Seasonal influenza virus vaccine quadrivalent (Sanofi Pasteur)

摘要：在过去二十年中，病毒样颗粒（VLPs）引起了广泛关注。基于VLP的疫苗已获批准用于预防三种传染病——乙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒和戊型肝炎病毒；它们非常有效，并能提供持久的免疫反应。除此之外，其他病毒（包括感染人类、动物、植物和细菌的病毒）的VLPs也在开发中。这些VLPs，尤其是来自人类和动物病毒的VLPs，作为独立疫苗用于预防VLPs来源的病毒。此外，包括来自植物和细菌病毒的VLPs在内的VLPs，作为平台用于展示来自其他传染病或代谢疾病（如癌症）的外来肽抗原，即它们可用于开发嵌合VLPs。嵌合VLPs的目标是增强展示在VLPs上的外来肽的免疫原性，而不一定是平台本身。本综述总结了已获批准和正在开发的用于人类和兽医用途的VLP疫苗。此外，本综述总结了已开发并在临床前研究中测试的嵌合VLP疫苗。最后，综述以VLP疫苗相对于传统疫苗方法（如减毒活疫苗和灭活疫苗）的优势作为结论。 1.引言 病毒感染了广泛的生物，包括人类、植物、动物、鸟类、昆虫以及微生物（例如，真核生物和原核生物）。病毒的一个独特特点是它们的结构蛋白、包膜蛋白或衣壳蛋白以及其他结构蛋白，可以独立或集体自发自组装形成不含病毒基因组的病毒样颗粒（VLPs）。因此，任何病毒都可以用来开发VLPs；VLPs可以通过将编码感兴趣病毒蛋白的结构基因克隆到表达载体中来开发（图1）。表达载体取决于将在其中表达蛋白（s）的表达系统，有时，如果表达系统（包括哺乳动物、昆虫和细菌）与病毒通常感染的细胞不同，则对蛋白进行密码子优化。然后，携带结构蛋白（s）DNA的载体被转染/转化到感兴趣的细胞中，在那里DNA被转录和翻译。翻译的蛋白折叠并组装形成VLPs。VLPs在生物医学科学中有多种应用，例如：（i）治疗——将药物/货物运送到特定的癌细胞；（ii）体内成像——装载荧光团的VLPs；（iii）诊断测试——使用装甲RNA作为传染病的阳性对照；（iv）疫苗开发。本综述仅关注后者：VLPs在疫苗开发中的应用。 图1. 一个示意图，展示了VLPs和嵌合VLPs的生成。一种病毒的衣壳蛋白被克隆到一个表达载体中。带有衣壳蛋白的载体也可以用来将外来肽插入到衣壳蛋白中（底部）。然后，每个载体被转化或转染到一个表达系统中，在那里蛋白质被表达并组装成VLPs。 VLPs具有许多不同于传统疫苗的特点，这使它们成为非常有吸引力的疫苗设计平台。它们在尺寸（20-200纳米）、几何形状（即多价表位的二十面体结构）以及激活T辅助细胞的能力方面模仿它们来源的病毒。VLPs自然编码T辅助细胞表位，这些表位由抗原呈递细胞（APCs）与主要组织相容性复合体（MHC）II类一起呈递给T辅助细胞。除了APCs的共刺激分子外，表位的呈递还导致T辅助细胞的激活。这激活了T辅助细胞分泌细胞因子，激活了其他免疫细胞，如巨噬细胞、B细胞和T细胞（图2）。VLPs还可以被设计为包裹内源性佐剂，如单链（ss）RNA，以刺激先天免疫反应，如下所述：ssRNA与位于免疫细胞的细胞内隔室（例如，内质网）的Toll样受体TLR7和TLR8结合。ssRNA与TLR7和TLR8的结合导致受体的激活，这些受体向下发送信号，导致细胞因子（例如，干扰素α、干扰素γ、TNFα、IL-1β、IL-6和IL-12）的表达/分泌。分泌的细胞因子激活先天免疫细胞，以及控制病原体入侵的适应性免疫系统的细胞。这一特性还增强了VLPs的免疫原性，即使是在较低剂量下。此外，VLPs被认为是安全的，因为它们不包含病毒基因组，因此不能复制。值得一提的是，像任何疫苗一样，VLPs可能会引起副作用，如注射部位的疼痛和肿胀。因此，VLPs在过去二十年中作为疫苗设计的有吸引力的平台引起了相当大的关注。虽然来自人类和动物病毒的VLPs被开发用于保护人类和动物免受VLPs来源的病毒的侵害，但来自其他生物（包括植物和原核微生物）的VLPs被开发用于展示人类和动物病毒的异源抗原，即开发嵌合VLPs（图1，底部）。嵌合VLPs的目标是引发对平台上展示的异源抗原的免疫反应，而不一定是平台本身。值得一提的是，来自人类或动物病毒的VLPs也可以用来开发嵌合VLPs，其中在VLP上展示的异源抗原来自其他人类病毒（图1，底部）。 图2. VLPs激活免疫反应。抗原呈递细胞吞噬并处理VLPs成片段，这些片段在MHC类II的帮助下呈递给T辅助细胞（顶部图像）。这导致T辅助细胞的激活，它们分泌激活B细胞的细胞因子（下方）。B细胞也通过VLPs交联B细胞受体（BCRs）被激活。激活的B细胞分裂并分化成浆细胞和记忆细胞（这里未显示）。浆细胞向体内分泌抗体，这些抗体中和了VLPs来源的感兴趣病毒。 2.来自人类病毒的VLP疫苗  已经开发了（还有一些仍在开发中）使用感染人类的病毒的VLPs（表1）。事实上，基于VLP的疫苗已获批准用于预防三种人类病毒感染，即乙型肝炎病毒（HBV）、人类乳头瘤病毒（HPV）和戊型肝炎病毒（HEV）。其中，全球至少有九种基于HBV的VLP疫苗已获批准，包括Engerix-B、Recombivax HB、Euvax B、Hepavax-Gene、GenHevac B、GenVac B和Heberbiovac HB。这些疫苗基于HBV表面抗原；其中一些疫苗；例如，Engerix-B和Recombivax HB，自20世纪80年代中期以来一直在使用，它们对其他HBV基因型，如A型和C型，提供交叉保护。尽管这些疫苗对其他基因型提供交叉保护，但已报道了几种疫苗逃逸病毒突变株。尽管如此，HBV保护性抗体在某些个体中可持续长达30年。接种时的年龄似乎与HBV抗体反应有关。例如，平均年龄36岁接种的个体产生的抗HBV抗体比平均年龄32岁接种的个体少。然而，一次加强注射使94%抗体水平低的个体的抗体水平提高。 三种基于VLP的疫苗——Gardasil-9、Gardasil-4和Cervarix——已在全球范围内获得批准，用于预防人类乳头瘤病毒。这些VLPs源自主要衣壳蛋白L1；它们提供针对两种至七种HPV类型的保护——HPV16、18、31、33、45、52和58——这些类型与70-90%的宫颈癌病例相关。它们还提供针对两种HPV类型的保护——HPV6和11——与约90%的生殖器疣相关。对Cervarix和Gardasil-4的免疫反应至少持续13年，而Gardasil-9的免疫反应至少持续6年。Cervarix疫苗在接种11年后对HPV35、31、33、45和58提供21-64%的交叉保护。另一方面，接种Gardasil-4的90%个体在14年后对异源HPV类型（HPV6、11和16）有抗体，52%对HPV18有抗体。值得一提的是，这三种疫苗的长寿研究正在进行中。另外两种有潜力提供更广泛保护的HPV疫苗正在进行临床试验；一种11价候选疫苗，含有未公开的HPV类型，和一种14价候选疫苗，分别处于III期和I期临床试验。预计14价候选疫苗将提供针对HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59的保护。 在中国，一种用于预防HEV的基于VLP的疫苗（Hecolin）已获批准；评估其在其他国家——孟加拉国和美国——的效力的临床试验正在进行中。该疫苗基于来自HEV基因型1衣壳蛋白开放阅读框2的氨基酸368-606。在16至64岁个体中，接种三剂疫苗后的12个月有效率为100%。在老年人中，即大于65岁的个体，接种Hecolin的97.3%个体在第三个月（第7个月）后的1个月内血清转换。此外，87%的接种者体内可检测到至少持续4.5年的抗体。该疫苗针对基因型1、2和4提供保护，并预计在较小程度上对基因型3提供交叉保护。 除了上述批准的基于VLP的疫苗外，还有几种候选基于VLP的疫苗正在开发中。Pumpens和Pusko的一本新书提供了一份全面的总结，介绍了从各种病毒开发的候选基于VLP的疫苗[1]。已开发并测试的VLPs包括流感病毒、SARS-CoV-2、人类免疫缺陷病毒和寨卡病毒。表1总结了一些从人类病毒开发的VLPs在临床前和临床试验中的情况。这些VLPs源自包膜蛋白、衣壳蛋白或两者兼有，并使用各种表达系统表达，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞，以及转基因植物。其中一些VLPs的效力可与传统方法开发的批准疫苗相媲美。例如，使用来自两种流感A亚型——H1N1和H3N2——的结构蛋白开发的杂交VLPs进行免疫接种，其免疫原性与批准的灭活流感病毒疫苗（Vaxigrip；H2N3）一样；IgG反应的标准化中位荧光强度>107。同样，用来自寨卡病毒或埃博拉病毒的VLPs免疫小鼠，提供高达100%的存活率，而对照小鼠则没有存活。 源自人类病毒的VLPs也被用来开发针对其他人类病毒的候选疫苗。例如，源自HBV的VLPs已被用来开发针对幽门螺杆菌（H. pylori）、丙型肝炎病毒（HCV）、与HPV相关的癌症和四种登革热病毒血清型的候选疫苗（表2）。在临床前研究中，用来自H. pylori的肽段展示的嵌合HBV VLPs免疫的小鼠细菌负担减少。在其他研究中，用来自HCV和登革热病毒的肽段展示的HBV VLPs免疫的小鼠的血清中和并保护小鼠免受HCV和登革热病毒感染。此外，展示来自HPV16 E7的肽段的HBV VLPs在HPV相关癌症的小鼠模型中抑制肿瘤。 3.源自兽医病毒的VLP候选疫苗 源自感染动物和鱼类的病毒的VLPs也被用来开发针对影响各种动物的病毒的疫苗，包括猪、兔、羊、马、鸡和鱼（表3）。例如，源自猪圆环病毒-2（PCV-2）的VLPs在小鼠中引发更好的抗体反应，优于商业亚单位疫苗。PCV-2与仔猪断奶后多系统消瘦综合征相关。在羊中，用源自蓝舌病病毒的VLPs免疫提供与活疫苗（单价BTV-8）相同的保护水平。在马驹中，用源自三种非洲马病病毒——AHSV-6、AHSV-3和AHSV-1——的嵌合VLPs免疫，引发了针对这些病毒的中和抗体，尽管水平较低。在鸡中，用来自不同亚型/株的流感A病毒的马赛克VLPs免疫，或用源自传染性法氏囊病病毒的VLPs免疫，比商业灭活疫苗（例如，H6N2用于流感病毒）提供更好的保护（表3）。与此同时，在鱼类中，用源自红点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）的VLPs免疫，将死亡率降低到约3.3%，相比之下，用商业灭活疫苗OceanTect病毒性神经坏死和对照组（死亡率分别为10%和约79%）免疫。此外，用源自大西洋鳕鱼神经坏死病毒的VLPs免疫鱼类，将死亡率降低到14%，相比之下，对照组的死亡率降低到只有约80%。 源自动物病毒的VLPs也被用作平台，开发针对其他病毒感染的候选疫苗（表4）。例如，源自犬细小病毒的VLPs已被用来展示来自中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的肽抗原，VLPs在小鼠中引发平衡的免疫反应；免疫小鼠的血清中和了假MERS-CoV。此外，用展示布鲁氏菌抗原——BCSP31——的新城疫病毒VLPs免疫，提供了针对布鲁氏菌强毒株（16M）的保护；保护水平与商业活疫苗：布鲁氏菌melitensis株M5相似；布鲁氏菌melitensis是一种与布鲁氏菌病相关的人畜共患病。 4.来自植物和细菌病毒的VLP候选疫苗  不仅人类和动物病毒，植物病毒和细菌病毒也已被用于开发VLPs。使用各种病毒开发了植物源VLPs，如苜蓿花叶病毒（AMV）、冬葵花叶病毒（PhMV）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒和锦葵花叶病毒（MaMV）（表5）。展示疟原虫（Pfs25蛋白）抗原的AMV VLPs在I期临床试验中被证明是安全且可耐受的。展示HER2肽的PhMV VLPs被发现可以减缓小鼠的肿瘤生长并延迟其死亡。此外，展示家猫过敏原肽——Feline domesticus——的PVY VLPs引发了针对抗原的高抗体滴度。而且，用展示犬流感病毒H3N8抗原的MaMV免疫的小鼠，与对照小鼠不同，能够保护小鼠免受同源和异源小鼠适应性流感病毒株的致命挑战。 在感染细菌的病毒（噬菌体或phages）的另一侧，已从噬菌体AP205、MS2、PP7、Qβ、P22等开发了VLPs（表6）。用展示HPV肽的MS2和PP7 VLPs免疫可以保护小鼠免受与癌症相关的11种HPV假病毒类型的感染。噬菌体VLPs也已被用于癌症研究。展示来自卵清蛋白的B细胞和T细胞表位的噬菌体P22 VLPs抑制了小鼠中EG.7-OVA淋巴瘤细胞。总的来说，来自感染人类、动物、植物和细菌的病毒的VLPs已被用来开发针对传染病代理以及代谢性疾病的疫苗/候选疫苗。表1-6提供了从各种病毒开发的不同VLPs及其潜在应用的概览。 5.专家评审评论和未来展望  VLP疫苗是蛋白质，因此它们不能像其他重组疫苗（如病毒载体疫苗和mRNA疫苗）那样在体内扩增（即转录和翻译以制作更多副本）。尽管如此，VLP疫苗是这两种重组疫苗的更好替代品。VLP疫苗不需要像mRNA疫苗那样在-20至-80°C的冷冻条件下运输和储存。此外，一旦VLPs被注入体内，它们就会立即被APCs处理，不像DNA和mRNA疫苗，细胞首先需要转录（对于DNA疫苗）并将其mRNA翻译成蛋白质，然后才能被APCs处理并呈递给免疫系统。 VLP疫苗也是传统疫苗（减毒活疫苗和灭活疫苗）的更好替代品，原因有几个：首先，VLP疫苗不复制，因此它们可以用于每个人，包括孕妇或免疫系统受损的人。此外，来自具有分段基因组的病毒（例如，流感病毒、AHSV和蓝舌病病毒）的衣壳蛋白——包括其他结构蛋白——也可以用来开发杂交/马赛克VLP疫苗，而不必担心基因重组，就像在减毒活疫苗中那样。具有分段基因组的病毒有能力进行基因重组；不幸的是，一种由AHSV衍生的减毒多价疫苗导致了AHSV 1型的毒力反转和与AHSV 1、3和4型的基因组重组，导致AHSV的零星爆发。第二，VLPs与真实病毒的结构非常相似，不像灭活疫苗，其结构蛋白可能在灭活过程中被修改，导致免疫原性受损。因此，VLP疫苗是灭活疫苗的更好替代品。它们在较低剂量下也具有免疫原性；事实上，研究表明，用0.3微克的候选狂犬病病毒VLP疫苗免疫引发的抗体滴度与用3微克的VLPs或兽医和人类疫苗免疫相当。 尽管VLP疫苗在较小剂量下具有免疫原性，但目前尚不清楚较小剂量的VLPs是否能为具有不同基因型的病毒（如HBV（至少有九种基因型）、HPV（与癌症相关的20多种类型）或HEV（至少有七种基因型））提供长期保护。如上所述，基于VLP的疫苗提供的免疫反应对不同HBV、HPV和HEV基因型提供交叉保护，但对其他基因型或逃逸突变株（例如，HBV）的保护较少。这些疫苗的剂量至少为每次免疫10微克（例如，用于HBV的Engerix-B）；因此，减少每次免疫的剂量可能不会增强交叉保护。我们认为，增加VLPs（一般抗原）的浓度或增加加强剂量的数量可能会增强交叉保护。例如，研究表明，与10微克相比，较高剂量的抗原（例如，90微克）可以增强对流感病毒亚型和小鼠存活率的交叉保护。同样，用高剂量（106空斑形成单位）的ASFV疫苗免疫可以完全交叉保护ASFV株，而用一半剂量免疫则只能提供部分交叉保护。 因此，针对感兴趣病毒的基于VLP的疫苗应该引发针对感兴趣病毒的所有基因型的交叉保护性免疫，以确保全球效力，考虑到基因型的分布在不同地理区域之间有所不同。例如，HBV基因型在不同大陆之间有所不同，A型在北美、南美、非洲和欧洲更为普遍，而B型和C型在东南亚和东亚更为普遍。D型在西亚、中亚和南亚以及欧洲更为普遍。用于全球使用的基于VLP的HBV疫苗应该提供针对所有HBV基因型的保护，无论个人居住在哪里。HPV和HEV疫苗也是如此。尽管已经通过开发Gadarsil-9来扩大对在世界其他地区普遍的致癌HPV类型（HPV16、18、31、33、45、52和58）的保护范围（如上所述），但仍有一些与10%的宫颈癌相关的HPV类型（例如HPV35、39、51、59等），疫苗不提供保护。例如，虽然Gadarsil-9为非洲、欧洲、北美和拉丁美洲及加勒比地区的大多数与约90%的宫颈癌病例相关的HPV类型提供了保护，但它在澳大利亚和亚洲分别只提供了86.5%和87.5%的保护。该疫苗不保护与非洲3.4%的宫颈癌病例、亚洲1.6%、拉丁美洲和加勒比地区2.3%、澳大利亚1.8%和欧洲1.4%相关的HPV35。HPV56是另一种普遍的HPV类型，疫苗不提供保护，它与欧洲和非洲1.4%的宫颈癌病例以及北美1.0%的病例相关。开发一种14价候选疫苗（包括Gadarsail-9未涵盖的HPV35、39、51、56和59），将在全球范围内保护上述HPV类型。 要在全球范围内有效，基于HEV的VLP疫苗，如Hecolin，必须提供针对在世界各地不同地理区域普遍的四种HEV基因型（HEV1-4）的保护。如上所述，Hecolin疫苗源自HEV基因型1，它对基因型2和4提供交叉保护。疫苗还预计将对基因型3提供一定程度的交叉保护。然而，由于基因型3在全球范围内普遍存在，而基因型1和2主要在亚洲和非洲的发展中国家普遍存在，而疫苗目前正在这些地区进行测试（即在孟加拉国，而不是非洲），至关重要的是要进行包括基因型3在内的其他地区保护研究，以确保疫苗在全球范围内的有效性；基因型4也在中国普遍存在。值得一提的是，Hecolin疫苗是使用细菌表达系统开发的。使用细菌表达系统比使用真核表达系统更便宜。然而，与真核表达系统不同，细菌表达系统缺乏翻译后修饰，如糖基化。尽管缺乏糖基化与一些疫苗的效力较差有关，但这似乎并不适用于Hecolin疫苗；事实上，用该疫苗免疫的猴子完全免受HEV基因型1感染。 如前所述，VLPs（尤其是来自HBV和HPV的VLPs）也被用作展示平台，以增强来自其他传染病（例如细菌和其他病毒）和非传染病（例如癌症）的肽段的免疫原性，最终目标是保护这些代理。然而，使用人类病毒的VLPs作为外来肽段的展示平台存在挑战，因为人类人群中存在针对平台的预先存在的抗体，这些抗体可能来自自然感染或疫苗接种。事实上，一些研究表明，对某些平台的高预先存在的抗体水平可能会降低平台的免疫原性以及平台展示的异源抗原的有效性。例如，儿童体内对脊髓灰质炎病毒的预先存在的母体抗体已被证明在儿童接种相同抗原后，疫苗效力降低高达28%。为了克服这一限制，可以使用不寄生在人类身上的动物病毒、植物病毒和细菌病毒的VLPs来展示外来肽段。 总体而言，VLPs是用于疫苗开发的多功能和高效平台。它们可以用来开发不仅针对它们来源的病毒，而且针对其他传染病和非传染病代理的疫苗。此外，它们是开发针对具有分段基因组的病毒（尤其是那些通过昆虫传播的病毒，例如AHSV）的杂交/马赛克疫苗的极好平台。它们在昆虫体内无法复制，降低了减毒活疫苗可能发生的重组事件的风险。此外，针对AHSV等病毒的基于VLP的疫苗还可能有助于区分已接种疫苗的马匹和感染的马匹，这在使用减毒活疫苗时可能是一个挑战。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 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摘要：流感仍然是主要的公共卫生问题之一，因为它每年都会流行，并有可能引发全球大流行。包括疫苗和抗病毒治疗在内的多种对策正在用于对抗季节性流感感染；然而，由于抗病毒药物的持续抗药性以及与其他疫苗相比流感疫苗相对较低且不可预测的效率，它们的有效性一直受到讨论。对疫苗作为预防和控制流感的有前途方法的兴趣日益增加，可能会提供具有潜在提高效率的替代疫苗开发选项。除了市场上现有的灭活、减毒活和重组流感疫苗外，目前正在探索诸如病毒样颗粒（VLPs）和纳米颗粒等新型平台，以及新的疫苗配方。这些平台提供了设计具有改进属性的流感疫苗的机会，以最大化质量和安全性。流感疫苗的生产过程也在向前发展，涉及基于鸡蛋和细胞的生产、纯化过程，以及对物理化学属性和疫苗降解途径的研究。这些将有助于设计更稳定、优化的疫苗配方，指导当代分析测试方法和通过实施该领域最新进展的实现。 1.流感病毒及其亚型 流感病毒是正黏液病毒科的一种包膜病毒。感染脊椎动物的流感病毒有四个属：A型、B型、C型和D型，它们根据基质蛋白和核蛋白的抗原差异进行区分。A型是迄今为止最有毒的病毒，可导致严重的呼吸道疾病或死亡。它甚至可能导致新的流感流行病和全球大流行。B型流感病毒也会导致人类的季节性流感流行。有两种流行的B型流感病毒谱系，即B/Yamagata和B/Victoria，它们包含在季节性流感疫苗中。与此同时，C型流感病毒通常引起轻微症状，并不已知引起流行病，而D型流感病毒已被确认感染猪、牛和羊，并未被识别为在人类中引起疾病。病毒携带一个负义、单链RNA(ssRNA)基因组，分为八个（A型、B型）或七个（C型、D型）独立的片段。在透射电子显微镜(TEM)下，A型和B型流感病毒在形态上无法区分（图1）。 图1.(A) 流感病毒的透射电子显微镜图像，主要呈球形，粒径约为100-150纳米；(B) 流感A型病毒的示意图，表示病毒组分，包括表面糖蛋白HA和NA，M1和M2蛋白，非结构蛋白和核蛋白。 它们具有直径约100纳米的球形或丝状形态，球形结构的直径通常超过300纳米，丝状形态的长度通常超过300纳米。A型流感病毒颗粒表面覆盖有病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。每个平均大小为120纳米的病毒颗粒在其脂质膜上有大约300-400个HA和40-50个NA，尽管不同亚型之间的每种蛋白的数量各不相同。这两种糖蛋白成为进一步细分A型流感病毒的基础。迄今为止，已鉴定出18种HA亚型和11种NA亚型。H1-3和N1,2株（例如A/H1N1和A/H3N2）主要感染人类，目前作为季节性流感株在人类中流行。也有记录显示，其他亚型如高致病性H5N1也会导致家禽爆发和人类感染。 病毒膜上存在少量的基质离子通道蛋白(M2)，其比例大约是每10-100个HA分子一个M2。脂质包膜及其三种蛋白(HA、NA和M2)包裹着称为M1的基质蛋白，它环绕着病毒核心。病毒内部含有非结构蛋白2(NS2)和核糖核蛋白(RNP)复合体，该复合体由RNA片段和核蛋白(NP)层叠构成，RNA依赖的RNA聚合酶由两个聚合酶基础亚基(PB1和PB2)和一个聚合酶酸性蛋白(PA)亚基组成。 流感B型病毒的结构配置几乎与四种膜蛋白相同：HA、NA，以及代替M2的NB和BM2在B型病毒中发现。流感C型和D型病毒在结构上与A型和B型病毒明显不同，它们只有一种主要的表面糖蛋白，即HA酯酶融合糖蛋白，其功能类似于A型和B型病毒的HA和NA。流感C型和D型病毒颗粒有多种形态：它们呈椭圆形或球形，直径为80-120纳米，或呈丝状，直径相似，但长度在微米范围内。2.流感病毒生命周期 流感病毒的复制周期经历了几个阶段，如图2所示，如下：(1)病毒附着在唾液酸受体上，(2)病毒进入宿主细胞，(3)病毒颗粒的融合和解壳，(4)vRNPs进入细胞核，随后病毒RNA基因组的转录和复制，然后vRNPs从细胞核中导出，(5)病毒组分的组装和在宿主细胞膜上的出芽，最后(6)新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 图2.流感A型病毒的生命周期：(1) 病毒通过HA附着在唾液酸受体上；(2) 病毒通过内吞作用进入宿主细胞；(3) 病毒颗粒的融合和解壳；(4) vRNPs进入细胞核，随后病毒RNA基因组的转录和复制，然后vRNPs从细胞核中导出；(5) 病毒组分的组装和在宿主细胞膜上的出芽；(6) 新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 (1) 病毒附着在唾液酸受体上：病毒感染的第一阶段是HA附着在宿主细胞膜表面的唾液酸上。唾液酸通过糖苷键与HA的碳水化合物相连。有两种连接对于HA的特异性至关重要；(i) a(2, 3)连接在禽类的消化道或人类、猴、马的支气管组织中丰富，以及猪的上呼吸道肺上皮，(ii) a(2, 6)连接在人类上呼吸道细胞表面以及蝙蝠和猪的气管中发现。 (2) 病毒进入宿主细胞：病毒结合后发生受体介导的内吞作用，病毒以内体形式进入宿主细胞。 (3) 病毒颗粒的融合和解壳：内体的酸性pH值（pH 5-6）导致病毒和内体膜融合，并打开M2离子通道蛋白，使核酸酸化，从而允许vRNP从M1中释放出来，进入宿主细胞的细胞质，然后进入细胞核。 (4) vRNPs进入细胞核后的转录和复制：构成vRNP（NP、PA、PB1和PB2）的病毒蛋白检测到可以附着在细胞核输入机制上的核定位信号，因此进入细胞核进行转录和复制过程。负义RNA首先被转化为正义RNA，并作为生成病毒RNA的模板，随后由病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）启动内部RNA合成。通过其C末端结构域，RdRp与RNA聚合酶II（Pol II）的大亚基相关联，继续转录以产生成熟的mRNA。然后vRNPs通过核孔从病毒核心中导出。 (5) 病毒组分的组装和出芽：病毒的蛋白组分，即HA、NA和M2，被运输到膜的顶部区域，病毒颗粒从极性上皮细胞中出芽。 (6) 新病毒颗粒从宿主细胞中释放：在形成病毒颗粒后，由NA切割糖蛋白和糖脂上的唾液酸残基，使新合成的病毒颗粒能够从宿主膜上释放并传播到附近的细胞。3.流感病毒的HA和NA HA和NA是主要的跨膜糖蛋白，HA大约占病毒表面的80%。这两种糖蛋白识别宿主细胞的同一分子，即唾液酸(SA)。除了病毒的感染力和传播力外，这两种蛋白还与病毒的毒力特性、宿主特异性和对抗病毒治疗的抗性有关。HA和NA结构的带状图示于图3中展示。 图3.1918年人类HA（蛋白质数据银行(PDB) ID: 1RUZ）和2009年H1N1 NA与奥司他韦(PDB ID: 3TI6)复合物的带状图，其受体结合位点以蓝色圆圈显示。(A) HA单体；(B) NA单体；(C) 三聚体HA和(D) 四聚体NA从顶部显示。 HA由三个不可区分的亚基（同源三聚体）组成，附着在病毒脂膜上，每个单体都拥有一个包含受体结合域的球形头部，以及一个杆状区域（图3A）。这种蛋白负责病毒与其目标细胞的初次接触，这些细胞含有末端唾液酸残基。此外，HA通过内吞作用促进病毒进入宿主细胞，从而将核蛋白送入细胞质。HA作为流感病毒上的主要抗原，成为抗体中和的主要靶标。 NA（图3B）是一种四聚体蛋白，由四个相同的多肽组成，包括一个球形头部、一个细胞质尾部、一个跨膜域和一个杆状区域。它是一种酶，通过催化从一系列糖缀合物（如糖蛋白和糖脂）中切割末端α-(2,3或2,6)-酮苷键唾液酸，破坏HA所识别的受体，因此在病毒复制周期中发挥着至关重要的作用。NA作为一种生物学剪刀，切割HA和细胞表面糖苷的唾液酸残基，促进病毒进入期间病毒的运动，以及从新合成的病毒颗粒的表面糖蛋白上切割，从而允许病毒从宿主细胞中释放并继续感染其他细胞。 流感病毒完全依赖于HA和NA的平衡作用来建立有效的感染。在初次感染期间，受体结合亲和力的增加似乎也需要增加病毒NA的受体破坏活性。另一方面，在感染的后期，增强的受体结合是一个严重的不利因素，因为它会阻止新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 4.HA和NA的糖基化 在流感病毒的复制周期中，由于复制过程的错误，病毒基因可能发生小的变化，这可能导致抗原漂移（病毒基因的小变化或突变，可能导致HA或NA的变化）。除了氨基酸序列的改变，抗原漂移通常还涉及病毒糖蛋白的糖基化模式的变化。HA和NA都具有N-糖基化潜在区域，通过N-糖苷键将寡糖链添加到存在于Asn-AA-Ser/Thr序列中的Asn残基上，其中AA可以代表除脯氨酸以外的所有氨基酸。这种附加是在内质网（ER）中存在的糖基转移酶和寡糖转移酶酶的帮助下发生的，随后在通过ER和高尔基体转移过程中，通过甘露糖苷酶和糖苷酶对寡糖进行结构改变。这种翻译后修饰对流感病毒生命周期至关重要，它影响生物合成、结构稳定性和糖蛋白功能。 HA的糖基化位点位于杆状区域，有助于HA的分子稳定性、其受体结合和宿主的免疫反应。先前的研究还表明，HA球形头部的糖基化可能暴露或保护抗原位点，使病毒能够逃避中和抗体。自1977年以来，四种季节性人类流感病毒株，两个A型亚型（A/H1N1和A/H3N2）和两个B型谱系（B/Victoria和B/Yamagata）已在全球范围内传播。图4展示了A/H1N1和A/H3N2株从1918年到2018年的糖基化模式的演变，即它们首次引入人类和当前流行的模式。1918年大流行A/H1N1和1968年A/H3N2流感病毒的HA杆状区域的糖基化已知是高度保守的。1918年A/H1N1在残基27、28、40、304、498和557处拥有六个保守的N-糖基化（NLG）位点（图4A），而1968年A/H3N2在残基24、38、54、301和499处有五个糖基化位点（图4B）。另一方面，HA的球形头部多年来经历了随后的糖苷增加和丢失。A/H3N2 HA球形头部的NLG位点数量从1968年最初的两个（位于残基97和181）增加到2018年季节性株的八个（位于残基79、138、142、149、160、174、181和262），在1975年左右97位点消失后。同样，1918年A/H1N1在其消失于1957年之前获得了越来越多的糖苷，并在1977年重新出现直到2009年A/H1N1株取代它之前具有相同的糖基化剖面。目前流行的A/H1N1株是猪系病毒的重组结果，糖基化与非常早期的人类A/H1N1相似。与此同时，自1983年Victoria和Yamagata谱系分裂以来，流感B病毒的NLG位点一直保持在大约10-12个位点相对稳定。 图4. 1918年HA（A）和1968年HA（B）的一些NLG位点。这些NLG位点是最初确定的，而红色、绿色和黄色的NLG位点是后来获得的。粉红色圆圈代表NLG位点的演变。1918年A/H1N1最初拥有六个NLG位点，并在1977年获得了两个NLG位点，但失去了两个，而2009年A/H1N1获得了三个。当前流行的2018年A/H1N1株又失去了五个NLG位点。与此同时，1968年A/H3N2 HA球形头部的NLG位点从1968年最初的两个增加到当前2018年株的八个（随着时间的推移，NLG位点的数量和位置发生了变化）。 HA中的糖基化位点和糖苷剖面的变化影响病毒与宿主免疫系统的相互作用。逃避中和抗体的识别使病毒能够继续在人类群体中传播。因此，需要更多的研究来研究病毒糖蛋白的糖基化模式，以设计更好的针对流感病毒的疫苗。虽然已知HA的NLG有助于免疫逃逸和流感病毒的毒力，但NA的NLG如何影响其功能仍然不清楚。先前发表的研究表明，N8 NA蛋白的糖基化对正确的四聚体化是必要的。此外，NA蛋白头部结构域的糖基化对正确的成熟是必需的。在最近的一项研究中，Bao等人探讨了A/1933/WSN/H1N1（WSN）病毒NA蛋白中NLG修饰的功能。结果表明，NA蛋白的NLG修饰对其出芽至关重要。在转染细胞中，非糖基化NA蛋白失去了出芽能力。此外，NLG修饰的缺失显著降低了突变病毒的出芽和复制。在小鼠模型中，NLG在219位点的缺失显著减弱了WSN病毒。有建议称，在细胞中过表达非糖基化NA蛋白诱导了未折叠蛋白反应（UPR），这可能会影响NA蛋白的出芽能力，从而减弱突变病毒的毒力。 5.流感流行病与大流行  流感病毒可以通过感染呼吸道引起严重的传染病，可能导致住院甚至死亡。据预测，每年的季节性流感大约有300万至500万例严重疾病和29万至65万例相关呼吸道死亡。东南亚和撒哈拉以南非洲的死亡率最高，75岁及以上的老年人、五岁以下儿童以及患有长期疾病使他们更容易感染流感或其并发症的个体，是严重后果和死亡的高风险群体。 新的A型流感病毒株每2至5年不定期出现，持续3至6个月，具体取决于地区。流感流行病通常被称为流感季节，可能与天气和气候有关。病毒表面糖蛋白HA和NA内的特定突变使得病毒能够逃避宿主免疫系统，导致自然感染或接种疫苗后都无法对病毒产生持久免疫力。流感病毒抗原性的微小变化被称为抗原漂移，这是流感流行病频繁发生的基础，使得每年都有必要根据世界卫生组织的建议更新流感疫苗以匹配当前流行的毒株。 另一方面，流感大流行是由病毒抗原性的显著变化引起的，大约每10至40年发生一次；然而，它可能在任何时候发生。历史上记载，20世纪至少发生了三次大流行：1918-1919年的西班牙流感、1957-1958年的亚洲流感和1968-1969年的香港流感，各自的死亡率从毁灭性到温和不等。这些大流行病毒通过不同流感病毒株的RNA片段重组获得了新的亚型。这种遗传变化，被称为抗原转变（由两种病毒株的基因组重组引起的病毒抗原性的突然变化），允许病毒株从一个动物物种跳到另一个物种，从动物跳到人类。 1918年的大流行，也称为西班牙流感，是有史以来第一次也是最严重的流感大流行。据估计，该病毒通过感染全球约25-30%的人口，杀死了大约5000万个体，约占世界人口的2.7%。2018年Spreeuwenberg等人的更近期分析表明，早期估计过高。他们自己的估计将死亡人数定为1740万，占世界人口的0.95%。1918年大流行是由A/H1N1亚型流感病毒引起的，被认为是几乎所有人类A型流感病例的共同祖先。这不仅包括1918年H1N1病毒的抗原“漂移”后代，还包括1957年（H2N2）、1968年（H3N2）和2009年（H1N1）出现的遗传重组大流行病毒。1957年2月在中国湖南省出现的H2N2亚型流感A病毒，被认为在临床上比导致1918年大流行的H1N1病毒更温和，全球死亡率为110万。该病毒在全球传播，直到1968年H3N2出现，引起了另一次大流行。它首先在中国出现，然后迅速传播到香港。1968年大流行，也称为香港流感，相比之下是一次较温和的大流行，死亡人数约为100万。21世纪的流感大流行始于2009年初，当时一种新的猪源性流感病毒出现并取代了以前的季节性流感H1N1。最初在墨西哥发现的病毒迅速在全球传播，并在74个国家报告感染后，世卫组织于2009年6月宣布为大流行。该病毒，也称为“2009 H1N1”，是两种已存在的猪流感病毒—北美H1N2和欧亚H1N1—之间的重组产物。 过去二十年，直接从鸟类到人类的禽流感病毒传播的报告有所增加，导致禽流感A/H5N1在家禽中的持续爆发和相关的人类感染。1997年，首次在香港检测到人类感染H5N1的致命病例。六年后的2003年，该病毒作为一种高致病性禽流感病毒重新出现，在当地家禽中引起了毁灭性的爆发，引发了对潜在流感大流行的担忧。这些爆发在几个国家已成为地方病，埃及、印度尼西亚和越南的病例数量最多。2007年，有证据表明中国有限的人传人H5N1。此外，世卫组织报告称，2006年和2007年在印度尼西亚和巴基斯坦分别观察到有限的、非持续的人传人H5N1病例。2014年1月8日，加拿大报告了美洲首例H5N1感染病例，是一名从中国返回的旅行者。尽管人类感染这种病毒并不常见，但大约60%的病例导致死亡。2019年11月，世卫组织宣布自2003年以来共有861例经核实的人类禽流感A(H5N1)病例，导致455例死亡，最后一例于2019年4月30日在尼泊尔报告。 6.针对流感流行病和大流行的疫苗  有几种疫苗用于对抗流感流行病和大流行。流感疫苗每年根据当前流行株的全球监测进行重新配制。因此，每年接种疫苗仍然是预防季节性流行性感冒的最有效方法。 目前，全球使用三种类型的疫苗：灭活流感疫苗(IIV)、减毒活流感疫苗(LAIV)和重组HA疫苗（表1）。每种疫苗都有其优点和缺点。疫苗可以诱导免疫效应分子，包括体液效应分子（B淋巴细胞产生的抗体），能够特异性结合病毒抗原，以及细胞效应分子（细胞毒性CD8+ T淋巴细胞），通过杀死感染细胞来限制病毒在体内的传播。所有流感疫苗都需要每年更新，因为免疫持续时间很短，并且要匹配流行病毒的抗原性。因此，世卫组织和其他利益相关者每年两次会面，根据全球流通病毒的抗原和遗传特性以及不同国家的流行病学信息，选择最合适的流感病毒。其中一次流感疫苗组成会议针对北半球，另一次针对南半球。 多年来，含有两种流感A（H1N1和H3N2）和一种流感B病毒系的三价疫苗被配制出来，以提供对三种不同流感病毒的保护，尽管存在两种不同的B病毒系。因此，为了更广泛地保护当前流行的病毒，将第二种B病毒系添加到配方中，制成四价流感疫苗。目前批准的流感疫苗在HA数量或抗原性方面进行了定量标准化，但并非在中和抗体（NA）方面。因此，疫苗的NA含量和NA免疫原性可能差异很大。 6.1.灭活流感疫苗(IIV) 灭活病毒疫苗是全球最常用的方法，因为它的高安全性和相对较低的生产成本。因此，它在全球流感疫苗市场中占有最高的百分比。IIV适用于六个月以上的儿童，如Afluria Quadrivalent、Fluarix Quadrivalent、FluLaval Quadrivalent和Fluzone Quadrivalent；然而，一些IIV仅适用于65岁及以上的个体，如Fluad和Fluzone High-dose Quadrivalent（表1）。这种类型的疫苗通常在鸡胚或哺乳动物细胞培养中培养病毒（图5）。已经证明IIV可以诱导局部和全身免疫，尽管可能需要加强疫苗接种以维持抗体滴度。IIV有三种类型：全病毒灭活疫苗、裂解病毒灭活疫苗和亚单位灭活疫苗。 图5.流感疫苗制造过程。基于鸡蛋和基于细胞的疫苗制造都是从在鸡蛋或细胞中培养的候选疫苗病毒（CVV）开始的（步骤1）。在收获、分离、过滤和纯化之后（步骤2），病毒通常使用甲醛进行化学灭活，以制造灭活流感疫苗，或者通过化学表面活性剂破坏，以准备分裂病毒疫苗或亚单位疫苗（步骤3）。最后一步涉及填充-完成过程和包装，在冷链条件下交付和储存产品（步骤4）。重组流感疫苗不需要整个病毒的生长；只需获得HA抗原的遗传信息，并与杆状病毒结合，以便于将遗传信息（DNA）传递到宿主细胞中表达HA抗原。然后生产、收获、过滤、纯化抗原，接着制备疫苗。 6.1.1.全病毒灭活疫苗(WIV) 全病毒疫苗是最早使用的流感疫苗。然而，在接种后报告了若干系统性和局部副作用。这些不良反应可能源于疫苗中的杂质，如鸡蛋蛋白。不过，疫苗生产技术的改进已经使得疫苗更安全，杂质更少，副作用更少。在WIV中，在鸡胚中孵化和生长后，病毒颗粒主要用甲醛或β-丙内酯化学灭活，然后进行纯化（图5）。尽管这种方法是流感病毒灭活最常用的方法，但也可以采用其他方法进行病毒灭活，包括加热和辐射。 由于市场上已经出现了其他类型的疫苗，如裂解病毒灭活疫苗，具有较少的反应原性效应，因此这种类型的流感疫苗的使用目前受到限制。疫苗3Fluart是由Fluart Innovative Vaccines Kft.生产的WIV，仅在欧洲使用。 6.1.2 裂解病毒灭活疫苗 目前使用的大多数流感疫苗是裂解病毒或亚单位疫苗，因为它们具有适当的免疫原性和生产便利性。然而，由于缺乏整个病毒结构，它们失去了一些固有的免疫原性，这与WIV不同。裂解病毒疫苗可以通过使用Triton-100或辛基葡萄糖苷等表面活性剂化学破坏病毒膜来制备。然后，通过切向流过滤去除表面活性剂。表1总结了美国（代表北半球）和澳大利亚（代表南半球）的季节性流感裂解病毒疫苗，包括其制造商和适用年龄组信息。 在澳大利亚，大多数季节性流感疫苗是裂解病毒灭活疫苗，市场上有五种疫苗：FluQuadri（由Sanofi, 美国宾夕法尼亚州生产）、Vaxigrip Tetra（由Sanofi-aventis, 新西兰奥克兰生产）、Fluarix Tetra（由GlaxoSmithKline Biologicals, 德国德累斯顿生产）、Afluria Quadrivalent（由Seqirus, 澳大利亚墨尔本生产）和Influvac Tetra（由Abbott, 荷兰霍夫多尔普生产）。在美国，裂解病毒灭活疫苗也占季节性流感疫苗的主要部分，有五种疫苗：Afluria Quadrivalent（由Seqirus, 澳大利亚墨尔本生产）、Fluarix Quadrivalent（由GlaxoSmithKline Biologicals, 德国德累斯顿生产）、FluLaval Quadrivalent（由ID Bio-medical, 加拿大魁北克省拉瓦尔生产）、Fluzone High-dose Quadrivalent（由Sanofi, 美国宾夕法尼亚州生产）和Fluzone Quadrivalent（由Sanofi, 法国巴黎生产）。 6.1.3.亚单位灭活疫苗 通常，亚单位疫苗只包含病毒的抗原部分：HA和NA。这些蛋白质是通过使用表面活性剂裂解病毒后从流感病毒中纯化的（见图5）。这种类型的流感疫苗通常需要佐剂来诱导足够的免疫原性，特别是在老年人中。Seqirus生产的Fluad和Fluad Quadrivalent是可用于65岁及以上人群的亚单位流感疫苗。另一个疫苗，由Mylan Health生产的Influvac Tetra，适用于三岁以上人群（见表1）。由于它们的免疫原性相当且反应原性低，所需的疫苗剂量大和高生产成本，所有这些都需要进一步改进。自20世纪70年代以来，裂解病毒比亚单位病毒疫苗更常用。 6.2.减毒活流感疫苗（LAIV） LAIV的开发是为了模仿自然感染和免疫，而不引起严重疾病，从而诱导体液和细胞免疫。LAIV最早在20世纪60年代提出，方法是在鸡蛋中在非最佳条件下培养流感病毒。这些减毒病毒对温度敏感，只在25°C（冷适应）下生长。冷适应供体病毒经过几次传代，温度逐渐降低，在孵化的鸡蛋中进行。因此，当LAIV通过鼻内给药时，它可以在与鼻咽粘膜表面相同的温度范围内生长。LAIV比IIV有一些优势，因为它主要诱导局部粘膜免疫和局部免疫球蛋白A（IgA）的产生以及IgG，而IIV只有系统性IgA和IgG抗体。然而，由于使用活病毒进行免疫的风险，LAIV不推荐用于免疫功能低下的个体（免疫受损）或与他们密切接触的人。 由MedImmune生产的FluMist Quadrivalent（见表1）是一种经美国批准的鼻内LAIV季节性流感疫苗，可安全用于2至49岁的儿童和成人，包含四种流感毒株（两种流感A和两种流感B）。由AstraZeneca生产的Fluenz Tetra在欧洲获批，是另一种用于2至17岁儿童的LAIV。截至2021年，澳大利亚尚未批准任何LAIV。 6.3.重组HA疫苗 重组HA疫苗可以通过昆虫细胞和杆状病毒的重组蛋白表达技术生产，因为它们产量高且成本效益好（见图5）。昆虫细胞是用于重组蛋白表达的典型细胞系，Gibco Sf9细胞系是最常用于人类或兽医医学中重组蛋白表达的细胞系。 重组HA疫苗比基于鸡蛋的流感疫苗有优势：没有来自鸡蛋适应的不需要的突变（见表1）。此外，重组HA疫苗是鸡蛋过敏者的合适选择。尽管重组HA疫苗和IIV的作用机制相似，但重组HA疫苗的免疫原性较低，因此需要比IIV多三倍的HA才能诱导出与IIV相同的抗体滴度。重组HA疫苗的另一个优势是它适合流感大流行，因为它可能需要更短的制造时间，并且由于缺乏高致病性病毒，它比其他流感疫苗更安全。然而，由于在儿童中缺乏效力，重组HA疫苗仅限于成人。由赛诺菲巴斯德生产的Flublok Quadrivalent是第一种重组HA疫苗（见表1）。 7.流感疫苗制造过程 目前，流感疫苗可以通过三种不同的方法生产：传统的基于鸡蛋的疫苗（传统方法）、基于细胞的疫苗和重组HA疫苗。这些方法在图5中总结。基于鸡蛋和基于细胞的疫苗制造都是从在鸡蛋或细胞中培养的候选疫苗病毒（CVV）开始的（步骤1）。在收获、分离、过滤和纯化之后（步骤2），病毒通常使用甲醛进行化学灭活，以制造灭活流感疫苗，或者通过化学表面活性剂破坏，以准备分裂病毒疫苗或亚单位疫苗（步骤3）。重组流感疫苗不需要整个病毒的生长；只需获得HA抗原的遗传信息，并与杆状病毒结合，以便于将遗传信息（DNA）传递到宿主细胞中表达HA抗原。最后一步涉及填充-完成过程和包装，在冷链条件下交付和储存产品（步骤4）。 7.1.基于鸡蛋的疫苗 自20世纪40年代以来，基于鸡蛋的疫苗一直是每年生产数百万流感疫苗的最常见方法。无论疫苗株如何，都需要大量的鸡蛋供应来在鸡蛋中培养目标病毒。这种方法从选择预测的循环病毒株开始，然后是HA和NA的遗传片段在鸡蛋中可以大量生长且具有良好安全特性的鸡蛋适应病毒中的重组，如A/Puerto Rico/8/1934。在这些重组病毒产生后，它们被注入孵化的鸡蛋中生长，然后进行测序确认以收集候选病毒。经批准的病毒随后由世界卫生组织全球流感监测和响应系统（GISRS）的附属中心交付给私营制造商。制造商在孵化的鸡蛋中大量生产病毒，然后纯化重组病毒。然后，使用甲醛或β-丙内酯化学灭活纯化的病毒，并标准化HA含量，去除非病毒蛋白的污染物。HA蛋白是诱导针对流感病毒的抗体的关键因素，因此是流感疫苗开发的重点。 尽管基于鸡蛋的制造方法有许多好处，例如通常获得高滴度的流感病毒和大规模生产的重要经验，但有几个缺点可能影响其效率。首先，重组病毒在鸡蛋中的适应性和筛选分离病毒的抗原性延迟了为下一个流感季节生产流感疫苗所需的时间，因此，必须在即将到来的流感季节之前很久就开始生产流感疫苗。然而，一些流感株（如H3N2病毒）在鸡蛋中生长不佳。因此，使用这些株的流感疫苗生产需要很长时间，并因影响标准生产时间框架而延迟疫苗的交付。在基于鸡蛋的制造过程中，病毒没有被监测并且会发生突变。这种鸡蛋适应性可能导致生产与循环株不匹配的病毒，从而导致疫苗效力下降。此外，由于潜在的禽流感病毒在鸡舍中的暴露风险，还存在生物安全问题。 7.2.基于细胞的疫苗 美国食品药品监督管理局（FDA）在2012年批准了Flucelvax，这是美国首个获批的基于细胞的流感疫苗。使用Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞来培养病毒。基于细胞的方法可以类似于基于鸡蛋的方法，使用选定毒株的HA和NA进行病毒的重组。与基于鸡蛋的方法相比，基于细胞的方法具有一些优势。首先，使用细胞可以克服鸡蛋短缺的限制，并由于依赖生物反应器的容量，提供了更灵活的疫苗生产方法。因此，与基于鸡蛋的疫苗相比，基于细胞的疫苗可以在更短的时间内生产。此外，在鸡蛋中培养病毒时可以观察到HA蛋白更异质的糖基化谱。一些研究调查了使用哺乳动物细胞作为基质可以增强疫苗免疫原性相对于禽类细胞的理论。 此外，基于细胞的疫苗是曾经经历过鸡蛋过敏的人的合适选择，因为它们的产品不含鸡蛋蛋白。有趣的是，基于细胞方法最重要的优势之一是缺乏由于鸡蛋适应而引起的HA突变。因此，在2016年，FDA批准了使用基于细胞的病毒，以防止由鸡蛋适应引起的进一步突变。 尽管基于细胞的方法存在优势，但仍然存在一些缺点。与基于鸡蛋的疫苗相比，大规模生产基于细胞的疫苗的经验仍然较少。此外，根据美国疾病控制中心（CDC），Flucelvax的成本比基于鸡蛋的疫苗高出40%。尽管程度较小，但在细胞培养中由于连续传代，HA和NA蛋白仍然可能发生突变。 8.流感疫苗配方和成分  疫苗必须含有确认对人类安全的成分。此外，每种疫苗成分都具有特定的目的，即增加抗原的免疫原性并保持疫苗配方稳定。 8.1.活性成分 病毒抗原，活性药物成分（API）作为免疫原性成分，是疫苗最关键的部分。每个流感季节，世界卫生组织（WHO）都推荐在四价疫苗中包含四种流感病毒，在三价疫苗中包含三种毒株。因此，四价流感疫苗包含四种流感毒株（两种流感A型毒株和两种流感B型毒株），三价流感疫苗包含三种流感毒株（两种流感A型毒株和一种流感B型毒株）。 8.2.佐剂 佐剂是改善疫苗免疫反应的化合物。其中包括如氢氧化铝（Panflu）、磷酸铝和硫酸铝钾等铝盐。佐剂被认为通过使抗原靠近注射部位，使免疫系统细胞容易接触到它们，从而增加免疫反应。疫苗中使用铝佐剂通常意味着每剂疫苗的抗原较少，在某些情况下，需要较少的疫苗剂量。疫苗中佐剂的使用通常与接种后注射部位的局部反应有关。其他佐剂也可以用于流感疫苗，如病毒体或油包水乳液（MF59、AS03、AF03）。Fluad Quad是澳大利亚唯一的含佐剂（MF59）流感疫苗。 8.3.稳定剂 稳定剂用于保持疫苗效力，通过在储存期间保持抗原和其他疫苗成分完整。稳定剂还防止疫苗成分粘附在疫苗瓶的侧面。稳定剂的例子包括糖（乳糖和蔗糖）和氨基酸（甘氨酸和谷氨酸钠）。 8.4.防腐剂 防腐剂用于某些疫苗配方中，以消除疫苗中的真菌和/或细菌感染。防腐剂最初是为了避免多剂量瓶中的细菌污染（不用于单剂量瓶疫苗）。硫柳汞、苯氧乙醇和苯酚是所使用的防腐剂之一。尽管全球范围内与使用防腐剂相关的重大有害效应相对较少，如过敏，但防腐剂已在众多疫苗接种中使用。 8.5.痕量成分 疫苗中的痕量成分是在生产初期使用的微量化学物质或物质，或从容器中浸出的，例如。根据生产程序，细胞培养液、鸡蛋蛋白、抗生素或灭活剂的痕量可能存在。在某些情况下，最终疫苗成分中只发现这些化合物的少量。 抗生素有时会在加工阶段使用，以确保不发生细菌污染。一些流感疫苗含有如新霉素、多黏菌素B和/或庆大霉素等抗生素。此外，预充疫苗注射器可能含有用作预充疫苗注射器润滑剂的硅油的痕迹。在WIV和分裂病毒灭活疫苗的开发过程中，使用灭活剂，最终疫苗含有相对较少的这些灭活化学物质或分裂剂，如甲醛、戊二醛或表面活性剂。 9.新型流感疫苗平台  9.1.类病毒颗粒（VLP）疫苗  VLP由表面病毒糖蛋白组成，它们自组装形成看起来像病毒的非复制颗粒。这些颗粒模仿原生病毒结构，但缺乏遗传物质，不能引起感染。VLP已成功开发为疫苗，并已用于对抗包括乙型肝炎病毒（Heptavax-B（由默克公司，新泽西州怀特豪斯）、Engerix-B（由葛兰素史克生物制品，比利时里克斯萨尔特）、H-B-VaxII（由默克公司，怀特豪斯，美国）和Hepavax-Gene（由杨森疫苗公司，韩国仁川））、人乳头瘤病毒（Gardasil（由默克公司，怀特豪斯，美国）、Cervarix（由葛兰素史克生物制品，比利时里克斯萨尔特）、Cecolin（由中国北京万泰生物制药）、Gardasil-9（由默克公司，怀特豪斯，美国））和戊型肝炎病毒HEV（Hecolin，由中国北京万泰生物制药）。因此，VLP平台已被证明是生产疫苗的良好策略，包括流感疫苗。 VLP已与乙型肝炎病毒核心（HBc）结合，并含有三个串联副本的M2蛋白（3M2e）以及核蛋白（NP）表位，以克服流感快速演变的挑战。VLP可以直接激活先天免疫，或通过刺激抗原呈递巨噬细胞或树突细胞，从而有效诱导病毒特异性T细胞和B细胞反应。此外，流感VLP疫苗可以包含几种不同的病毒蛋白（HA、NA、M1或M2e）在单个VLP上单独或组合，为更广泛的保护提供一定的灵活性。将纯病毒神经氨酸酶添加到传统流感疫苗中，可产生平衡且广泛的免疫反应。此外，由于蛋白质的保守性，M2e是通用疫苗开发的潜在靶标。由M1和NA组成的VLP复合物诱导了对同源和异源A亚型的反应性抗体反应和显著的保护水平。一些VLP流感疫苗候选物已进入临床试验（见表2）。Novavax公司的一种重组A（H1N1）2009流感VLP疫苗（HA）在2012年进行了2期临床试验，以评估其安全性和免疫原性。这种VLP流感疫苗在单次接种后显示出强大的免疫反应，仅有轻微的不良事件。此外，Medicago公司的一种基于植物的QVLP（HA）在2019年完成了2期临床试验。基于植物的VLP流感疫苗能够诱导强大的抗体反应和抗原特异性CD4+ T细胞。这些VLP疫苗候选物能够产生体液和/或细胞反应。它还通过诱导对四种不同流感毒株（两种流感A型和两种流感B型）的抗体，显示出交叉保护。 9.2.抗原呈递细胞（APC）诱导型疫苗 CD11c+ 树突状细胞（DCs）在病毒感染期间通过积累和转化病毒抗原为肽段，并通过主要组织相容性复合体（MHC）在二级淋巴器官向T细胞呈递，从而显著促进适应性抗病毒免疫反应。一些临床前工作已经进行，以通过诱导抗原呈递细胞来加强针对流感病毒的T细胞反应。例如，Fonteneau及其同事研究了流感病毒感染对纯化的血液DCs的影响及其向CD8+和CD4+ T细胞呈递病毒抗原的能力。他们证明，暴露于流感病毒可以诱导抗流感病毒的TH1型CD4+ T细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的扩增。这些发现表明DCs在产生抗病毒T细胞反应中具有新功能，暗示这些DCs在适应性免疫反应中扮演重要角色。另一种方法表明，将alpha-Gal表位嫁接到HA上可以增强APCs对流感疫苗病毒的摄取。因此，通过有效地针对APCs进行疫苗接种，可以增强流感病毒疫苗的免疫原性。此外，可以使用融合DNA疫苗将流感HA靶向到APCs，这些疫苗编码的蛋白能够双价地结合到流感HA上，将其靶向到APCs的不同表面分子上。这种靶向能够诱导对CD8+/Th1 T细胞反应或抗体/Th2反应的免疫反应。 9.3.基于纳米粒子的流感疫苗 传统的流感疫苗可以提供针对病毒的系统性保护；然而，对于流感病毒，也期望在粘膜呼吸道中提供局部保护。纳米粒子具有如溶解度和稳定性等特性，使它们适合粘膜免疫，因为它们能够诱导针对呼吸道病毒的免疫。这些纳米粒子可以来自天然或合成来源，并作为抗原载体。因此，与其他病毒相比，使用纳米粒子对抗流感病毒的研究更多。番木瓜花叶病毒纳米粒子被用作三价灭活流感疫苗的佐剂，并已在小鼠免疫中进行了测试。这种纳米粒子疫苗在诱导基于IgG2、IgA和支气管肺泡灌洗样本及血清中的IgG滴度的抗流感免疫方面，发现优于IIV，特别是在鼻内免疫后。此外，聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒子与流感A（H1N1）保守肽结合，并作为疫苗鼻内给药。这种疫苗能够诱导抗原特异性的CD4+和CD8+ T细胞，从而在猪的肺部诱导保护。因此，诱导能够针对感染过程中涉及的多个途径的交叉保护性抗体，对于更好地保护流感病毒将大有裨益。两种不同的保守流感抗原（螺旋C和基质蛋白2（M2e）的外域）被链接在一个自组装的纳米粒子中，以实现这一目标。它们能够在小鼠模型中诱导中和抗体。 9.4.通用流感疫苗 尽管疫苗接种是预防流感感染的最有效方式，但流感病毒的抗原转变和抗原漂移使它们能够逃避抗体中和。流感病毒的这些变化是不可预测的，因此流感疫情管理非常具有挑战性。为了克服当前流感疫苗的局限性，一种提供长期和广泛保护的通用流感疫苗将非常理想。理想的通用流感疫苗应该对所有流感病毒（A型和B型）的HA和NA亚型或抗原突变都有效。为了达到这个目标，疫苗应该诱导交叉保护性抗体，这可能通过针对HA、NA或M2或内部蛋白如M1和NP中发现的保守表位来实现。HA的茎或柄区域在不同毒株的流感病毒中高度保守，被认为是开发通用流感疫苗非常有希望的目标。此外，一些从人类中分离出的针对病毒柄区域的抗体能够中和所有流感A型病毒亚型，可以用于开发通用流感疫苗。例如，开发了一种顺序嵌合HA疫苗技术，将免疫反应从头部重定向到柄域（表3）。嵌合HA由来自第1组或第2组流感病毒的柄域和来自禽流感病毒亚型的头部域组成。在2020年完成I期临床试验后，这种通用流感疫苗候选物被发现是安全的，并能唤起针对血凝素保守、免疫亚显性柄的广泛、强烈、持久和有效的免疫反应。此外，开发了一种计算优化的广泛反应性抗原（COBRA）针对H1作为通用流感疫苗（表3）。为了评估B细胞的广度，由COBRA血凝素（HA）（称为P1）诱导的抗体分泌细胞与由历史H1N1疫苗株诱导的抗体分泌细胞进行了比较。P1 HA诱导的单克隆抗体（mAbs）展示了广泛的HA识别范围，从狭窄到广泛的反应性mAbs。还开发了一种新的疫苗Multimeric-001，通过包含流感A型和B型毒株的HA、NP和M1蛋白的保守线性表位，来防御季节性和大流行性流感病毒类型，与突变无关（表3）。这种疫苗在2020年的III期临床试验中进行了评估，以评估其保护和耐受性，以及体液和细胞免疫反应。该疫苗耐受性良好，没有记录到严重不良效应。体液和细胞反应表明，该疫苗具有针对突变无关的流感病毒株的交叉免疫。在接受季节性疫苗接种前给予Multimeric-001剂量的参与者中，与单独季节性疫苗接种相比，H1N1和H3N2株的抗体反应更大。此外，在接种Multimeric-001的人群中，与基线相比，H1N1、H3N2和流感B的CD4+和CD8+ T细胞反应有所增加。 10.疫苗产品的表征  大部分疫苗生产时间（70%）都用于质量测试，以确保纯度、效力和疫苗安全性。在流感疫苗开发过程中，需要进行广泛的表征，以确保生产步骤遵循现行良好生产规范（cGMP）。尽管疫苗生产不同，质量控制测试必须考虑某些物理化学参数的方面，如纯度、含量、均质性和稳定性。 10.1.纯度  疫苗的纯度是确定最终疫苗产品中“活性”疫苗抗原比例的关键物理化学标准。最终，通过疫苗抗原测量的纯度程度将取决于测试的特异性、额外的定量方法以及产品样本的准备，以及非产品杂质。因此，至关重要的是使用选择性测定法来测量潜在的非产品/工艺相关杂质（例如，宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和/或RNA、脂质、细胞培养诱导剂等）和产品相关杂质（例如，分子重量变体，如聚集体和降解产物），以界定低于定义量的污染物和杂质的存在。此外，需要通过过滤、离心或蒸发方法去除灭活剂来纯化IIV。需要在最终产品中去除分裂病毒疫苗中的分裂材料，如Triton-100，这可以通过过滤或其他分离方法如疏水作用色谱来完成。表4总结了几种可能使用的方法，通常结合使用，以确定疫苗纯度。例如，使用正交过程如质谱法，可以准确测量分子质量，并且还可以详细说明共价变化（即糖基化）的身份和位置。此外，由于杂质在质谱分析中可能表现出与疫苗抗原相同的质量/电荷（m/z）比率，因此使用另一种正交方法如光散射（尺寸排除色谱、多角度激光光散射）来测量基于半径的回转半径的质量，有助于在质谱分析中将疫苗抗原与未解决的杂质分离。 10.2.含量 HA是流感病毒中的主要抗原蛋白，疫苗中的HA含量必须足以激发免疫系统。因此，任何类型的流感疫苗中HA的含量必须达到15 µg/mL。使用传统的蛋白质估算方法如UV吸收280 nm、双缩脲酸测定、Bradford测定、Lowry测定、基于洗涤剂的荧光检测、带荧光染色的定量凝胶电泳、胺标记“衍生化”（使用荧光探针）和酶联免疫吸附测定（ELISA）来进行定量。尽管每种方法都有潜在的优点和缺点，但了解测量方法与样本体积、pH环境、灵敏度、通量、稳健性和测定精度之间的关系至关重要。最后，评估“活性”疫苗抗原在产品相关杂质存在下的数量对于制定正确的剂量指南至关重要。 10.3.均质性 可以使用多种技术确定疫苗抗原中蛋白质的大小或分子量：分离和散射方法是主要的两种方法。在分离方法中，可以对样本施加力（例如，机械、离心、电力），根据大小、电荷、疏水性等不同特征分离分子，然后根据其运动确定生物分子的大小、形状或电荷。分离方法包括色谱测定，如高效液相色谱、凝胶电泳和沉降平衡。除了光散射方法，质谱和荧光光谱等其他光谱方法在样品表征时也常被使用。此外，透射电子显微镜（TEM）和流动成像显微镜等显微镜方法在蛋白质表征方面也有重要应用（表4）。场流分离是一种根据分子在狭窄通道中层流的取向分离蛋白质/糖蛋白/颗粒的技术，较小的分子流动更快，较大的分子（无法快速分散）流动缓慢。使用质谱法评估蛋白质的分子量或规模有助于蛋白质识别，并在定量和定性阶段量化蛋白质纯度、共价修饰和降解产物。光散射和电子显微镜（EM）是用于表征和确定基于蛋白质/糖蛋白的疫苗抗原的大小或WIVs中病毒大小分布的两种常用技术。此外，疫苗产品中蛋白质聚集的存在可能影响疫苗的稳定性和效力。这些聚集体可能是由于在分裂病毒流感疫苗的生产中去除分裂剂（表面活性剂）引起的。除了EM和光散射，UV-Vis吸收光谱和荧光发射光谱是识别蛋白质聚集的可靠技术。EM是确定大型蛋白质或蛋白质复合物大小和形状的直接成像工具。然而，由于仪器的高成本和进行此类实验所需的专业知识，通常选择其他技术（如光散射）作为大小分析的主要方法。通过动态光散射可以测量分子量、分布、扩散系数和流体动力学半径。 10.4.稳定性 了解蛋白质/糖蛋白疫苗抗原的功能和稳定性对于疫苗在激发所需的保护性免疫反应方面的总体效力至关重要。疫苗的不稳定性可能由不同因素引起，如热量、光线、辐射、环境变化或与容器或其他疫苗成分的相互作用。过度加热或冷冻可能会加速疫苗效力的丧失。因此，必须谨慎处理疫苗，密切关注它们的处理，以确保它们质量高，并提供最大效力。这可以通过使用冷链将疫苗保持在限制性温度环境中（这是保持效力所需的）从生产者到最终消费者来实现。此外，在分裂病毒疫苗中，表面活性剂类型、孵化时间、病毒浓度、表面活性剂浓度和病毒分裂比例是可能影响疫苗稳定性的其他因素。例如，在稀释或去除表面活性剂后可能会出现聚集，因此应通过优化过滤步骤的数量来监测剩余表面活性剂浓度，以维持疫苗的稳定性和效力。可以使用多种分析方法来研究疫苗稳定性，如荧光发射光谱、UV-Vis吸收光谱和血凝抑制试验（HI）测定（表4）。由于聚集和/或降解是影响蛋白质/糖蛋白稳定性的典型特征，利用这些分析方法有助于识别聚集体的大小或分子量，以了解疫苗的短期和长期稳定性。 11.流感疫苗的有效性 流感疫苗的有效性一直是流感疫苗的主要问题，因此每年都会评估季节性流感疫苗的有效性。疫苗的有效性测量可能会受到一些因素的影响，如被调查的人群、研究设计、评估的结果以及分析的流感疫苗季节。通常情况下，在流感季节，当大多数流通的流感病毒与流感疫苗中使用的病毒非常匹配时，流感疫苗接种会降低一般人群感染流感疾病的风险，降低幅度在40%到60%之间。然而，如果流感疫苗与流行病毒匹配度不高，则对由常见流通病毒引起的疾病几乎没有或没有保护作用。因此，流感疫苗的有效性每年都有所不同，从2004-2005年的10%到2010-2011年的60%不等（见图6）。 图6.根据美国疾病控制中心的数据，2004年至2020年间季节性流感疫苗在美国的有效性波动。 许多参数导致疫苗反应的不一致性，包括内在的病毒特性以及宿主因素。越来越多的数据表明，宿主变量如年龄、性别、怀孕和免疫历史在改变流感疫苗的有效性方面发挥重要作用。因此，更好地了解影响流感疫苗诱导的免疫的宿主变量，可能有助于通过优化甚至定制疫苗类型、剂量和佐剂使用，提高现有季节性和未来通用流感疫苗的有效性。自2004年以来，通常使用测试阴性设计（TND）来测量流感疫苗的有效性，当时卫生官员开始追踪流感疫苗的有效性。TND是一种修改后的病例对照方法，它对比了因流感样症状来到医疗保健场所的个体的疫苗接种状况。尽管它最大限度地减少了与寻求医疗活动相关的选择偏差，但它的局限性在于它只包括寻求呼吸疾病治疗的人。然而，随机对照试验更适合测量疫苗的有效性，因为它们较少受到选择和混杂偏差的影响。 为了提高流感疫苗的有效性，可以使用不同的策略。例如，增加疫苗的HA抗原剂量，以实现更高的血凝抑制滴度和免疫原性。最近的元分析显示，高剂量IIV比标准剂量IIV更有益于避免因流感住院，以及减少65岁以上个体与流感相关的死亡率。使用皮内疫苗接种是提高疫苗有效性的另一种选择，显示出等于或优于通过肌肉注射获得的血凝抑制水平。这归因于真皮内抗原呈递细胞数量的增加，这是增强皮内疫苗接种免疫原性的机制之一。向疫苗中添加佐剂是另一种提高疫苗效力的方法。与无佐剂的三价灭活疫苗相比，引入新型佐剂三价灭活疫苗已被证明可以增强老年人的免疫反应，并减少因流感和肺炎住院的风险。另一个选择是使用非基于鸡蛋的系统，以避免突变和其他变化，如在病毒鸡蛋适应过程中病毒蛋白的翻译后修饰，包括糖基化。 12.结论  由于广泛的病毒变异和漂移，流感可以逃避宿主的免疫防御，因此，它仍然是一个重要的、周期性的全球公共卫生挑战。因此，需要每年更新流感疫苗。目前市场上有三种流感疫苗：灭活流感疫苗（IIV）、减毒活流感疫苗（LAIV）和重组血凝素（HA）疫苗。像大多数其他疫苗一样，流感疫苗的配方复杂，需要几个关键成分，如病毒抗原、佐剂、防腐剂和稳定剂，以保持稳定和有效的疫苗配方。此外，疫苗在加工步骤和最终产品中经过许多质量测试，以确保疫苗符合标准并且安全使用。尽管如此，仍需要更多的研究来克服当前流感疫苗的局限性，如效力低、生产时间长以及缺乏交叉保护。为此，新的流感疫苗候选物正在进行中，以提高疫苗效力或提供针对许多不同毒株的交叉保护（即通用流感疫苗），以克服每年更新疫苗的需求。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。