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新药研发是医药公司运转的齿轮，推动公司发展，是一项投资高、风险高、周期长，竞争激烈，但利润率高的工程。10年时间，花费10亿美元，研发一款新药，无论是利益的驱动，还是拯救万千患者的成就感，药企的这一行为都值得我们尊敬。 一款新药从研发到上市，都要经历那些过程呢？本文以小分子药物为例，大致梳理整个流程。 新药的研发分为两个阶段：研究和开发。这两个阶段是相继发生又互相联系的。区分两个阶段的标志是候选药物的确定，即在确定候选药物之前为研究阶段，确定之后的工作为开发阶段。所谓候选药物是指拟进行系统的临床前试验并进入临床研究的活性化合物。 1 新药研究阶段 研究阶段包括四个重要环节，即药物作用靶点（target）以及生物标记（biomarker）的选择与确认、先导化合物（lead compound）的确定、构效关系的研究与活性化合物的筛选、候选药物（candidate）的确定。 1 药物作用靶点及生物标记的选择与确认 早期人们对药物作用靶标认识有限，往往只知道有效，但不知如何起效。比如，百年来，人们知道阿司匹林（aspirin）具有解热、消炎、止痛、抗血栓，甚至抗癌作用。直到1971年，英国人John R. Vane 在《Nature》期刊发文才阐明了Aspirin作用机理为抑制前列腺素合成，并于1982荣获Nobel生理和医学奖。现代生物医学的研究进展，以及人类基因图谱的建立，让人类对疾病的机理了解更加准确，为新药开发提供了明确的方向、具体的靶标。 一般而言，药物作用的新靶点一旦被发现，往往会成为一系列新药发现的突破口。通俗易懂一点解释，如果把疾病比作一把锁，那么靶点为锁芯，如若找到锁芯，研究出锁芯的立体结构，那么我们就可以根据它的立体结构为其配备一把专有的钥匙，那么该新药即为这把专有的钥匙。 2 先导化合物（lead compound）的确定 一旦选定了药物作用的靶标，药物化学家（medicinal chemist）首先要找到一个对该靶标有作用的化合物。这个化合物可以来自天然产物（动物、植物、海洋生物）；也可以是根据靶标的空间结构，计算机模拟设计、合成的化合物；还可以根据文献报道或以前其它项目的研究发现。比如，某一类化合物具有作用于该靶标的药理活性或副反应等等。目前我们常用的方法是跟踪国外研发机构对某一靶标的药物开发，以他们的化合物作为先导，希望设计出更优秀的化合物。 3 构效关系的研究与活性化合物的筛选 围绕先导化合物，设计并合成大量新化合物，通过对所合成化合物活性数据与化合物结构的构效关系分析，进一步有效的指导后续的化合物结构优化和修饰，以期得到活性更好的化合物。 4 候选药物（candidate）的确定 候选药物的确定标志着分子设计、化学合成、生物评价循环反馈的完成，达到了新药开发的标准。候选药物的确定也没有统一的标准，每个项目选择的候选药物数量也不尽相同，总的趋势是要求候选药物具有较好的成药性，为了降低研发失败的概率、缩短开发时间，候选药物的选定一般要遵循以下原则。 图表：候选药物的确定遵循的一般原则 资料来源：药物化学总论，中金公司研究部 2 新药开发阶段 候选药物确定后，新药研发就进入开发阶段，开发阶段主要分为以下五个环节：临床前实验、临床研究、新药申请、批准上市、上市后检测。 图表：新药临床开发过程 资料来源：CNKI，中金公司研究部 1 临床前实验 化学、制造和控制（Chemical Manufacture and Control, CMC） 新药开发工作的第一步是原料药合成工艺研发（Process R & D），这是一个不断改进、完善的过程。第一批提供的原料药主要用于毒理研究（100—1000g），要求是越快越好，成本不是主要考虑因素。因此，只要药化路线能够实现毒理批合成，工艺研发部门就会采用。但随着项目的推进，工艺部门会根据需要设计全新合成路线，开发合理生产工艺来满足从I—III期临床用药与商业化的需求；同理，制剂部门首先也会以最简单的形式给药，完成毒理研究，然后不断完成处方工艺研究，开发出商业化的制剂工艺。 药代动力学（Pharmacokinetics, PK） 了解药物在动物体内的吸收、分布、代谢、排泄（ADME），这些数据可以指导临床研究以何种形式给药（口服、吸入、针剂），给药频率与剂量。 安全性药理（Safety Pharmacology） 证明该化合物针对特定目标疾病具有生物活性，同时评估药物对疗效以外的作用，比如可能的副作用，尤其是对心血管、呼吸、中枢神经系统的影响。 毒理研究（Toxicology） 毒理研究种类较多，包括急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性、生殖毒性、致癌性、致突变性等。为了加速新药能及早验证是否有疗效，尤其是对一些抗癌药，有些耗时费钱的毒理实验（如致癌性、生殖毒性）是可容许在临床试验阶段再进行。 制剂开发 制剂开发是药物研发的一个重要环节。早期制剂研究并不需要完整的处方开发，所有研究围绕毒理学研究和一期临床时方便给药即可，目的是将候选药物尽快推向临床。随着项目推进，给药方式和处方研究就越来越全面。比如，有的药胃肠吸收很差，就需要开发为注射剂。有的药对在胃酸里面会失去活性，就需要开发为肠溶制剂。有的化合物溶解性不好，也可以通过制剂来部分解决这个问题。 前面这些内容都统称为临床前研究，是药物开发的第一阶段。临床前各个实验的步骤可不是严格按照上述这个顺序展开，而是一个相互包容、相互协调的关系。比如，原料药工艺研发部门，完成毒理批样品合成后，就必须立即开展合成路线的选择，开发新的合成工艺，提供足够量的原料药以满足制剂部门制剂研究用原料药和9-12个月后开展I期临床用药的需求。 2 临床研究(Clinical studies) 当一个化合物通过了临床前试验后，需要向药监部门提交新药临床研究申请（IND），以便可以将该化合物应用于人体试验。新药临床研究申请需要提供先前试验的材料；以及计划将在什么地方，由谁以及如何进行临床试验的说明；新化合物的结构；给药方式；动物试验中发现的所有毒性情况；该化合物的制造生产情况。所有临床方案必须经过伦理审评委员会（Institutional Review Board，IRB）的审查和通过，每年还必须向FDA和IRB汇报一次临床试验的进程和结果。在美国，如果在提交申请后30天内FDA没有驳回申请，那么该新药临床研究申请即被视为有效，可以进行人体试验。在中国则需要获得NMPA正式批准，方可进入临床。  1 Ⅰ期临床试验 在新药开发过程中，将新药第一次用于人体以研究新药的性质的试验，称之为Ⅰ期临床试验。这一阶段的临床试验一般需要征集20－100名正常和健康的志愿者（对肿瘤药物而言通常为肿瘤病人，但人数更少），在严格控制的条件下，给不同剂量（随着对新药的安全性了解的增加，给药的剂量也逐渐提高，并可以多剂量给药）的药物试验于健康志愿者，住院以进行24小时的密切监护，仔细监测药物的血液浓度、排泄性质和任何有益反应或不良作用，以评价药物在人体内的性质。 同时也要通过这一阶段的临床试验获得其吸收、分布、代谢和排泄以及药效持续时间的数据和资料；以及药物最高和最低剂量的信息，以便确定将来在病人身上使用的合适剂量。可见,Ⅰ期临床试验是初步的临床药理学及人体安全性评价试验，目的在于观测人体对新药的耐受程度和药代动力学，为制定给药方案和安全剂量提供依据。 2  Ⅱ期临床试验 为了证实药品的治疗作用的，就必须在真正的病人身上进行临床研究，即Ⅱ期临床试验。Ⅱ期的临床试验通常需要征集100－500名相关病人进行试验。其主要目的是获得药物治疗有效性资料。 将试验新药给一定数量的病人志愿者，评价药物的药代动力学和排泄情况。这是因为药物在患病状态的人体内的作用方式与健康志愿者是不同的，对那些影响肠、胃、肝、和肾的药物尤其如此。Ⅱ期临床试验一般通过随机盲法对照试验（根据具体目的也可以采取其他设计形式），对新药的有效性和安全性作出初步评价，并为设计Ⅲ期临床试验和确定给药剂量方案提供依据。  3  Ⅲ期临床试验 当一个新药推进到三期临床，原料药和制剂工艺研究也推进到了相应的阶段。三期临床用药以商业化生产工艺提供临床用药。一般来讲，商业化生产的原料药生产工艺应该考虑以下因素：产品质量，生产安全性，生产成本，环境影响，生产的稳定性和可持续性。 Ⅲ期的临床试验通常需1000－5000名临床和住院病人，在医生的严格监控下，进一步获得该药物的有效性资料和鉴定副作用，以及与其他药物的相互作用关系。该阶段试验一般将对试验药物和安慰剂（不含活性物质）或已上市药品的有关参数进行对照和双盲法试验（医生和病人都不知道自己吃的是新药、老药或安慰剂），在更大范围的病人志愿者身上，进行扩大的多中心临床试验。最后，根据严格统计学数据分析，进一步评价药物的有效性和耐受性（或安全性），决定新药是否优于（superior）或不差于（not inferior）市场现有的“老药”。Ⅲ期临床试验是治疗作用的确证阶段，也是为药品注册申请获得批准提供依据的关键阶段，该阶段是临床研究项目的最繁忙和任务最集中的部分，无疑是整个临床试验中最重要的一步。三期临床研究往往持续好几年。 除了对成年病人研究外，还要特别研究药物对老年病人，有时还要包括儿童的安全性。一般来讲，老年病人和危重病人所要求的剂量要低一些，因为他们的身体不能有效地清除药物，使得他们对不良反应的耐受性更差，所以应当进行特别的研究来确定剂量。而儿童人群具有突变敏感性、迟发毒性和不同的药物代谢动力学性质等特点，因此在决定药物应用于儿童人群时，权衡疗效和药物不良反应应当是一个需要特别关注的问题。在国外，儿童参加的临床试验一般放在成人试验的Ⅲ期临床后才开始。如果一种疾病主要发生在儿童，并且很严重又没有其他治疗方法，美国食品与药品管理局允许Ⅰ期临床试验真接从儿童开始，即在不存在成人数据参照的情况下，允许从儿童开始药理评价。我国对此尚无明确规定。 上述任何一步反馈得到的结果不好，都有可能让一个候选药物胎死腹中。最悲惨的结果可能是这个项目就直接被取消了。2007年，Merck有四个三期临床药物失败。 能够通过全部3期临床评价而上市的新药越来越少，部分原因是开发出比市场上现有药物综合评价更好的新药越来越难。而一个药物从源头研发到3期临床是一个耗资巨大的过程。公开数据表明，平均下来一个新药要花费约为十亿美金（1 billion US dollars）。正是因为药物研发的耗资巨大，大公司花不起那么多钱同时展开多个项目研究，小公司又没有那么多的财力完成药物研发的全部流程。现在的药物研发的一个趋势是，小公司反而能够更好的找准市场上的空缺，开发出在临床前研究阶段具有良好表现的候选药物。这时大公司通过并购小公司或者购买专利（或者使用权），将这个项目买过来继续开发。如果是购买专利的情况，则会根据这个项目最后能够进展到哪个阶段，完成后相应得再支付给小公司一笔“奖金”，叫做milestone。 3 新药申请（New drug application, NDA） 完成所有三个阶段的临床试验并分析所有资料及数据，药物的安全性和有效性得到了证明，新药持有人则可以向药监部门提交新药申请。新药申请需要提供所有收集到的科学资料。通常一份新药申请材料可多达100000 页，甚至更多！按照法规，FDA应在6个月内审评完新药申请。但是由于大部分申请材料过多，而且有许多不规范，因此往往不能在这么短的时间内完成。中国药监局也在努力改进工作，期望缩短审批时间。 4 批准上市  新药申请一旦获得药监部门批准，该新药即可正式上市销售，供医生和病人选择。但是新药持有人还必须定期向药监部门呈交有关资料，包括该药物的副作用情况和质量管理记录。对于有些药物药监部门还会要求做第四期临床试验，以观测其长期副作用情况。 如果能够走到这一步，那么暂时可以说是大功告成了。从最开始的备选化合物走到这一步的药物寥寥无几。但是批准上市了并不代表这个药物就高枕无忧了。因为还有后面一步。 5 IV期临床研究（药物上市后监测） 药物在大范围人群应用后，需要对其疗效和不良反应继续进行监测。药监部门要求根据这一阶段的监测结果来修订药物使用说明书。这一阶段研究还会涉及到的一些内容有，药物配伍使用的研究，药物使用禁忌。如果批准上市的药物在这一阶段被发现之前研究中没有发现的严重不良反应，比如显著增加服药人群心血管疾病发生率之类的，药物还会被监管部门强制要求加注警告说明，甚至下架。如Merck的抗关节炎药物Vioxx 因增加心血管疾病风险于2004 年“主动”撤离市场。 新药研发是一个高风险，高投入，当然也是高回报的行业。研发周期长，涉及多学科、多专业的密切配合与协调。如果一个新药研发机构各专业职能部门配套合理，各专业人员能够做好各自的本职工作，又注重各专业间的配合和与药监局的及时沟通，新药研发管理并不复杂，只要有一个负责任的项目管理员，根据约定的项目关键时间节点及时协调各个职能部门的工作，项目就可按计划有序进行。 中国和美国在新药研发相关流程上的不同之处 3 产业前景 创新药是科技属性非常强的行业，其代表的是最尖端的生命科学和生物科技，可以说生物医药行业的新技术也是层出不穷。 一方面稍有接触医药行业的都知道，一旦新药研发成功，尤其是First in Class的一些新药，上市后给药企带来的回报是非常丰厚的；另一方面国内很少关注新药研发失败的问题，这和前期国内新药研发以Me Too和Me Better型的新药研发为主有关，但是随着现有靶点研发管线的拥挤程度越来越高，找寻First in Class的机会就变得更为重要，研发失败的风险也将迅速扩大，实际上即使进入临床阶段的新药，成功上市的比例也仅有十分之一左右。 因此可以说创新药是十足的“高风险”+“高收益”的行业。面对这样一种行业属性，该如何把握行业大的发展机遇，核心是赛道、团队、格局，三者缺一不可。 首先，赛道很大程度上决定高度，赛道的选择列在首位。其次，研发团队和核心高管是创新药企的灵魂，一个或几个核心的灵魂人物带领的一个研发团队搭建出的研发平台是一家药企最核心的竞争力。最后，创新药的投资需要更大的格局，包括医疗保健支出不会因为仿制药的带量采购而下降，反而是给了创新药、创新器械和医疗服务更大的施展空间，中国未来会是几千亿美元级别的创新药市场。    研发流程类 来源：公众号新药社 三张图cover抗体药物开发全流程 以上两张图来源：https://ncats.nih.gov/translation/maps（最后更新于 2017 年 11 月）    临床研究类   申报流程类 来源：公众号RAtypical 药品加快上市申请 来源于CDE老师PPT 撰稿人 | 新药研发质量指南 责任编辑 | 邵丽竹 审核人 | 何发 推荐阅读 特别专题 | 访菲特中国：从实验室到生产，以全链条本土化创新重塑制药行业生态 从仿制到首创：中国制药业正迈向全球化临界点 人工智能在生物医药领域的应用前景分析及对策建议 文章信息源于公众号新药研发质量指南，由“制药工艺与装备“公众号转载。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。

摘要   类器官是由干细胞衍生的三维结构，能够重现相应组织的关键结构和功能特征。与传统的二维细胞系相比，人体类器官提供了更接近人类生理的实验模型。它们能够捕捉人类组织的复杂性和异质性，从而用于研究疾病机制、药物疗效和毒性。当从患者材料生成时，类器官还可以评估个体对药物的反应。在本综述中，我们探讨了类器官在药物发现中的应用。我们概述了生成和维持类器官的当前方法，考察了它们在疾病建模、药物筛选和安全性评估中的应用，并考虑了监管方面以及它们在药物发现中更广泛应用所面临的挑战。 引言 在药物发现中，体外模型通过提供用于研究细胞对药物反应的明确实验系统发挥着关键作用。由于其相对简单、低成本以及在研究实验室中的广泛可及性，人类细胞系传统上一直被用作药物发现的主力。细胞系通常来源于肿瘤，并已适应在二维塑料表面上生长。因此，细胞系无法代表组织结构，也不包含各个器官的功能细胞类型。这促使人们探索更符合生理的三维培养系统，例如类器官，以更精确地模拟体内微环境。与动物实验相比，类器官更具成本效益，并且能够实现高通量筛选（HTS），同时避免了动物实验中涉及的物种差异和伦理问题。Mina Bissell及其同事在通过使用Matrigel（一种类似细胞外基质的水凝胶）开创上皮细胞三维培养方面发挥了重要作用。在三维Matrigel培养环境中，细胞能够进行更符合生理的细胞间和细胞与基质间的相互作用。事实上，Bissell证明乳腺来源的上皮细胞可以在Matrigel中形成三维腺体结构。这些类器官甚至可以被诱导分泌乳汁。 利用多能干细胞（PS细胞）开发类器官技术的起源可以追溯到20世纪80年代胚胎干细胞（ES细胞）的发现。ES细胞自然存在于囊胚期胚胎中，但在特定条件下可以长期培养，并且理论上可以在正确的生长因子条件下被指导分化为任何细胞类型，例如神经元或心肌细胞。然而，由于ES细胞来源于早期人类胚胎，其提取会导致胚胎的破坏，由此产生的物流和伦理挑战限制了人类ES细胞的广泛应用。2006年，Shinya Yamanaka发明了诱导多能干细胞（iPS细胞），通过转染四个转录因子将成年组织中的体细胞重新编程为iPS细胞，从而解决了这些问题。PS细胞的研究主要采用了二维培养方法。当科学家开始探索三维培养技术，例如球形iPS细胞聚集时，发现PS细胞可以自发形成更复杂的结构。Yoshiki Sasai团队率先开发出基于PS细胞的类器官模型，这些模型类似于视网膜和中枢神经系统（CNS）的其他部分。这些结构能够自我组织，重现实际器官的关键特征，包括细胞类型多样性和空间组织。目前，用于生成代表各种人类组织的PS细胞类器官的标准协议正以不断增加的速度被开发出来。这些通常需要数周甚至数月的协议，从微小的iPS细胞团开始，专注于优化营养供应，同时模拟顺序发育信号环境，以引导PS细胞向目标组织分化（图1a）。流行的PS细胞衍生类器官可以模拟大脑、视网膜、肺、肾脏、肝脏和肠道等组织。 图1：多能干细胞和组织干细胞衍生的人类类器官。 a, 诱导多能干细胞（iPS细胞）衍生类器官的生成流程。从iPS细胞生成类器官需要逐步进行谱系特异性分化，以模拟体内胚胎发育过程，从多能性逐步发展到目标器官。iPS细胞通常以细胞团的形式收获，这些细胞团保持细胞间接触，并能够自发形成复杂结构。类器官首先通过应用适当的微环境因子被引导至特定的胚层，然后利用组织特异性的发育信号进一步分化为器官特异性的细胞类型。生成的类器官通常可以达到晚期胎儿发育阶段。图中展示了参与胚层特异性和细胞类型特异性分化或成熟的代表性信号因子。 b, 组织干细胞（TSC）衍生类器官的生成流程。组织被处理成单细胞或小片段，然后直接嵌入细胞外基质（如Matrigel）中进行三维培养。由于细胞来源于目标器官的活检样本，因此跳过了PS细胞衍生类器官所必需的谱系特异性步骤。基于TSC的类器官培养只需要支持长期扩增的因子，因此通常建立时间更短。TSC衍生类器官中的功能性细胞类型分化可以与干细胞自我更新自发进行，也可以通过使用细胞类型特异性的微环境因子进一步诱导。TSC衍生类器官可以从含有活跃干细胞的组织（如消化道）中高效建立，而非自我更新的组织（大脑、视网膜、心肌）只能从iPS细胞生成。利用基于CRISPR的基因编辑技术可以将与疾病相关的遗传突变引入类器官模型。这一过程需要编辑后的细胞具有高度增殖能力，以支持其从单个细胞生长，因此基因编辑通常在谱系特异性和细胞分化之前，在iPS细胞或TSC中进行。ALK，间变性淋巴瘤激酶；BMP，骨形态发生蛋白；EGF，表皮生长因子；FGF，成纤维细胞生长因子；HGF，肝细胞生长因子；HHi，Hedgehog抑制剂；IGF，胰岛素样生长因子；OSM，肿瘤坏死因子；RA，视黄酸；TGF，转化生长因子；VEGF，血管内皮生长因子；VitC，维生素C。 几乎所有器官都通过其组织干细胞（TSCs）的作用来替换受损或磨损的细胞，心脏肌肉、肾脏肾小球和中枢神经系统（CNS）的大部分可能是例外。骨髓中的造血干细胞是最早被发现的TSCs。后来，在皮肤、角膜和肠黏膜等组织中发现了上皮TSCs。2009年，我们证明单个来自肠上皮的TSC可以创建不断扩增的上皮类器官，其中包含所有相关的肠细胞类型，展示了TSCs及其细胞后代的固有自我组织能力。与iPS细胞类似，特定的生长因子和细胞外基质（ECM）成分对于引导TSC扩增和分化为各种感兴趣的细胞类型至关重要（图1b）。与基于PS细胞的方法的主要区别在于，基于TSC的类器官是从活检样本或其他原发组织来源建立的（而不是从基于iPS细胞的培养物中），不需要在体外指定到目标组织。 在过去十年中，类器官研究的数量迅速增长，该技术似乎已准备好开始实现其在药物开发中的各种承诺。人类类器官提供了可以补充传统二维人类细胞系和动物模型的体外实验模型（表1）。如上所述，细胞系对其起源组织的代表性很差：它们几乎不可避免地经历了某种形式的恶性转化，要么是因为它们来自癌症，要么是因为它们已广泛适应在塑料表面上的二维生长。实际上，当移植时，细胞系通常会形成肿瘤，而移植的类器官则会产生健康、功能正常的组织。与细胞系相比，动物模型的优势在于能够在整个生物体的背景下重现生物现象，但它们也有局限性：由于固有的物种间差异，许多人类疾病仍然难以在动物中复制。同样，动物和人类之间的生理差异限制了对药物安全性和有效性的准确预测。此外，由于伦理考虑，动物的使用受到越来越多的监管。2022年，美国国会通过了FDA现代化法案2.0，随后又通过了法案3.0，以澄清药物开发中对动物模型的感知需求。最近，FDA宣布打算在单克隆抗体疗法和其他药物的开发中逐步淘汰动物实验。因此，监管机构正在积极探索替代方法。 表1：人类类器官与传统临床前模型的比较 在本综述中，我们概述了生成和维持类器官的方法，并强调了它们在疾病建模、治疗筛选以及药物药理学和毒性评估中的应用。我们还讨论了它们在个性化医疗中的潜力，即可以从患者自身的细胞中衍生出类器官，从而实现个体化药物测试。最后，我们探讨了监管方面的考虑以及必须解决的挑战，以便类器官平台成为药物开发中的成熟工具。 疾病建模 类器官已被应用于多种疾病领域，包括遗传性疾病、癌症和传染病（图2）。 图2：疾病建模中不同类型的类器官 类器官能够复制真实器官的（病理）生理特征，例如大脑、肾脏、肝脏、肺和肠道。与永生化细胞系相比，类器官具有复杂的组织结构，具有区域特异性和正确的细胞极性。它们包含成熟的细胞谱系，有助于进行功能性检测。值得注意的是，类器官表达关键的受体和细胞内成分，能够支持病原体感染并维持这些病原体的完整生命周期。这些独特的特征（总结在上图中）使类器官在建模疾病（包括遗传性疾病、感染和各种癌症）方面具有重要价值。此外，通过引入免疫细胞等微环境成分，类器官可以建模并研究炎症性疾病，并为疾病机制和潜在治疗提供见解。建模的疾病示例显示在下图中。MASH，代谢功能障碍相关脂肪性肝炎；EEC，肠内分泌细胞；SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2。 遗传性疾病   人类类器官似乎特别适合用于建模遗传性疾病。它们可以直接从受累器官的活检样本中获得（患者来源的类器官，PDOs），或者通过CRISPR介导的基因编辑从健康个体获得的类器官中产生。 囊性纤维化（CF） 囊性纤维化是一种常染色体隐性遗传病，由CFTR基因的功能丧失突变引起。该基因编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR），这是一种氯化物/碳酸氢盐通道，对包括肺和肠在内的多种上皮组织中的离子和液体稳态至关重要。目前已开发出几种CFTR调节剂，例如Orkambi，它由两种化合物（ivacaftor和lumacaftor）组成，专门针对携带同源CFTRΔ508突变的患者，约占CF人群的50%。然而，患者对这种药物的反应存在差异，即使携带相同的基因突变，因为CFTR调节剂的活性受到细胞和遗传背景的影响。值得注意的是，CF的遗传基础及其在人类和现有小鼠模型中的症状也存在显著差异。Cftr突变（包括CftrΔ508）小鼠不会发展出CF患者所观察到的严重呼吸道疾病，如黏液积聚、气道阻塞或慢性肺部感染。CF是第一个通过PDOs实现个性化医疗方法的疾病。 CFTR通道由cAMP激活。在健康的肠道或气道类器官中，加入forskolin（一种通过刺激腺苷酸环化酶将ATP转化为cAMP从而提高cAMP水平的化合物）会触发类器官快速膨胀，这是由于CFTR介导的水分流入腔内所致。相比之下，来自CF患者的类器官对forskolin无膨胀反应。这种膨胀失败可以通过CRISPR基础的CFTR突变校正或使用有效的CFTR调节剂治疗来挽救。重要的是，通过这种膨胀检测测量的药物反应与患者的临床结果（如预测的1秒用力呼气量百分比（ppFEV1）和痰细胞计数（SCC））密切相关。类器官膨胀检测的简单性也使其适用于药物高通量筛选（HTS）。 原发性纤毛运动障碍（PCD） 原发性纤毛运动障碍是另一种影响气道的遗传性疾病，由与纤毛结构相关的基因突变引起，包括DNAH5/11、DNAI1和CCDC39/40，可以通过来自PCD患者的鼻气道类器官进行研究。这些类器官允许直接观察纤毛的摆动，并通过电子显微镜成像观察结构变化。通过prime editing校正DNAH11基因突变，该类器官模型已显示出基因治疗的潜力。由SFTPB（编码肺表面活性物质相关蛋白B）和SFTPC等基因突变引起的表面活性蛋白缺乏症会导致家族性肺纤维化。由肺泡II型（AT2）细胞产生的表面活性蛋白可降低肺泡中气-液界面的表面张力，从而防止肺泡在呼吸过程中发生萎陷（肺不张），便于肺扩张和高效的气体交换。最近有报道称从胎儿肺中衍生出AT2细胞类器官，来自SFTPB缺乏症患者的iPS细胞衍生肺类器官重现了特征性的异常板层小体形成，通过重新表达野生型SFTPB得以挽救。 肾脏疾病 肾脏疾病也可以通过类器官进行建模。多囊肾病（PKD）是最常见的遗传性肾脏疾病，通过携带PKD1或PKD2突变的患者肾脏类器官进行研究，这两个基因分别编码多囊素1和多囊素2。这些类器官重现了常染色体显性PKD（ADPKD）的标志性特征——囊肿形成，同时也表达了ADPKD基因特征。利用可扩展的ADPKD类器官进行高通量筛选，已发现了一些有前景的化合物，可以减少囊肿生长，包括可能的核因子-κB（NF-κB）通路调节剂——喹唑啉。最近，利用携带PKHD1突变的iPS细胞衍生肾脏类器官建立了一个类器官芯片平台（Box 1和图3a），该基因编码纤维囊蛋白。该系统模拟了原生组织微环境中的液体流动，并重现了常染色体隐性PKD（ARPKD）患者的囊肿生成，为药物测试提供了具有临床相关性的表型。 图3：疾病建模和药物安全性评估中的先进类器官系统 a, 物质递送与扩散策略。病原体受体和化合物转运蛋白或通道可能不对称地分布在细胞的顶端表面。传统的类器官通常嵌入Matrigel中，其基底外侧表面暴露（顶端朝内），需要将病原体或化合物微注入类器官腔内以提高递送效率。通过去除Matrigel生成的翻转（顶端朝外）类器官，可以减轻与递送和扩散相关的挑战，同时保留类器官的三维结构。在二维Transwell培养中，类器官细胞的顶端和基底外侧表面均易于接触，能够与外部环境进行全面互动。类似于Transwell系统，生物工程化的微流控平台通过配备有入口和出口的多个腔室，从类器官细胞的顶端和基底外侧表面精确控制物质递送。 b, 具有改进的组织级复杂性和组织结构的先进类器官模型。在无Matrigel的悬浮培养系统中，各种细胞类型的混合物可以自发聚集形成组装体（assembloids），细胞外基质由内皮细胞和基质细胞等不同细胞类型提供。尽管组装体显著增强了细胞复杂性，但未能准确反映组织的组织结构。生物打印的类器官展现出多样细胞系谱的优越排列，紧密模拟自然组织的结构，即具有改进的血管网络、神经支配模式和区域化。当在生物工程芯片上培养时，不同细胞类型（如内皮细胞、基质细胞或免疫细胞）可以被系统地整合和组织，通过定制设计实现复杂的组织级结构。 Box 1 类器官的演变 大多数现有的类器官模型缺乏血管、免疫细胞和神经支配等关键组织成分，而这些成分对于重现人类组织的完整生理环境至关重要。研究人员已经开始通过将类器官与内皮细胞共培养（“三维生物打印”或“微工程组装体”）或将微流控系统（“类器官芯片”）用于创建血流通道，将血管网络整合到类器官模型中（图3）。例如，在肝脏类器官中加入人内皮细胞，能够形成类似功能性血管的结构，改善组织功能并模拟肝脏的自然灌注。同样，通过将免疫细胞群体（如巨噬细胞、树突状细胞和T细胞）整合到类器官培养中，解决了类器官中缺乏免疫细胞的问题。在癌症研究中，一种方法是将患者来源的免疫细胞整合到肿瘤类器官中，从而能够在肿瘤微环境中研究免疫反应并测试免疫调节疗法。最后，通过将类器官与神经元共培养或将神经祖细胞整合到类器官中以创建神经类器官，部分克服了类器官缺乏神经支配的问题。 对于相对均质的类器官或不依赖三维结构的检测，将类器官细胞培养为二维单层是一种可行的替代方案。通常，起始细胞团是在三维培养中生成的。二维方法减少了孔间差异，提高了检测的一致性和可重复性。平坦的单层结构也支持快速和高内涵成像，并便于整合到复杂系统中，例如“类器官芯片”，该系统在存在基质细胞类型（包括内皮细胞和免疫细胞）的情况下研究药物效应。我们最近描述了一种细菌蛋白——耶尔森菌侵袭素，它可以涂覆在二维Transwell上，完全替代Matrigel。值得注意的是，二维Transwell系统还可以改善药物安全性和代谢测试，这可能需要能够接触类器官的顶端和基底表面。 遗传性肝脏疾病  α1-抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）是一种单基因疾病，由SERPINA1基因突变引起，导致α1-抗胰蛋白酶（A1AT）水平低下。A1AT主要在肝脏中产生，作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，保护肺组织免受中性粒细胞弹性蛋白酶介导的破坏。AATD患者更容易发生肺部和肝脏损伤，而AATD患者的肝脏类器官能够模拟疾病特征，包括A1AT聚集、蛋白质分泌减少以及弹性蛋白酶抑制功能受损。这一模型为探索基因治疗和其他旨在防止A1AT在肝细胞内聚合的策略提供了机会。 患有JAG1突变的Alagille综合征患者的类器官显示出导管细胞分化的延迟以及腔内凋亡的增加，反映了胆管树的体内异常。由Wilson病患者产生的胆管细胞类器官（Wilson病由ATP7B基因突变引起，该基因编码铜转运β-ATP酶）显示出对铜处理的敏感性增加，这是由于铜转运缺陷和细胞内铜的毒性积累所致。尽管Atp7b基因敲除小鼠模型能够捕捉到该疾病的一些肝脏特征，如铜过载、炎症和纤维化，但它未能重现患者所表现出的神经和精神症状。患有胆道闭锁的患者的肝脏类器官显示出异常的形态，其特征为多个空泡、增殖能力降低、顶底组织结构紊乱以及CFTR蛋白水平低下。这些表型与患者的阻塞性胆管疾病一致，而且转录组分析进一步揭示了胆管周围淀粉样β（Aβ）沉积作为一种新的病理和诊断特征。 中枢神经系统的遗传性疾病 帕金森病（PD）以中脑多巴胺能神经元的丧失为特征，导致运动和非运动症状。鉴于iPS细胞衍生的多巴胺能神经元处于胎儿成熟状态，使用类器官模拟具有晚发症状的PD症状性神经退行性表型以及其他中枢神经系统疾病仍具挑战性。因此，大多数工作都集中在利用携带疾病相关突变的类器官重现早期病理过程，这可以揭示特定突变的疾病机制。例如，携带DNAJC6基因（与PD早发相关）功能丧失突变的人类胚胎干细胞衍生的中脑类器官显示出多巴胺能神经元发育受损、α-突触核蛋白病理性聚集、神经元自发放电频率增加以及线粒体和溶酶体功能障碍，这是由于WNT–LMX1A信号受损所致。值得注意的是，Dnajc6基因敲除小鼠未能重现与PD相关的表型。同样，携带与PD相关的富含亮氨酸重复序列的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2（LRRK2）G2019S突变的iPS细胞衍生的中脑类器官重现了患者观察到的标志性特征，包括α-突触核蛋白聚集增加和清除受损。进一步分析确定了TXNIP是LRRK2相关PD的关键因素。 在另一个涉及常见神经退行性疾病的例子中，载脂蛋白E变异体APOE4是阿尔茨海默病（AD）的最强遗传风险因素。携带APOE4变异体的iPS细胞衍生的大脑类器官显示出增强的AD病理特征，包括Aβ和磷酸化tau水平增加、细胞凋亡以及突触完整性的降低。值得注意的是，除了APOE4变异体对神经元的直接影响外，涉及神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的共培养类器官模型揭示了小胶质细胞APOE4在AD病理中的作用，通过诱导神经炎症。进一步的转录组分析确定了与APOE4变异体相关的细胞类型特异性变化，包括神经元突触功能受损、星形胶质细胞中Aβ摄取减少和胆固醇积累以及类似小胶质细胞的形态改变和Aβ吞噬作用降低。从携带家族性AD（携带编码淀粉样β前体蛋白的APP基因重复或编码早老素1或2的PSEN1或PSEN2基因突变）的患者的iPS细胞衍生的类器官会自发地发展病理特征，如淀粉样蛋白聚集、tau过度磷酸化和内质网异常，这些可以通过β-和γ-分泌酶抑制剂来挽救。 尽管过度磷酸化的tau是AD的标志，但编码tau的MAPT基因突变可导致额颞叶痴呆（FTD），这是一种以tau积累和谷氨酸能皮质神经元丧失为特征的异质性疾病。携带MAPT突变（R406W）的iPS细胞衍生的大脑类器官已被用来研究tau病理学的特定机制。R406W突变通过微管不稳定诱导tau错位和轴突营养不良，这也破坏了突变神经元中的线粒体运输。突变的tau蛋白磷酸化减少，更容易受到钙蛋白酶介导的切割和片段化。同样，携带另一种MAPT突变（V337M）的类器官已被用来研究FTD的早期发病机制。这些类器官在多个时间点进行表型评估，以识别FTD-tau病理学发展的各个步骤。在后期（4个月后）观察到FTD的标志性特征，包括神经元丧失、tau积累进展以及对谷氨酸毒性的敏感性。tau的积累主要是由于蛋白水解活性缺陷所致，这是由于自噬-溶酶体途径受到破坏，而不是由于tau表达增加。进一步的基因富集分析显示，编码神经元RNA结合蛋白的剪接调控基因ELAVL4表达增加，导致剪接失调和谷氨酸能神经元功能受损。这种谷氨酸能神经元发育失调导致兴奋毒性，即主要由谷氨酸引起的兴奋性神经递质过度刺激，导致钙离子过度流入神经元，引起细胞功能障碍和最终死亡，以及在发育后期的凋亡。此外，通过脂质激酶抑制剂阿皮利莫德可以挽救突变tau类器官中谷氨酸能神经元的丧失，它防止谷氨酸受体回收到膜上，从而减少谷氨酸诱导的兴奋毒性。使用腺相关病毒（AAV）将突变tau（P301L）注入iPS细胞衍生的前脑类器官也会诱导含有tau纤维的明显tau聚集。除了MAPT突变外，FTD还有其他各种遗传原因，包括导致颗粒蛋白前体蛋白单倍剂量不足的GRN突变以及C9ORF72中的GGGGCC重复扩展。从iPS细胞衍生的大脑类器官切片模型重现了皮质结构，并显示出C9ORF72相关FTD的早期分子病理特征。在这些类器官中，星形胶质细胞显示出自噬相关蛋白P62水平增加，而深层神经元积累了二肽重复蛋白poly（GA）、DNA损伤并经历了可以通过药物GSK2606414挽救的核固缩。携带C9ORF72扩展的iPS细胞衍生的FTD类器官也显示出加剧的TDP43功能障碍，这是急性损伤的关键驱动因素。基于FTD类器官的CRISPR干扰（CRISPRi）筛选已确定KCNJ2抑制是一种有前景的治疗靶点，可以减轻神经退行性过程。 神经发育障碍也可以在类器官中建模。脆性X综合征（FXS）是由脆性X智力迟滞蛋白（FMRP）的缺失引起的，FMRP是一种RNA结合蛋白，调节参与突触发育和可塑性的特定mRNA的翻译，包括脑源性神经营养因子（BDNF）、代谢型谷氨酸受体（mGluRs）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）和突触后密度蛋白95（PSD95）。在来自FXS患者前脑的类器官中，FMRP的缺失导致神经发生、神经元成熟和兴奋性失调。这些缺陷可以通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）途径来挽救，但不能通过mGluR5拮抗剂来挽救。值得注意的是，针对mGluR5的治疗在临床试验中显示出有限的成功，但在动物模型中显示出有希望的结果。这些FXS类器官的转录组分析进一步揭示了人类FMRP mRNA靶标，如CDH2，为FXS的治疗开发提供了机制见解和潜在的可药物靶点。这一模型的一个显著局限性是FXS类器官中GABA能抑制性神经元的显著减少。因此，进一步研究FMRP缺失在GABA能神经元发育中的作用将受益于另一种富含GABA能神经元的模型系统，如腹前脑类器官。此外，这种FXS类器官模型无法完全捕捉细胞类型及其复杂相互作用的多样性，特别是涉及星形胶质细胞的相互作用，据报道星形胶质细胞介导人类FXS神经元异常放电的细胞非自主校正。最近的一项研究表明，FMRP可以通过含有YTH结构域的家族蛋白1（YTHDF1）抑制神经元翻译。在一个iPS细胞衍生的前脑类器官模型中，针对YTHDF1的小分子抑制剂逆转了与FMRP缺乏相关的发育缺陷。 代谢性疾病   代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是一种由肝细胞内脂质积累驱动的慢性炎症和纤维化疾病，影响全球约5%的成年人。MASH的风险因素包括营养过剩或更罕见的遗传性脂质紊乱。通过遗传变化（如瘦素或瘦素受体的突变，或与脂质代谢相关的基因如Apoa5、Nr1h4、Pparg、Cebpa的敲除）或饮食因素（高脂饮食、西方饮食或过量摄入糖分）驱动的MASH动物模型被广泛使用。然而，这些动物模型不适合大规模药物筛选，此外，物种间差异也使得研究结果难以转化为人类生理学。 肝细胞类器官代表了肝脏组织的三维结构，并重现了原代肝细胞的基因表达谱和细胞功能。从患者中衍生的MASH类器官或通过代谢物挑战诱导的MASH类器官捕捉到了疾病的关键特征，表现为促炎通路和肿瘤相关标记物的上调、脂质积累增加以及对凋亡的敏感性增强。例如，一个在游离脂肪酸（FFA）处理下显示出脂质积累的肝脏类器官系统已被用来研究二甲双胍和L-肉碱的效果，这两种药物均用于治疗2型糖尿病（T2D）。由Wolman病患者（由溶酶体酸性脂肪酶（LAL）的遗传性功能障碍引起，导致甘油三酯水解受损）衍生的肝脏类器官显示出大量的脂质积累和严重的脂肪性肝炎。这些表型可以通过成纤维细胞生长因子19（FGF19）治疗来挽救，FGF19激活法尼酯X受体（FXR）以减少脂质储存诱导的活性氧（ROS）活性。其他化合物也在肝脏相关的类器官模型中进行了评估，结果喜忧参半。尽管有报道称镁可以改善2型糖尿病和肝脏代谢紊乱，但在三维类器官模型中，镁无法逆转疾病表型。相比之下，索拉非尼（一种用于治疗肝脏和肾脏癌症的广谱酪氨酸激酶抑制剂）已在MASH的三维共培养模型中显示出减少脂肪诱导的纤维生成的潜力。 值得注意的是，MASH中炎症变化与纤维化进展之间的相互作用涉及库普弗细胞（KCs）和肝星状细胞（HSCs）的相互作用。从iPS细胞衍生的多细胞类型肝脏类器官已被用于研究MASH的发病机制并促进药物筛选。在这个系统中，游离脂肪酸刺激胶原蛋白的产生。长期的脂肪酸暴露导致库普弗细胞中促炎细胞因子表达增加、肝星状细胞激活以及类器官硬度增加。这些发现强调了生成多谱系相互作用对于改进MASH建模的重要性。 类器官不仅用于建模代谢性疾病，还促进了新的治疗发现。从家族性高胆固醇血症患者衍生的iPS细胞肝细胞揭示了心脏糖苷在减少载脂蛋白B产生方面的作用。从线粒体DNA耗竭综合征患者衍生的肝细胞显示出NAD治疗改善线粒体功能，通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC1α）恢复ATP水平。肝细胞类器官对于在临床前代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）和MASH的背景下筛选小分子抑制剂或进行基于CRISPR的功能研究具有价值。我们使用胎儿肝细胞类器官来建模MASLD的早期发病，背景是遗传性脂肪肝（APOB−/−或MTTP−/−，分别编码载脂蛋白B和微粒体甘油三酯转移蛋白的基因）或游离脂肪酸过载。作为概念验证，传统的药物筛选和基于CRISPR的失活筛选都可以在这些MASLD类器官中进行，强调脂肪酸去饱和酶2（FADS2）是肝脂肪变性的一个决定因素。 慢性炎症性疾病   建模免疫介导疾病（如炎症性肠病（IBD）或乳糜泻（CeD））需要将类器官与适当的免疫细胞和/或炎症介质相结合。 通过患者基因组和转录组分析，已确定了众多IBD的风险因素。然而，在动物模型中阐明其主要细胞靶点和潜在机制已被证明是具有挑战性的。从IBD患者衍生的类器官或暴露于促炎细胞因子的类器官允许进行直接调查。例如，对IL-22刺激的结肠类器官的分析揭示了招募C-X-C趋化因子受体2（CXCR2）+中性粒细胞的基因上调。值得注意的是，从IBD炎症黏膜衍生的类器官保留了炎症组织的转录特征，而且即使在炎症环境被移除后，儿童IBD患者的疾病特异性表观遗传学改变也可以在类器官中持续存在。研究IBD发病机制的一种生理相关方法涉及类器官-免疫细胞共培养系统。例如，克罗恩病患者的自体黏膜T细胞可以侵入类器官，并直接诱导上皮细胞死亡。这种侵入和细胞毒性依赖于T细胞通过CD103（一种介导T细胞与上皮细胞粘附的整合素）和NKG2D（一种激活受体，与上皮细胞上的应激诱导配体结合）的识别。针对CD103和NKG2D的阻断抗体靶向免疫细胞-上皮细胞相互作用，以减少T细胞侵入和上皮损伤。 乳糜泻是一种由麸质引发的自身免疫性疾病，与特定的HLA-DQ单倍型相关。小鼠自然不具备这些人类HLA单倍型，尽管已开发出表达人类HLA分子的转基因小鼠，但它们并不能完全复制乳糜泻的免疫反应或疾病病理，或者需要人工诱导或基因改造，这些改造并不能完全复制自然疾病过程。来自乳糜泻患者的十二指肠活检样本可以直接在气-液界面系统中培养，该系统保留了肠道上皮以及多样的组织驻留免疫细胞群，从而重现了麸质依赖的病理。通过这种共培养系统进行的功能研究表明，IL-7是一种麸质诱导的致病调节因子，在乳糜泻发病机制中诱导上皮破坏是必要且充分的。 甲状腺是众所周知的器官特异性自身免疫疾病的目标：甲状腺功能亢进的格雷夫斯病和甲状腺功能减退的桥本甲状腺炎是自身免疫性疾病，其特征是异常的激素产生。含有产生激素的滤泡细胞的甲状腺组织类器官可以很容易地生成。暴露于格雷夫斯病自身抗体（已知可激活促甲状腺激素受体，TSHR）的甲状腺类器官显示出细胞增殖增加和激素分泌增加，重现了疾病的关键特征。从桥本甲状腺炎患者衍生的类器官显示出趋化因子CCL2和CCL3水平升高，这些因子在桥本甲状腺炎发病机制中招募免疫细胞可能发挥关键作用。 慢性阻塞性肺病（COPD）主要由肺泡和气道损伤引起，导致气流减少、黏液产生增加和炎症，这些共同导致呼吸困难。来自COPD患者的支气管类器官证实了杯状细胞增生和纤毛摆动频率降低的存在。通过将人类肺类器官暴露于香烟烟雾提取物，研究了与吸烟相关的COPD，这导致类器官形成受到抑制，与健康气道类器官相比，肺泡类器官对香烟烟雾的敏感性增加。 传染病   隐孢子虫是一种引起腹泻的原生动物寄生虫，其生活史复杂，包括有性阶段和无性阶段，且难以在实验室中培养。人类肠道类器官，特别是分化的肠上皮细胞，支持隐孢子虫生活史的有性和无性阶段，并产生具有与感染宿主动物相当的二次感染能力的卵囊。 同样，人类肠道类器官提供了第一个体外人类诺罗病毒（HuNoV）平台，确定肠上皮细胞是复制的靶点。HuNoV感染是全球急性胃肠炎的主要原因，然而传统的细胞系无法支持HuNoV感染和复制，小鼠由于物种特异性的病毒受体和免疫反应差异而自然抵抗感染。此外，小鼠诺罗病毒模型在病毒结构、受体利用和致病性方面与HuNoV不同，限制了将研究结果直接转化为人类疾病。肠道类器官克服了这些障碍，显示出对组织血型抗原的HuNoV结合特异性与动物和人类研究结果一致。除了HuNoV，肠道类器官还被应用于建模其他肠道病毒感染，包括轮状病毒、柯萨奇B病毒和肠病毒。 2016年，世界卫生组织宣布寨卡病毒（ZIKV）感染与巴西新生儿小头症和其他神经系统疾病聚集有关，构成国际关注的突发公共卫生事件。由于无法获取感染的活体人类胎儿组织，限制了对发育中的中枢神经系统中ZIKV发病机制的理解。小头症表型需要一个三维结构模型，只能通过感染大脑类器官来重现。使用人类iPS细胞衍生的大脑类器官进行的实验表明，ZIKV感染破坏了大脑皮层层，减少了细胞增殖，并减少了功能性神经元的数量。在旋转生物反应器中生长的区域特异性大脑类器官表明，亚洲和非洲ZIKV菌株优先并有效地感染神经祖细胞，触发早熟分化和细胞死亡增加，这与在人类胎儿中观察到的感染模式一致。脑室区和脑室下区的祖细胞可能受到影响，支持了在人类神经发育过程中增殖的祖细胞是疾病的关键靶点的假设。基于这些类器官模型的机制研究表明，ZIKV蛋白NS2A损害了人类前脑类器官中放射状胶质细胞的增殖，并破坏了神经干细胞中的顶点连接形成。ZIKV蛋白NS4A和NS4B的表达通过抑制AKT-mTOR信号通路阻断神经发生并促进自噬。ZIKV蛋白NS5特异性靶向人类（而非小鼠）的STAT2以抑制I型干扰素信号通路，ZIKV可以激活Toll样受体3（TLR3）介导的先天免疫反应，导致涉及神经发生、轴突导向和凋亡的基因失调。人类前脑类器官也被用于药物筛选，确定了水仙碱溴化物作为一种消除感染人类神经祖细胞中的ZIKV并挽救ZIKV诱导的小头症表型的药物。另一项药物再利用筛选发现，泛半胱天冬酶抑制剂emricasan（抑制ZIKV诱导的半胱天冬酶3活性）可以保护类器官培养中的人类皮质神经祖细胞，美国食品药品监督管理局批准的B类抗寄生虫药物氯硝柳胺可以阻断ZIKV复制。此外，ZIKV感染通过病毒NS3蛋白与CaMKII之间的相互作用增加宿主细胞中瞬时受体电位通道4（TRPC4）的表达，从而增强TRPC4介导的钙离子内流。通过药物抑制CaMKII或TRPC4可以潜在地减少癫痫发作并阻断iPS细胞衍生大脑类器官中的ZIKV传播。 呼吸道感染   呼吸道是病原体的主要靶点，2019冠状病毒病（COVID-19）大流行促使对体外模型的需求前所未有。在分化的气道类器官中，表达血管紧张素转换酶2（ACE2）和跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）的气道纤毛细胞是初始感染的主要细胞靶点。鉴于ACE2和TMPRSS2在多种上皮组织中表达，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）可以在初始呼吸道感染后传播到其他器官。含有表达ACE2的肠上皮细胞的人类肠道类器官可以支持强大的SARS-CoV-2感染和复制。后续研究使用CRISPR介导的遗传工程类器官库表明，SARS-CoV-2以及中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV专门使用TMPRSS2，TMPRSS2通过蛋白水解激活刺突蛋白，允许病毒包膜与宿主细胞膜直接融合。因此，这些病毒可以在不需要内吞作用的情况下感染宿主细胞，使TMPRSS2成为泛冠状病毒治疗药物的有吸引力的靶点。值得注意的是，（羟基）氯喹是一种内吞作用阻断剂，最初基于细胞系研究被提出，并被广泛用于COVID-19患者。然而，这种药物在类器官模型中并不抑制病毒繁殖。这一发现与临床观察一致，即（羟基）氯喹对SARS-CoV-2无效，突出了类器官作为更准确的转化平台用于筛选新药物治疗的潜力。 更广泛地说，气道类器官可以用于研究流感A病毒（IAV）、呼吸道合胞病毒（RSV）或人类鼻病毒C（HRV-C）等呼吸道病毒的感染动态和跨物种传播潜力。它们表达TMPRSS2和TMPRSS4，这些酶介导IAV表面血凝素的切割，从而实现病毒-宿主膜融合。分化的二维类器官可以区分人类感染性IAV与人类感染性较差的禽类和猪亚型的复制能力，并已用于评估最近禽类H5N6和H5N8株的溢出风险。长期可扩增的人类气道类器官重现了RSV感染的关键特征，包括由非结构病毒NS2蛋白驱动的细胞运动增加以及在共培养中优先招募中性粒细胞。同样，它们可以支持可重复的HRV-C传播，为病毒-宿主相互作用提供见解。在HRV-C感染后，气道类器官比鼻类器官引发更强的先天免疫反应，α-CDHR3和抗病毒药物的治疗显著减少了病毒生长，表明其作为抗病毒药物开发平台的潜力。 癌症   许多癌症类型（如胰腺癌、肝癌和乳腺癌）在动物模型中不会自发发生。当通过引入特定的癌症突变实验性地诱导肿瘤（这通常需要相当长的时间）时，它们仍然无法捕捉人类癌症的复杂性和异质性，包括它们的遗传多样性和免疫环境。在过去十年中，患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）的出现极大地扩展了临床前癌症模型的范围。这些培养可以从几乎所有癌瘤中轻松建立，使用活检或切除材料作为起始组织。它们可扩展，并且紧密重现原始肿瘤的组织学、遗传和转录组学特征，并且可以一致地移植到小鼠体内进行体内特征描述。携带特定遗传突变的PDTOs可以在不依赖通过突变激活的致癌信号通路的生长因子的情况下生长。例如，具有KRASG12V突变的类器官可以在缺乏表皮生长因子（EGF）的情况下生长，而EGF对于健康类器官的生长是必需的，这种方法通常用于区分肿瘤衍生的生长与正常组织生长。通过将致癌突变依次CRISPR工程化到野生型类器官中，可以创建定义的癌症模型。这种人工创建的癌症类器官在异种移植后产生预期的组织学。 PDTOs及其匹配的健康类器官已在各种肿瘤类型中广泛生成并存储在生物银行中（总结在表2和补充表1中）。这些PDTOs反映了肿瘤间和肿瘤内的异质性，允许研究肿瘤的进化和进展，测试治疗反应的变异性，理解耐药机制，并识别新的治疗靶点。例如，MCLA-158（petosemtamab）是一种针对EGFR和LGR5的双特异性抗体，完全使用结肠癌PDO系开发。重要的是，PDTOs显示出与它们的亲本肿瘤组织相当的抗肿瘤治疗敏感性，强调了PDTOs在药物筛选中的可靠性。值得注意的是，在它们的“基态”中，PDTO系不包含免疫细胞、肿瘤基质或血管，但这些元素可以通过共培养轻松包含，由微流控系统和生物工程技术支持，如类器官芯片和3D生物打印。 尽管有这些优势，类器官代表了一个高度简化的实验平台，尽管结果往往稳健且可重复，但在类器官可以常规应用于药物开发之前，结果必须通过现有的体外平台、动物研究和临床试验数据进行广泛验证。PDTOs在推进多种癌瘤类型的个性化医疗方面显示出前景，胰腺癌、胃肠道癌和乳腺癌的类器官药物反应与临床结果之间的相关性已被证实。然而，它们的更广泛的可转化性仍有待最终证明，目前正在进行多项随机临床试验，以评估它们的预测价值，特别是在放疗和化疗环境中。重要的是，在肿瘤学之外，转化证据仍然很少，而且控制的临床验证大多缺失。此外，负面预测数据很少报告，限制了我们对基于类器官的预测边界的理解。在神经学和其他复杂的系统性疾病中，类器官进一步受到建模多细胞相互作用和系统药代动力学的困难的挑战，这限制了它们的预测效用。 Box 2：MCLA-158（petosemtamab），利用专门的癌症类器官生物库开发抗癌药物 双特异性抗体MCLA-158靶向富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（LGR5）和表皮生长因子受体（EGFR），为类器官技术如何推进药物开发提供了一个有力例证。整个发现项目都是利用患者来源的结肠癌类器官系进行的。生成了一个包含500多个双特异性抗体的文库，其中一个臂靶向EGFR家族成员，另一个臂靶向包括LGR5在内的干细胞标志物。在一小组结直肠癌（CRC）类器官系中进行无偏功能筛选，以寻找生长抑制和形态变化，从而确定了MCLA-158，并在更广泛的健康和CRC类器官中对其进行了进一步表征。MCLA-158消除了CRC类器官，但没有消除健康结肠类器官。 MCLA-158在多种上皮癌的临床前模型中表现出治疗特性，如抑制KRAS突变CRC肿瘤生长、阻断转移起始以及抑制肿瘤生长。开发项目从发现到1期临床试验仅用了30个月。正在进行的临床研究包括在一线头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中进行的3期注册试验，作为单药治疗以及与帕博利珠单抗联合使用，2024年底启动了在晚期转移性CRC中进行的2期开放标签试验。 转化安全应用 尽管大多数研究都集中在利用类器官进行药物疗效和疾病建模，但其应用范围现在正在扩大到制药行业，用于评估药物化合物在多个器官中的安全性（表3）。 肝脏毒性 肝脏在药物代谢中起着核心作用，肝毒性是药物研发失败、市场撤回以及获批后限制使用的主要原因。药物诱导的肝损伤（DILI）是治疗相关的重要致病和致死因素，预测和减轻DILI仍然具有挑战性。类器官技术为预测药物诱导的肝毒性提供了新的机会。 从多能干细胞（PS细胞）或肿瘤干细胞（TSC）中衍生的成熟人类肝脏类器官（HLOs）能够重现已知的药物肝毒性，例如：由于肝毒性而被撤回的抗糖尿病药物曲格列酮、广泛使用的镇痛药对乙酰氨基酚（也称为扑热息痛）以及抗生素特拉万星和左氧氟沙星，其敏感性高于二维肝细胞，且在临床相关浓度下表现更好。同样，TSC衍生的HLOs在模拟药物诱导的磷脂沉积症方面优于传统的肝癌细胞系HepG2细胞，磷脂沉积症是一种与多种药物相关的严重不良反应，这突显了其评估代谢物介导肝毒性的能力。此外，PS细胞衍生的HLOs已被用于建立高通量筛选方法，以大规模筛选化合物，准确标注了238种药物的DILI潜力，并通过多重读出方法展示了其模拟个体供体对波生坦（一种可能引起胆汁淤积性肝损伤的内皮素受体拮抗剂）的基因型特异性敏感性的能力。基于这些进展，HLOs能够模拟多种与DILI相关的表型，包括脂肪肝、纤维化和免疫反应，并且与临床数据高度一致，例如使用对乙酰氨基酚和TAK-875（一种G蛋白偶联受体40（GPR40）激动剂，曾因肝毒性而被停止开发）等化合物。HLOs的应用范围不断扩大，肝内胆管细胞类器官已被用于研究氯丙嗪诱导的胆管损伤，并证明该模型能够有效复制药物诱导的胆道毒性。最近，HLOs还被用于评估广泛用于基因治疗（尤其是肝脏靶向治疗）的腺相关病毒（AAV）载体，为评估基因治疗开发中的载体性能和靶向肝毒性提供了新的平台。 肾脏毒性 人类PS细胞衍生的肾脏类器官在药物研发中模拟药物诱导的急性肾损伤方面具有潜力，尽管它们仍然缺乏一些关键的转运蛋白和管状过滤功能。这些类器官包含肾单位、集合管、肾间质和内皮细胞，并且能够自我组织成类似肾单位的结构，包括足细胞、近曲小管、髓袢和远曲小管，进一步重现体内肾单位的组织结构。它们在对顺铂和庆大霉素等肾毒性物质的反应中表现出差异性凋亡，并且剂量依赖性地上调肾脏损伤标志物肾损伤分子1（KIM1），从而确立了其用于肾脏毒性测试的实用性。后续研究进一步完善了肾脏类器官模型，以更好地重现肾毒性反应。顺铂和多柔比星诱导的损伤，包括剂量依赖性凋亡，已在传统类器官、悬浮培养的微类器官以及生物打印肾脏类器官中得到重现，并且这些类器官已显示出对多柔比星和氨基糖苷类抗生素的毒性。一个整合了灌注外周血单个核细胞（PBMCs）的免疫功能齐全的血管化肾脏类器官芯片系统进一步实现了对免疫介导毒性的评估，例如通过靶向人类白细胞抗原A2呈递的WT1肽的T细胞双特异性抗体（TCB）选择性杀伤WT1表达细胞。这突显了该系统在动态微环境中评估化学和免疫介导毒性的能力。 胃肠道毒性 使用类器官模型更好地预测小分子和大分子的胃肠道毒性可以显著改善临床前的风险-效益评估，并减少药物研发过程中的失败率。 一项开创性的研究使用人类回肠TSC衍生的类器官来模拟药物诱导的腹泻，建立了一个基于类器官的检测方法，以验证31种参考药物。该检测方法在预测药物诱导腹泻的临床发生率方面具有90%的准确性。在此基础上，使用TSC衍生的小肠和结肠类器官探索了胃肠道毒性的分子决定因素，研究了多柔比星和吉非替尼诱导的副作用机制。一种成本效益高的肠道类器官培养方法已经开发出来，能够进行小分子的表型高通量筛选，有助于简化临床前工作流程。利用该平台，未分化的类器官能够准确区分具有细胞毒性或非细胞毒性潜力的化合物。此外，通过比较人类、大鼠和狗类器官对化合物的反应，揭示了物种特异性的敏感性差异，这与临床前发现一致，并证明了类器官用于早期安全性评估的实用性。肠道类器官平台的预测能力还扩展到了评估基于蛋白质的生物制剂（如T细胞双特异性抗体）的“靶向肿瘤外”效应，包括缺乏交叉反应的临床前物种。补充了免疫细胞的肠道患者来源类器官（PDOs）和肿瘤类器官已显示出T细胞双特异性抗体的组织特异性肿瘤外毒性，成功捕捉到了传统组织模型（缺乏这些免疫成分）未能预测的临床不良反应。扩展这种方法，通过将上皮类器官与自体组织驻留记忆（TRM）T细胞整合，生成了人类肠道免疫类器官，并用于研究癌症患者中观察到的T细胞双特异性抗体诱导的肠道炎症。 中枢神经系统毒性 药物诱导的神经毒性是候选药物研发中断的主要原因，据报道中枢神经系统不良反应导致早期和晚期项目的中断率为7% - 34%。类器官为揭示传统方法可能无法检测到的毒性机制提供了一个强大的模型。更简单的系统如二维细胞培养可能忽略了依赖于中枢神经系统微环境复杂细胞相互作用的独特毒性机制，尽管小鼠模型确实复制了中枢神经系统的一些复杂性和多样性，但它们可能无法准确代表人类对毒素的特异性反应。例如，由于缺乏类似人类脑组织的体外模型，长春新碱神经毒性机制的研究历来集中在周围神经上。最近，诱导多能干细胞（iPS细胞）衍生的大脑类器官揭示了长春新碱对大脑发育的神经毒性影响，确定了细胞外基质介导的信号传导，并强调了基质金属蛋白酶在这一过程中的作用。这些发现强调了使用复杂的三维大脑类器官系统探索毒性机制的重要性，这些机制可能涉及发育中人类大脑组织的结构和细胞复杂性。大脑类器官可以长期培养以实现功能成熟。成熟的大脑类器官已被用于研究用于治疗难治性抑郁症的药物苯乙肼对大脑发育的影响，通过转录抑制BHC110/LSD1靶向基因和组蛋白H3赖氨酸4的去甲基化，确定了对神经元和星形胶质细胞的剂量依赖性大脑损伤。最近，iPS细胞衍生的大脑类器官已被用于评估化疗诱导的神经毒性，特别是紫杉醇，证明了类器官在评估小分子诱导的神经毒性方面的实用性。 心脏毒性 尽管开发并实施了预测性临床前检测方法，但心脏毒性仍然是药物研发失败和上市后撤回的主要原因。人类心脏类器官由干细胞衍生的心肌细胞和支持细胞类型组成，应重现心脏组织结构、收缩功能和电生理学的基本方面，以提供预测药物对心脏反应的替代方法。 多柔比星诱导的心脏毒性已在心脏类器官中得到模拟。暴露于多柔比星会降低类器官的活性，增加乳酸脱氢酶（LDH）和脑钠肽（BNP）水平，并诱导凋亡、纤维化和线粒体功能障碍。在无细胞外基质（ECM）的模型中，多柔比星处理会导致类器官收缩、节律受损、胶原沉积、成纤维细胞激活以及内皮 - 间充质转化的早期迹象。在一个模拟缺血后组织的心脏梗死类器官模型中，多柔比星加剧了缺氧敏感性损伤，破坏了协调收缩所需的钙循环，并促进了梗死核心区域纤维化的出现。心脏类器官平台已被用于筛选一系列临床相关药物。一项评估FDA召回化合物（阿司咪唑、西沙必利、米贝拉地尔、培高利特、特罗狄林、罗非昔布、伐地昔布、溴芬酸、替尼酸和曲格列酮）的研究表明，与二维单层相比，类器官能更有效地检测剂量依赖性ATP耗竭和节律中断。额外的高通量筛选还发现了针对GSK3、TGFβ和甲羟戊酸途径的促增殖化合物，这些化合物刺激心肌细胞增殖，但同时导致收缩时间延长或力量减弱，表明尽管具有再生潜力，但存在功能副作用。空间组织化的心脏类器官已被用于模拟发育毒性。暴露于沙利度胺会减少心脏组织形成并损害功能，较大的构建物显示出更稳定的节律，而较小的构建物显示出松弛延迟和形态变异性。最后，多器官平台突显了其他组织的代谢如何驱动心脏毒性。在肝脏 - 心脏共培养中，肝脏通过细胞色素P450酶将氯米帕明转化为去甲氯米帕明，导致心脏类器官节律降低、钙通量中断和细胞死亡，当缺乏肝脏类器官时未观察到这些效应，这意味着肝细胞是观察到的毒性的原因。一个六组织平台同样证明，肝脏代谢卡培他滨和异环磷酰胺会在下游诱导心脏毒性反应，突显了器官间相互作用在心脏毒性中的作用。 类器官平台的临床前安全性应用 目前正在进行探索传统类器官对现有药物安全性的预测能力，但新一代具有更高复杂性的生物工程类器官平台已经展现出进一步改善药物安全性测试的能力。这些模型整合了血管和免疫成分，能够研究药物对组织微环境和全身反应的影响，或者内置生物传感器，实时检测ATP与ADP比率以评估药物诱导的肾脏毒性。此外，结合肝脏、心脏、肺、血管、睾丸、结肠和大脑的多器官类器官系统已被用于“芯片上的身体”平台，用于筛选FDA召回的药物，并提供有关多器官毒性和全身相互作用的见解。类似地，肝脏和胰岛类器官的微工程组装体被用于测量二甲双胍的活性。 最近，生物工程二维类器官，如微型结肠和微型肠道芯片平台，通过维持类器官的分化和顶 - 基极性，同时通过流体流动实现腔内通路，进一步扩展了药物安全性评估能力。在这种设置中，“打开”三维类器官，并将其外部或基底表面放置在二维基底上。类器官的内部/腔内/顶表面可以从上方自由接触。这已被证明特别适用于测试靶向干细胞的抗癌化疗药物，如阿糖胞苷和伊达那普利。这些结合类器官生物学与生物工程方法的先进平台为应对具有日益复杂作用机制的治疗药物提出的转化安全性挑战提供了新的选择。此外，基于Transwell的类器官单层还能够通过跨上皮电阻（TEER）测量定量评估上皮屏障完整性，提供一种非侵入性和动态的组织极化和紧密连接功能读出方法。值得注意的是，作为一种替代TEER测量的方法，基于图像的检测方法也已被用于通过荧光染料在组织屏障中的扩散来确定完整肠道类器官的屏障完整性，要么将荧光染料添加到培养基中并跟踪其在屏障降解时的内化，要么直接将染料微注入类器官的腔内空间并定量上皮屏障的渗漏性。 类器官吸收和代谢检测 预测药物吸收、分布和代谢的能力是药物研发的关键，直接影响药物的药代动力学，进而影响治疗候选药物的预期疗效、安全性和剂量。了解这些参数对于优化药物配方、减轻不良反应和确保临床成功至关重要。肝脏、肠道和肾脏是药物吸收、代谢和清除的主要器官，因此成为制药行业主要的体外器官模型。 肝脏类器官用于药物代谢 肝脏是药物代谢的主要器官，促进三个关键过程：某些药物的主动摄取到肝脏、转化为代谢物以及药物和代谢物分泌到胆汁中。目前最先进的体外模型，如短期悬浮培养的冷冻保存原代肝细胞或肝细胞共培养系统，可用于确定内在清除率和药物的主动摄取。然而，这些模型存在局限性，例如无法完全复制肝脏代谢和转运表型（原代人肝细胞在培养中迅速退化）、细胞与培养基比例不佳，影响代谢和转运过程的可测量性以及评估胆汁分泌的能力有限。肝脏细胞系表达药物代谢酶和转运蛋白的水平不佳，限制了其预测人类药代动力学的能力。为了解决这一问题，开发了一种TSC衍生的肝脏类器官系统，该系统表达广泛的I相药物代谢酶（如细胞色素P450酶CYP3A4和CYP2D6，这些酶可化学修饰药物）、II相酶（如UDP - 葡糖醛酸转移酶和磺基转移酶，这些酶可将代谢物结合以促进其排泄）以及药物转运蛋白（包括阴离子转运蛋白OATP1B3、ATP依赖性转位酶ABCB1（也称为MDR1）和MRP3）。该系统与微流体芯片集成，已应用于研究咪达唑仑的代谢和生物利用度，以及在结合肠道和肾脏类器官的多器官平台中香豆素和二甲双胍的排泄。此外，肝内胆管细胞类器官（ICOs）已用于评估对乙酰氨基酚、羟基咪达唑仑和7 - 羟基香豆素葡萄糖醛酸苷的代谢物形成。尽管ICOs成功模拟了代谢物的产生，但其CYP酶表达水平低于原代人肝细胞的水平，这突显了进一步优化以匹配原生组织功能的必要性。 肠道类器官用于药物代谢和转运 早期的概念验证研究表明，肠道类器官系统有助于更好地理解和预测肠道吸收和代谢。通过地塞米松、β - 萘黄酮和组成性雄烷受体激动剂TCPOBOP，可在TSC衍生的肠道和肝脏类器官中成功诱导CYP酶的活性，从而进行药物代谢研究。实际上，小鼠衍生的隐窝类器官已被用于研究肠道药物代谢酶（DMEs），显示出前药CPT - 11转化为其有毒代谢物SN - 38。人类十二指肠类器官被应用于研究肽类药物转运，显示出对头孢羟氨苄、β - 内酰胺类抗生素和环己肽的摄取。此外，基于Transwell的二维单层系统便于进行双向（顶 / 基）转运研究。如上所述，这种二维设置从三维类器官开始，将类器官打开并放置在二维基底上。虽然在三维类器官中将化合物递送至上皮细胞的顶侧需要注入类器官腔内，但二维Transwell设置允许轻松接触上皮结构的顶侧和基侧。因此，富含肠细胞的极化人类十二指肠类器官单层培养成功区分了高通透性和低通透性化合物，显示出主要外排转运蛋白（包括MDR1和BCRP）的功能活性。此外，三维十二指肠和结肠类器官表现出I相和II相DMEs的代谢活性，其节段特异性差异与已知的DME表达谱一致。为了直接接触顶侧，已生成具有逆转上皮极性的PS细胞衍生肠道类器官，从而便于研究转运蛋白和酶的活性。这些“内翻”类器官显示出在暴露于利福平和骨化三醇后CYP3A4和MDR1的功能诱导，以及被维拉帕米和伊伐卡托抑制。 肾脏类器官用于药物转运和清除 尽管在复杂的肾脏芯片系统、生物打印肾脏模型和血管化类器官芯片平台方面取得了进展，但肾脏类器官在药物转运和清除研究中的实际应用仍然有限，几乎没有令人信服的用例。一种源自类器官的近曲小管上皮细胞芯片模型显示出关键转运蛋白（包括有机阳离子转运蛋白2（OCT2）和有机阴离子转运蛋白1（OAT1）和OAT3）的重要上调。这种增强的转运蛋白表达导致与使用永生化近曲小管上皮细胞的对照芯片相比，药物摄取得到改善。同样，基于尿液衍生肾脏类器官的管状芯片平台在微流体系统中复制了功能性肾脏管状屏障。使用荧光罗丹明123，该模型已显示出OCT1和OCT2介导的转运，突显了该平台在研究P - 糖蛋白活性和跨上皮药物转运中的实用性。 类器官在ADME中的应用 类器官在吸收、分布、代谢和排泄（ADME）领域的应用仍然有限。关键挑战包括肝脏和肾脏类器官分化的相对不成熟。此外，尽管存在可转化性问题，但在动物中进行小药代动力学研究的相对简单性通常超过了基于类器官平台预测的预期益处。解决药物的ADME参数需要一个具有代表体内情况的酶活性、重现人类生理功能的屏障功能以及足够组织量（数百万细胞）以催化药物生物转化的平台。尽管存在技术挑战，类器官开始被探索以解决ADME相关问题。尽管存在技术挑战，类器官在满足ADME测试需求和解决预测跨模式药物代谢的关键行业难题方面显示出潜力。对于小分子而言，其主要优势在于重现相关的转运、屏障功能和生理代谢活动。肝脏类器官在功能性肝胆结构方面的最新进展可能有助于解决评估药物胆汁清除的关键差距，而肾脏类器官开发方面的进展可用于增强药物肾脏分泌的临床前评估。类器官忠实地复制组织靶标表达的能力特别适合于评估大分子的结合、靶标评估和靶标介导的药物处置。将流体连接的类器官组织和血管类器官相结合，有望通过实现重复采样和精确评估药物代谢和向靶组织的递送，来解决药代动力学和组织分布的挑战。 解决当前挑战的潜在方法 如上所述，类器官技术仍面临限制其在药物研发中广泛应用的障碍。其中一个障碍是，尽管类器官比细胞系复杂得多，但仍然是一个还原论的模型，缺乏真实组织的基本要素。大多数类器官缺乏血管，这限制了营养和氧气的输送，进而影响生长、成熟和功能，特别是在较大的类器官中。由于大多数药物是通过静脉给药的，类器官模型中缺乏血管化对准确评估药物提出了挑战。类器官培养通常不包括免疫细胞，因此分析免疫反应、炎症或免疫治疗相互作用具有挑战性。其他复杂的组织成分，如细胞外基质、基质细胞和神经元，也不存在于类器官中，影响其功能性和疾病建模能力。类器官不模拟全身性相互作用，如激素信号或多器官相互作用。原生组织会经历生物力学力，如剪切力、拉伸和压力，这些在类器官培养中很难重现。另一个主要障碍是类器官培养的变异性，这可能导致可重复性方面的困难：不同实验室之间的协议差异，如细胞来源、培养基组成和生长条件的差异，可能导致类器官发展的不一致性；来自不同患者供体的细胞的遗传多样性可能导致类器官批次之间的变异性；实现均匀和受控的分化或功能仍然具有挑战性，导致类器官批次内和批次之间的异质性；数据分析通常需要复杂且定制的分析工具，这也增加了研究过程和结论的复杂性。这些限制反过来又使类器官作为标准化模型用于高通量筛选和大规模药物测试变得复杂。同样，可扩展性仍然是药物研发的一个挑战。克服这些挑战将需要在培养协议、微流体技术整合和模型复杂性方面的进步，这些将共同使类器官能够充分发挥其作为个性化医学和药物发现可靠工具的潜力。 一种传统的基于类器官的药物筛选程序涉及将类器官嵌入基质中，并将这些类器官播种到多孔板中，然后在上面添加培养基。自动化机器人和液体处理系统可以简化这一过程。这种方法已被用于乳腺癌和结直肠癌（CRC）来源的患者衍生肿瘤类器官（PDTOs）的药物筛选。然而，这种方法缺乏对播种类器官的数量和空间分布的精确控制，限制了高通量筛选检测的可重复性。 图4：自动化高通量药物筛选策略 a, 一种传统方法，使用多滴设备将类器官 - Matrigel混合物自动播种到多孔板中。   b, 生物工程微流体装置能够快速生成大量复制的类器官滴，精确控制其形状、大小和细胞数量。   c, d, 这些类器官滴随后可以被引入多孔板（a部分）、微孔阵列（c部分）或微柱芯片（d部分）中进行进一步的药物评估。不同颜色表示微孔中的不同药物。   e, 多室微流体芯片可以通过直接将类器官细胞播种到腔室中用于高通量筛选（HTS），或者可以无缝集成到现有的HTS设置中（即微孔或微柱芯片），以促进药物递送。   f, 基于荧光或吸光度读数的自动化成像和数据处理，借助人工智能（AI）驱动的算法。HTS读数的例子包括细胞活性检测，如CellTiter-Glo或MTT，用于传染病药物筛选的荧光病原体，以及基于疾病相关表型的评估，例如疾病标志物的表达、疾病酶的活性、用于监测代谢病中代谢物动态的荧光染料以及与疾病相关的形态变化。 生物工程微流体装置 生物工程微流体装置能够快速生成大量嵌入在少量细胞外基质（如Matrigel）中的复制类器官。Matrigel是一种从Engelbreth–Holm–Swarm小鼠肉瘤中提取的溶解性基底膜，富含细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白111、胶原蛋白IV和纤维连接蛋白），能够支持细胞极性和存活。这些装置将类器官播种到多孔板、微孔 / 微阵列或微柱芯片中（图4a–d），可以精确控制类器官的形状、大小和细胞数量，从而显著提高均质性和可重复性（图4b）。这些系统非常适合高通量筛选（HTS），因为检测需要简单且稳健。理想情况下，生成的类器官应处于均匀的水平和垂直平面上，便于基于成像的表型分析。例如，嵌入在多孔板中的微工程水凝胶薄膜可以同时生成数千个均匀的类器官，这些类器官被困在微腔阵列中，处于同一焦平面上，能够对数千个接受抗癌药物处理的结直肠癌（CRC）类器官进行实时自动化成像。利用微流体技术打印嵌入Matrigel的类器官滴，确保类器官之间的均质性，同时保留组织异质性，提供与患者结果一致的稳健药物反应预测。小滴格式（具有较大的表面积与体积比）还能够实现高效的病毒感染和T细胞渗透，已应用于SARS-CoV-2的药物测试和快速嵌合抗原受体（CAR）-T效力检测。微孔阵列（图4c）已用于分析肺癌类器官，可在一周内预测药物反应，而3D培养的神经干细胞在384微柱芯片（图4d）中生长，已实现对大型化学库的神经毒性筛选。 3D高通量平台   这些3D高通量平台通常使用生物相容性涂层基质，如聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、水凝胶或Matrigel，以维持类器官的3D结构并支持细胞生长。对于某些类器官类型，如大脑类器官和肝脏组装体，可以使用带有旋转装置的超低吸附板进行无基质悬浮培养。这些悬浮培养也可以整合到微流体系统中，以生成用于HTS检测的均匀且大小可控的类器官。 自动化方法   早期的自动化发展进一步改善了类器官与基于微流体的HTS平台的整合（图4e）。例如，Mimetas器官板能够实现自动化培养基更换、精确控制环境条件，甚至在几乎无人工干预的情况下进行药物筛选。该平台已用于测试肝脏类器官的肝毒性以及肺部类器官的呼吸疾病建模，展示了自动化在药物筛选和疾病建模中的潜力。Emulate公司引入了另一种早期的类器官芯片方法。轨道摇床平台提供自动化类器官培养，并保持持续、温和的振荡，这对于3D类器官培养的最优生长和均匀性至关重要。这些系统可以与多孔板整合以实现规模化。另一个值得注意的自动化例子是使用高通量自动化平台培养和筛选来自结直肠癌、胰腺癌和其他癌症的患者衍生肿瘤类器官（PDTOs），该平台整合了机器人液体处理，用于自动化培养基更换、药物添加和化合物筛选，能够快速测试大型药物库。 为了从类器官提供的组织复杂性中提取信息，基于成像的技术和高内涵筛选系统已被整合到类器官自动化中，以提供稳健的数据采集和分析。荧光显微镜和自动化成像平台（如CellInsight CX7）能够实时监测类器官的生长、形态变化和药物反应。这些系统使用计算机视觉和图像分析算法来定量细胞活性、结构完整性、基因表达和药物效力等参数。例如，在阿尔茨海默病研究中，大脑类器官已通过自动化显微镜系统筛选针对淀粉样斑块或tau缠结的药物候选物。 自动HTS检测的读数   自动HTS检测的读数最简单且最可靠的方法是定量荧光或吸光度信号（图4f），如广泛使用的基于CellTiter-Glo或MTT的细胞活性检测。来自板式读取器的数据可以数字化定量，并直接使用标准化的统计方法进行处理。这些原理可以扩展用于设计疾病特异性读数。例如，关键疾病蛋白的表达或活性（如AATD中的A1AT产生）可以与催化化学反应或ELISA检测相关联。与疾病相关的表型（如脂肪肝病中的脂肪积累）可以使用荧光指示剂可视化并通过表型成像分析。一些遗传性疾病可以使用功能检测（如由CFTR功能介导的肿胀检测）进行检测。传染病相关药物筛选可能依赖于荧光标记的病原体或病原体相关RNA或蛋白的检测。 此外，先进的组织学技术是一种在诊断和毒理病理学中使用形态学终点的高度标准化方法，正逐渐被采用以增加类器官研究的通量和标准化。类器官可以被甲醛固定并嵌入石蜡（FFPE），或在最佳切割温度化合物或明胶中新鲜冷冻。组织微阵列允许将一个完整的96孔板类器官嵌入一个FFPE块中，为人工智能支持的定量图像分析提供了有力工具，该工具借鉴了数字病理学这一新兴领域。这使得将分子病理学方法应用于类器官系统成为可能，包括免疫组化、多重免疫荧光、空间转录组学和电子显微镜以及基质辅助激光解吸/电离（MALDI）成像。 监管挑战与机遇 尽管类器官具有显著优势，但在将其无缝整合到药物开发流程之前，监管接受仍然是一个主要障碍。解决这些挑战可以加强药物安全性评估，促进更有效疗法的开发，并减少对动物实验的依赖。 类器官在药物安全性测试中的应用   类器官在药物安全性测试中的应用面临的挑战包括模型资质认证、可重复性、临床转化、成本效益优化和监管接受。为了支持首次人体临床试验，临床前测试通常结合体内和体外模型，以最大化临床预测性，同时尽量减少动物使用。当需要功能性和生理相关终点时，类器官可以补充传统的二维细胞培养检测，特别是在解决机制问题时，但目前对于监管文件来说，复杂性较低、通量更高、成本更低的体外工具更受青睐。在特定使用情境中展示出比传统方法更优越的预测能力等明显优势是更广泛采用类器官的关键。此外，将资质认证工作扩展到多样化的使用情境和治疗模式中，对于增强人们对类器官预测价值的信心至关重要。重要的是，尽管类器官作为预测毒性的转化模型显示出潜力，但这里提到的大多数研究代表了临床前的概念验证工作，与体内和患者数据的验证仍然有限。需要进行更多的正向和反向转化研究，以将类器官确立为转化标准。 类器官在临床前药物开发中的应用通常分为两类：内部决策（例如，筛选和机制研究）和纳入监管文件。制药公司已在选定的使用情境中将类器官用于探索性和机制研究，但这些研究很少在决定临床试验安全性方面起到关键作用。 类器官的复杂性也带来了实际障碍。其构建和维护需要大量的时间、资源和技术专长，通常需要先进的成像和数据分析流程。对于资源有限或使用案例偶尔的组织来说，在内部维持这种专长是不切实际的。将项目外包给拥有大量基于类器官项目的合同研究组织，以维持一个稳固的商业模式，是内部努力的一个可行替代方案。此外，努力标准化和自动化协议，简化工作流程，对于释放类器官的更广泛效用并确保其整合到药物开发流程中至关重要。 应用于药物开发的类器官的监管框架 首次人体临床研究之前非临床研究的目标是评估产品的药理活性，并确保在I期临床研究中健康志愿者或患者的药物安全性。对于人类药物开发，FDA法规并未规定用于支持临床研究药物合理安全性的研究类型或设计（无论是体内、体外还是计算机模拟）。尽管动物毒性研究已被证明对于识别潜在人类风险至关重要，但寻找减少动物使用并开发有效替代方法的方法是一个重要努力方向。在监管环境中，迫切需要更具人类预测性的转化平台和技术，如类器官，这些被称为新方法（NAMs）。2022年，美国国会通过了FDA现代化法案2.0，随后是3.0，澄清了药物开发中动物测试的感知要求。这要求FDA建立一个途径，使实体可以申请在特定使用情境中使用非临床检测方法。为此，FDA启动了“替代方法计划”，首先，扩大流程以认证用于监管使用的替代方法；其次，为开发替代方法的外部利益相关者提供明确指导；第三，通过应用研究填补信息空白，以推进新政策和指导的开发。最近，FDA宣布计划用一系列实验室方法取代单克隆抗体疗法和其他药物开发中的动物测试，包括基于AI的毒性计算模型以及细胞系和类器官毒性测试。然而，将类器官成功整合到临床前测试流程中需要对其适当表征、验证和资质认证，以向最终用户以及卫生当局证明其适用于特定目的或使用情境（Box 3）。经济合作与发展组织（OECD）很好地描述了验证原则，为如何针对个体使用情境评估类器官提供了有用的指导。这种评估是监管环境中使用方法的标准。目前，跨行业联盟和卫生当局正在共同开发NAMs（包括类器官）的监管接受努力，重点是制定标准并培训利益相关者。理想情况下，由生物工程师、生物学家、毒理学家和病理学家组成的多样化团队共同开发类器官模型，并共同评估其使用情境。 Box 3：监管指南   在经济合作与发展组织（OECD）层面，有三份与体外方法开发和使用相关的指导文件：《良好体外方法规范指南》（GIVIMP）、《描述非指南体外检测方法的指导文件》（GD211）和《新或更新检测方法用于危害评估的验证和国际接受的指导文件》（GD34）。GD34和GD211支持对类器官进行详尽的描述、表征和验证，以增强其可信度。其中，表征可以包括对类器官的生物学相关性和科学有效性的评估，而验证是指为特定使用情境建立某一检测的可靠性和相关性的过程。 监管展望   目前，只有少数基于细胞的检测方法被经济合作与发展组织（OECD）的测试指南所描述。大多数毒性测试仍然属于非指南方法。最近，美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）都提出了推进新方法（NAMs）在药物开发中监管接受的路线图。例如，EMA的自愿提交数据程序，也称为安全港方法，旨在允许生成、汇编和审查数据，以帮助为NAM定义使用情境。此外，EMA评估特定使用情境下某一NAM的准备情况和监管接受的局限性。这一过程旨在增强对NAMs的信心，并可能支持基于定义的使用情境起草资质标准，这反过来又会指导模型开发者如何为监管应用资格认证新型模型。FDA的路线图则专注于在未来几年内逐步用NAMs取代单克隆抗体和其他药物的动物测试。 因此，逐步将类器官作为NAM纳入监管提交，以替代、减少和改进动物模型，具有潜在的可能性。然而，这不应损害评估药品所要求的既定标准。至关重要的是要保持谨慎的平衡——在维护欧洲药品监管网络的严格标准的同时，拥抱这些创新方法，包括类器官。 结论   类器官在药物开发中的应用为临床前研究提供了一种更准确且与患者相关的模型，实现了变革性的飞跃。如上所述，类器官作为一个平台，能够重现人类组织的复杂性，提供比传统二维细胞培养和动物模型更具生理相关性的环境。然而，尽管该领域取得了重要进展，但仍面临挑战。特别是在高通量筛选（HTS）的背景下，类器官培养的可扩展性和可重复性需要进一步完善。这将需要持续开发和验证标准化、自动化的类器官平台，并建立清晰的监管框架以促进行业采用。此外，增强类器官对人类治疗反应的预测能力——特别是在癌症、神经退行性疾病以及慢性炎症和代谢疾病等复杂疾病中——还需要在血管化、免疫系统整合和多器官建模方面进行创新，并结合单细胞组学、高速图像采集和人工智能支持的数据分析等尖端分析技术。随着技术的成熟，我们期望基于类器官的平台成为药物发现流程中不可或缺的一部分，弥合基础科学与临床结果之间的差距。类器官可能会彻底改变我们理解和治疗疾病的方式，其在药物开发中的未来潜力巨大。 Wang, D., Villenave, R., Stokar-Regenscheit, N. et al. Human organoids as 3D in vitro platforms for drug discovery: opportunities and challenges. Nat Rev Drug Discov (2025). https://doi.org/10.1038/s41573-025-01317-y