Amatuximab

近期，美国国家卫生研究院癌症研究所的研究团队在华人抗体协会旗下期刊Antibody Therapeutics（影响因子：4.5）上发表了题为“Recent Advances in Structural Investigations of Cancer Antigen Mesothelin and Its Interactions with Therapeutic Antibodies ”的综述。该综述概述了肿瘤相关抗原mesothelin(MSLN,间皮素) 自身及其与治疗性抗体相互作用的最新结构研究进展。 论文全文可点击：https://doi.org/10.1093/abt/tbaf028 Mesothelin是多种癌症的免疫治疗靶点 Mesothelin是主要在间皮细胞表面表达的一种糖蛋白，在正常组织中的表达量有限；然而在间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌等多种人类肿瘤细胞表面过度表达，因而被视为治疗这些肿瘤的潜在靶点而备受关注。在细胞外基质蛋白酶的作用下，mesothelin可从细胞表面被切割脱落并高度富集在肿瘤组织和体液中，进而作为一种有效的肿瘤检测标志物，其应用前景十分看好。 尽管mesothelin的确切生物学功能及其在细胞表面表达的原因仍不清楚，目前已提出其四种功能：(i) 异型细胞黏附，其依据是mesothelin可以结合CA-125。CA-125 是一种已知的癌抗原，呈递于黏蛋白16 (MUC16) 上。Mesothelin可与CA-125相互作用，促进异质细胞黏附，进而推动肿瘤的着床及播散。这种相互作用涉及MUC16 的 N-连接糖链，并且可以被单克隆抗体阻断。(ii)胰腺腺癌中mesothelin表达水平较高，且其过量表达可促进癌细胞迁移，表明mesothelin参与癌症进展。(iii) 有研究表明，mesothelin过表达可能通过减少细胞凋亡而赋予癌细胞对紫杉醇等化疗药物的耐药性。(iv)在应激条件下，mesothelin介导肝脏、肺和肾脏的纤维化。 靶向mesothelin的免疫治疗策略正受到深入研究，包括单克隆抗体，免疫毒素、抗体药物偶联物，和CAR-T細胞等。临床研究结果表明，在细胞外基质蛋白酶作用下被切割脱落的mesothelin是导致抗体类药物效果欠佳的主要原因。解析mesothelin及其治疗性抗体的结构并深入理解他们之间的相互作用是推动生物靶向药物研发的关键一环。本综述详细总结了当前关于mesothelin自身及其治疗性抗体的结构研究进展并展望今后发展方向。 Mesothelin的结构特征 经过多个实验室历经多年的反复尝试后，mesothelin的截短体（MSLN-64 和 MSLN-207，Fig 1. A）晶体结构先被解析出来，进而为解析全长mesothelin晶体结构的相位问题提供了方案。全长mesothelin (fl-MSLN，Fig 1. B and C) 是一个由24个a螺旋层叠形成的“J”形右手超螺旋状结构；此外，其三个预测的N-糖基化位点均在结构中被证实存在糖链修饰。对多个mesothelin结构分析的结果表明，mesothelin的N段结构域十分刚性稳定，具有强免疫原性，因而更利于诱导抗体产生。而C段则相对柔软灵活，免疫原性较弱（Fig. 1C）。Mesothelin的另一个结构特征是模块化结构，这使得各个区域可以被分别体外表达，作为免疫原用于抗体的诱导和筛选。这些关于mesothelin结构上的认知，将对其功能机制的深入研究以及新型单克隆抗体的开发起到重要推动作用。 图1: Mesothelin的结构。(A) MSLN-207的结构（PDB：7U8C，包括Mesothelin的前207个氨基酸，即mesothelin前体序列中的296-501区段）。整个结构中的17个a螺旋被标注为H1到H17，三个模块化区域由不同颜色表示。（B）MSLN-245的结构（PDB：8CX3，即mesothelin前体的氨基酸残基299-543区段）。三个N-糖基化位点上的糖链以棒状模型显示并标注。（C）将6个MSLN-245分子对比显示，C端区域相对比较灵活存在差异。 Mesothelin和治疗性抗体的复合物结构 正如mesothelin结构特征所预言的那样，绝大多数研发报道的mesothelin抗体都结合在其N端结构域。目前，有6个不同抗体与mesothelin的复合物结构已分别被X射线晶体学解析，按他们在mesothelin上的结合位点从N端到C端排列下来依次是MORAb-009 (Fig. 2 A, 2B and 2F)，3C9-VH domain (Fig. 2 C and 2D), Anetumab (Fig. 2 G), 1A12 (Fig. 2 E and 2G), 15B6 (Fig. 2H) and RO4 (9p4c.pdb).除了MORAb-009和3C9-VH domain在mesothelin上的结合位点有部分重疊之外，其他的抗体在mesothelin上的结合位置没有重叠。值得指出的是抗体15B6和RO4的结合位点在mesothelin 的C-末端结构无序区域（氨基酸582-598），这段序列也富集了主要的蛋白酶水解位点。靶向该序列的抗体15B6和RO4可以保护mesothelin免受蛋白酶切割从细胞表面脱落，从而提高了抗体的效率。 图2：Mesothelin与不同抗体形成的复合物的结构。（A）抗体MORAb-009与mesothelin截短体MSLN-64（mesothelin前64个氨基酸）的复合物结构。（B）抗体MORAb-009与全长mesothelin的复合物结构。（C）抗体3C9-VH domain与mesothelin的复合物结构。（D）抗体3C9-VH domain自身在与mesothelin结合时形成的二聚体结构。（E）Mesothelin与抗体1A12形成的复合物结构。（F）Mesothelin与两种抗体，MORAb-009和1A12，同时结合形成的复合物结构。（G）Mesothelin截短体（氨基酸442-589）与两种抗体，Anetumab和1A12，同时结合形成的复合物结构。（H）Mesothelin的C末端结构无序区域（氨基酸582-598）与抗体15B6形成的复合物结构。 Mesothelin与CA-125的相互作用 癌抗原 125（CA-125，也称为 MUC16）是一种细胞膜表面的黏蛋白，由多个串联的结构域组成：一个含约 12,000 个氨基酸、富含 O-糖基化的 N 端结构域；一个由 60 多个串联重复（每个 156 个氨基酸）组成并带有 N-糖基化的重复结构域；一个由 16 个串联 SEA结构基序（每个约 120 个氨基酸）组成的结构域；一个跨膜结构段；以及一个较短的（32 个氨基酸）细胞内尾部。已有的研究报道，CA-125 上的 N-糖基化修饰对其与 mesothelin 的结合至关重要。Mesothelin与CA-125的相互作用可被抗体 MORAb-009 所阻断，并且可能受到 mesothelin 本身 N-糖基化的影响。 近期，通过解析一个将mesothelin截短体MSLN-64（含MSLN前64个氨基酸）与 MUC16 的第 10 个 SEA 结构基序（SEA10）融合在一起的融合蛋白的晶体结构，研究者在理解MSLN与CA-125 相互作用的化学本质方面取得了重要进展。晶体结构显示，MSLN-64/SEA10融合蛋白以“头-尾”方式与晶体对称分子结合，而非自我缔合，SEA10在mesothelin上的结合位点与 MORAb-009 部分重叠，且不涉及糖链。 图3: MSLN与MUC16的相互作用。（A）融合蛋白MSLN-64/SEA10的结构。MSLN-64上与SEA10相互作用的氨基酸残基以棒状模型显示，包括：Y318， W321和E324。(B) 两个融合蛋白MSLN-64/SEA10形成二聚体的结合方式。虚线框出的是MSLN-64与SEA10 的相互作用界面。(C) MSLN-64/SEA10 的结合界面细节。左图：SEA10以卡通模型展示，其中接触MSLN-64的关键残基侧链以棒状模型展示，并叠加在按静电势着色的MSLN-64 表面图上。右图：MSLN-64 以卡通模型展示，其中接触SEA10的关键残基侧链以棒状模型展示，并叠加在按静电势着色的 SEA10 表面图上。 总结和未来展望 Mesothelin因在多种上皮来源肿瘤中高表达而成为重要的治疗靶点。尽管其生物功能尚不完全明确，多个具有高亲和力与稳定性的抗体已被开发并进入临床研究。已有的结构研究为揭示mesothelin可能的生物学功能，与不同抗体的相互作用模式、以及设计更高效的抗体与CAR-T 产品提供了坚实基础。未来的重点将围绕：深化mesothelin的功能研究，开发具有更高稳定性、亲和力及体内活性的抗体与细胞疗法，从而推动mesothelin 靶向治疗在癌症临床应用中的进一步突破。 期刊简介 《Antibody Therapeutics》是华人抗体协会（ChAbS）的旗下期刊，由牛津大学出版社（Oxford University Press）出版。作为一本同行评审的开放获取期刊，Antibody Therapeutics 为全球科学界提供了一个平台，用于发表治疗性抗体在发现、研究、开发及相关方法学方面的最新进展与挑战。该期刊已被ESCI（影响因子=4.5）、Scopus（CiteScore=8.4）及PubMed Central等主要文献数据库收录。 期刊官网： https://academic.oup.com/abt

-01-引言随着医学从传统的框架转向更个性化的癌症治疗方法，有必要认识肿瘤特异性抗原。其中最著名的间皮素（mesothelin）是一种糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的细胞表面糖蛋白，在许多癌症中过度表达。间皮素最初是通过与卵巢癌细胞表面反应的抗体来识别卵巢癌中新的细胞表面标记物时发现的。间皮素在正常组织中的表达有限，在几种肿瘤细胞中过表达，因此间皮素是肿瘤特异性治疗的理想靶点。在使用人表皮样癌细胞系表达间皮素的临床前研究中，用放射性标记的单克隆抗体K1进行的生物分布分析显示，对抗原表达肿瘤具有良好的肿瘤定位和特异性。迄今为止，几种免疫治疗方法，尤其是抗间皮素抗体偶联药物，已成功用于治疗表达间皮素的实体瘤，包括卵巢癌、胰腺癌和恶性间皮瘤，而间皮素靶向嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗也显示出显著的抗肿瘤效应。针对间皮素的靶向治疗和免疫治疗表现出良好的应用前景。-02-一、间皮素的结构和功能间皮素基因位于染色体16p13，间皮素基因MSLN包含17个外显子，cDNA长约2138bp，含有1884bp的开放阅读框，编码628个氨基酸的前体蛋白（69 kDa）。该前体蛋白可被弗林（furin）蛋白酶水解为两个部分：40 kDa大小片段的间皮素和31 kDa大小的分泌片段，称为巨核细胞集落刺激因子（MPF）。与许多GPI锚定蛋白一样，间皮素也会脱落，从而产生可溶性间皮素相关肽（SMRP），这些肽通常被用作检测恶性间皮瘤的标志物。由于细胞外环境中存在多种蛋白酶，间皮素可以在不同的细胞外位点被切割，在表达间皮素的细胞上，有七个主要的切割位点靠近膜端，导致产生膜结合的截短间皮素。GPI连接的蛋白质通常参与细胞信号传导和粘附，因此间皮素可能在这些生物过程中发挥作用。间皮素在正常生理条件下的确切作用尚不清楚。MSLN敲除的小鼠具有正常的发育和生殖能力，表明间皮素功能不是生命所必需的。然而，在MSLN基因敲除小鼠中，间皮膜的超微结构受到影响，这表明间皮素可能在形成肿瘤微环境中发挥作用。与野生型小鼠相比，MSLN基因敲除小鼠腹腔内癌细胞的生长显著减少。补充间皮素或MPF刺激MSLN基因敲除小鼠的生长可促进肺癌生长，这些支持了间皮素在肿瘤细胞粘附、迁移和转移中的作用。-03- 二、间皮素在癌症和信号传导中的作用间皮素在许多实体瘤中均有表达，最常见于间皮瘤、上皮性卵巢癌和胰腺癌，但也见于肺和子宫恶性肿瘤以及胆管癌。间皮素在卵巢癌和间皮瘤中的表达最高，较高的表达与晚期肿瘤分期和较高的转移率相关。在IV期结直肠癌中，间皮素的高表达与化疗耐药性、侵袭性和不良预后直接相关。相比之下，胰腺癌的数据似乎表明，尽管间皮素有表达，但与癌症侵袭性无关。这表明间皮素的表达及其与预后和肿瘤侵袭性的关系具有肿瘤特异性。间皮素的相互作用蛋白是CA125/MUC16，它是粘蛋白家族的一员，在卵巢癌和恶性间皮瘤中表达。CA125/MUC16和间皮素之间的相互作用在体外介导异型细胞粘附，因此被认为是卵巢肿瘤腹膜转移的潜在机制。CA125/MUC16与间皮素的结合通过SGK3/FOXO3信号通路下调DKK1（Dickkopf-1，WNT信号通路抑制剂），进而促进迁移。阻断CA125/MUC16和间皮素结合能够恢复DKK1水平并防止卵巢癌转移。可溶性间皮素与表面锚定间皮素结合，通过ERK1/2（细胞外信号调节激酶）、Akt和JNK（c-Jun N-末端激酶）信号通路触发基质金属蛋白酶-7（MMP-7）的表达，导致迁移和侵袭增强。间皮素在卵巢癌细胞中的过表达也有类似的效果，并与MMP-7表达显著相关。此外，间皮素与CA125/MUC16结合也通过胰腺导管腺癌中的p38 MAPK途径触发MMP-7表达。另外，与间皮素沉默的细胞系相比，过度表达间皮素的胰腺癌细胞系显著增加了增殖，加快了细胞周期进程。间皮素的过表达导致STAT3的组成性激活，导致细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白E/细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）复合物的表达增加，以及更快的G1-S转换。-04-三、间皮素靶向疗法间皮素由于在正常组织中表达有限，在几种恶性肿瘤中过表达，因此是靶向治疗的理想候选。几项针对间皮素的免疫治疗药物临床试验的结果已被证明是安全的，这些药物包括免疫毒素疗法、单克隆抗体、疫苗、抗体偶联药物、CAR-T细胞、CAR-NK细胞和α靶向疗法。单克隆抗体和免疫毒素SS1P是一种抗间皮素免疫毒素，是一种基于抗体的细菌毒素疗法。该重组蛋白由与假单胞菌外毒素a有效载荷连接的小鼠Fv片段组成。尽管该毒素耐受性良好，并表现出显著的抗肿瘤活性，但其疗效受到中和抗体的限制。LMB-100是第二代免疫毒素，包括人源化抗间皮素Fab片段和改良的假单胞菌外毒素a有效载荷，尽管其设计的免疫原性较低，但LMB-100同样受到了抗抗体的限制。在间皮瘤中，与单独治疗相比，LMB100和抗PD-1抗体治疗的结合提高了疗效。对于表达间皮素的实体瘤，这两种方法仍需结合化疗进行研究。Amatuximab（MORAb-009）是一种针对间皮素的单克隆抗体，破坏细胞粘附并引发抗体依赖性细胞毒性。已完成的I期和II期临床试验结合化疗确定了抗肿瘤效果和最大耐受剂量。Amatuximab治疗增加了对吉西他滨的敏感性，降低了肝脏中c-Met和AKT的表达，同时降低了胰腺癌细胞转移率。疫苗GVAX是一种粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）肿瘤细胞疫苗，表达多种抗原，并通过交叉启动机制诱导抗肿瘤免疫反应，以招募抗原呈递细胞，间皮素被确定为GVAX治疗的靶点之一。人们因此开发了表达间皮素的单核细胞增生性李斯特菌疫苗（CRS-207），CRS-207在受感染抗原呈递细胞的胞浆中分泌间皮素，由主要组织相容性复合体（MHC）处理和呈递，从而刺激免疫反应。一项II期研究使用CRS-207联合GVAX和常规化疗治疗转移性胰腺癌患者，提高了总生存率；然而，一项随访的IIb期研究显示，生存率与化疗相似。CRS-207耐受性良好，几乎没有不良事件。抗体偶联药物Anetumab-ravtansine是一种ADC，由人源化抗间皮素抗体与DM4（一种maytansinoid微管蛋白抑制剂）偶联而成，显示出对表达间皮素的肿瘤细胞的有效杀伤作用。对晚期实体瘤患者进行的I期试验表明，anetumab-ravtansine可以安全地用于患者，并支持其抗肿瘤疗效。其他第一和第二阶段试验正在进行中。临床前研究表明，在卵巢癌模型中与标准化疗联合使用时，抗肿瘤效果得到显著改善。DMOT4039A是一种人源化抗间皮素单克隆抗体与单甲基auristatin E（MMAE）偶联的ADC，具有抗有丝分裂作用，在I期临床试验中显示出良好的安全性。另一种ADC BMS-986148是与微管溶素偶联，可破坏微管组装并诱导凋亡，在实体瘤中进行了评估。BMS-986148单独治疗或与PD-1抑制剂nivolumab联合治疗的1/2a期研究得出结论，具有可管理的安全性和临床活性，需要与其他检查点抑制剂联合进行进一步的临床试验。CAR-T细胞间皮素靶向CAR-T细胞的临床前研究显示，肿瘤显著减少。I期研究表明，以间皮素为靶向的CAR-T细胞耐受性良好，靶向非肿瘤效应很小，但临床活性有限。有许多正在进行的试验研究实体瘤中间皮素靶向的CAR-T细胞。CAR-T细胞通常针对单一抗原设计，然而，靶向两种抗原的串联CAR-T细胞可能比靶向单一抗原的CAR-T细胞更有效，具有更高的抗肿瘤效果。这些串联CAR-T细胞可以识别多个抗原，并已用于血液系统恶性肿瘤，例如同时针对BCMA和CD38治疗多发性骨髓瘤。靶向肿瘤特异性上调的分子间皮素和叶酸受体1（FOLR1）的串联CAR-Ts同时具有IL-12分泌活性，与抗间皮素CAR-Ts相比具有更高的浸润性和持久性，并且IL-12的分泌增强了卵巢癌的治疗效果并减少了肿瘤抗原逃逸。这些数据表明，通过识别多个肿瘤相关抗原可能改善CAR-T细胞的效果。与CAR-T细胞类似，自然杀伤（NK）细胞也可以表达嵌合抗原受体，并且可能比CAR-T细胞更有效。在一项关于卵巢癌的研究中，CAR-NK细胞被设计识别间皮素，与亲代NK细胞治疗相比，通过增加细胞因子分泌，CAR-NK细胞在消除间皮素+癌细胞方面是有效的。在使用抗间皮素NK细胞对抗胃癌的体外研究中，与转导的NK细胞相比，间皮素NK细胞在杀死间皮素+肿瘤和分泌细胞因子方面更具选择性，并且能够延长异种移植小鼠的存活率。双特异性抗体双特异性T细胞接合器一个靶向效应细胞（最常见的是T细胞上的CD3），另一个靶向肿瘤抗原。这些双特异性抗体将T细胞的细胞毒性作用导向特定的肿瘤细胞。HPN536是一种三特异性T细胞激活结构，被用于治疗表达间皮素的实体瘤。除了与CD3和间皮素结合外，HPN536还与血清白蛋白结合，以增加该分子的血浆半衰期。在食蟹猴的体内研究中，HPN536具有良好的耐受性，并表现出间皮素依赖的药代动力学。目前，HPN536正在进行治疗实体瘤的I期临床试验（NCT0387206）。艾伯维的ABBV-428是另一种双特异性抗体，专为MSLN依赖性CD40激活而设计。由于CD40具有强大的免疫刺激作用，在某些情况下，全身毒性可能成为临床应用的挑战。因此，绝大多数CD40激动剂抗体需要交联作用，例如抗体Fc结构域与免疫细胞表面FcγR的结合，通过肿瘤抗原结合诱导交联和CD40激活。ABBV-428已被证实在肿瘤抗原存在时，能有效激活CD40，目前针对实体肿瘤的I期临床试验正在进行中。靶向阿尔法疗法靶向阿尔法疗法（TAT）代表了一种新兴的靶向癌症疗法，它利用阿尔法粒子的高能发射，在DNA中引发永久性双链断裂，最终导致细胞死亡。靶向钍-227结合物（TTC）代表一种TAT亚型，由共价连接的3,2-HOPO螯合剂与特定抗体组成，以确保钍-227传递到表达间皮素的细胞。间皮瘤、卵巢癌和乳腺癌中的特异性间皮素TTC，BAY 2287411，在PDX模型中，在体外和体内均显示出抗肿瘤效力。BAY 2287411的细胞反应包括增加DNA双链断裂、氧化应激和凋亡标记物。这项研究的结果支持BAY 2287411开展一期临床试验，以治疗卵巢癌和间皮瘤。-05-结语鉴于间皮素在肿瘤细胞中的过表达和在正常组织中的低表达，间皮素是肿瘤特异性免疫治疗的理想靶点。目前，尚无靶向间皮素的药物获批上市，多款靶向间皮素的药物处于临床阶段，包括ADC、单抗、CAR-T、CAR-NK、疫苗和抗体核素药物，这些药物将为MSLN阳性肿瘤的治疗带来希望。参考资料：1.Mesothelin: An Immunotherapeutic Targetbeyond Solid Tumors. Cancers (Basel). 2022 Mar; 14(6): 1550.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。