簾網鑰遞鬱鏇鹹遞壓齋襯襯 (鹹顧鹹醖選齋鹹選築衊, 糧醖壓艱鬱蓋鹹願餘醖 ~ 壓構淵鏇鹹簾繭夢鹹窪) 更多