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会议推荐 2026第三届中国医药企业项目管理大会 2026第二届中国AI项目管理大会 2026第十五届中国PMO大会 2026第五届中国项目经理大会 本 文 目 录 1、Reviews | 共价药物发现研究进展(一) 2、Reviewsl共价药物发现研究进展(二) 3、Nature综述:共价药物发现的最新进展 4、Nature Reviews DrugDiscovery | 共价药物发现进展  一、Reviews | 共价药物发现研究进展(一) （原创 PeptidETS 药思享） 尽管担心反应性，但共价的潜在好处激发了药物化学家探索共价药物空间。在许多情况下，反应性、选择性和效力之间的折衷产生了安全有效的药物。我们在此讨论的关键示例（图 1 和表 1）包括布鲁顿酪氨酸激酶 (BTK) 抑制剂依鲁替尼 (AbbVie) 和表皮生长因子受体 (EGFR) 抑制剂奥希替尼 (AstraZeneca)，销售额总计 84.3 亿美元和2020 年为4.33 亿美元。此外，通过共价修饰的有效抑制使传统上“不可药物”的蛋白质成为可能，例如 sotorasib (Amgen) 的批准，它是一种突变 KRAS(G12C) 的抑制剂，一种 GTP 酶，抵抗了数十年的药物发现努力 (图1）。与此同时，更传统的蛋白酶活性位点共价靶向药物继续产生有价值的药物，如尼玛瑞韦（辉瑞公司），它可以抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）主要蛋白酶（Mpro）（图1）。 靶向共价抑制剂通常是通过结构导向设计发现的，即通过将亲电试剂掺入配体中，否则该配体将可逆地结合靶蛋白。掺入的亲电试剂不可逆地与靶蛋白上的氨基酸结合，除了已经发挥作用的可逆相互作用外，还引入了共价相互作用。 共价配体筛选是另一种越来越普遍的配体发现方法，其中使用各种方法从亲电子化合物库中发现共价配体。这种“亲电优先”的方法部分得益于化学蛋白质组学平台的发展，该平台能够快速识别共价配体的靶标和选择性分析。将共价配体筛选和化学蛋白质组学的进展与结构生物学相结合，以增强药物化学的能力，有可能产生选择性结合具有挑战性的蛋白质靶标的分子。 在这篇综述中，我们首先简要强调共价药物的历史例子及其作用机制。然后，我们详细阐述了过去十年共价药物发现的里程碑，根据所采用的发现方法对我们的讨论进行了分类.最后，我们总结了新兴共价药物发现技术的工具箱，重点是筛选策略和选择性分析。  共价药物的历史 含有蛋白质反应性官能团的化合物在药物化学中经常被避免，并被排除在化合物筛选集合之外，因为它们可能会干扰测定和脱靶杂乱。许多历史上共价药物的例子在其广泛使用后被发现通过共价机制发挥作用。其中最突出的一种是非甾体抗炎药 (NSAID) 阿司匹林，它自 1899 年开始上市（图 1）。阿司匹林的作用机制直到 1971 年才被发现，当时人们发现它通过乙酰化环氧合酶 1 的底物结合通道中的 Ser529 发挥抗炎作用，阻止底物花生四烯酸转化为前列腺素。 早期的共价药物也往往来源于或受天然来源的启发。由青霉属真菌产生的 β- 内酰胺类抗生素如青霉素（图 1）与参与细菌细胞壁合成的青霉素结合蛋白 (PBP) 结合。所有 PBP 都含有可被青霉素酰化的活性位点丝氨酸残基，抑制 PBP 活性并导致细胞膜破裂。另一种共价抗生素是含环氧化物的磷霉素（图 1），它由一些链霉菌产生，通过与 UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-烯醇丙酮酸转移酶 (MurA) 的催化半胱氨酸反应破坏肽聚糖合成并诱导膜破裂。 一些共价药物是含硫醇代谢物的前药，可形成二硫键以使其靶标失活。1988年美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗胃食管反流病的质子泵抑制剂奥美拉唑（图1）就是一个例子，也是一种在其作用机制之前上市的药物作用被理解为是共价的。奥美拉唑和氯吡格雷（图 1）是一种用于预防中风和心脏病发作的抗血小板药物，它们都被肝脏中的细胞色素 P450 酶激活以产生具有生物活性的硫醇代谢物。 共价药物在癌症治疗中也具有历史意义。嘧啶核苷类似物 5-氟尿嘧啶 和吉西他滨是分别用于抑制胸苷酸合酶和核糖核苷酸还原酶 I 的前药，用于治疗多种癌症（图 1）。硼替佐米（图 1）是一种二肽硼酸，可共价结合并抑制 26S 蛋白酶体的催化苏氨酸残基，于 2003 年被 FDA 批准用于治疗多发性骨髓瘤患者。 共价药物已被用于治疗多种疾病。然而，从项目开始就关注共价性，而不是事后发现共价作用机制，为改进药物设计提供了机会。该领域的最新工作展示了共价药物发现工具如何为其他难以解决的药物发现挑战提供解决方案。 二、Reviewsl共价药物发现研究进展(二) （原创 PeptidETS 药思享） 大家好，今天接着上次推送Reviews || 共价药物发现研究进展（一），继续去学习：亲电体优先方法的发现与共价药物发现工具箱 一、基于亲电体优先方法的发现 1.1 共价 KRAS(G12C) 抑制剂 共价 KRAS(G12C) 抑制剂的发现和开发激动人心。KRAS 是一种编码 GTP 酶的致癌基因，在大约 25% 的所有癌症中发生突变，尤其是在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中。野生型 KRAS 在活跃的 GTP 结合状态和非活跃的 GDP 结合状态之间受到调节，但许多 KRAS 突变会减弱 GTPase 活性，导致 GTP 水解率低和 RAS 信号传导升高，从而驱动肿瘤发生。自近 30 年前发现 KRAS 在癌症中的作用以来，尝试直接使用传统药物发现方法对其进行药物治疗的尝试一直未成功。KRAS 没有可用于可逆抑制剂结合的口袋，竞争性抑制剂需要克服 GTP 和 GDP 的皮摩尔结合亲和力，对野生型 KRAS 有活性的抑制剂可能显示出靶向毒性。 针对 G12C 突变体的共价 KRAS 抑制剂之所以有吸引力，有几个原因。首先，靶向突变 KRAS 可以对癌细胞产生选择性细胞毒性。其次，通过共价结合实现的亲和力将是有利的，因为 KRAS 缺乏易于配体的口袋。第三，NSCLC 中 12-14% 的 KRAS 突变是 KRAS G12C，这是一个有希望的患者群体，可直接受益于 KRAS(G12C) 抑制。最后，KRAS 中的第 12 位紧挨着效应器结合区和核苷酸结合袋的下方，表明共价 KRAS（G12C）配体可能影响 KRAS 功能。 2013 年，加利福尼亚大学旧金山分校的研究人员报告了第一个选择性共价突变体 KRAS（G12C）抑制剂。抑制剂（他们研究中的化合物 12）是通过称为 tethering 的二硫键片段筛选方法发现的，其中使用完整蛋白质质谱 (MS) 针对 GDP 结合状态的 KRAS (G12C) 筛选 480 个二硫键片段库。KRAS(G12C) 的共晶结构表明，与开关 II 区域结合的化合物，以及随后将二硫键部分交换为丙烯酰胺和乙烯基磺酰胺亲电子试剂，从而产生了在体外有活性的 KRAS(G12C) 抑制剂，包括化合物12. 化合物 12 与开关 II 口袋的结合通过将核苷酸亲和力从有利于 GTP 转变为 GDP 来损害 KRAS 信号传导，并导致 KRAS 在其非活性状态下积累。 这种选择性 KRAS(G12C) 抑制的新机制为临床共价 KRAS(G12C) 抑制剂的开发奠定了基础。2016 年，Wellspring Biosciences 披露了 ARS-853，这是一种 KRAS(G12C) 的选择性共价抑制剂，在低微摩尔范围内具有纤维素功效。化合物 12 的结构导向优化和使用基于细胞液相色谱和串联质谱 (LC-MS/MS) 的分析来确定 H358 细胞中 KRAS(G12C) 的参与程度，得到 ARS-853。KRAS（G12C）依赖性细胞系中的 ARS-853 处理降低了活性 KRAS（G12C）的量，抑制下游 RAS 信号传导并诱导细胞凋亡。尽管 KRAS(G12C) 被认为是组成型活性的，但 ARS-853 与 GDP 结合的非活性 KRAS(G12C) 的选择性结合提供了 KRAS 突变体在 GTP 结合状态和 GDP 结合状态之间循环的证据。 为促进体内研究，合成了ARS-1620，克服代谢稳定性和生物利用度限制。ARS-1620基于新型喹唑啉核心支架，设计用于更好地占据开关II袋，因此，加强了丙烯酰胺亲电体和半胱氨酸之间共价反应的更有利构象。最终，ARS-1620被确定为第一个适用于体内研究的KRAS（G12C）抑制剂，并在200 mg kg处理的KRAS（G12C）患者衍生异种移植物模型中显示出疗效−1每天一次或每天两次。这一系列KRAS（G12C）抑制剂的效力增加和体内模型的成功表明，可能设计出临床有效的药物。 Sotorasib (AMG-510)（表 1）是第一个于 2018 年进入临床试验的选择性 KRAS(G12C) 抑制剂，由 Amgen 开发，建立在与 Carmot Therapeutics 合作的发现基础上，其中定制的小分子库共价针对 KRAS(G12C) 筛选结合半胱氨酸。通过这次合作确定的分子导致在 KRAS（一个神秘的口袋）上发现了一个以前未知的口袋，安进的科学家们利用它通过基于结构的设计发现了 sotorasib。Sotorasib 旨在通过与 His95、Tyr96 和 Gln99相互作用来占据神秘的口袋。一项调查 sotorasib 的 II 期临床试验于 2020 年成功完成，随后于 2021 年 5 月获得 FDA 批准用于治疗患有 KRASG12C 突变的局部晚期或转移性 NSCLC 的成人。其他共价 KRAS(G12C) 抑制剂正在进入临床试验。Adgrasib (MRTX849) 来自 Mirati Therapeutics 和 Array BioPharma 之间的联合药物发现合作，其中确定了 KRAS(G12C) 的不可逆共价抑制剂； Mirati Therapeutics 随后使用基于结构的设计方法来优化 adagrasib，该方法于 2019 年 1 月进入临床试验（图 3）。 JNJ-74699157（ARS-3248；J&J 和 Wellspring Biosciences）正在对表达 KRASG12C 的多种晚期实体瘤患者进行研究，包括 NSCLC 和结直肠癌，但其临床试验已终止。 设计小分子共价 KRAS (G12C) 选择性抑制剂提供了一种优雅的解决方案，可以为无法药物治疗的癌症靶点提供药物。在 KRAS（G12C）抑制剂之前，最近在肿瘤学中发现的靶向共价抑制剂大多是使用配体优先方法鉴定的。共价 KRAS(G12C) 抑制剂的成功验证了共价药物发现的亲电优先方法，并肯定了共价片段筛选技术的重要性（下文讨论）。优化从共价筛选平台中出现的初始命中化合物（例如化合物 12）可以随后导致产生有效共价抑制剂（例如 sotorasib）的程序。此外，sotorasib 的故事表明，在其他疾病中，关键蛋白质靶点经历氨基酸被半胱氨酸残基取代，共价抑制剂提供了一种越来越有效的方法，有可能为患者提供精准治疗。 1.2SARS-CoV-2 主要蛋白酶抑制剂 2021年12月，美国食品药品监督管理局(FDA)发布了辉瑞公司帕洛韦(nirmatrelvir 和利托那韦的组合)的紧急使用授权，用于治疗成人和一些儿童患者的轻度至中度2019冠状病毒疾病(由 SARS-CoV-2引起) ，标志着该疾病首次获得批准的口服治疗。Nirmatrelvir (表1)共价抑制 SARS-CoV-2的 Mpro 。本节着重介绍如何通过添加半胱氨酸反应性共价功能基团来靶向蛋白酶活性位点，以及基于结构的化学改造，将活性较低的肽模拟物适应于有效和选择性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。 SARS-CoV-2 是一种具有单链 RNA 基因组的病毒，它编码两种多蛋白（pp1a 和 pp1ab）以及结构蛋白和辅助蛋白。病毒复制依赖于半胱氨酸蛋白酶 Mpro（也称为 3CLpro）将 pp1a 和 pp1ab 成功切割成功能性病毒蛋白。SARS-CoV-2 Mpro 共价抑制剂的发现源于对 SARS-CoV-1 蛋白酶抑制剂的广泛研究，在 2002-2003 年 SARS1 爆发期间，研究人员使用与六肽基氯甲基酮共价半胱氨酸反应性抑制剂结合的同源猪传染性胃肠炎冠状病毒 (TGEV) Mpro 的晶体结构，为设计针对 SARS-CoV-1 的Mpro共价抑制剂提供了基础。由于所有 Mpro 的同源性，这项工作促成了 rupintrivir (AG7088) 的发现，它是一种基于机制的人鼻病毒 (HRV) Mpro 抑制剂。 由于 SARS-CoV-1 缓和，开发冠状病毒 Mpro 抑制剂的工作放缓，直到 2019 年出现 SARS-CoV-2。SARS-CoV2 Mpro 与 SARS-CoV-1 Mpro 具有 96% 的序列同一性，并且有 100% 的序列催化位点的重叠 。对改进以前的氯甲基酮抑制剂的新兴趣促使研究人员将 rupintrivir 改编为 SARS-CoV-2 Mpro 抑制剂，其效力足以获得共晶结构。这一发现反过来又使得能够鉴定含有α-羟甲基酮的抗病毒药物 PF-00835231，它在基于荧光共振能量转移 (FRET) 的活性测定中证明了有效的 SARS-CoV-2 Mpro 抑制作用，在基于抗病毒细胞的测定中具有活性，血浆稳定性和体内低清除率。 在随后的研究中，PF-00835231 的口服生物利用度通过将 α-羟甲基酮部分替换为腈基团而得到改善，腈基团也可以作为亲电体。腈可以共价结合特别具有反应性的亲核试剂；然而，硫代亚胺酯加合物中硫醇的消除容易使腈类比其他一些亲电子试剂（例如丙烯酰胺）更可逆。PF-00835231 的优化最终产生了 PF-07321332，命名为 nirmatrelvir（图 4 和表 1），它是一种高效的 SARS-CoV-2 可逆共价抑制剂，在基于 FRET 的检测中显示出对所有人类冠状病毒的有效抑制，而对人半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶没有抑制作用。在小鼠适应的 SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2 MA10) 模型中证明了 nirmatrelvir 的体内功效。 在 2021 年 11 月发布的 II/III 期临床试验数据中，Paxlovid 被证明在预防有症状患者进展为严重 COVID-19 方面非常有效。这种针对 COVID-19 的口服生物可利用药物的出现将有助于改善高危人群中未住院患者的病情。总体而言，SARS-CoV-2 Mpro 共价抑制剂作为单一疗法或与其他抗病毒药物联合使用，为治疗冠状病毒感染提供了有希望的途径。 上文所介绍的蛋白酶抑制剂快速适应选择性靶向 SARS-CoV-2 Mpro 就是一个使用基于结构的设计，同时考虑到共价药物特性的例子。 1.3 其他抑制剂 HCV NS3/4a protease inhibitors Covalent proteasome inhibitors Other boron- containing drugs Mutant- haemoglobin modulators 二、共价药物发现工具箱 2.1 筛选平台 2.2 化学蛋白质组学发现 化学蛋白质组学平台能够直接在复杂的生物系统中识别靶蛋白上的共价化合物及其相应的可配位点。化学蛋白质组学的进步促进了针对无法成药的疾病靶点的共价配体的发现，并使共价配体在整个蛋白质组中的选择性分析能够识别这些配体的靶标和脱靶标。在这里，我们在与药物发现相关的最近工作的背景下讨论反应性配体热点的化学蛋白质组学分析、ABPP 筛选平台和目标识别。化学蛋白质组学实验可以提供有关配体选择性的关键信息，并为选择共价药物发现计划的目标提供早期指导。 图5 | 同位素串联正交蛋白水解-基于活性的蛋白质分析。A | 活性蛋白质分析(ABPP)反应探针的实例，该反应探针由与分析手柄连接的广泛反应性亲电弹头设计。B | 竞争性 isoTOP-ABPP (同位素串联正交蛋白水解-基于活性的蛋白质分析)方法的示意图。用蛋白质反应性化合物处理细胞或裂解物可防止泛反应性探针的后续结合，而这种竞争性配体结合可在富集步骤后通过串联质谱法(MS/MS)检测，以间接鉴定感兴趣化合物的共价蛋白质靶标。TEV，烟草蚀刻病毒。 三、Nature综述:共价药物发现的最新进展 （原创 张虎 AIDDPro）共价药物包含一个轻度反应性的官能团，该官能团与蛋白质靶标形成共价键，除了参与药物结合的非共价相互作用外，还赋予额外的亲和力。在过去的30年中，共价药物的合理设计引起了人们越来越多的兴趣，共价靶向非保守氨基酸以增加选择性已然常见。共价药物的长期靶向结合可提供独特的药效学特征和特殊的效力。 图1：主要共价药物开发的时间表 1 共价药物史 在药物化学中经常避免使用含有蛋白质反应性官能团的化合物，并且由于其潜在的测定干扰和脱靶混杂效应，将其从化合物筛选收集中排除。早期的共价药物也倾向于来源于天然物质。青霉素类β-内酰胺类抗生素（图1）由青霉属真菌产生，与青霉素结合蛋白(PBPs)结合，PBPs参与细菌细胞壁的合成。所有PBPs均含有可被青霉素酰化的活性位点丝氨酸残基，抑制PBP活性并导致细胞膜破裂。 一些共价药物是具有含巯基代谢产物的前体药物，通过形成二硫键使其靶点失活。质子泵抑制剂奥美拉唑（图1）于1988年被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗胃食管反流病，也是一种在其作用机制被了解为共价之前上市的药物。 共价药物在历史上也在癌症治疗中具有重要意义。嘧啶核苷类似物5-氟尿嘧啶和吉西他滨是前体药物，分别用于抑制胸苷酸合成酶和核糖核苷酸还原酶I，治疗广泛的癌症（图1）。 2 共价EGFR抑制剂 受体酪氨酸激酶EGFR的过度活性驱动非小细胞肺癌(NSCLC)的进展，使EGFR成为肿瘤的关键药物靶点。在21世纪初的临床开发期间，发现可逆性第一代EGFR抑制剂吉非替尼和厄洛替尼（图2a）对携带EGFR体细胞激活突变（外显子19缺失或L858R点突变）的肿瘤有效，这些突变发生在10-30%的NSCLC患者中。然而，这些患者的疾病最终仍进展；EGFR ATP结合位点的门控残基突变不仅会降低许多可逆性抑制剂对EGFR的结合亲和力，还会增加EGFR对ATP的结合亲和力。 图2：EGFR抑制剂结构的进展 共价第二代抑制剂是通过与丙烯酰胺Michael受体结合，与EGFR中的半胱氨酸残基(Cys797)发生反应。除了对T790M的中度活性外，共价第二代抑制剂延长了对EGFR信号转导的抑制，表明这些共价EGFR抑制剂可能比可逆的第一代抑制剂（如厄洛替尼）更有效。阿法替尼（勃林格殷格翰）于2013年获得FDA批准，作为携带EGFR激活突变的转移性NSCLC患者的一线治疗。 继阿法替尼之后的第三代EGFR抑制剂；这些共价抑制剂选择性靶向T790M突变体而非野生型EGFR，包括WZ4002（Dana–Farber癌症研究所）、奥希替尼和rociletinib(Clovis Oncology；CO-1686)（图2c）。这些化合物保持丙烯酰胺基团共价结合Cys797，但将第一代和第二代化合物的喹唑啉基团交换为嘧啶，以促进对突变型EGFR(T790M)的选择性。与野生型EGFR相比，T790M的亲和力更高，不仅可有效治疗EGFR门控突变癌症，还有助于改善安全性特征，使奥希替尼的推荐剂量高于阿法替尼。奥希替尼于2015年被FDA加速批准作为NSCLC的二线治疗药物，并于2018年被批准作为转移性NSCLC的一线治疗药物。 3 共价BTK抑制剂 由于BTK在B细胞受体下游的关键作用，BTK成为慢性淋巴细胞白血病的关注靶点。B细胞受体的激活通过Lyn和Syk激酶诱导BTK的磷酸化，并最终激活与B细胞增殖、分化、细胞迁移和粘附相关的转录因子。在B细胞发育中的关键作用表明BTK是B细胞恶性肿瘤的相关靶点。 伊布替尼于2013年获得FDA批准用于治疗套细胞淋巴瘤，之后用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)、华氏巨球蛋白血症和慢性移植物抗宿主病。与EGFR抑制剂相似，伊布替尼可与BTK中靠近ATP结合位点的半胱氨酸残基(Cys481)结合，并且由于只有少数激酶具有同源半胱氨酸，因此伊布替尼对BTK的选择性高于其他激酶。伊布替尼的快速清除（其半衰期为2-3h）也可以实现激酶选择性；由于长时间的共价结合，伊布替尼应该保持对BTK的活性，而脱靶的可逆性抑制最小化。 4 共价KRAS(G12C)抑制剂 KRAS是一种gtp酶编码癌基因，在约25%的所有癌症中发生突变，最显著的是胰腺癌、结直肠癌和肺癌。野生型KRAS在活性GTP结合状态和非活性GDP结合状态之间受到仔细调节，但许多KRAS突变减弱GTP酶活性，导致GTP水解率较低和RAS信号传导升高，驱动肿瘤发生。KRAS没有可供可逆性抑制剂结合的口袋，竞争性抑制剂需要克服GTP和GDP的皮摩尔结合亲和力，对野生型KRAS有活性的抑制剂可能表现出靶向毒性。 2013年，加州大学旧金山分校的研究人员报道了首个突变选择性共价KRAS(G12C)抑制剂。2016年，Wellspring Biosciences披露了ARS-853，它是KRAS(G12C)的选择性共价抑制剂，在低微摩尔范围内具有细胞疗效。最终，ARS-1620被确定为第一个适用于体内研究的KRAS(G12C)抑制剂，并在KRAS(G12C)患者来源的异种移植模型中显示出疗效，给药剂量为200 mg kg-1每天一次或每天两次。 设计小分子共价KRAS(G12C)选择性抑制剂为药物提供了一种优雅的解决方案，使癌症靶标具有稳健性。在KRAS(G12C)抑制剂之前，最近发现的肿瘤靶向共价抑制剂主要使用配体优先方法确定。共价KRAS(G12C)抑制剂的成功验证了共价药物发现的亲电优先方法，并肯定了共价片段筛选技术的重要性。 5 SARS-CoV-2主要蛋白酶抑制剂 2021年12月，FDA发布了辉瑞Paxlovid（nirmatrelvir和利托那韦的复方制剂）的紧急使用授权，用于治疗成人和一些儿童患者的轻中度COVID-19，标志着该疾病的首个获批口服治疗药物。SARS-CoV-2 Mpro与SARS-CoV-1 Mpro的序列同源性为96%，催化位点的序列重叠率为100%。对改进以前的氯甲基酮抑制剂重新产生了兴趣，促使研究人员将rupintrivir适应到SARS-CoV-2 Mpro抑制剂中，该抑制剂的效力足以获得共晶结构。 在随后的研究中，通过用腈基取代α-羟甲基酮基团来提高PF-00835231的口服生物利用度。腈可以共价结合特别反应性的亲核试剂；然而，硫代酰亚胺加合物中巯基消除的便利性使腈比其他一些亲电试剂（如丙烯酰胺104）更可逆。对PF-00835231进行优化最终得到PF-07321332，命名为nirmatrelvir，其为高效SARS-CoV-2可逆性共价抑制剂，在所有人冠状病毒的FRET试验中显示出强效抑制作用，而对人半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶未观察到抑制作用。总体而言，SARS-CoV-2 Mpro共价抑制剂作为单药治疗或与其他抗病毒药物联合治疗冠状病毒感染提供了一条有前景的途径。 6 共价蛋白酶体抑制剂 基于α-酮酰胺的共价抑制剂已被开发用于通过抑制NS3/4a治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染，NS3/4a是一种丝氨酸蛋白酶，可将HCV多聚蛋白裂解为复制所需的多种非结构蛋白。硼替佐米是首个获得FDA批准的含硼药物，并于2003年获批用于治疗多发性骨髓瘤。硼替佐米是通过优化含醛蛋白酶体底物肽而发现的，为发现HCV NS3/4a抑制剂（如特拉匹韦）开创了先例。将醛电泳交换为硼酸可显著提高蛋白酶体抑制的效力。硼替佐米的作用来自硼酸与20S蛋白酶体β5亚基N端苏氨酸的羟基共价结合，从而抑制蛋白酶体的糜蛋白酶样活性。硼替佐米可利用血液学癌症（如多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤）对蛋白酶体抑制敏感性增加的优势。 7 共价药物发现筛选方法的比较 8 总结 在过去十年中，共价药物发现的进展导致了成功的药物，包括EGFR、BTK、KRAS(G12C)和SARS-CoV-2 Mpro的抑制剂。 采用亲电优先发现策略代表了该领域的一个显著转变。当已知现有的可逆性配体在亲核氨基酸（如半胱氨酸）附近结合时，配体优先策略将继续高度适用于设计针对蛋白质的共价药物。未来预计亲电优先方法将越来越多地使用，特别是当可逆配体的发现被证明具有挑战性时。 四、Nature Reviews DrugDiscovery | 共价药物发现进展  （原创 医药速览 医药速览） 共价药物用于治疗疾病已有一个多世纪的历史，而促进共价药物合理设计的工具最近才出现。Nature Reviews Drug Discovery上发表了题为“Advances in covalent drug discovery”的综述文章，阐述了过去十年共价药物发现的里程碑，总结了新兴共价药物发现技术的工具箱。 01 共价药物的历史 历史上许多共价药物都是在它们已经被广泛使用后才被发现通过共价机制起作用，其中最突出的是阿司匹林。 此外，早期的共价药物也倾向于来自或受到自然来源的启发。青霉菌产生的β-内酰胺类抗生素，如青霉素，与参与细菌细胞壁合成的青霉素结合蛋白(PBPs)结合。 一些共价药物是含有硫醇代谢物的前药，这些代谢物形成二硫键以灭活其靶标。如质子泵抑制剂奥美拉唑，于1988年被FDA批准用于治疗胃食道反流病。 在癌症治疗中，嘧啶核苷类似物5-氟尿嘧啶和吉西他滨分别是用于抑制胸苷合成酶和核糖核苷酸还原酶I的前药。Bortezomib是一种与26S蛋白酶体的苏氨酸催化残基共价结合并抑制其活性的二肽硼酸，于2003年被FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤患者。 共价药物已被用于治疗各种疾病。而从一开始就关注共价性，而不是在事后发现共价作用机制，往往可以更好改进药物设计。 图1 主要共价药物开发时间表 02 共价药物发现方法 1、配体优先方法 将中等活性的亲电官能团加入到已知的可逆配体中，以加强对蛋白质功能的抑制。这些化合物往往需要在反应性、活性和选择性之间取得平衡。 代表例子是EGFR共价抑制剂。第一代可逆的EGFR抑制剂Gefitinib和Erlotinib被发现对含有EGFR体细胞激活突变的肿瘤有效，然而随着T790M突变，不仅降低了许多可逆抑制剂与EGFR的结合亲和力，而且还增加了EGFR与ATP的结合亲和力。 为了克服这一问题，共价第二代抑制剂被战略性地设计为与丙烯酰胺迈克尔受体反应，与EGFR中的半胱氨酸残基(Cys797)反应。Cys797位于ATP结合位点附近，EGFR配体与EGFR的不可逆结合部分恢复了对T790M关守突变体的活性。 第三代EGFR抑制剂紧随阿法替尼之后，这些共价抑制剂选择性地针对T790M突变体而不是野生型EGFR，包括WZ4002、Osimertinib和Rociletinib。这些化合物保持丙烯酰胺基团与Cys797共价结合，但将第一代和第二代化合物的喹唑啉部分交换为嘧啶，以提高突变EGFR(T790M)的选择性。 共价EGFR抑制剂的成功验证了将非催化、非保守的半胱氨酸与激酶活性部位相邻的半胱氨酸共价结合的方法，以提高最初可逆配体的效力并调节其药效学。除此之外，具有代表性的还有BTK抑制剂ibrutinib，JAK3抑制剂feogatinib等。 图2 EGFR抑制剂结构的进展 2、亲电优先方法 该方法意味着从最初的发现过程就植根于寻找共价配体，而不是将共价结合到已知的可逆配体中。关键药物包括KRAS (G12C)抑制剂sotorasib和SARS-CoV-2 MPRO抑制剂nirmatrelvir。 基于KRAS靶点治疗癌症，直接使用传统药物发现方法均未成功。KRAS没有用于可逆抑制剂结合的口袋，竞争性抑制剂需要克服GTP和GDP的皮摩尔结合亲和力，而对野生型KRAS有活性的抑制剂可能显示出靶向毒性。而针对G12C突变体的共价KRAS抑制剂具有吸引力有几个原因。首先，靶向突变的KRAS可以对癌细胞产生选择性的细胞毒作用。其次，由于KRAS缺乏易于连接的口袋，因此通过共价结合实现的亲和力将是有利的。第三，NSCLC中12-14%的KRAS突变是KRASG12C，这是一个有希望的患者群体，将直接受益于KRAS(G12C)抑制。最后，KRAS中的第12位位于效应器结合区和核苷酸结合口袋的下方，这表明共价KRAS(G12C)配体可能影响KRAS的功能。 2013年，研究人员报告了第一个突变选择性共价KRAS(G12C)抑制剂。该抑制剂是通过一种称为tethering的二硫键片段筛选方法发现的。在此基础上综合代谢稳定性、生物利用度等方面优化的结果，ARS-1620被确定为第一个适用于体内研究的KRAS(G12C)抑制剂。这一系列KRAS(G12C)抑制剂效力的提高和体内模型的成功表明，设计临床有效的药物是可能的。Sotorasib(AMG-510)是2018年进入临床试验的第一个选择性KRAS(G12C)抑制剂，其中针对KRAS(G12C)筛选了一个共价结合半胱氨酸的定制小分子文库。 设计小分子共价KRAS(G12C)选择性抑制剂为给无法用药的癌症靶点提供了一种解决思路。在KRAS(G12C)抑制剂之前，最近在肿瘤学中发现的靶向共价抑制剂大多是通过配体优先的方法确定的。共价KRAS(G12C)抑制剂的成功验证了亲电优先发现共价药物的方法，并肯定了共价片段筛选技术的重要性。 03 共价药物发现方法 1、筛选平台 许多新兴的共价配体筛选平台涉及基于MS的检测，这是通过化合物与蛋白质之间形成共价键实现的。还使用了其他表型、DNA编码或计算方法，然后将其与基于MS的验证、基于ABPP的实验配对，以告知选择性和结构生物学，从而实现药物化学。 表1总结了最突出的共价筛选方法。亲电片段类化合物商业文库的增长是这些亲电优先发现策略兴起的关键因素。 表1共价药物发现筛选方法比较 2、化学蛋白质组学的发现 化学蛋白质组平台可以直接在复杂的生物系统中鉴定共价化合物及其对应的靶蛋白上的可配位位点。化学蛋白质组学的进展促进了针对不可药物的疾病靶点的共价配体的发现，并使跨蛋白质组的共价配体的选择性图谱能够识别这些配体的靶点和非靶点。 3、亲核共价配体 大多数蛋白质反应性共价药物往往是亲电的，以便与亲核氨基酸发生反应。相比之下，亲核药物可以与亲电辅助因子和翻译后修饰发生反应。几种含肼的化合物作为单胺氧化酶(MAO)A和B的基于机制的抑制剂，从而被MAO激活使黄素辅因子能够烷基化，从而抑制酶。ABPP原理和“反极性”探针已被用来研究亲电翻译后修饰。基于联氨的探针也被用来帮助识别和表征具有亲电辅助因子或翻译后修饰的蛋白质的配体。 4、赖氨酸导向的共价配体 半胱氨酸的低丰度使选择性成为可能，但限制了以共价方式靶向特定感兴趣蛋白质的机会。这个问题促使科学家研究其他亲核氨基酸的靶向，特别是赖氨酸。由于赖氨酸的ε-氨基在生理条件下的亲核性很低，因此发现高效的赖氨酸靶向共价配体需要鉴定异常活性的赖氨酸。结合全面的电泳谱、赖氨酸导向的化学蛋白质组学和结构导向的方法，科学家将能够利用配体结合位点附近丰富的赖氨酸残基来促进共价药物的发现。 04 总结 过去十年里，共价药物有了成功的进展，包括EGFR、BTK、KRAS(G12C)和SARS-CoV-2 MPRO的抑制剂。这些药物的批准代表了里程碑，展示了共价药物发现从偶然的努力演变为具有既定成功路线的领域。在可逆共价机制中，活性和选择性之间平衡的研究将会继续。亲电优先发现策略的采用代表了该领域的一个显著转变。我们相信，共价配体独特的特性将继续推动共价药物的发现与发展。 end 本公众号声明： 1、如您转载本公众号原创内容必须注明出处。 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1957年，伦敦国立医学研究所的病毒学家阿利克·艾萨克和瑞士裔同事让·林登曼正在研究一个看似平凡的现象：为什么细胞感染一种病毒后，就不容易被第二种病毒感染？这个被称为“病毒干扰”的现象，自1930年代就被观察记录，但原因成谜。 他们设计了一个精妙的实验：用热灭活的流感病毒先处理鸡胚绒毛尿囊膜细胞，再将这些细胞破碎，提取其中的液体，添加到新鲜的细胞培养中。然后，他们用活的水泡性口炎病毒攻击这些新鲜细胞。 按照当时的主流观点，热灭活的病毒不可能在新鲜细胞中复制，因此不应该有任何保护作用。然而，令人困惑的结果出现了：那些接受了“处理过”细胞提取液的新鲜细胞，竟然真的抵抗了活病毒的攻击！ 两人面面相觑。这不可能来自残留的灭活病毒，那么，细胞里究竟产生了什么物质，能够“干扰”后续病毒的感染？经过一系列严谨的排除实验，他们得出一个革命性的结论：被病毒感染的细胞，会释放出一种可溶性的、能够传递给其他细胞、使其获得抗病毒能力的“因子”。 1957年，他们在《英国皇家学会学报》上发表了这一发现，并将其命名为 “干扰素” 。这个平淡无奇的名字下，隐藏着人类对抗病毒和癌症的全新武器库的第一把钥匙。当时没有人能预料到，这个源于基础研究的好奇心，将开启生物制药史上最艰辛、最昂贵，也最富戏剧性的篇章之一。 1 “白色黄金”的炼金术: 前基因工程时代的艰难求索 干扰素的发现激起了科学界的巨大热情。它似乎提供了一个理想的抗病毒方案：一种由人体自身细胞产生的天然防御物质，理论上应该高效且低毒。然而，通往临床应用的道路上横亘着一座几乎无法逾越的大山：如何获得足够用于治疗的干扰素？ 在1970年代，生产干扰素的过程堪称一场“现代炼金术”，其成本与难度令人咋舌： 原料的奢侈：最初，科学家发现人白细胞——主要是血液中的白细胞层（“白膜层”）——是干扰素-α的良好来源。这意味着，生产原料是人血。芬兰科学家卡里·坎特尔发展了一套相对高效的方法：用仙台病毒刺激从献血者血液中分离出的白细胞，诱使其产生干扰素。但即便如此，产量也低得可怜。 数字的震撼：据估算，从4.5万升人血（约需6万名献血者）的白细胞中，仅能提取出约0.4克纯度不足1%的干扰素粗品。为了治疗一名癌症患者一个疗程，可能需要数百名献血者的血液。其稀缺性和生产成本，使其价格一度远超黄金，被誉为 “白色黄金”。 应用的悲壮：由于数量极度有限，早期的干扰素临床试验充满了悲壮色彩。它被优先用于那些常规治疗全部失败、濒临死亡的癌症患者。剂量微小，疗效不确定，但这是绝望中的唯一曙光。1970年代和80年代初，干扰素治疗成了医学界一个既充满希望又令人心酸的符号——它代表了一种革命性的治疗理念，却被现实的生产技术牢牢锁在实验室的保险柜里。 这场“炼金术”的困境，清晰地暴露了传统生物提取法的极限，也催生了对技术革命的迫切呼唤。 2 基因工程的救赎与“多面手”的证明 转机出现在生物技术革命的黎明。1970年代末至1980年代初，重组DNA技术（基因工程）日趋成熟。科学家们开始思考：如果能找到编码干扰素的基因，将其插入细菌或哺乳动物细胞中，不就可以像工厂一样大规模生产了吗？ 这是一场激烈的国际竞赛。多家生物技术公司（如基因泰克、百健）和学术机构投入巨资。1979–1980年，多个团队几乎同时克隆出第一个人干扰素基因。到1982年，采用基因工程大肠杆菌生产的重组人干扰素-α 首次进入临床试验。这是历史性的一刻：曾经比黄金还贵重的物质，终于有可能实现工业化、规模化生产。生物制药的新纪元，随着干扰素的量产而真正开启。 有了充足的“弹药”，医学家们开始系统地探索干扰素这位“多面手”的真正实力。临床试验的结果，描绘出一幅复杂而振奋人心的图景： 1. 对抗血液肿瘤的“奇兵”： 干扰素最早获得确凿胜利的领域是某些血液肿瘤。1980年代中期，研究表明，高剂量的干扰素-α对毛细胞白血病——一种罕见但难治的B细胞肿瘤——疗效显著，能诱导大部分患者获得长期缓解乃至接近治愈。对于慢性髓性白血病，干扰素-α也能诱导部分细胞遗传学缓解，在格列卫问世前，它是重要的治疗选择。此外，它对滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等也有一定作用。其抗肿瘤机制复杂，包括直接抑制肿瘤细胞增殖、增强免疫细胞（如NK细胞、巨噬细胞）的杀伤活性、抑制血管生成等。 2. 抗击慢性病毒感染的“主力”： 干扰素的本职是抗病毒，它在这一领域确立了长达二十余年的统治地位。 · 慢性乙型肝炎：干扰素-α（特别是聚乙二醇化长效剂型）能够抑制乙肝病毒复制，促使部分患者实现e抗原甚至乙肝表面抗原（HBsAg）清除±抗-HBs阳转（即“临床治愈”），疗效持久。 · 慢性丙型肝炎：干扰素-α联合利巴韦林，曾是数十年间全球唯一的丙肝标准疗法。尽管治愈率（约40%-60%不等，取决于基因型）远非完美，且副作用显著，但它为数百万患者延缓了肝硬化、肝癌的进程，守住了生命防线。 干扰素的临床应用远不止于此，它还曾用于治疗尖锐湿疣（一种HPV病毒感染）、卡波西肉瘤（一种与HIV相关的肿瘤）等。 然而，这位“多面手”有着一张众所周知的、令人望而生畏的“价签”——其副作用谱。 几乎所有患者都会经历类似重流感的“急性反应”：高烧、寒战、剧烈头痛、肌肉酸痛。长期治疗则可能导致持续疲劳、抑郁、食欲不振、骨髓抑制（白细胞、血小板减少）、甲状腺功能紊乱，甚至诱发自身免疫性疾病。患者们常常形容干扰素治疗是一场“与魔鬼的交易”：用数月乃至数年的极度不适，去换取一个不确定的、延缓疾病进展的机会。许多患者因无法耐受而中途放弃。 3 辉煌谢幕： 被更精准的武器取代的传奇 科学和技术从不停止进步。干扰素疗法虽然有效，但其广谱激活式的机制（诱导细胞产生数百种抗病毒与免疫调节蛋白）和显著的副作用，促使科学家寻找更精准、更温和的武器。 在丙肝战场，这场更替尤为彻底和迅速： 2011年，直接抗病毒药物特拉匹韦和博赛匹韦上市，与干扰素联合，首次将部分基因型丙肝的治愈率提升至接近70%。这仅仅是开始。2013年，索磷布韦——一种高效、高耐药屏障的NS5B聚合酶核苷类似物抑制剂——的横空出世，敲响了干扰素疗法在丙肝领域的丧钟。以索磷布韦为基础的全口服、无干扰素方案，在随后的几年里将丙肝的治愈率推向了惊人的95%以上，疗程缩短至8-12周，副作用轻微。 几乎在一夜之间，曾经需要每周打针、忍受严重副作用、疗程长达一年的干扰素方案，从全球各大肝病治疗指南中黯然退场。丙肝从一个需要艰苦卓绝斗争、仍有失败风险的慢性病，变成了一个几乎可以轻松治愈的感染。这是现代药物史上一次干净利落、近乎完美的 “技术性击倒”。 在乙肝领域，情况略有不同： 虽然强效、低耐药的口服核苷（酸）类似物（如恩替卡韦、替诺福韦）已成为一线治疗，能极好地抑制病毒复制，但它们很难实现停药后持久的免疫控制（即“临床治愈”）。因此，干扰素-α（特别是聚乙二醇干扰素）凭借其免疫调节作用、有机会获得持久应答的优势，仍在一定范围的患者（如年轻、高ALT、低病毒载量）中作为有限疗程的选择，与口服药联合或序贯使用，追求更高的治疗目标。它在这里的角色，从一个“主力”变成了一个追求特定战略目标的“特种部队”。 在肿瘤领域： 随着各种高度特异性的靶向药物（如BCR-ABL抑制剂、CD20单抗等）和免疫检查point抑制剂的兴起，干扰素在大多数肿瘤治疗中的一线地位已被取代。但它仍未完全退出舞台，在一些特定情况（如高危黑色素瘤的辅助治疗）或作为联合方案的组成部分，仍有其应用价值。 4 活化石的遗产与不朽的精神 今天，当我们回顾干扰素-α的故事，它仿佛生物医药领域的一块 “活化石” 。它记录了一段完整的技术史：从偶然的实验室发现，到依赖人血制品的“前工业时代”，再到基因工程带来的第一次生产力解放，最终因更精准的第二代、第三代技术的出现而让出舞台中心。 它的“过时”，恰恰是医学进步最有力的证明。它的遗产丰厚而深刻： 1. 概念的奠基：它是第一个被明确界定和命名的细胞因子，开启了细胞因子与干扰素研究的大门，让人们认识到细胞间可以通过分泌蛋白质进行复杂的通讯和防御。 2. 技术的先驱：它是第一批通过基因工程技术实现工业化生产的蛋白质药物之一，为整个生物制药产业（包括后来的EPO、G-CSF、胰岛素、单克隆抗体）铺平了产业化道路，验证了从基因到药物的可行性。 3. 治疗的启蒙：它证明了免疫调节和生物治疗可以有效地对抗病毒和肿瘤，为后续所有免疫疗法（如白细胞介素-2、肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂、CAR-T）的探索提供了最初的信心和范式。 4. 标准的塑造：在长达二三十年的时间里，它定义了慢性病毒性肝炎和某些血液肿瘤的治疗标准，拯救和延长了无数生命，直到被更好的药物取代。 干扰素的故事，是一个关于科学好奇心如何发现宝藏、人类智慧如何克服生产难关、医学需求如何驱动技术迭代的经典叙事。它从实验室的意外中走来，背负着“白色黄金”的盛名与重担，经历了临床的辉煌与争议，最终在更优秀的后辈面前优雅地转换角色。它的核心精神——利用和增强人体自身的防御系统来对抗疾病——早已融入现代医学的血液，并在新一代免疫疗法中发扬光大。 在药柜里，它的身影或许不再常见；但在医学发展的丰碑上，干扰素-α的名字，将永远镌刻在基石之上。 向下滑动查看 参考文献 1. 奠基性发现： Isaacs, A., & Lindenmann, J. (1957). Virus interference. I. The interferon. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 147(927), 258-267. 2. 早期生产与临床试验： Cantell, K., Hirvonen, S., & Koistinen, V. (1981). Partial purification of human leukocyte interferon on a large scale. Methods in Enzymology, 78, 499-505. Quesada, J. R., Reuben, J., Manning, J. T., Hersh, E. M., & Gutterman, J. U. (1984). Alpha interferon for induction of remission in hairy-cell leukemia. The New England Journal of Medicine, 310(1), 15-18. 3. 在病毒性肝炎治疗中的关键作用： Hoofnagle, J. H., et al. (1986). Treatment of chronic non-A, non-B hepatitis with recombinant human alpha interferon: a preliminary report. The New England Journal of Medicine, 315(25), 1575-1578. Wong, D. K., et al. (1993). Effect of alpha-interferon treatment in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B: a meta-analysis. Annals of Internal Medicine, 119(4), 312-320. 4. 聚乙二醇化与长效制剂： Zeuzem, S., et al. (2000). Peginterferon alfa-2a in patients with chronic hepatitis C. The New England Journal of Medicine, 343(23), 1666-1672. 5. 被直接抗病毒药物取代的转折点： Lawitz, E., et al. (2013). Sofosbuvir for previously untreated chronic hepatitis C infection. The New England Journal of Medicine, 368(20), 1878-1887. 6. 历史回顾与综合评述： Pestka, S. (2007). The interferons: 50 years after their discovery, there is much more to learn. Journal of Biological Chemistry, 282(28), 20047-20051. Ivashkiv, L. B., & Donlin, L. T. (2014). Regulation of type I interferon responses. Nature Reviews Immunology, 14(1), 36-49. END 温馨提醒：本账号所有内容仅为科普分享，不能代替任何专业医疗建议。 封面图片为AI生成，请注意甄别。