Telaprevir

会议推荐 2026第三届中国医药企业项目管理大会 2026第二届中国AI项目管理大会 2026第十五届中国PMO大会 2026第五届中国项目经理大会 本 文 目 录 1、共价药物研发进展 2、Nature综述 | 再战江湖 共价药物有哪些新进展? 3、共价药物的研发进展及合成工艺简介 4、综述 | 共价药物2.0时代:如何靶向""不可成药""蛋白的最新进展 一、共价药物研发进展 （原创 小E Enamine） 共价抑制剂经历了长足的发展，从早期的偶然发现，到后面的有目的的分子设计，十几年来经久未衰，并且每年都有共价小分子被FDA批准。共价药物结合了一个温和的反应性官能团，与蛋白质靶标形成共价键，赋予药物结合中涉及的非共价相互作用之外的额外亲和力，使得那些不可成药靶点也能成药。 下面是共价药物发展的时间轴，每种共价药物都根据其治疗的药物类型或疾病类型进行分类。（文献：10.1038/s41573-022-00542-z） 2021年之后，FDA批准上市的共价药物有4个，结构如下： 截至2024年12月，在肿瘤治疗领域已有13个TCIs（Targeted covalent inhibitors）获得FDA批准上市，针对6种不同类型的蛋白质靶标：蛋白酶体、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)、表皮生长因子受体(EGFR)、输出蛋白1（exportin 1）、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、和G12C突变的Kirsten大鼠肉瘤病毒蛋白(KRAS G12C)。 TCIs理论上的优势： 1 延长作用时间：TCIs通过与目标蛋白形成共价键，可能具有比RIs更长的作用时间，这取决于目标蛋白的周转率而非药物的半衰期。　 2 更低的治疗剂量：由于TCIs具有更高的药理学效力，因此可能需要更低的剂量来实现治疗效果。 3 降低非特异性结合风险：TCIs设计为高度选择性地与特定氨基酸残基（如半胱氨酸和赖氨酸）反应，理论上减少了非特异性结合和相关不良事件的风险。 4 减少药物-药物相互作用（DDI）：由于高选择性和低剂量，TCIs可能具有较低的DDI风险。（文献：10.1002/cpt.3390） 在以前的综述文献里，很少分门别类的对半胱氨酸，赖氨酸，络氨酸进行过归纳和总结。而最近ACS文献（10.1021/acs.chemrev.5c00001）除了对半胱氨酸进行了简单的介绍，另外重点介绍了酪氨酸和赖氨酸导向的共价配体及其在化学生物学和治疗方面的进展，运用基于活性的蛋白质分析（ABPP），同位素标记和液质联用技术。 共价配体筛选是另一种越来越常见的配体发现方法，通过各种方法从亲电化合物库中发现共价配体。这种亲电试剂优先的方法在一定程度上得益于化学蛋白质组学平台的发展，这些平台能够快速鉴定靶点和选择性分析共价配体。将共价配体筛选和化学蛋白质组学的进展与结构生物学相结合，以增强药物化学的能力，有可能产生选择性结合具有挑战性的蛋白质靶标的分子。 共价库是Enamine文库中的一个大库，包括共价筛选库，共价片段库，亲电共价探针库等10个子库。其中共价筛选库，包含需求量最大的弹头类型的多样化共价库，这些弹头包括：丙烯酰胺类，氯乙酰胺类，2-氯丙酰胺类，磺酰氟类，环氧烷烃类，乙烯砜类，腈乙酰胺类，邻甲酰苯硼酸类。具体分布如下饼状图。 部分实例如下： 二、Nature综述 | 再战江湖 共价药物有哪些新进展? （原创 陈小琦 Being科学） 共价药物发展至今已经有100多年的历史了，最早可以追溯到1899年的阿司匹林。共价药物与非共价药物的最大区别在于，共价药物能够通过与靶蛋白形成共价键，从而永久地“关闭”靶蛋白，而非共价药物由于与靶蛋白的结合过程是可逆的，因而并不能完全地“关闭”靶蛋白。许多早期共价药物是偶然发现的，并与活性位点结合，从而抑制酶活性。这些药物通常模仿底物过渡状态，以实现催化氨基酸残基的共价修饰。在过去的30年里，共价药物的合理设计引起了越来越多的兴趣，共价瞄准非保守氨基酸以提高选择性已司空见惯。 近日，美国加利福尼亚大学的Daniel K. Nomura教授在杂志《nature reviews drug discovery》上发表了题为“Advances in covalent drug discovery” 的综述，描述了共价药物发现中的里程碑，重点是吸取过去研发方案中的经验教训，以及不断促进发展共价药物的发展。 尽管担心反应性，但共价的潜在好处激发了药物化学家探索共价药物空间。在许多情况下，反应性、选择性和效力之间的折衷产生了安全有效的药物。综述中讨论的关键示例包括布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂依鲁替尼(AbbVie)和表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂奥希替尼(AstraZeneca)，2020年销售额分别为84.3亿美元和43.3亿美元。此外，通过共价修饰的有效抑制使传统上“不可成药”的蛋白质成为可能，例如sotorasib(Amgen)的批准，它是一种突变KRAS(G12C)的抑制剂。与此同时，更传统的蛋白酶活性位点共价靶向药物继续产生有价值的药物，例如尼玛瑞韦（辉瑞公司），它可以抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）主要蛋白酶（Mpro）。 共价药物的历史 许多共价药物的历史例子被发现在使用已经很普遍后通过共价机制起作用，其中最突出的是非类固醇抗炎药物（NSAID）阿司匹林。早期共价药物往往来自或受到天然来源的启发。青霉素真菌产生的β-乳酸酯抗生素（如青霉素），与青霉素结合蛋白（PBP）结合，这些蛋白质则参与了细菌细胞壁的合成。所有PBP都含有活性位点丝氨酸残基，可以被青霉素酰化，抑制PBP活性并导致细胞膜破裂。另一种共价抗生素是含环氧化物的磷霉素，它由一些链霉菌产生，通过与UDP-N-乙酰葡萄糖胺-烯丙基转移酶（MurA）的催化半胱氨酸反应，扰乱肽聚糖的合成并诱导膜破裂。一些共价药物是含有含硫醇代谢物的前药，这些代谢物形成二硫键来灭活其目标。美国食品药品监督管理局（FDA）于1988年批准用于治疗胃食管反流病的质子泵抑制剂奥美拉唑，就是这方面的一个例子。共价药物在癌症治疗中也具有历史意义。Bortezomib是一种二肽硼酸，共价结合和抑制26S蛋白酶体的催化索氨酸残基，于2003年获得FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤患者。 共价EGFR抑制剂 受体酪氨酸激酶EGFR的过度活动驱动了非小细胞肺癌（NSCLC）的进展，使EGFR成为肿瘤学中的关键药物靶点。在21世纪初的临床发展过程中，发现可逆的第一代EGFR抑制剂格菲替尼和埃罗替尼对EGFR中存在体细胞激活突变的肿瘤有效。第二代抑制剂还对EGFR信号传导进行了长时间抑制，这表明这些共价EGFR抑制剂可能比埃罗替尼等可逆第一代抑制剂更有效。Afatinib（Boehringer Ingelheim）于2013年被FDA批准为转移性非小细胞肺癌患者的一线治疗。第三代EGFR抑制剂选择性地针对T790M突变体，而不是野生型EGFR，包括WZ4002、osimertinib和罗西替尼。Osimertinib于2015年获得FDA加速批准，作为非小儿细胞肺癌的二线治疗，并于2018年被批准为转移性非小细胞肺癌的一线治疗。 共价BTK抑制剂 共价BTK抑制剂的发现与共价EGFR抑制剂的发现有几个共同主题，包括配体优先的方法和使用Michael受体亲电剂。BTK因其在B细胞受体下游的关键作用而成为慢性淋巴细胞白血病的关注目标。B细胞受体的激活通过Lyn和Syk激酶诱导BTK的磷酸化，并最终激活与B细胞增殖、分化、细胞迁移和粘附相关的转录因子。B细胞发育中的这一关键作用表明，BTK是B细胞恶性肿瘤的相关目标。21世纪初，Celera基因组学的科学家对使用BTK抑制剂治疗类风湿关节炎感兴趣，他们使用基于结构的方法发现了BTK激酶结构域的丙烯酰胺抑制剂，该抑制剂可以用作荧光标记BTK55的工具化合物。随后发现，该工具化合物本身，后来被称为伊布鲁替尼，具有足够的活性和适当的理化特性，可以推进临床研究。2013年，伊布鲁替尼被FDA批准用于治疗地幔细胞淋巴瘤，随后用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）。 其他共价激酶抑制剂 共价抑制剂已被用于选择性地靶向EGFR和BTK以外的激酶，其ATP结合位点附近有非保守的半胱氨酸残基。一个例子是Janus激酶3（JAK3），这是一种非受体酪氨酸激酶，主要在白细胞中表达，并参与细胞因子信号传导。JAK3非保守的Cys909的共价靶向为JAK3产生了选择性抑制剂，而不是其他JAK家庭成员，用于治疗自身免疫性疾病。其中一种抑制剂利曲西替尼（辉瑞）在第二阶段临床试验中为类风湿性关节炎患者带了希望。成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）的几种共价抑制剂针对FGFR4中的非保守Cys552残基，以赋予FGFR1、FGFR2和FGFR3的选择性，并克服肝细胞癌（HCC）中对可逆FGFR抑制剂产生耐药性的突变。含丙烯酰胺FGFR4抑制剂菲索加替尼目前处于第二阶段临床试验。含醛罗布利替尼是一种可逆共价FGFR4抑制剂，也与Cys552反应，也正在临床研究中。总体而言，针对ATP结合位点附近非保守半胱氨酸的共价激酶抑制剂的合理设计已成为提高激酶抑制剂效力和选择性的常规方法。 共价KRAS（G12C）抑制剂 共价KRAS（G12C）抑制剂的发现和开发是以共价药物为特色的最令人兴奋的临床发现故事之一。KRAS是一种GTP酶编码的致癌基因，在大约25%的癌症中发生突变，特别是在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中。野生型KRAS在活跃的GTP约束状态和非活跃的GDP约束状态之间受到仔细调节，但许多KRAS突变减轻了GTP酶活性，导致GTP水解率低，RAS信号传导升高，推动了肿瘤发生。自近30年前发现KRAS在癌症中的作用以来，使用传统药物发现方法直接给它下药的尝试一直没有成功。Sotorasib（AMG-510）是2018年第一个进入临床试验的选择性KRAS（G12C）抑制剂，由Amgen开发，该抑制剂基于与Carmot Therapeutics合作的发现，其中对KRAS（G12C）共价结合半胱氨酸的自定义小分子库进行了筛选。Sotorasib的第二阶段临床试验于2020年成功完成，随后美国食品药品监督管理局于2021年5月批准用于KRASG12C突变局部晚期或转移性非小细胞肺癌的治疗。其他共价 KRASG12C 抑制剂正在进入临床试验。 SARS-CoV-2主要蛋白酶抑制剂 2019年冠状病毒疾病（COVID-19）疫苗以前所未有的速度开发，类似的研究势头导致开发出有益于新冠肺炎患者的治疗方法。2021年12月，美国食品药品监督管理局发布了辉瑞Paxlovid（Nirmatrelvir）包含的紧急使用授权，以治疗成人和一些儿科患者的轻度至中度COVID-19（由SARS-CoV-2引起），这是该疾病的首次批准口服治疗。Nirmatrelvir共价抑制SARS-CoV-2的Mpro，病毒复制取决于Mpro（也称为3CLpro）将pp1a和pp1ab成功解为功能性病毒蛋白。Nirmatrelvir是一种高效的SARS-CoV-2可逆共价抑制剂，在所有人类冠状病毒的基于FRET的检测中表现出有效的抑制作用，同时没有发现对人类半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶的抑制作用。Nirmatrelvir的体内功效在小鼠适应的SARS-CoV-2模型中得到了证明。在2021年11月发布的第二阶段/第三阶段临床试验数据中，Paxlovid在防止有症状的患者发展为严重COVID-19方面非常有效。这种口服生物可获得的新冠肺炎药物的出现将有助于改善高危人群中非住院患者的疾病。总体而言，SARS-CoV-2 Mpro共价抑制剂为治疗冠状病毒感染提供了一个有前途的途径，无论是作为单一疗法还是与其他抗病毒药物结合使用。 HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂 基于α-酮酰胺的共价抑制剂已经开发出来，通过抑制NS3/4a来治疗丙型肝炎病毒（HCV）感染，NS3/4a是一种丝氨酸蛋白酶，可将HCV多蛋白切割成复制所需的多种非结构蛋白。虽然丙型肝炎病毒已使用PEGylated干扰素-α和利巴韦林的联合治疗，但适度的反应率和显著的不良事件促使人们发现NS3/4a蛋白酶抑制剂来治疗HCV。根据六肽裂解产物可以抑制NS3/4a的初步观察，设计了线性肽胺抑制剂boceprevir（Merck）和telaprevir（Vertex）。Boceprevir和telaprevir在治疗HCV方面有效，并在成功试验后于2011年获得FDA批准。然而，由于不良事件，telaprevir于2014年被撤回，默克于2015年停产了boceprevir。 共价蛋白酶体抑制剂 Bortezomib（Takeda）是FDA批准的第一款含硼药物，并于2003年获准治疗多发性骨髓瘤。Bortezomib是通过优化含醛蛋白酶体底物肽发现的，并为发现HCV NS3/4a抑制剂开创了先例。将醛亲电极交换为硼酸大大提高了蛋白酶体抑制的效力。Bortezomib的影响来自硼酸与20S蛋白酶体β5亚基N端索氨酸的羟基共价结合，导致蛋白酶体的胰蛋白酶样活性的抑制。Bortezomib的开发证实了蛋白酶体是癌症靶点，鼓励了其他蛋白酶体抑制剂的发现。由天然产品环氧霉素转化而来的卡非佐米布（Amgen），于2012年获得FDA批准。 突变血红蛋白调节剂 Voxelotor（全球血液治疗）是一种赖氨酸靶向共价药物，用于治疗镰状细胞贫血，Voxelotor的发现取决于赖氨酸侧链反应性增强的知识。镰状细胞贫血是由编码β-血红蛋白链的基因中的单个突变引起的，该突变在缺氧条件下诱导突变血红蛋白（HbS）聚合。Voxelotor于2019年被美国食品药品监督管理局批准，建议剂量为每天1.5克，这是共价药物中的异常高剂量。 总结 在过去十年中，共价药物发现的进步导致了许多药物的成功开发，包括EGFR、BTK、KRAS（G12C）和SARS-CoV-2 Mpro的抑制剂。这些药物的批准代表了药物研发的里程碑，展示了共价药物发现从偶然演变为具有既定路线图的历程。共价药物的发现克服了针对无法抑制蛋白质靶点设计配体的障碍，预计共价配体的独特特征将继续刺激共价药物的发现。 三、共价药物的研发进展及合成工艺简介 （原创 李国智 药源CDMO） 一、什么是共价药物 共价药物是除了跟蛋白靶标通过非共价作用结合发挥作用外，还通过自身的官能团和蛋白靶标之间形成共价键而发挥作用的一类药物。早期的共价药物如阿司匹林、青霉素等都是偶然发现的，其作用机理也是在上市后很多年才被阐明。本世纪初，随着越来越多的蛋白质组学的发展，共价药物的理性设计引起人们的极大关注，目前市场上已经有50多种共价药物。 图1：共价药物的发现历程（参考文献2） 从化学的角度看，蛋白靶标是由各种氨基酸构成的，如图2所示，能够参与反应的残基主要是含有巯基（半胱氨酸）、氨基（赖氨酸）和羟基（丝氨酸等）的几种氨基酸；能够跟氨基酸残基形成共价键的亲电试剂同时具有ICH M7标识的警示结构。因此在共价药物的设计中，毒性和疗效的平衡一直是研发人员关注的重点。 图2：共价药物的代表性结构特点（参考文献1） 二、共价药物的优势和劣势 理想情况下，共价药物可以针对特定蛋白设计，实现精准医疗。药物只与它们想要的目标蛋白共价结合，形成药物-蛋白质复合物，因此可以维持对目标蛋白功能的抑制，延长药效，同时也可以克服靶蛋白突变产生的抗药性。 但选择性一直是共价药物的一个主要问题。蛋白质结构复杂，各种残基众多，共价药物除了与目标氨基酸残基反应外，也可能跟其他非预期的氨基酸残基结合，从而产生毒副作用，并且由于这种结合是不可逆的，毒性作用随着时间会有累积的风险，因此全面的安全评估在设计共价药物的过程中非常重要，需要深入了解靶蛋白和药物之间的相互作用，在选择了合适的靶标后需要再选择合适的亲电试剂，研发过程中通过对反应性和选择性进行调整，减少对脱靶问题的担心，通常会耗费大量的研发时间。 三、常见的共价药物有哪些 1、表皮生长因子受体酪氨酸激酶EGFR抑制剂 如图3所示：第一代为含有喹唑啉母环的可逆EGFR抑制剂，包括吉非替尼（阿斯利康）和厄洛替尼（罗氏）以及国产的埃克替尼（贝达），针对EGFR19位外显子缺失或者21L858R点突变的转移性非小细胞肺癌。为了解决第一代治疗后出现的T790M突变引起的耐药问题，第二代共价药物被设计出来，包括阿法替尼（勃林格殷格翰）、来那替尼（Puma）和达克替尼（辉瑞）等，这些都含有取代的丙烯酰胺结构，通过跟EGFR的Cys797残基不可逆结合发挥作用，但保留了中度活性。第三代选择性靶向T790M突变体，包括奥希替尼（阿斯利康）、阿美替尼（豪森）以及伏美替尼（艾力斯）等，这些选择了丙烯酰胺作为亲电结构。 图3：三代EGFR的结构 2、布鲁顿氏酪氨酸激酶BTK抑制剂 如图4所示：第一代的伊布替尼（强生/艾伯维），第二代的阿卡替尼（阿斯利康）、泽布替尼（百济神州）、tirabrutinib（吉利德）和奥布替尼（诺诚健华）都是不可逆抑制剂，含有丙烯酰胺或者丁炔酰胺的亲电结构，可以与BTK蛋白的半胱氨酸残基（Cys481）共价结合，药物的治疗作用较强，但在高浓度下存在一定的脱靶毒性，第三代的pirtobrutinib（礼来）又回到了可逆抑制剂，牺牲一定的疗效以提升药物的安全性。 图4：三代BTK抑制剂结构 3、KRAS抑制剂 KRAS没有供可逆性抑制剂结合的口袋，一直以来被认为是不可成药靶点。Sotorasib（安进）和Adagrasib（Mirati Therap）两个获批的KRAS(G12C)抑制剂验证了共价药物发现方法，两者选择了丙烯酰胺的亲电结构，国内很多fast follow也有类似的结构。 图5：上市KRAS抑制剂结构 4、SARS-CoV-2 Mpro共价抑制剂 由辉瑞研发的口服新冠治疗药物Paxlovid是奈玛特韦和利托那韦的复方制剂，这款复方中的奈玛特韦为SARS-CoV-2共价抑制剂，在冠状病毒的试验中显示出强效抑制作用。与其他共价药物不同的是，奈玛特韦选择了氰基作为亲电试剂跟氨基酸残基结合。 图6：奈玛特韦结构 四、代表性共价药物的工艺 在共价药物的工艺开发中，由于亲电结构容易跟氨基羟基等活性基团发生反应，一般在工艺最后引入，试剂的选择也要根据反应情况，比如奥希替尼选择3-氯丙酰氯引入丙烯酰结构，而泽布替尼选择丙烯酰氯，主要还是依据反应的杂质谱，选择产生杂质较少且容易纯化的试剂。 1、奥希替尼的合成 如图7所示：化合物45和37发生F-C反应生成化合物39可以作为起始物料，然后跟40和41发生两次SNAr反应得到42，还原硝基后再跟3-氯丙酰氯发生缩合及消除反应得到奥希替尼，最后成盐精制。对于奥希替尼的合成来说，这条路线中规中矩，没有额外的保护基，不同路线只是调整一下对接的顺序。 图7：奥希替尼的合成路线 2、泽布替尼的合成 泽布替尼的合成可以选择BG-9作为起始物料，经过还原、脱Boc保护、游离得到BG-11A，在手性酸D-DBTA作用下拆分，水解氰基成酰胺得到BG-12，然后再用L-DBTA拆分精制得到高手性纯度的中间体BG-13，最后跟丙烯酰氯反应得到目标产品。这是百济神州的专利路线，不足之处在于需要拆分，会损失一半以上的收率，且拆分的效果一般，需要在后期再加入手性酸精制一次。对于拆分母液中的另一个异构体的回收套用，印度MSN LABORATORIES的专利WO2022101939A1提供了一种思路，通过氧化将另一个异构体回到起始物料BG-9，提高利用效率。 图8：泽布替尼的合成路线 3、奈玛特韦(nirmatrelvir)的合成 奈玛特韦的GMP合成步骤比较简单，如图9所示：选择化合物2为起始物料，先水解甲酯然后跟化合物4和6先后发生两次酰胺化得到化合物7，再在TFAA作用下将酰胺转化为氰基，最后精制得到奈玛特韦。其中化合物2中三元环的构建比较有意思，采用CoBr2催化的Simmons-Smith反应高效构建不对称结构，感兴趣的可以读一下最近发表的OPRD的参考文献5。 图9：奈玛特韦的合成路线 五、未来展望 21世纪以来，包括 EGFR，BTK，KRAS和 SARS-CoV-2 Mpro 抑制剂在内的共价药物获批为病人提供了新的突破性疗法，主要体现在肿瘤学领域，同时也拓展到了新型冠状病毒的研发。未来我们期望看到更多的研究，探索可逆的共价机制的使用，在各种情况下达到效力和选择性之间的平衡，使得共价药物在肿瘤和其他治疗领域发挥越来越重要的作用。 参考文献： 1、Drug Dev Res. 2023;1-28 2、nature reviews drug discovery 2022；881-895 3、Org. Process Res. Dev. 2016, 20, 12, 2028-2042 4、CN109563099B 5、doi.org/10.1021/acs.oprd.3c00251 四、综述 | 共价药物2.0时代:如何靶向""不可成药""蛋白的最新进展 （原创 积极向上的砌小智 砌块化学） 1 ABPP工作流程： 1）探针设计：开发具有可调控亲电弹头的广谱活性探针（ABP），需兼顾高反应活性和结构简化性以确保检测效率。 2）可配性评估：构建含有亲电弹头的类片段化合物库，通过竞争性ABPP技术评估目标残基位点的可配性。 3）配体结合位点的功能验证：通过遗传学和药理学手段对靶蛋白位点进行干预，验证其生化效应及细胞生物学功能。 4）转化与优化：将可配性研究成果转化为高活性、高选择性的工具化合物，用于靶蛋白的细胞及体内评价。通过SAR研究降低ABPP结果中发现的脱靶亲和力，同时增强对靶蛋白的抑制效力。 案例：PTGR2（Y100）共价抑制剂开发 该抑制剂采用磺酰唑（SufAz）弹头作为酪氨酸/赖氨酸选择性亲电基团。SufAz ABPs对半胱氨酸几乎无亲和力，可能源于磺酰硫酯（SO₂-S）加合物固有的不稳定性。通过定量ABPP方法评估磺酰唑片段库对PTGR2的抑制效力和选择性后，HHS-0701被选为先导化合物，随后通过SAR研究进一步将三唑离去基团优化为咪唑，可显著提升其选择性。 综上所述，ABBP与LC-MS/MS联用技术的出现推动了共价药物发现的进程。其中碘乙酰胺（IA）等半胱氨酸定向ABP已成熟应用，如治疗斑秃药物Ritlecitinib（Pfizer，2023）的研发关键就在于其与JAK3 C909生成的共价键。然而，半胱氨酸仅占人类蛋白质组的1.7%，目前针对其他在蛋白质组中丰度更高的亲核性氨基酸，如赖氨酸（6.0%）和络氨酸（3.2%）ABP的开发备受关注。 2 突破半胱氨酸：靶向赖氨酸和酪氨酸的新策略 1. 半胱氨酸靶向化学 目前已经开发出多种靶向半胱氨酸的亲电弹头，包括经典的碘乙酰胺(IA)、α-卤代酰胺和α,β-不饱和酰胺等共价探针。此外，卤代杂环化合物作为新型探针，可通过亲核芳香取代(SNAr)反应特异性标记半胱氨酸，其中可点击的嘌呤类似物特别适用于RNA结合蛋白的研究。这些半胱氨酸靶向技术已通过BTK和EGFR抑制剂等临床药物得到验证，其成熟的硫醇-亲电体反应机制为激酶选择性抑制和蛋白质组标记提供了可靠工具。 然而，由于并非所有蛋白口袋都含有可靶向半胱氨酸，促使研究者开始探索赖氨酸和酪氨酸等替代位点的靶向策略 2. 赖氨酸靶向化学 2.1 天然赖氨酸靶向醛类及其模拟物 醛类与赖氨酸形成亚胺键在水溶液中的热力学不稳定性，会迅速分解为其醛类和胺类前体。磷酸吡哆醛（PLP）作为一种活性维生素B6衍生物，能够与胺类结合，因此被用于共价修饰赖氨酸残基。这一特性被丙氨酸消旋酶、天冬氨酸氨基转移酶、丝氨酸羟甲基转移酶、芳香族L-氨基酸脱羧酶等酶类所利用，进而催化氨基酸的转化反应（图A）。通过NMR测定，在水溶液中，醛亚胺与邻位羟基质子之间形成的分子内氢键的强度约为3 kcal/mol（图B）。 此外，PLP在生物系统中的作用还体现在其与药物的相互作用上。以异烟肼（用于治疗结核病）为例，其与PLP的结合会导致异烟肼神经炎，干扰维生素B6代谢。通过联用吡哆醇可以缓解这一问题。类似地，卡比多巴（用于治疗帕金森病）通过抑制外周组织的芳香族L-氨基酸脱羧酶（AAAD）来提升脑内多巴水平，但大剂量(100 mg/kg)使用时会显著降低多个组织的PLP浓度（血清下降88%，肝脏51%等），临床治疗剂量(10-30 mg/kg)下需联用吡哆醇以维持PLP稳态。除上述实例外，还有多种药物（如肼屈嗪、苯乙肼、环丝氨酸、青霉胺及苯丙胺）会与PLP结合导致维生素B6缺乏（图C）。 为了更好地利用PLP的这些特性，研究者们合成了一系列PLP模拟ABPs（图D，1-3），用于检测PLP依赖性酶（PLP-DE）的磷酸化过程，并识别PLP-DE抑制剂（如D-环丝氨酸）的脱靶作用。研究中采用无催化活性的对照化合物4（缺乏PLP催化所需的电子能力）来评估PL骨架的非特异性反应。通过ABPs（1-3），研究团队成功检测到真核细胞、革兰氏阳性与阴性细菌中的大量靶点，并将其应用于抗生素药物研发。 2014年，Wilde团队发现降压药肼屈嗪能够共价修饰双链和单链DNA中的脱碱基位点（Ap位点）。这些位点以环状闭合的半缩醛结构5和开环醛式结构6两种形式动态平衡存在。肼屈嗪会与醛式结构6反应生成腙类化合物7，该产物可进一步环化形成易诱发DNA错配且具有潜在致突变性的半胺醛结构8（图A）。 此外，醛糖会与蛋白质或脂质自然形成晚期糖基化终末产物（AGEs，图B）。这些AGEs会在血管壁逐渐沉积，引发微血管和大血管病变，并与多种衰老及酒精相关疾病密切相关。其分子机制表现为：蛋白质上的赖氨酸或精氨酸残基与醛糖的醛基发生反应，形成蛋白质-醛糖生物偶联物，该过程与上述（图A）反应机理类似。 为研究AGEs形成的生物学过程，研究人员利用AGEs的主要活性羰基前体甲基乙二醛（MG）开发了化学蛋白质组学分析探针（图C）。AEG相关治疗药物包括氨基胍（图D），可通过共价修饰1,2-二羰基化合物促进口服吸收的AGEs经尿液排泄，并减少其在肝肾中的蓄积。其他药物如ALT-946和吡哆胺与氨基胍作用机制类似，而ALT-711则通过切断1,2-二羰基键发挥作用。 2.2 合成醛类弹头 ORIN1001是一种针对肌醇需求酶1（IRE1）的抑制剂，源自水杨醛筛选得到的化合物13，已作为抗肿瘤药物进入临床试验阶段（图A）。此外，通过给可逆抑制剂PPY-A引入醛基弹头，研究人员开发出了可逆共价Bcr-Abl激酶抑制剂15（图B）。这些可逆共价抑制剂的设计基于PPY-A与ABL1激酶的X射线共晶结构（图C），旨在靶向催化赖氨酸K271。 一般来说，溶剂暴露的非催化性赖氨酸残基通常不作为醛基亲电体的优先靶点，这主要归因于两个因素：其一，此类相互作用具有可逆性；其二，这些残基多以质子化形式存在。然而，2-羟基-1-萘甲醛16却能特异性结合KRIT1蛋白的K720位点。该位点虽具有固有低亲核特性，但作为HEG1结合域的表面残基，使得化合物16能够发挥蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）抑制剂的功能（图D）。 近期，Cravan团队通过引入水杨醛弹头，将临床可逆的泛AKT1变构抑制剂ARQ-092改造成了不可逆的AKT1(E17K)突变选择性抑制剂17（如下图）。该选择性机制的关键在于募集了内源性锌离子，从而稳定了E17K突变体与水杨醛弹头形成的醛亚胺产物。且对比泛AKT1抑制剂，抑制剂17并未引起高血糖副作用。 Gao团队设计的硼酸化合物相较于2-甲酰基或2-酮基芳基硼酸具有更长的驻留时间。通过将2-甲酰苯胺基团连接到邻苄位，他们观察到共价修饰的半衰期(t1/2)显著延长。其作用机制表现为：赖氨酸形成的亚胺与硼配位（类似于2-甲酰硼酸），且苯胺氮原子同时与硼配位，从而形成双环结构（如下图）。 水杨醛的可逆共价特性近期推动了多种含醛基ABPs的开发。Yang团队基于驻留时间设计出了靶向赖氨酸的ABPs（图A）。虽然苯甲醛探针18与水杨醛探针19-20检测到的激酶数量相近，但探针18在洗脱后半衰期较短（图B）。相比之下，水杨醛能稳定亚胺共价产物，显著延长可逆共价探针洗脱后的半衰期（图C）。洗脱后不同激酶呈现差异化解离速率，使得ABPs能在体外和体内系统中选择性结合如AURKA K162等激酶位点。 通过ABPP与LCMS/MS联用技术筛选亲胺化合物，研究人员发现包括Jensenone 21和22在内的二羧醛片段可作为潜在的赖氨酸靶向侦察分子（图D）。基于这些发现，团队进一步合成了间苯三酚类萜及其对应探针，用于研究活细胞内赖氨酸-间苯三酚类萜相互作用（图D）。 近期，Chen团队采用2-乙炔基苯甲醛（2-EBA）弹头开发靶向催化性赖氨酸的配体。与其他醛类弹头不同，2-EBA能与肽的N端或赖氨酸残基不可逆结合，形成稳定的异喹啉鎓产物（图A）。由于2-EBA弹头本身反应活性较低，化合物27与谷胱甘肽（GSH）的反应可忽略不计。基于已报道的可逆抑制剂结构，研究人员对2-EBA和磺酰氟衍生物进行了研究（图B）。该研究表明2-EBA衍生物具有更优的效力和赖氨酸选择性。此外，在弱酸性条件（pH=6.5）下，2-EBA弹头成功实现了对N端氨基（而非赖氨酸残基）的选择性修饰。 2.3 迈克尔受体弹头 通过基于结构的药物设计法，研究人员将可逆性细胞周期蛋白D激酶2（CDK2）抑制剂NU6155转化为靶向K87的不可逆抑制剂NU6300（图A）。类似地，通过在催化残基（如K102和Y181C）附近引入丙烯酰胺基团，可逆的非核苷类HIV逆转录酶抑制剂33被成功改造为不可逆抑制剂34-35（图B）。 此外，通过比较各类迈克尔受体与谷胱甘肽（GSH）及N-α-乙酰-L-赖氨酸的反应活性发现，乙烯砜和磺胺类化合物与N-α-乙酰-L-赖氨酸的反应速率显著快于GSH。由于N-α-乙酰-L-赖氨酸为硬亲核试剂，与乙烯基磺酰胺等硬亲电试剂的反应效率优于丙烯酰胺类软亲电试剂。该发现为优化赖氨酸靶向迈克尔受体化合物的效价和稳定性提供了重要启示（如下图）。 2.4 活化酯弹头 N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS酯）是经典的赖氨酸反应性活化酯。其中应用最广泛的TMT试剂能高效标记N端游离氨基和赖氨酸残基（图A）。但NHS酯易水解，且高反应活性会导致残基特异性下降。 针对NHS酯类TMT试剂易过度标记丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等其他残基的问题，Ward团队采用同位素串联正交蛋白酶解-ABPP（isoTOP-ABPP）平台，在小鼠肝脏蛋白质组中研究了NHS酯-炔烃ABP37的残基选择性。该研究共鉴定出3,372个修饰肽段，其中49%标记位点为赖氨酸残基（图B）。Hacker团队合成了包括NHS酯、硝基苯酯和氟代苯酯在内的多种活化酯ABP，其中磺基四氟苯基（STP）-炔烃ABP38展现出强蛋白质组反应活性和高赖氨酸选择性，次要标记位点丝氨酸残基仅占8%，其他残基修饰率不足5%（图C）。 此外，通过ABP38在癌细胞蛋白质组中筛选30余种亲胺化合物，发现77%的配体结合蛋白未收录于DrugBank数据库，表明这些亲胺片段可作为靶向难成药蛋白的侦察分子。Wan团队合成了一系列活化酯，利用含赖氨酸肽段调控反应活性，其中三嗪酯42在体外实验中表现出最优反应活性和赖氨酸选择性（图D）。 通过使用活化酯弹头，研究人员成功将可逆性选择性PI3Kδ抑制剂GSK2292767和GSK2269557（比对PI3Kα、β、γ的选择性高约1,000倍）转化为不可逆抑制剂46，通过修饰与K779相互作用的磺胺药效团来实现（图A）。此外，ATP和ADP-脱硫生物素探针已被广泛用作ABP，通过靶向ATP结合位点、ATP酶和热休克蛋白等各种核苷酸结合蛋白中的保守赖氨酸残基，来分析蛋白质激酶（图B）。在蛋白激酶中通常存在两个高度保守的赖氨酸残基：一个位于亚结构域II（WNK家族除外），另一个位于HRDxKxxN基序中的亚结构域VIB（图C）。 2.5 N-酰基-N-烷基磺胺（NASA）弹头 NASA（N-酰基-N-烷基磺胺）基团作为酰基供体具有赖氨酸反应活性，Hamachi团队将其优化为ABP中的亲电弹头（图A）。与NASA母体相比，N-酰基-N-芳基磺胺（ArNASA）衍生物51不仅半衰期显著延长，选择性也明显提高（图B）。此外，在靶向活细胞内蛋白的赖氨酸残基时，配体导向的NASA抑制剂（52-53）较母体化合物显示出更强的效力（图C）。 2.6 方酸酯（squarate）、方酰胺酯（squaramate）及方酰胺（squaramide）类弹头 Kiessling研究团队系统比较了方酸酯/方酰胺酯与NHS酯等赖氨酸反应性亲电试剂的反应速率。研究发现，方酰胺酯的二级连续反应速率显著低于NHS酯（图A）。Ohara团队设计的糖链-BODIPY-方酰胺酯偶联物59能与N-糖基化酶HUGT1结合，通过方酰胺酯59与K1424的不可逆修饰，揭示了HUGT1糖苷配基结合位点及折叠感应机制（图B）。 Abbasov团队进一步开发出了化合物60和61（图17C）。相较于其他位阻型方酰胺酯，这两种化合物具有更广泛的赖氨酸反应活性。值得注意的是，化合物61能共价修饰Ku70（XRCC6）蛋白的K351位点，抑制其与Ku80（XRCC5）的二聚化，阻断人类细胞中修复DNA双链断裂的关键通路——非同源末端连接机制。 Ivancova团队将方酸酯与脱氧胞苷核苷酸连接，创制出方酰胺酯连接型dCTP（dCESQTPs，62），该衍生物可通过DNA聚合酶嵌入DNA链。这些合成DNA探针（DNA_CESQ）能高效与DNA结合蛋白反应，但对无DNA亲和力的多肽反应性有限（图D）。 2.7 硫(VI)-氟类弹头：磺酰氟（-SO₂F）与氟硫酸酯（-OSO₂F） 磺酰氟类化合物曾因其动力学与热力学稳定性并存导致亲核反应活性受限，长期被视为非理想亲电体。但Baker首次证实：若磺酰氟化合物首先与蛋白可逆结合，能够促使共价键的形成。这一发现使其在药物研发和化学蛋白质组学领域获得广泛关注。磺酰氟可修饰酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和组氨酸等多种残基，其易调控的水解稳定性为诸多不稳定的不可逆配体提供了替代方案（图A）。 Zhao团队开发的XO44是一种高选择性蛋白激酶ABP，在活体Jurkat细胞中检测出133种内源性激酶（图B）。该探针在与酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼（Dasatinib）的竞争性ABPP中展现出识别激酶抑制剂脱靶效应的潜力（图C）。进一步研究显示，在375种测试的纯化蛋白激酶中，XO44对219种激酶的IC50值低于1μM（图D）。该探针还被用于研究多靶点酪氨酸激酶抑制剂乐伐替尼（Lenvatinib）的耐药机制。这些发现表明，XO44不仅能用于评估激酶抑制剂的活性谱，还可作为有前景的激酶抑制剂先导骨架。 最新研究表明，氟硫酸酯（-OSO2F）作为一类比磺酰氟更稳定、更具潜在亲胺活性的亲电弹头，成为开发不可逆配体的新选择。Tang团队将氟硫酸酯引入第一代EGFR抑制剂厄洛替尼（Erlotinib），靶向保守的催化位点K745（图A）。由此获得的不可逆抑制剂72在保持与厄洛替尼相当细胞活性的同时，展现出更优的体外和体内药代动力学特性。该团队还合成了XO44的氟硫酸酯衍生物73（图B），该衍生物能检测出比XO44更多的激酶亚型，研究人员将其与VX-680联用开发出新型不可逆极光激酶抑制剂74。该抑制剂对AURKA的抑制效力与VX-680相当，但表现出更高的选择性。 2.8 磺酰唑（SufAz）弹头 硫(IV)氟弹头与SufAz弹头的显著区别在于磺酰亲电中心离去基团的选择——SufAz化合物通过修饰唑类离去基团可获得额外的可调控性。作者团队开发了硫-三氮唑交换（SuTEx）化学技术用于化学蛋白质组学和蛋白配体发现（如下图）。1,2,4-磺酰三氮唑类化合物对酪氨酸和赖氨酸残基具有修饰偏好（优先修饰酪氨酸）。通过以下策略可增强SuTEx化学对赖氨酸的结合活性：（1）将离去基团替换为1,2,3-三氮唑；（2）利用激酶结合骨架将亲电体定位在催化性赖氨酸附近。 3. 酪氨酸靶向化学 3.1 Mannich型弹头 Francis团队开发了一种三组分Mannich型酪氨酸偶联策略。该策略利用Mannich反应的Betti变体，首先使富电子苯胺与甲醛发生原位亚胺缩合，随后与酪氨酸形成C-C键（如下图）。虽然该反应条件温和，但需要较长反应时间和精确pH控制，且会与色氨酸、半胱氨酸形成副产物，化学选择性有限。 为突破这些局限，Tanaka团队开发了双组分Mannich型酪氨酸生物偶联策略。该方法预先合成稳定的环状亚胺中间体，再与酪氨酸反应，具有以下优势：广谱pH适应性、避免反应中烯胺副产物形成、更高水解稳定性，显著提升了Mannich型偶联在生物体系中选择性靶向酪氨酸的应用价值。虽然环状亚胺在全局酪氨酸标记中活性有限，但在靶向共价标记与抑制方面极具潜力。 在上述络氨酸偶联策略基础上，Wang团队设计合成了环状亚胺弹头作为靶向共价抑制剂。其中，环己基亚胺内酯与内酰胺在PBS缓冲液中均表现出与Ac-Tyr-NHMe的反应活性。其中内酯类虽反应活性较高，但其亲电中心不稳定易水解；而环己基亚胺内酰胺在GSH处理及酸碱条件下均保持稳定。 研究团队将该策略应用于可逆性双靶点抑制剂SW2_110A 75，通过引入环状亚胺选择性靶向CBX8非保守位点Y39，从而增强其对比于CBX2的选择性（图A）。该共价抑制剂的设计基于CBX8与寡肽UNC3866的共晶结构（图B）。生化实验与LC-MS/MS分析证实，环状亚胺77通过靶向共价结合策略显著提升了选择性（图C）。 3.2 三唑啉二酮（TAD）弹头 Barbas团队首次报道了环状TAD（三唑啉二酮）弹头对酪氨酸的偶联能力。由于其对酪氨酸和色氨酸的高度选择性及产物稳定性，TAD弹头被广泛研究（如下图）。但其水相稳定性较差，制约了药物开发应用。此外，TAD水解产生的异氰酸酯会与赖氨酸等残基发生非特异性结合，尽管该问题可通过加入Tris缓冲液清除副产物来缓解。后续Decoene团队发现pH可调控TAD对Tyr/Trp的选择性：酸性条件更利于色氨酸修饰。Moinpour团队则进一步量化了TAD对表面酪氨酸残基的标记效率，该技术为解析蛋白质构象变化及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）提供了关键研究工具。 3.3 硫(VI)-氟类弹头：磺酰氟（-SO₂F）与氟硫酸酯（-OSO₂F） 如2.7所述，磺酰氟弹头对酪氨酸及赖氨酸残基均表现出显著反应活性。Scammells团队通过传统构效关系（SAR）研究，将可逆性A1腺苷受体（A1AR）拮抗剂DPCPX改造为了不可逆拮抗剂FSCPX。该团队通过在8位或N3位引入芳基磺酰氟弹头，实现了FSCPX的共价失活作用。进一步代谢稳定性优化发现了化合物DU172；与hA1AR的X射线共晶结构证实，该配体与hA1AR的Y2657.36残基形成共价键（图A）。 基于DU172与hA1AR的同源建模结果，Yang团队进一步设计了新型不可逆hA3AR拮抗剂。由于现有hA3AR调节剂多为可逆性配体，此类不可逆配体为研究hA3AR功能提供了新型化学探针。通过简单地在DU172中引入亲电基团，实现了与hA3AR Y2717.36的共价结合。该修饰策略进一步发展为带有末端炔基的ABPs，可用于内源性hA3AR表达谱分析（图B）。 Jones及其研究团队针对DcpS的RNA结合能力设计开发了ABPs和不可逆抑制剂。通过DcpS与化合物D153249 78的X射线共晶结构分析，研究人员在苄基基团附近发现了三个亲核残基（Y113、Y143、K142），促使他们在苄基取代基的邻位、间位和对位引入磺酰氟弹头。实验结果显示：SF-p1 79选择性地修饰了Y143残基，而SF-m1 80和SF-o1 81则与Y113残基形成共价结合（如下图）。此外，通过在化合物80上引入炔基化修饰能使其成为评估DcpS靶标结合的有效工具。 Chen团队报道了一类芳基氟硫酸盐ABPs，能够选择性修饰细胞内脂质结合蛋白（iLBP）底物结合位点中的保守酪氨酸残基。其中，联苯芳基氟硫酸盐在活细胞中实现了对CRABP2的选择性标记。这种选择性源于邻近精氨酸残基的影响，使得CRABP2的Y134残基pKa值降低至约7.6。Olsen团队进一步发展了该领域，开发出不可逆的SIRT5选择性氟硫酸盐抑制剂和ABPs。他们早期基于机制设计的可逆性SIRT5抑制剂82含有硫脲基团，但存在细胞渗透性和血清稳定性问题。虽然通过生物电子等排体和前药策略尝试解决这些局限，但仍不能满足体内应用需求。最终，研究团队将弹头替换为氟硫酸盐基团，并引入胍基以提高水溶性，成功开发出具有体内活性的SIRT5 ABP 83（如下图）。 3.4 磺酰唑（SufAz）弹头 研究表明，SuTEx配体能够通过结合蛋白质上的催化/非催化酪氨酸位点来破坏酶活性中心，并可干扰参与生物分子凝聚体形成与解离过程的蛋白质-蛋白质或蛋白质-RNA复合物。Hahm团队合成了一系列SuTEx化合物，其中HHS-465 84和HHS-475 85被广泛应用于裂解液和活细胞中的ABPP研究（如下图）。值得注意的是，HHS-482 86虽然反应活性中等，但展现出卓越的酪氨酸选择性（Y：K ~5）。 Brulet团队通过系统修饰加合物基团和离去基团上的取代基，在有机溶液和蛋白质组两个体系中深入研究了SuTEx化合物的可调控性。研究发现：芳基取代基作为加合物基团时表现出卓越的反应活性，而环丙基取代的加合物基团则会显著降低亲电性。此外，SuTEx化合物的反应活性与其取代基的电子特性呈现高度相关性（如下图）。 Huang团队创新性地将血清素受体拮抗剂Ritanserin的RF001片段与SuTEx弹头相结合（如下图）。Ritanserin本身对二酰基甘油激酶（DGK）α等代谢激酶具有次级活性，这促使研究团队引入RF001结合元件来开发激酶靶向ABPs。该探针设计将结构复杂的RF001模块安装在离去基团上，既实现了特异性识别，又避免了肽段-探针加合物的复杂化，从而显著提升了LC-MS/MS对修饰位点的检测灵敏度。由此开发的SuTEx活性探针TH211，在活细胞中成功鉴定出50余种蛋白质和代谢激酶的催化或调节结构域中的酪氨酸残基。 3 立体选择性：共价配体设计的新维度 传统配体筛选方法在评估细胞活性时，往往受配体理化性质的影响，这会增加SAR分析的复杂性。此外，许多蛋白质利用立体化学特性作为区分底物的关键因素之一。为此，立体探针对（stereoprobe pairs）的概念被提出，作为一种创新解决方案来进行系统性SAR分析，减少理化性质带来的干扰。立体探针对作为理想匹配的对照，可有效评估亲电配体的靶向结合与非特异性结合及其细胞活性。对映体探针最初用于两个方面的蛋白质组定位研究：一是采用迈克尔受体亲电体靶向半胱氨酸残基，二是利用光反应性重氮基团以不依赖蛋白质残基的方式广泛靶向蛋白质组（如下图）。 最近，Taunton团队合成了针对酪氨酸和赖氨酸的磺酰氟对映体ABP对，证明立体化学因素不仅影响半胱氨酸残基的结合偏好，同样作用于其他蛋白残基（如下图）。通过筛选十对对映体探针96-105，在活细胞中检测到的共2,343个修饰位点（1,728 Tyr，615 Lys）中，有634个位点（513 Tyr，121 Lys）表现出立体选择性修饰特征。这些对映体探针对为揭示蛋白结合位点的立体化学偏好提供了宝贵信息，其应用不仅可以指导靶向新型蛋白的小分子设计，还能将化合物处理细胞中观察到的表型与靶向/非靶向结合位点的作用关联起来。 4 end 本公众号声明： 1、如您转载本公众号原创内容必须注明出处。 2、本公众号转载的内容是出于传递更多信息之目的，若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请作者或发布单位与我们联系，我们将及时进行修改或删除处理。 3、本公众号文中部分图片来源于网络，版权归原作者所有，如果侵犯到您的权益，请联系我们删除。 4、本公众号发布的所有内容，并不意味着本公众号赞同其观点或证实其描述。其原创性以及文中陈述文字和内容未经本公众号证实，对本文全部或者部分内容的真实性、完整性、及时性我们不作任何保证或承诺，请浏览者仅作参考，并请自行核实。

会议推荐 2026第三届中国医药企业项目管理大会 2026第二届中国AI项目管理大会 2026第十五届中国PMO大会 2026第五届中国项目经理大会 本 文 目 录 1、扩展共价药物的""弹药库"" 2、共价药物典型药代动力学特征及案例分享 3、研究进展:综述-共价药物 | Nature Reviews Drug Discovery 4、共价药物新舞台瞄准赖氨酸的共价药物开发 一、扩展共价药物的""弹药库"" （原创 北纬55°  X-MOL资讯） 共价药物在2022年底抗击Covid-19疫情中扮演了中流砥柱的角色。辉瑞的抗SARS-CoV-2病毒药物Paxlovid对于抑制疫情起到了极为重要的作用。Paxlovid中有效成分之一nirmatrelvir就是一款共价药物，能够结合在SARS-CoV-2病毒增殖过程中发挥重要作用的蛋白3C样蛋白酶蛋白（3CLPRO，亦称Mpro）从而抑制病毒增殖。这个抑制过程并非传统药物的药物分子与靶标的非共价结合方式，nirmatrelvir分子上的亲电氰基与Mpro蛋白上Cys145残基的侧链巯基之间共价结合，产生硫代亚胺酸脂（thioimidate），从而结合靶标实现药效（图1）。由于是共价反应，该药选择性更高，药效更强。 图1. 抗SARS-CoV-2病毒药物nirmatrelvir，以及其共价结合机理。 其实共价药物并不是新生事物，在药物历史上具有里程碑意义的药物中，有一些就是共价药物，例如1899年问世的阿司匹林和1928年的盘尼西林。它们分别靠乙酰水杨酸酯和β-内酰胺四元环充当亲电“弹头”，与靶标上的亲核基团发生共价反应，抑制靶标的生物学功能（图2）。 图2. 阿司匹林作用机制。 共价药物发展史可谓英才辈出，涌现出的重要共价抑制剂药物参见图3。 图3. 共价药物发展史上重要的药物代表（红色结构为亲电弹头）。图片来源：Drug Discov. Today 共价抑制剂设计要点 共价抑制剂最重要的优势之一，在于它们比非共价抑制剂更高的选择性。药物的毒性也与选择性之间存在重要关联。共价药物的选择性和毒性主要由三个方面决定：弹头的亲电性、目标残基的亲核性以及药物配体-靶标之间的非共价作用。 弹头亲电性在共价抑制剂选择性方面起到极其重要的作用。高反应性亲电试剂通常表现出较低的选择性，这是因为它们也容易攻击除目标靶标之外的细胞其它部分。这可能导致有毒产物或加合物的形成，从而引发毒副作用。鉴于过高的亲电性可能导致脱靶效应，人们通常优选具有较低反应性的弹头。在与靶标初始非共价结合之后，目标的共价反应应该仅与目标靶标的亲核基团进行，从而降低脱靶效应和毒性。例如在一项研究中，科学家发现用富马酸叔丁酯取代丙烯酰胺弹头可减少 70% 的脱靶率。富马酸叔丁酯弹头较大的空间体积阻碍了不希望的反应，但保持了原始弹头的反应性。与靶标的非共价相互作用也赋予抑制剂选择性。为了实现高选择性，非共价结合应该足够强，以选择性地与其靶标结合，并且实现高停留时间。 共价抑制剂亲电弹头 如上文所述，共价抑制剂药物的弹头通常是亲电的，针对各种亲核蛋白质残基，最常见的是半胱氨酸和赖氨酸残基，也包括组氨酸的咪唑基团。图4显示了根据三个数据库（CovalentInDB、WHdb、CovPDB）中与共价抑制剂作用的氨基酸残基数量（其中包括了该氨基酸位于多肽N-端的情况，例如Val）。大多数弹头以半胱氨酸、丝氨酸和赖氨酸为目标。但靶标范围已显著扩大，21个氨基酸中有 16 个被共价靶向。CovalentInDB 还提供了有关针对辅助因子的共价弹头详细信息，这可能代表了一种新颖的靶向策略。最常见的亲电弹头包括丙烯酰胺、氯乙酰胺和腈，它们已经出现在很多上市共价药物之中，例如nirmatrelvir中的氰基。 图4. CovalentInDB，WHdb 和 CovPDB数据库中，与共价抑制剂作用的氨基酸残基分布图。图片来源：Drug Discov. Today 靶向半胱氨酸的共价弹头 半胱氨酸是共价抑制最常见的氨基酸靶标，其巯基pKa 8.4，接近生理pH，因此半胱氨酸的部分巯基是以去质子的thiolate状态存在的，这大大增强了它的亲核性和与亲电试剂的反应活性。在介电常数较高的极性环境中更倾向于发生半胱氨酸的亲核加成，因为反应基团上的电荷在更大程度上局域化，利于稳定thiolate并有利于它的亲核反应。然而在疏水口袋中，半胱氨酸不易极化，因此不易发生亲核反应。蛋白质表面半胱氨酸能够实现更大的极化，并且提供更大的空间来容纳各种亲电试剂，因此是最优选的。除了环境的极性和 pH 值之外，位置还控制着半胱氨酸的反应程度。靶向半胱氨酸的共价抑制剂亲电弹头包括迈克尔受体、腈、环氧化物、醛、卤代乙酰胺。其反应机理如表1-4所示。分别对应亲核取代、亲核加成、加成-消除和氧化反应机制。 表1. 通过亲核取代机制操作的半胱氨酸靶向弹头 1. 亲核取代机制 弹头3（β-杂芳基巯基乙酰胺）和弹头4（苯硫酚酮）分别针对常见共价弹头丙烯酰胺和酮的性质而开发。3是丙烯酰胺的生物电子等排体，其杂芳基取代基介导的可控反应性，能够实现更持久的抑制，还表现出较高的生理稳定性。相比之下，4是酮类不可逆共价抑制的首个例子，其中苯硫酚结构可以实现可逆抑制过程，因为它可以稳定硫代缩酮中间体。与传统的α-卤代甲基弹头相比，弹头4具有较高的特异性。溴代环丁烯胺酮5具有高水稳定性和生物利用度，其二甲基降低了母环的亲核性，使得只有溴被裂解，而氨基通过给电子来调节反应性并降低双键的亲电活性（迈克尔加成反应受体），从而降低 5 的整体反应性。 磺酰吡啶弹头 6a 和 亚砜吡啶弹头6b 通过吡啶上的砜/亚砜取代实现可调节的反应性，吸电子磺基团激活吡啶以进行 SNAr 反应。在硝基呋喃弹头7中，改变C4位置的取代基会改变弹头的反应性。SNAr弹头6和7都表现出高半胱氨酸选择性。硫醇取代的1,2,4-三唑基可以作为氯甲基弹头8的激活基团。用吸电子基团对 R1 基团进行修饰可增加反应活性，为弹头提供了调节空间。二卤乙酰胺 9 的开发是为了提高常规单卤乙酰胺弹头的选择性。由于氯氟乙酰胺 9a 中氟的吸电子性质，在C原子上感应出正电荷，从而减少了碳-氯键长度，导致弹头的亲电性降低。9a 的作用是可逆的，而二氯乙酰胺 9b 可以通过不可逆的机制起作用。羟胺弹头 10的安全性仍有待研究。硫代甲基四嗪 11 最近被鉴定为三合一共价抑制剂：（1）可逆共价半胱氨酸弹头；（2）与反式环辛烯（TCO）发生双正交反应，形成稳定的加合物，转化为不可逆共价弹头；（3）可通过与 TCO 的双正交反应用于荧光标记。 2. 亲核加成机制 表2. 通过亲核加成机制作用的半胱氨酸靶向弹头 以迈尔克加成反应为代表的亲核加成反应，是传统的丙烯酰胺类共价抑制剂与半胱氨酸产生共价结合的机制。随着人们对可逆共价抑制剂认识的不断加深，新型的亲核加成弹头也不断涌现出来。芳香族三氟甲基酮 15与 FGFR4 受体的 Cys552 表现出可逆共价结合，并且对硫醇表现出选择性。苯并噻唑基酮弹头 16曾用于开发抗 SARS-CoV-2 药物，可与3CL 蛋白酶的 Cys145 可逆结合。在被并入多肽骨架后，该抑制剂表现出优异的安全性，中度 CYP 抑制作用，无心脏毒性，也无致突变性。这表明有可能将这种弹头纳入进一步的共价药物发现活动中。在研究黄酮类化合物抑制Mpro的过程中，研究人员发现连苯三酚 17也是一种共价弹头。在氧化条件下，连苯三酚被氧化为邻苯醌形式，这是一种迈克尔加成反应受体，可与半胱氨酸靶标发生反应。连苯三分弹头与半胱氨酸的共价反应有很高的目标选择性，其反应性由氧化环境控制。与 α,β-不饱和羰基体系类似，炔烃也会发生迈克尔加成。炔烃通常连接在缺电子杂环上，因为它们有助于稳定负电荷并增加反应性。新开发的炔基弹头的分子实体包括18-21，它们具有高选择性。在炔基嘧啶 19 中，吸电子的嘧啶降低了炔基的亲电性，使其能够与不耐受高极性丙烯酰胺弹头的靶标相互作用。炔基噻唑20可调节炔基弹头的反应性，2-位的取代降低了电子密度，从而增加了弹头的亲电性。通过改变炔烃亲电性，杂环或环稠合也有助于调整反应性。尽管膦酰胺衍生物 21a 和 21b 仅应用于生物缀合和装订肽，但由于其高半胱氨酸选择性、易于合成和高化学稳定性，它们也有望用于共价抑制应用。这些弹头中 R1 位置的吸电子基团有助于调控弹头反应活性。 3. 加成-消除机制 表3. 通过加成-消除机制作用的半胱氨酸靶向弹头 研究人员发现，α-取代甲基酮与靶标之间的不可逆反应与离去基团的pKa有关。这个发现催生了α-酰氧基甲基酮亲电弹头22的产生。22具有可调节的 pKa 和反应活性，其中的杂芳酯基团增加了极性表面积（PSA, polar suface area），有助于优化药物分子的物理化学性质。弹头23在共价接合后释放完整的糖精，可应用于果糖 1,6-二磷酸酶 (FBPase) 的共价抑制。而在加成-消除过程中释放的糖精，本身也是一个共价抑制剂，可用于碳酸酐酶抑制。23的应用因此可以达到双重靶向目的。通过共价靶向释放糖精是一个新概念，可用于将糖精这样本身的共价抑制剂整合到大的共价抑制剂中，通过与靶标的共价反应将其释放，进一步引发位点特异性的共价抑制反应。碳酸酯 24 和氨基甲酸酯 25均表现出可逆共价结合、高半胱氨酸选择性和低反应性。二芳基碳酸酯24可以酰化去泛素酶靶标，形成动力学稳定的硫代碳酸酯中间体，该中间体经历缓慢的二酰化，从而表现出持续的抑制作用。二硫代氨基甲酸酯 25 对硫醇（例如谷胱甘肽）表现出低反应性。三卤乙酰胺弹头 26 具有更大的空间位阻，半胱氨酸硫醇攻击羰基（而不是直接进攻 β-碳）产生硫代半缩酮中间体，然后进行1,2-位移以取代一个溴化物。 4. 氧化机制 表4. 通过氧化反应机制作用的半胱氨酸靶向弹头 二硫烷基苯甲酰胺 27 有一个二硫键，可以与半胱氨酸的巯基发生thiol-disulfide交换反应，从而进行共价结合。硫代磺酸盐28通过独特的氢键激活机制，它与附近的组氨酸残基形成氢键会导致 S-S 键极化，从而更容易与半胱氨酸反应。这种机制增强了28选择性，使其倾向于半胱氨酸蛋白酶 (CP) 而不是丝氨酸蛋白酶 (SP) 结合。在CP中，组氨酸以质子化形式存在，因此很容易与28形成氢键（组氨酸作为氢键供体）。1,2,4-噻二唑 29可以通过可逆结合的方式抑制SARS-CoV-2病毒Mpro 蛋白酶的Cys145。R1、R2 和 R3基团调控弹头的反应活性。29本身显示出高反应性，通过R2和R3位置的对位卤素取代增强了反应性。值得注意的是，29 还表现出高细胞渗透性。硫氰酸盐30用于共价靶向CC 趋化因子受体 2 (CCR2) 和 SARS-CoV-2病毒的Mpro 蛋白酶。研究证明30是一种不可逆的半胱氨酸选择性弹头，反应性低，安全性高。 二、共价药物典型药代动力学特征及案例分享 （原创 药明康德DMPK 药明康德DMPK） 前 言 共价药物（covalent drug）是一类通过与靶标（通常是酶或受体）形成共价结合，从而抑制其生物功能的一类化合物。许多早期的共价药物是偶然发现的，它们通过结合活性位点来抑制酶的活性[1]。这些药物往往都含有丙烯酰胺、β-内酰胺等官能团，能与靶蛋白中特定的氨基酸残基形成共价键，发生不可逆或可逆的化学反应。因其特殊的作用机制，共价药物在某些方面表现出与传统小分子药物不同的药效学和药代动力学特征。 共价药物因能与靶蛋白发生非平衡的共价结合，从而克服内源性底物的竞争，能够靶向不可成药靶点，延长药物的作用时间等多方面的优点而倍受关注，并已取得了巨大成功。如表1不完全统计，自2011年来，至少已有30款共价药物已被批准用于治疗癌症、胃肠道疾病、心血管疾病、感染等不同的疾病，引领了小分子药物研发的前沿。已上市及在研的共价药物主要靶向EGFR、BTK、FGFR2、KRAS及JAK3蛋白等。由于共价作用特殊的机制，其在药代动力学方面也表现出了与其他常规小分子药物不一样的特点，本文总结了共价药物这些特殊的药代特征，供研发人员参考。 表1. 2011-2024年已上市共价药物  （下滑查看更多） *于2024年4月退市 注：共价弹头以红色标出。 共价药物与蛋白发生共价结合 共价药物与靶蛋白共价结合是发生药效的关键。除了与靶蛋白，共价药物还可能与其他蛋白发生共价结合，包括血液系统中的蛋白和组织蛋白如肝脏蛋白等。从而影响药物在体内的分布、代谢及可能产生的毒性。 1 共价药物与血清白蛋白（HSA） 发生共价结合 共价药物进入体内血液循环系统后，可能与血清白蛋白（HSA）发生共价结合。Wang等人[2]使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术分析了来那替尼（neratinib，HKI-272）与HSA的结合产物并确定了结合位点。研究表明HSA的Lys190残基与来那替尼共价结合，发生迈克尔加成形成了来那替尼-HSA加合物。此外，当来那替尼-HSA加合物在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中重新孵育18小时，来那替尼会逐渐游离出来，证明了来那替尼与HSA的共价结合具有缓慢的可逆性。 图1. 来那替尼与血清白蛋白发生可逆的共价结合 Paul A. Dickinson等人[3]发现奥希替尼（osimertinib）会与HSA发生不可逆的共价结合。不同浓度的奥希替尼（0.1、1、10和100 μM）分别与不同种属的血浆在37℃下孵育6小时以评价奥希替尼的稳定性。实验发现，与小鼠血浆、大鼠血浆、犬血浆、人血浆、HSA以及人源α1-酸性糖蛋白（AGP）相比，奥希替尼在人血浆和HSA的中的剩余百分比非常低（分别小于1%和15%，表2）。10 μM 14C标记的奥希替尼在37℃下与雄性大鼠血浆、人类（男性，n=3）血浆、磷酸盐缓冲液中的HSA（40 mg/mL）中进行孵育。在所有样品中，初始时间点测得的共价结合量≤1 pmol eq/mg蛋白质。随着时间的推移，蛋白共价结合物逐渐增加，在6小时孵育后，大鼠血浆、人类血浆和HSA的共价结合物的量分别达到159、196和158 pmol eq/mg蛋白，并且这些共价结合具有不可逆性，不同种属的血清白蛋白由于结构差异，形成共价结合物的程度不一样。 表2. 在37℃孵育6小时后，不同浓度的奥希替尼在小鼠血浆、大鼠血浆、犬血浆、人血浆、HSA和人α1-酸性糖蛋白（AGP）中剩余百分比（%） 索托拉西布（sotorasib）是一种首创的靶向KRASG12C的共价抑制剂，Upendra P. Dahal等人[4]通过与大鼠血液或血浆与索托拉西布体外共孵育实验，利用蛋白质组学技术证明了索托拉西布会与大鼠的血清白蛋白或大鼠血红蛋白发生共价结合形成共价结合物。Irene Vuu等人[5]对索托拉西布给药后的人体内血浆样品进行了蛋白质组学分析。结果表明，索托拉西布的会与HSA的137位的赖氨酸残基（lysine-137）发生共价结合。而布鲁替尼、来那替尼和奥希替尼与HAS的共价结合为190位的赖氨酸（lysine-190）残基。 与血浆蛋白发生共价结合的直接影响是使用常规平衡透析实验测试血浆蛋白结合率的时候，获得低的回收率，进而导致游离分数fu值的可靠性低。除此以外，与血浆蛋白共价结合，很可能是某些共价药物的在体内的消除途径之一，具体在本文的2.2部分讨论。 2 共价药物与肝脏蛋白发生共价结合 用3H标记的奥希替尼与人肝细胞共孵育，0和4小时与肝细胞蛋白形成共价结合物的量分别为16.7和693 pmol eq/mg蛋白[6]。3H标记的奥希替尼与大鼠肝细胞共孵育后，0和4小时与肝细胞蛋白形成共价结合物的量分别为10.9和228 pmol eq/mg蛋白（表3）。3H标记的奥希替尼与人肝细胞和大鼠肝细胞共同孵育后，共价结合分数分别为0.29和0.02。肝脏作为人体的主要代谢和解毒器官，与肝脏蛋白的共价结合可能导致肝脏毒性或免疫毒性。但迄今为止，在临床或临床前研究中没有发现表明奥希替尼或其代谢物与蛋白的共价结合与任何毒性相关，包括特异性肝脏毒性或免疫介导的毒性。 表3. 奥希替尼在体外与人肝细胞和大鼠肝细胞形成共价结合物的情况 共价药物的代谢和消除 共价药物的代谢和消除与常规小分子药物有很多相似之处，比如都会发生CYP450介导的一相代谢。带有丙烯酰胺弹头的共价药物会与谷胱甘肽（GSH）或半胱氨酸形成共价结合物。会随着血清白蛋白共价加合物的新陈代谢而发生体内消除。 01 与谷胱甘肽/半胱氨酸形成加合物作为 体内重要消除途径 福巴替尼（futibatinib）是一种选择性、不可逆的成纤维细胞生长因子受体1-4（FGFR1-4）抑制剂，最近已获批用于治疗FGFR2重排阳性的胆管癌。I期临床研究评估了14C-福巴替尼在健康参与者（n=6）中单次口服20毫克剂量的物质平衡和代谢特征[7]。研究显示，血浆中最主要的代谢物是与半胱氨酸甘氨酸形成的结合物，占循环放射活性（CRA）的13%。在人体肝细胞的体外孵育实验中，14C-福巴替尼的代谢物包括去甲基福巴替尼的葡萄糖苷酸结合物和硫酸盐结合物，同时也包括与谷胱甘肽和半胱氨酸形成的结合物。这些数据表明，福巴替尼的主要代谢途径为O-去甲基化和谷胱甘肽结合。 索托拉西布（sotorasib）的人体内代谢涉及非酶促的谷胱甘肽结合、γ谷氨酰转移酶（GGT）介导的谷胱甘肽加合物的水解，以及CYP450介导的氧化反应。健康男性受试者在服用单次口服720 mg剂量（含约1 μCi的[14C]-索托拉西布）后，检测器血浆中的代谢物[8]。研究表明，在血浆提取物中，半胱氨酸加合物和药物原型分别占总放射性的31.6%和22.2%。在血浆中检测到的索托拉西布-白蛋白加合物作为一种次要成分。另外，在人肝S9体外研究中表明，谷胱甘肽加合物的形成主要是通过非酶促迈克尔加成进行的。使用人肾S9并结合GGT酶特异性抑制剂的体外研究表明，GGT酶是将谷胱甘肽加合物转化为半胱氨酸加合物的主要酶。具体代谢途径如图2所示。 图2. 索托拉西布在人体内的代谢途径[8] 02 共价药物随着白蛋白结合物的 新陈代谢而清除 在一项健康志愿者单次口服20 mg（0.037 MBq） [14C]-奥希替尼的临床试验中[6]，给药84天后，放射性总回收率占给药剂量的82%，粪和尿的回收率分别是67.8%和14.2%，表明奥希替尼主要通过粪便途径排泄。血浆中奥希替尼消除半衰期为61.2小时，而血浆总放射性半衰期是474小时，如图3所示。血浆总放射性的消除延迟是由于奥希替尼与人血浆蛋白发生共价结合所致。此外，从血浆中提取的放射性物质（8%）远低于粪便（70%），考虑到粪便样本中约有30%的放射性物质未被提取，推测这30%来自于血浆中奥西替尼与白蛋白的结合物或其代谢物，因此通过形成蛋白加合物排泄到粪便中是奥希替尼在体内的主要清除途径之一。 图3. 健康男性志愿者单次口服[14C]-奥希替尼20mg后，血浆中奥希替尼的浓度-时间曲线图和血浆放射性-时间曲线图[6] 表4总结了几个共价药物的体内主要代谢和清除途径[9]。来那替尼、吡咯替尼、达克替尼、依鲁替尼与常规小分子一样，其体内的主要清除途径是经过CYP450酶的代谢，阿法替尼与奥希替尼类似，其体内主要清除途径也是与血浆蛋白发生共价结合而消除。 表4. 6个共价药物在人体内的主要清除途径[9] NR: 未报道。 共价药物对CYP450酶的时间依赖性抑制 据报道，大多数共价药物至少是一种人CYP酶的时间依赖性抑制剂[10]。Moghaddam MF等人对10个共价药物（阿比特龙、阿法替尼、波塞普韦、卡奈替尼、卡非佐米、达可替尼、来那替尼、依鲁替尼、特拉匹韦以及氨己烯酸）在5 μM浓度下对7种CYP酶（包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4/5）的可逆抑制和时间依赖性抑制（TDI）进行测试。实验结果显示，大多数共价药物对至少一种CYP酶亚型表现出时间依赖性抑制的潜力。 根据已上市药物的申报资料披露情况，表5列出了近年获批的共价药物的TDI情况，9个共价药物均至少对某一亚型有TDI效应。药明康德DMPK已发表的公众号文章：共价药物体外时间依赖性抑制（TDI）数据分析和解读 中详细分析了29个已上市的共价药物对CYP酶的TDI研究结果，并对体外TDI风险评估方法和数据解读提供了相关建议，欢迎参阅。对于具有潜在TDI效应的共价药物，在研发早期通过体外研究明确药物主要抑制的CYP450酶并获得相应的动力学参数，并结合人体PK数据可有效预测临床TDI的风险。 表5. 近年上市的共价药物对人CYP酶的时间依赖性结果 “Y”表示体外实验显示有TDI。“-”表示体外实验未显示TDI。 共价药物的PK/PD关系 对于传统小分子药物而言，需要将血药浓度维持在一定水平以维持药效作用。而共价药物与靶蛋白共价结合后，持续占据靶标活性位点而发挥药效，靶标活性的恢复周期取决于新的靶标蛋白合成所需的时间，而与血浆中药物的半衰期关联不大。 如下以一款不可逆BTK抑制剂CC-292的PK/PD关系为例阐述其与常规小分子的不同[11]。在一项临床研究中，六名健康成年受试者接受了一次口服2.0 mg/kg剂量的CC-292并在一段时间内连续收集血样，以确定CC-292的血浆浓度与BTK靶点蛋白占位之间（PK-PD）的关系。所有受试者均在给药后24小时内，血浆浓度下降至接近或低于检测下限（0.1 ng/mL），终末消除半衰期为1.9小时。在CC-292给药后8至24小时内，所有六名受试者均维持了完全或接近完全的BTK靶点占有率，而此时血浆中药物浓度已降低至低水平或接近定量下限。在给药后48至72小时BTK靶点占有率接近50%。而这一数值与BTK靶点蛋白的再生半衰期48至72小时相吻合（图4）。这些数据表明共价药物的药代动力学（PK）与药效（PD）之间的脱钩。因此，共价药物不需要像常规小分子一样优化血浆消除半衰期或血浆暴露量。共价药物在短时间内达到与靶标结合的浓度后，靶点蛋白的再生速率将决定药物作用的持续时间。 图4. CC-292在健康人群血浆中药物浓度—时间曲线图与靶点占有率—时间曲线图[11] 结 语 本文主要总结了共价药物区别于传统小分子药物的典型药代动力学特征，包括与体内蛋白发生的共价结合影响药物在体内的分布和代谢、与谷胱甘肽/半胱氨酸共价结合、可能对CYP450酶的时间依赖性抑制以及PK/PD关系的特殊性。这些复杂的药代特征也为药物的研究和开发带来了新的挑战。通过了解共价药物这些独特的药代动力学特征，可以协助研发人员拨开迷雾。 三、研究进展:综述-共价药物 | Nature Reviews Drug Discovery （原创 今日新材料 今日新材料） 共价药物Covalent drugs，用于治疗疾病，已有一个多世纪的历史，但促进共价药物合理设计的工具，最近才出现。 正如用于治疗各种癌症的共价表皮生长因子受体 covalent epidermal growth factor receptor，EGFR和Bruton酪氨酸激酶Bruton’s tyrosine kinase，BTK抑制剂所证明的那样，有目的地向现有配体添加反应性官能团，可以实现对靶蛋白的有效和选择性抑制。 此外，通过“亲电优先electrophile-first”方法鉴定共价配体，也产生了共价药物的发现，如KRAS(G12C) 和 SARS-CoV-2主要蛋白酶的共价抑制剂。特别是，KRAS(G12C)抑制剂的发现，验证了共价筛选技术的使用，该技术，在过去十年中，变得更加强大和广泛。化学蛋白质组学平台的出现是，对共价配体筛选的有力补充，并有助于配体发现、选择性分析和靶标鉴定。 近日，美国 加利福尼亚大学伯克利分校（University of California, Berkeley）Lydia Boike，Nathaniel J. Henning，Daniel K. Nomura，在Nature Reviews Drug Discovery上发表综述文章，系统展示了共价药物发现的里程碑，重点是，从这些项目中吸取的经验教训，以及不断发展的共价药物发现技术工具箱，如何促进该领域的成功。 Advances in covalent drug discovery.  共价药物发现的进展。 图1：主要共价药物开发的时间表。 图2：表皮生长因子受体epidermal growth factor receptor，EGFR抑制剂结构进展。 图3：KRAS(G12C) 与adagrasib (MRTX849)和sotorasib (AMG-510)共结晶的排列结构。 图4：Nirmatrelvir与SARS-CoV-2主要蛋白酶的复合物。 文献链接：https://www.nature.com/articles/s41573-022-00542-z https://www.nature.com/articles/s41573-022-00542-z.pdf DOI: https://doi.org/10.1038/s41573-022-00542-z 本文译自Nature。 四、共价药物新舞台瞄准赖氨酸的共价药物开发 （原创  北纬55°  X-MOL资讯） 共价药物一百多年前就已出现，例如大名鼎鼎的阿司匹林与青霉素，它们的乙酰水杨酸基团以及β-内酰胺四元环，可以与靶标蛋白上的亲核基团产生共价反应，从而以更牢固的共价方式结合受体。这意味着与非共价药物相比，它们具有更长的作用时间，并且能够在更小的剂量下发挥药效。近年来，共价药物因其效力和能力而越来越受到药物开发人员的关注。大名鼎鼎的治疗套细胞淋巴瘤的依鲁替尼（ibrutinib）和抗SARS-CoV-19药物Paxlovid中的活性成分nirmatrelvir都是共价药物（图1）。 图1. Ibrutinib和nirmatrelvir化学结构。 共价药物通常带有一个亲电基团，可以与受体蛋白上丰富的亲核基团产生共价反应，因此共价药物上的这个反应活性基团，也被形象地成为“弹头（Warhead）”，例如irutinib和nirmatrelvir上的亲电弹头就分别是丙烯酰胺与氰基。从蛋白受体的角度来看，氨基、羟基、甲巯基、巯基、咪唑基等亲核基团，都可以成为共价药物靶向的基团。其中，半胱氨酸巯基丰度较低，在众多适应症中发挥重要的生理学作用，而且去质子后巯基具有高度的亲核性，因而成为了绝大多数共价药物靶向的目标。Ibrutinib和nirmatrelvir均靶向受体上的关键半胱氨酸，前者瞄准的是布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）上的Cys481；后者则靶向SARS-CoV-19病毒的3C样蛋白酶（3CLPRO）上的Cys145。 尽管半胱氨酸因其上述特性成为了绝大多数共价药物靶向的基团，但仍然存在非半胱氨酸的氨基酸靶标，为其它的共价药物的开发提供了思路，例如在蛋白组中大量存在的赖氨酸。半胱氨酸作为共价结合位点尽管取得了很大的成功，但却存在不小的挑战。一方面，它具有一定程度的选择性——人体蛋白质的半胱氨酸的比例很小，因此可以实现较高的选择型和较低的脱靶效应。另一方面，由于半胱氨酸较低的丰度，使得靶向半胱氨酸的策略不能“放之四海而皆准”地适应共价药物的开发。与半胱氨酸不同，赖氨酸在蛋白质中广泛存在，它侧链的氨基同样具有较强的亲核性（尽管在生理条件下，大多数赖氨酸氨基被质子化），从这个角度来看，赖氨酸有望使更多人类蛋白质可用于靶向共价药物。赖氨酸残基的数量几乎是体内半胱氨酸的三倍，平均每种蛋白质大约包含32个赖氨酸残基。 半胱氨酸靶向共价药物的研究还发现，某些与癌症相关的蛋白质（例如表皮生长因子受体EGFR）可以产生突变，以将其关键的被靶向的半胱氨酸残基转换为其他氨基酸，从而使曾经的母体蛋白靶标不再被药物靶向，实现所谓的耐药性。与之相反，靶向赖氨酸的药物被卷入耐药性问题的可能性较低。这是因为对于某些大类蛋白质（例如激酶中），赖氨酸对蛋白质的功能至关重要，无法用另一种氨基酸代替。作为药物靶标，赖氨酸不仅用途广泛，而且产生耐药性的问题较少。尽管如此，专家仍然认为，靶向赖氨酸的共价药物开发至少要落后半胱氨酸十年以上。目前尚无靶向赖氨酸的共价药物上市，而靶向半胱氨酸的共价药物例如ibrutinib和osimertinib，不仅成功上市，而且在一定程度上制定了共价药物开发的基调。 图2. Osimertinib化学结构。 赖氨酸的潜力 尽管赖氨酸在蛋白质中普遍存在，但并非所有赖氨酸都可以作为药物的靶点。当暴露在酸性甚至弱碱性环境中时，例如生理 pH 值时，赖氨酸的侧链氨基都会质子化，不再具备亲核性。因此，药物开发通常会注重那些蛋白质内部赖氨酸，尤其是具有较低pKa的赖氨酸残基，它们可能会以中性而非质子化的氨基形式存在。 为了探索赖氨酸的潜力范围，研究人员最近绘制了人类蛋白质中赖氨酸的分布图，以寻找可成药的位点。他们的努力表明，在这个相对未开发的领域存在大量机会。康奈尔大学化学家 Mikail Abbasov 及其同事梳理了人体蛋白质可靶向赖氨酸的免疫细胞和癌细胞。[1] 研究人员绘制了超过 14,000 个赖氨酸，其中至少有 3,000 个可以用于开发共价药物。该小组还进行了实验，以评估各种反应基团在不同位点与赖氨酸共价结合的效率，为共价药物设计提供起点。 共价/非共价相得益彰 赖氨酸的亲核性比半胱氨酸较低，因此可能需要活性更高的亲电弹头。但从共价药物的角度来看，过强的亲电基团可能会导致药物本身的化学稳定性出现问题（例如含有醛羰基的化合物，其对湿度较为敏感），而且过强的亲电性会导致共价药物的选择性降低，导致它们可能与血液中的水、酶或其他化合物发生反应。开发者因此需要在亲电药物设计中平衡反应性和稳定性。由加州大学河滨分校的 Maurizio Pellecchia 领导的团队已经在这个平衡点的追求过程中取得了显著的进步：他们从高亲电性的磺酰氟开始，通过调整正确的给电子基团来调和它的亲电性。[2] 在另一个案例中，研究人员设计了一种芳基氟磺酸酯（图3），可以与受体上的赖氨酸发生选择性共价结合。[3] 图3. 靶向赖氨酸的含芳基氟磺酸酯的共价药物候选物。 共价药物的亲电弹头不能与药物分子中的其它部分割裂开来，否则单独地合成一个芳基氟磺酸酯岂非就可作为共价药物？图3分子上的多肽部分需要与受体蛋白实现有选择性的非共价作用，将其亲电弹头递送到靶向的赖氨酸附近，从而促进氟磺酸酯与赖氨酸之间的共价反应。抗SARS-CoV-19药物Paxlovid中的活性成分nirmatrelvir，就是依靠这种非共价为基础、共价结合为重点的模式，实现对于3C样蛋白的绑定而使其丧失关键的生物学活性。 共价键的形成与断裂 可逆共价抑制剂也是共价药物发展的一个方向，所谓的可逆并非有机化学层面的可逆，而是指产生的共价键在某种情况下可以断裂。例如nirmatrelvir中，通过分子上的氰基与半胱氨酸巯基之间形成的硫代亚胺酸酯，可以在水解的条件下分裂为巯基和酰胺。它并没有恢复初始的氰基，因此从有机化学家的角度来看，这并非一个可逆反应，而是反应产物继续的降解。但从药理学来看，巯基被恢复，因此受体得到了再生，所以属于可逆过程。 醛基可以靶向赖氨酸氨基，产生可逆共价结合的效果。以醛基为弹头的共价药物已经实现了商业化，例如2019年通过FDA审批的治疗镰状细胞病的voxelotor（图4），就是通过药物分子中的醛基结合血红蛋白上的 N 端氨基实现药效的。 图4. Voxelotor化学结构。 尽管Novartis因为商业原因放弃了voxelotor，但还是开发了可逆共价抑制剂 roblitinib，一种靶向半胱氨酸的含醛基共价药物，并通过了2期临床试验，作为肝癌的潜在疗法。虽然voxelotor和roblitinib都不靶向赖氨酸，但针对赖氨酸的共价药物，似乎离问世不算太遥远了。 靶向赖氨酸的共价药物，任重而道远 制造有效的共价药物需要平衡各种因素，药物分子骨架、亲电基团的选择、恰当的反应活性以及靶标赖氨酸周围的微环境。尽管含量丰富，但赖氨酸并不意味着能够取代半胱氨酸作为首选的共价靶标。相反，研究人员希望半胱氨酸和赖氨酸能够相互补充，以扩大整体可成药空间。[4] 除了赖氨酸之外，丝氨酸与酪氨酸也成为了研究的靶标（丝氨酸实际上已经在阿司匹林的神话里面成功地成为了靶标）。尽管困难重重，但一旦成功，共价药物抑制剂的开发经迎来崭新的舞台。 end 本公众号声明： 1、如您转载本公众号原创内容必须注明出处。 2、本公众号转载的内容是出于传递更多信息之目的，若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请作者或发布单位与我们联系，我们将及时进行修改或删除处理。 3、本公众号文中部分图片来源于网络，版权归原作者所有，如果侵犯到您的权益，请联系我们删除。 4、本公众号发布的所有内容，并不意味着本公众号赞同其观点或证实其描述。其原创性以及文中陈述文字和内容未经本公众号证实，对本文全部或者部分内容的真实性、完整性、及时性我们不作任何保证或承诺，请浏览者仅作参考，并请自行核实。