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摘     要 基因治疗产品通过所转导遗传物质的转录或翻译而发挥作用，基于蛋白的疗法需要反复给药，而如果可修复病人的错误基因或直接提供正确的基因，那么单次治疗就有可能产生持续的治疗效果。随着基因治疗的突破性发展，为某些罕见疾病（尤其是单基因遗传病）提供了一次治愈的可能，或将成为未来治疗人类疾病的重要手段。国家药品监督管理局于2021年12月发布了《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》，为基因治疗产品的研发提供建议，以支持开展相应的临床试验。本文回顾和梳理了已上市的3种基因治疗产品所开展的非临床研究，并分别从药理学、药代动力学和毒理学等方面对基因治疗产品非临床评价的关注要点进行分析和探讨，供研究者关注或参考。 基因治疗概念的形成可以追溯到20世纪70年代，科学家首次提出基因交换和基因优化的理念。随后，一篇发表在《Science》杂志的文章中正式提出使用基因疗法作为治疗人类遗传疾病的手段，单基因遗传病可通过给病人提供正确的基因来治疗。截至目前，在针对单基因遗传病的基因治疗领域，美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）共批准了3款以腺相关病毒作为载体，并通过直接注射进行递送的基因治疗产品。尽管已有上市药物的研发经验，但由于基因治疗产品种类、作用机制、作用特点、安全性风险差异较大，使其非临床研究相对于传统药物而言存在新的问题和挑战。本文通过对上述3个已上市基因治疗产品所开展的非临床研究进行梳理分析，扼要探讨基因治疗产品在非临床研究中需要特别关注的问题，为我国探索和实践此类产品的研发和监管提供参考。 1 非临床研究概要 1.1 治疗策略 基因治疗需要确定疾病的遗传基因，选择合适的递送系统，将治疗性基因导入以发挥治疗作用。通过非整合载体将基因递送到长期存活的细胞或缓慢分裂的细胞内，并确保该基因在细胞存活期间持续表达，目前已上市的基因治疗产品均采用了这样的治疗策略。本文着重介绍已上市这3个基因治疗产品的非临床研究方面情况。 1.2 递送方式 与小分子药物不同，大多数基因治疗的分子无法通过自由扩散越过生理屏障进入细胞内部，且面临在血液循环中被降解的问题。经过多年的发展，已发展出包括病毒载体、非病毒载体等多种用于人体基因治疗的递送途径。由于病毒载体可以高效地感染人类细胞, 具有传递其基因组进入细胞的分子机制，多数基因治疗方案采用病毒作为递送载体。目前，最常见的病毒载体有逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒和慢病毒等。腺相关病毒（AAV）是最为常用的病毒载体，可感染分裂和非分裂细胞，在不直接插入宿主基因组的情况下，呈卫星状态游离于宿主细胞基因之外长期稳定表达。但外源基因容量有限（通常在4.5到4.9 kb之间）也限制了它的应用，科学家们目前正试图克服这一限制。 非病毒的脂质体载体在安全性方面（如遗传毒性）具有优势，脂质体将外源基因包裹后与细胞膜结合, 由于脂质体与细胞膜的相似性而发生融合，使得外源基因进入细胞。脂质体细胞转染的方法目前已经相对成熟，该方法简单、无免疫原性、细胞毒性低, 但转染效率不高，多为瞬时表达。目前，脂质体在基因治疗领域多被用于体外细胞转染，而体内递送应用随着新型脂质体的产生和组合，正在迅速发展。 1.3非临床研究设计的总体考虑 根据产品具体特点和早期临床试验计划制定非临床研究计划，用以评估产品在目标患者人群中的风险-获益特征。基因治疗产品非临床研究为临床试验提供支持性信息，研究内容一般为药理学、药代动力学、毒理学，用于提供作用机制有效性证据、明确生物分布特点、确定药理作用特征、了解毒理学特征（确定靶器官、暴露量-反应关系和可逆性等）、确定首次人体试验的安全剂量水平、建议临床给药途径和剂量递增计划、支持患者入组标准、确定可指导临床监测的生理参数、提示临床试验风险等。 2 药理学 2.1动物模型的选择 Zolgensma在新生SMNdelta7小鼠中进行了体内有效性研究，该模型缺乏内源性小鼠运动神经元存活基因1（SMN1）基因，但携带2份完整的人类SMN基因（hSMN2）和另外2份去除外显子7的hSMN2 基因，以提供足够的SMN表达而防止胚胎死亡。Luxturna则分别采用基因敲除和自发基因突变模型考察了其有效性。RPE65-/-模型通过靶向破坏小鼠RPE65建立，模型在3到4月龄时视网膜功能出现严重异常（进行性视网膜变性），15周龄时视网膜生理学和生物化学发生变化，视杆光感受器（PRs）外节盘紊乱，视网膜电图（ERG）检测可见视杆功能消失；rd12小鼠是一种RPE65自发基因突变模型，通过间接检眼镜和ERG进行筛选，该基因缺陷被鉴定为RPE65基因第3外显子的无义突变，预计会导致蛋白质功能丢失，模型在3周龄时表现出ERG反应减弱，在大约3月龄时出现视网膜变性；RPE65缺陷犬模型是由cRPE65基因纯合突变而自然产生的，其基因中4个碱基对的缺失会导致移码和过早终止密码子，进而导致RPE65蛋白不表达，该模型表现出的疾病表型与人类视网膜变性相似，包括先天性视力障碍，并发展为视网膜变性。Glybera在分别使用脂蛋白脂肪酶（LPL）缺陷（LPL-/-）小鼠和猫的研究中验证了其治疗LPLD的机制和原理，LPL-/-小鼠可见持续的高三酰甘油血症伴随总胆固醇（TC）升高和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）降低，且不能存活超过24 h；LPL-/-猫为自然产生的LPLD猫品系，其表型类似于人类LPL缺乏症，有乳状血浆、黄瘤病和视网膜脂血症，且血浆三酰甘油浓度异常高。 2.2 概念验证研究 新生SMNdelta7小鼠单次静脉给予1.2×1013～1.1×1014 vg·kg-1的Zolgensma后，生存率可见剂量依赖性的改善，中位数生存期从15 d增加至49 d（批号：600156）；在SMNdelta7小鼠中使用早期非临床批次载体开展的其他研究表明，其运动功能、神经肌肉传递、体重增加和心脏功能均有改善；在出生后第1或2天给药的小鼠中，生存率和体重增加的改善最高。RPE65-/-小鼠和rd12小鼠模型视网膜下注射Luxturna（每只眼1×109 vg）后，均可见注射眼RPE细胞表达RPE65和视网膜电图（ERG）改善，rd12小鼠还可见视力改善；RPE65突变犬经视网膜下给予(双侧同时给药) Luxturna (每只眼8.25×1010 vg)后，可改善瞳孔反应、ERGs和视觉行为，减少眼球震颤，在RPE细胞中可检测到RPE65蛋白；此外，经视网膜下注射Luxturna(每只眼1.5×1011 vg)(第0天注射1只眼，13~15 d后注射对侧眼)后，可在第一眼注射后2周内改善定向能力（navigation）和瞳孔对光反射，第二眼注射后视觉行为进一步改善，眼球震颤减少。LPL缺陷小鼠和猫模型单次经肌肉注射Glybera，可诱导人源LPL的持久表达，改善三酰甘油血症和脂血症，并可延长LPL缺陷小鼠的生存期。 基因治疗产品一般针对具体的基因缺陷所设计，上述3个已上市产品在非临床研究阶段的药理学研究中均采用了转基因动物作为试验模型。Zolgensma的主要药效学试验包含6个独立的研究，试验中均采用临床批次样品，包括I期临床（批号NCHAAV9SMN0613）和Ⅲ期临床（批号816836、600156、600307、600443）中使用的样品，均设置4或5个剂量组，并在1.2×1013～1.1×1014 vg·kg-1剂量范围内，可见剂量依赖性的改善SMNdelta7小鼠的生存率。由于模型的局限性，单一模型可能无法准确预测基因治疗产品在患者人群中的有效性和安全性，Luxturna和Glybera均在多个动物模型中开展了药效学试验，分别对动物表型、导入基因的体内表达和功能活性相关生物标志物等进行检测来说明产品的作用机制，并形成证据链，这有助于生成支持产品开展临床试验的数据，还有机会发现用于临床试验监测的活性/毒性生物标志物，以支持产品进行临床开发。 3 生物分布研究 Zolgensma的生物分布研究整合在新生FVB小鼠单次给药毒性试验中，给药12周后，载体DNA浓度在心脏中最高（12周：1.69×105 vg·μg-1 DNA），其次是肺、肝、腰脊髓、股四头肌、大脑、卵巢、脾和睾丸。人SMN mRNA转录本具有相似的组织表达谱，在心脏中表达水平最高（12周：3.14×106 copies·μg-1总RNA），其次是股四头肌、肝、肺、大脑和腰脊髓；在脾和性腺组织中检测到低水平的SMN mRNA。Luxturna分别在正常视力猴和犬单次给药毒性试验中开展了生物分布研究，在载体注射眼的眼内液（前房液和玻璃体）检测到了最高水平的载体DNA（107 copies·μg-1 gDNA），在视神经中检测到低水平的载体DNA（1 571 copies·μg-1 gDNA），在非眼组织中分布着非常有限的低水平载体DNA，在生殖腺中未检测到载体DNA。Glybera开展了多项分布研究，主要检测了注射部位肌肉、肝、脾和腹股沟淋巴结中的载体DNA；在猫的睾丸、附睾和活动精子中检测到了载体DNA，提示该载体可分布至生殖腺；在小鼠中，注射部位肌肉和少量腹股沟淋巴结在180 d观察期内均可检测到载体DNA。 生物分布特征是基因治疗产品非临床研究的关键部分，有助于解释药理学、毒理学的研究发现，也可为临床试验设计提供支持信息。基因治疗产品的作用特点差异很大，应根据产品的具体特点，基于风险分析的基础来设计产品的非临床研究。上述3种产品虽然均采用AAV作为载体，但是由于AAV血清型的不同、给药方式的不同（除导入的目的基因的影响之外），生物分布情况有明显差异。Zolgensma的载体DNA和SMN mRNA转录本在心脏中具有最高的浓度或表达水平，在毒性研究中亦可见明显的心脏不良反应；Luxturna则因其给药方式，主要分布在眼内液中，并可见视网膜相关的毒性反应；Glybera的载体DNA主要分布在注射部位的肌肉组织中，其毒性反应也表现为相关的肌肉损伤等。在关键组织器官的长期分布（如心脏、神经系统、肺、生殖器官等），可能会带来相应的风险，在非临床研究中需要重点关注。国际人用药品注册技术协调会在基因治疗产品的生物分布方面已制定专门的指导原则S12，将于2023年完成，届时，基因治疗产品非临床生物分布研究将会有较为明确的技术标准和建议。 4 毒理学研究 Zolgensma在新生FVB小鼠中开展了多项单次给药毒性研究，静脉给予7.9×1013 vg·kg-1及更高剂量，可剂量依赖性的导致心肌出现轻微至轻度的变性或再生。在1.5×1014 vg·kg-1及更高剂量水平，心脏不良反应的发生率和严重程度呈剂量依赖性增加，包括心房血栓形成、心房扩张、纤维组织增生、心肌变性和炎症；心室的其他变化包括炎症、水肿和纤维化；这些发现有时与心脏重量增加和大体检查异常（包括心脏增大、形状异常和/或心房增大）相关。肝的不良发现包括肝细胞变性/坏死、肝细胞肥大、核周空泡化和枯氏细胞增多。在2.4×1014 vg·kg-1或更高剂量水平下，动物死亡与Zolgensma的心脏和肝的毒性相关，死亡原因常见于心房血栓形成，也与心房扩张、纤维组织增生、心肌变性、单核细胞浸润和肝细胞变性或再生有关。Luxturna在正常视力犬、RPE65突变犬和正常视力非人类灵长类动物（NHPs）中进行了单次和重复给药毒性试验。在犬和NHPs中单次或重复视网膜下给药后，在非眼组织中未观察到毒性反应，可见偶发网膜炎症，认为和手术给药过程有关。正常视力犬视网膜下注射每只眼1.5×1012 vg的Luxturna，镜检可见载体暴露区域出现炎症和视网膜变性。眼部组织病理学显示，RPE65突变犬同一只眼睛重复给药，可能存在轻微的免疫反应。Glybera在小鼠中开展了3项单次给药毒性试验，剂量范围为1×1011 ~1×1013 vg·kg-1，观察期分别为90、105和180 d，可见体重增加减少，尿素和肌酸磷酸激酶降低，组织病理学检查可见肌肉退行性变和亚急性炎症，且具有剂量依赖性；在小鼠中开展了生殖毒性研究，雌性小鼠交配前或妊娠期间给药，胎仔中均未检测到Glybera，在雄性小鼠性腺中可检测到，但申请人未进一步开展相关研究。 基于基因治疗产品的生物学复杂性，安全性评估应足够全面，以允许识别和量化潜在的局部和全身毒性。动物种属的选择通常不严格要求数量，重点是试验动物种属要反映受试物的药理学特点，上述产品选择了1个或2个具有生物活性的种属开展毒理学试验。毒理学试验应尽量采用临床拟用样品，Zolgensma采用临床Ⅲ期的样品开展了毒理试验，而Luxturna和Glybera在早期使用非临床拟用样品开展试验，后期均采用临床批样品开展了相关研究。在合适的情况下，毒理学试验可以与药效学试验联合，Luxturna在RPE65突变犬中开展的毒理试验合并考察了药效学指标。 以病毒为载体的基因治疗产品非临床安全性开发策略与小分子或单抗类药物不同，后者通常涉及重复给药，时间长达几个月，而基因治疗产品一般为单次给药，并对动物进行一段时间的观察之后进行个案处理，上述产品的毒理学试验均设置了多个剂量组以考察毒性的量效关系，并覆盖了临床拟用的剂量；而给药期限和频率则根据具体产品设定，上述产品均开展了单次给药毒性试验，Luxturna还开展了重复给药毒性试验以模拟可能的人体情况。此外，基于产品的一般毒理发现、作用机制、适应症和特点等，上述产品均未开展生殖毒性、基因毒性和致癌性试验。 5 讨论 基因治疗预计将成为未来治疗人类疾病的重要手段之一，目前主要围绕着发病机制相对明确的单基因遗传病开展，而随着基因治疗产品的不断研发，越来越多的产品已进入临床试验，治疗领域涉及癌症、免疫系统疾病、消化系统疾病、遗传性疾病、皮肤疾病和血液病等。本文主要对支持基因治疗产品进行早期临床开发的非临床研究进行了阐述，上述基因治疗产品均针对具体的基因缺陷所设计，药理学试验采用多种转基因动物作为试验模型；生物分布研究多结合在毒性试验中进行，由于AAV血清型的不同、给药方式的不同（除导入的目的基因的影响之外），生物分布情况有明显差异；毒理学试验均采用了具有生物活性的种属开展，设置多个剂量组以考察毒性的量效关系，并覆盖了临床拟用的剂量。 AAV作为目前最有前景的基因治疗载体，被认为具有相对低的插入突变风险，AAV载体主要保持非整合形式，很少整合到宿主细胞DNA中，曾有共识认为AAV不会导致任何人类疾病。2021-09-06，BioMartin宣布FDA暂停了其在研基因疗法BMN307的Ⅰ/Ⅱ期临床研究，该研究旨在评估BMN307治疗成人苯丙酮尿症（PKU）的安全性和有效性，暂停原因是在一项评价BMN307在2种生殖系突变小鼠中的活性持久性的研究中，高剂量组（2e14 vg·kg-1）发现6/7只动物在给药52周后出现肿瘤，5只患有胰腺癌，1只患有肝细胞癌，并且有证据表明AAV载体部分整合到基因组中。尽管已有AAV载体相关产品上市，且针对罕见的、危及生命的疾病，应基于患者的风险获益比进行全面考虑，但AAV载体应用于人体的安全性风险仍不容忽视。此外，虽然非病毒的脂质体载体在安全性方面具有优势，但在基因治疗领域多被用于体外细胞转染，而体内递送技术仍在发展中。因此，在开展临床试验之前对载体进行全面的安全性研究是非常关键的。 由于基因治疗产品的多样性、生物复杂性和科学认识的局限性，基因治疗产品研发应遵循创新药物研发的一般原则，分阶段逐步推进。在现有药品监管认知体系下开展非临床研究，基于产品的特点开展风险获益分析，并采取具体问题具体分析的原则对产品进行综合评价。 版权声明：本文来源于中国临床药理学杂志 2023 年第 39 卷第 2 期。文章内容版权归原作者所有，仅供学习参考，如有侵犯版权请联系小编，我们将及时回复。

新兴基因递送平台中的工程挑战与转化机遇 「BioMedDaily」 研究概述 2026年5月6日，美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心Betty Y. S. Kim教授团队在Nature Biomedical Engineering期刊在线发表题为“Engineering challenges and translational opportunities in emerging gene delivery platforms”的综述文章。本综述系统比较了腺相关病毒（AAV）、脂质纳米颗粒（LNP）和细胞外囊泡（EV）三类代表性基因递送平台在遗传载荷兼容性、靶向能力、胞内表达效率、免疫原性及临床转化方面的优势与局限。 文章指出，AAV具有持久转基因表达和较成熟的临床转化基础，但受限于载荷容量小、既往免疫和高剂量毒性；LNP具备可规模化生产、RNA载荷适配性强和临床安全性较好的特点，但仍面临肝脏富集、内体逃逸效率低和重复给药免疫反应等问题；EV则因低免疫原性、天然屏障穿越能力和生物相容性受到关注，但其载荷效率、批次一致性、纯化标准和GMP生产仍是主要瓶颈。文章进一步讨论了平台杂交、AI辅助设计、非水剂型、局部给药和个体化递送策略在提升组织特异性、安全性和可及性方面的潜力。 总体而言，本综述强调下一代基因治疗递送系统不应局限于单一平台竞争，而应通过标准化比较研究、疾病场景适配和工程化组合设计，实现更安全、可扩展且功能精准的体内基因递送。 导读 「BioMedDaily」 基因治疗旨在通过递送核酸来调节患者体内的细胞功能，从而治疗遗传性疾病。治疗疗效的一个关键决定因素在于能否将这些遗传载荷精准、高效且具有组织特异性地递送至目标部位，而这一挑战依赖于专门化载体的开发。尽管数十年来不断创新，生物学和生理学屏障仍持续阻碍体内基因递送，限制了基因治疗的临床转化。这些障碍推动了递送策略的重大进展，并在过去五年中促使该领域重新兴起，其标志是多种已显示临床获益的基因治疗产品获得监管批准。 在过去六十年中，基因递送系统经历了一系列技术变革。在最突出的平台中，腺相关病毒（AAVs）、脂质纳米颗粒（LNPs）和细胞外囊泡（EVs）分别代表病毒载体、合成非病毒载体和天然载体（图1）。病毒载体最早进入临床，并且仍然是基因治疗中的基础性平台。AAVs因其非整合型附加体特性而受到青睐，这种特性降低了早期病毒系统（如逆转录病毒和腺病毒）所见的插入突变和免疫原性风险。尽管如此，AAVs仍存在重要局限，包括载荷容量小、既存免疫的存在以及染色体整合风险，这些问题持续引发人们对其安全性和疗效的关注。 图1. AAVs、LNPs和EVs作为基因递送平台的概述。 这些局限促使人们更加关注非病毒载体，尤其是脂质基系统。其中，LNPs已显示出高递送效率、可调节的组成、临床规模化生产能力以及良好的安全性特征。LNPs在2019冠状病毒病（COVID-19）信使RNA疫苗成功中的关键作用凸显了其临床潜力，并加速了其在更广泛基因递送应用中的采用。与此同时，EVs作为天然分泌的脂质双层囊泡，因其内在生物相容性、低免疫原性、长循环时间以及跨越生物屏障的能力而受到越来越多关注。这些特性使EVs成为核酸治疗中具有吸引力且可与合成纳米载体互补的递送工具。 该领域目前正经历一种范式转变：从病毒系统转向非病毒系统，从合成构建体转向生物来源载体。这一演变反映出人们对更安全、更高效且可规模化的基因递送技术的需求不断增加。与此同时，基因递送领域的进展已推动其应用范围不断扩大，包括离体和体内基因转移、基因编辑治疗以及过继性细胞治疗（表1，见https://www.nature.com/articles/s41551-026-01643-5/tables/1）。AAVs产品是最早获得监管批准的基因治疗产品之一，始于2012年获批的Glybera。此后，越来越多AAVs治疗产品获得批准，例如Luxturna、Zolgensma、Hemgenix、Roctavian、Elevidys、Beqvez和Upstaza，主要用于罕见单基因疾病（图1b）。与此同时，COVID-19大流行推动了LNPs配方mRNA药物的发展，并建立在Onpattro等既往LNPs成功案例的基础之上。尽管EVs基因治疗尚未获得监管批准，但过去五年中，其临床前和临床开发工作呈指数级增长。 除罕见病和感染性疾病预防外，基因治疗平台目前也正在被探索用于更广泛的适应症，包括癌症、神经系统疾病、心血管疾病、肺部疾病、代谢性疾病和免疫性疾病，以及再生医学。值得注意的是，若干过继性细胞治疗和基因编辑治疗，例如嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）以及基于CRISPR的产品Casgevy，已经获得监管批准，但主要应用于离体工程化自体细胞的背景下。随着AAV、LNP和EV递送技术的持续进步，这些治疗模式正越来越多地被改造用于直接体内应用。 在本综述中，作者对AAVs、LNPs和EVs作为代表性基因递送平台进行了系统性比较分析。研究团队考察了它们的关键特征，包括遗传载荷兼容性、靶向精准性、细胞内表达和生物相容性，并评估这些特性如何影响其转化潜力（图1d）。作者进一步探讨了各平台特有的挑战和局限，尤其是在临床应用背景下，并评估它们在多种疾病中的作用（图1e）。研究团队特别关注过继性细胞治疗和基因组编辑治疗，因为这些载体在其中发挥着关键赋能作用。最后，本研究讨论了克服当前递送障碍的策略，并强调了下一代基因递送系统设计中的创新机遇。 正文 「BioMedDaily」 1. AAVs、LNPs和EVs的功能比较 AAVs、LNPs和EVs表现出不同的理化性质，这些性质会影响其生物学性能、工程化需求和转化潜力（框1，见原文）。AAVs能够实现持久且强效的基因表达，但受到宿主免疫反应的限制，其给药资格因载体衣壳和患者特征而异。LNPs作为合成载体，支持广泛类型核酸的包封，但其递送效率在很大程度上依赖于配方优化。EVs作为天然来源囊泡，具有低免疫原性和穿透屏障的能力，但其治疗应用受到核酸装载效率有限和生产规模化能力不足的阻碍。为了评估这些平台的临床转化潜力，有必要从几个关键维度对其进行比较：载荷兼容性、靶向性、基因表达和耐受性（表2，见原文）。 1.1 遗传载荷兼容性 高效的遗传载荷包装是实现治疗疗效和规模化生产的前提。 AAVs主要用于DNA递送，可提供长期表达，但其载荷容量限制在约4.7 kb。这使其无法容纳大型基因（例如DMD）以及碱基编辑器（约5.2 kb）或prime editors（约6.3 kb）等基因编辑工具。尽管多载体系统、最小化调控元件以及片段化共递送策略已被探索，但这些方法通常会导致滴度较低和基因组片段化。 相比之下，LNPs能够包封广泛类型的核酸，包括小干扰RNA、microRNA、环状RNA、质粒DNA、mRNA和自扩增RNA（saRNA）。经过临床优化的LNPs能够高效包封1–5 kb的载荷，其中mRNA疫苗的包封效率超过90%。更大的saRNA构建体（9–12 kb）在定制化脂质组成和配方方法的支持下，也可达到约70–90%的效率。 EVs天然携带小型非编码RNA，并在较低程度上携带编码RNA和DNA片段，具体取决于其细胞来源。为了装载治疗性核酸，研究人员已开发出多种主动和被动工程化方法。尽管小RNA的装载效率可达10–30%，但较长转录本的递送效率仍然较低。长度可达4,000个核苷酸的全长mRNA（例如TP53、I型胶原α1链、骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子A、白细胞介素-12（IL-12）和干扰素-γ）通常每个囊泡只能装载约1–10个拷贝，且电穿孔法很少能达到超过30%的效率，远低于LNPs（表2）。为了利用LNPs更优越的装载能力，研究人员提出了LNP–EV杂交体。这类杂交体通过直接膜融合和脂质混合形成，通常由物理或化学干预诱导，例如冻融、超声处理、挤出、聚乙二醇（PEG）、促融合肽或病毒促融合蛋白；其配方参数（例如EV:LNP比例、pH和PEG-脂质含量）可被调节，以最大化双层膜混合，并尽量减少载荷泄漏或EV表面功能丧失。 简而言之，AAVs是小型DNA构建体的可靠载体，但并不适合大型基因和基因编辑技术。LNPs可通过配方调节，为多样化且较大的RNA载荷提供稳健的包封能力。EVs尽管具有良好的生物相容性，但在高效装载和递送较长转录本方面仍面临重大限制，因此带来了显著的转化挑战。 1.2 靶向特异性 靶向递送通过确保遗传载荷在正确时间到达正确组织来决定治疗疗效。它还会影响给药途径、安全性和免疫反应。靶向特异性受到给药后事件的影响，例如生物分子冠形成、循环清除、肝脏蓄积以及跨越生理屏障的能力（图2a）。 AAVs主要依赖其衣壳实现组织嗜性。衣壳特异性嗜性已经实现了中枢神经系统（CNS）和心脏递送，例如Zolgensma中通过AAV9介导SMN1递送治疗脊髓性肌萎缩症。除天然衣壳外，衣壳工程也可通过定向进化（例如易错PCR或DNA改组）、理性设计（例如在表面环中插入肽或蛋白，或偶联抗体、纳米抗体或设计型锚蛋白重复蛋白）以及人工智能（AI）驱动的方法（例如利用机器学习模型设计具有多重特性的衣壳并筛选测序变体）对AAVs进行重新靶向，从而获得具有定制嗜性的工程化衣壳，改善非肝脏靶向、降低免疫原性，并可能允许再次给药。 图2. AAVs、LNPs和EVs的体内命运与细胞内转运途径。 LNPs在历史上一直受到肝脏蓄积的限制。通过改变LNPs的理化性质（大小、电荷和脂质组成），研究人员已经实现了选择性器官靶向，并将递送扩展至肝外组织。替代给药途径，如吸入、鼻内、口服或玻璃体内给药，也可增强组织特异性，尽管这些方式通常需要定制化配方（例如气溶胶或水凝胶）。然而，LNPs仍容易通过调理作用和生物分子冠形成被快速清除（框2），其生物分布也会受到年龄和性别的影响。 EVs表现出内在归巢能力，这由其膜相关脂质、蛋白和聚糖驱动。它们的嗜性反映了供体细胞来源。例如，肿瘤来源EVs可靶向肿瘤，并可能刺激抗肿瘤免疫。EVs还能够比合成载体更有效地跨越血脑屏障（BBB）。然而，由于冠介导的清除，EVs同样存在非特异性摄取以及肝脏或脾脏蓄积的问题（框2）。改善靶向性的策略包括用抗吞噬分子修饰EVs、工程化亲本细胞以表达靶向配体，以及用单克隆抗体或肽进行表面修饰。一项直接比较显示，在胰腺癌模型中，双靶向EVs的跨胞转运和肿瘤蓄积水平是LNPs的2–3倍。 总体而言，在临床前研究中，EVs在靶向和与生物屏障相互作用方面显示出内在潜力。AAVs具有更成熟的重新靶向工具箱和系统性递送能力，并已有跨越屏障的临床证据。LNPs同样已经获得临床验证，并且在肝脏靶向方面最为成熟，但其屏障应用仍处于探索阶段。关于组织嗜性和基因表达效率的比较研究仍然有限（表2），这凸显了开展标准化评估的必要性，以指导不同疾病背景下的平台选择。 1.3 细胞内基因表达 高效的细胞内基因表达不仅依赖于平台本身的性质，还依赖于关键细胞过程：（1）内吞作用；（2）内体逃逸；以及（3）细胞质表达或核转运（图2b）。这些步骤在很大程度上决定了基因递送的总体效率。 AAVs通过受体介导的内吞作用进入细胞，主要经由网格蛋白包被小窝。不同衣壳与不同的表面聚糖和共受体相互作用，从而决定内化途径和转导表现。例如，AAV2结合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，AAV5靶向唾液酸，AAV9结合半乳糖；对于大多数衣壳，包括许多工程化变体，其高效进入还依赖多衣壳AAV受体（KIAA0319L）。这些机制性认识推动了衣壳工程的发展，以提高细胞摄取效率。 LNPs也通过网格蛋白介导的内吞作用或巨胞饮作用被内化，其过程受到脂质组成和细胞类型的影响。可电离脂质（例如DLin-MC3-DMA（MC3））可增强囊泡摄取，而胆固醇和辅助脂质支持膜融合。PEG化可在循环中稳定颗粒，但如果使用过量，则可能阻碍摄取。 相比之下，EVs利用多种内吞途径，包括网格蛋白和小窝蛋白介导的途径、巨胞饮作用、吞噬作用，甚至直接融合。EVs的摄取受表面蛋白（例如四跨膜蛋白）调控，并因供体和受体细胞类型而异。尽管这种多样性增强了生物相容性，但也带来了递送变异性。 对于所有这些平台而言，内体逃逸都可能构成一个主要瓶颈。AAVs优于非病毒平台，原因在于其衣壳介导的、pH依赖性膜穿孔过程，并受到VP1磷脂酶A2结构域的辅助。LNPs的逃逸率较低（约1–2%），因为大多数LNPs会被转运至溶酶体并被降解，这促使当前研究致力于开发具有内体裂解能力的配方。在脂质化学层面，调节可电离脂质的表观pKa（约6.2–6.8）和结构（改变头基，例如叔胺；可降解连接臂，例如酯或缩酮；以及疏水尾部，例如支化或不饱和基团）可增强其在晚期内体中的质子化，并促进其与阴离子脂质之间的静电相互作用，从而驱动膜不稳定化和半融合。为缓解PEG困境（延长循环时间但阻碍内体逃逸），PEG-脂质被最小化使用，或被设计为可裂解形式以在内体中脱落；此外，模块化干预措施（例如pH响应性促融合肽、质子海绵添加剂或病毒–脂质杂交体）可在相关模型中进一步增加胞质释放，同时维持耐受性。有趣的是，LNPs也可能通过继发性EV介导途径转移mRNA。 与LNPs相比，EVs通过磷脂酰丝氨酸和四跨膜蛋白与内溶酶体膜融合，天然表现出更好的逃逸能力（约20%）。借鉴LNPs的经验，EV内体逃逸工程已经探索了pH响应性促融合肽和细胞穿透肽、病毒来源促融合蛋白的引入，以及赋予质子海绵样效应的杂交配方，以进一步增强内体释放。在匹配的肽工程条件下，EVs发生溶酶体蓄积的倾向低于LNPs（分别约为5.7%和26%），这凸显了EVs内在优势可通过工程化进一步放大，并带来更优越的胞质递送能力。 基因表达结果会因载荷和定位而异。AAVs通过importin或核孔蛋白介导的机制将DNA递送至细胞核，但其效率取决于衣壳。例如，AAV2的体外研究显示，仅约17%的细胞质颗粒能够到达细胞核。鉴定AAV核导入的分子决定因素，并相应地工程化衣壳与importin和核孔蛋白之间的相互作用，是增强转导效率的一种有前景策略。相比之下，LNPs和EVs主要在细胞质中发挥作用，依赖mRNA修饰（例如5′帽修饰、UTR调节和密码子优化）来增强表达。例如，携带mRNA的内源性EVs可介导血浆和器官中功能性人促红细胞生成素的产生，但其水平比递送匹配剂量合成mRNA的LNPs低6–8倍，这揭示了RNA工程在增强表达效力中的关键作用。 总体而言，AAVs由于具有高效核递送能力和DNA载荷，可提供最持久的基因表达。LNPs受到较差内体逃逸能力的限制，而EVs虽在逃逸方面表现突出，却面临载荷装载和一致性翻译方面的挑战。直接头对头比较仍然稀少（表2），尽管近期数据提示，在某些情境下EVs可能优于LNPs（或脂质体）。例如，吸入给药后，EV递送的mRNA在肺组织中产生的IL-12蛋白约为脂质体的2.2倍。 1.4 生物学耐受性 生物学耐受性是基因递送平台安全且有效应用的核心，会影响免疫原性、毒性和再次给药可行性。尽管自2017年以来已有多种AAVs治疗获得美国FDA批准，但其更广泛应用仍受到免疫原性、剂量相关毒性和患者特异性变量的限制。既存中和抗体存在于相当一部分人群中（例如AAV1/AAV2的血清阳性率为60–80%），会损害转导并阻碍再次给药。替代衣壳（例如人源AAV9和非人源AAV8及AAVrh74）以及更新的工程化变体（例如肽修饰AAV2P2和AAV2P4）已被筛选或设计用于降低血清阳性率并逃避常见抗体，从而提升临床可用性和安全性。系统性高剂量AAVs可触发严重免疫反应，包括T细胞介导的肝毒性和补体驱动的微血管病，偶尔会导致死亡。值得注意的是，近期多例与Elevidys（重组AAV（rAAV）rh74血清型）相关的患者死亡导致试验暂停。尽管近期声明指出，单例死亡中巨细胞病毒共感染可能是一个促成因素，但因果关系尚不确定，AAV毒性很可能是多因素造成的，包括剂量相关免疫激活和宿主特异性易感性。 鉴于这些免疫原性挑战，患者年龄是一个关键变量，因为婴儿和幼儿具有未成熟的免疫系统和较低水平的AAV中和抗体，因此较不容易产生强烈的细胞毒性反应，从而允许使用更高的载体剂量。婴儿表现出较低的免疫反应性和更好的耐受性。例如，全球已有超过800名脊髓性肌萎缩症婴儿接受基于rAAV9的Zolgensma治疗，并显示出一致的治疗获益和可接受的毒性特征。对于血清阳性患者以及其他存在免疫反应风险的患者，研究人员正在探索降低AAV免疫原性的新兴策略，包括衣壳再工程化、短暂免疫调节和递送优化。其中一种策略是使用EV相关AAVs，即在生产细胞生物发生过程中进入EVs的一部分AAV颗粒，可通过基于大小或密度的分离进行富集；EV包膜能够屏蔽衣壳表位，从而减少体液免疫识别、提高循环稳定性并增强转导效率。尤其值得注意的是EV–AAV6/9构建体，它们在免疫化条件下表现出更好的免疫逃逸能力，并使心脏转导效率提高超过两倍；与单独AAVs相比，这些构建体在心脏和肺部模型中还表现出更强的报告基因表达和更好的功能改善。 相比之下，LNPs在COVID-19大流行期间表现出良好的耐受性。尽管其免疫原性低于AAVs，但重复或高剂量LNP给药可激活先天免疫通路（例如Toll样受体（TLRs）、NOD样受体和补体），引起细胞因子释放和短暂炎症。LNPs的免疫原性可通过优化配方和定制脂质结构进行调控。PEG化脂质是一个关键设计变量；尽管它们能够延长循环时间，但也可能诱发抗PEG抗体反应，从而限制再次给药。聚（2-恶唑啉）、聚羧基甜菜碱、聚肌氨酸以及无PEG配方等替代方案正在被探索。此外，遗传载荷本身，尤其是体外转录mRNA和saRNA，也可能诱发先天免疫反应，特别是通过双链RNA（dsRNA）副产物；这些副产物在疫苗中可能可被耐受，但在再生医学或基因编辑中则可能构成问题。因此，这些缺陷已通过成熟的良好生产规范（GMP）流程得到缓解，尤其是核苷修饰和严格去除dsRNA；在适当情况下，还可通过短暂表达或共递送先天免疫调节因子来降低风险。 EVs由于其内源性来源和天然组成，具有更优越的生物相容性，通常可避免先天或适应性免疫激活。这些优势推动了EV–病毒和EV–合成杂交体的发展，以降低免疫原性。直接比较研究仍然有限，但一项研究发现，装载I型胶原α1链mRNA的EVs比基于MC3的LNPs引起更少的局部炎症。另一项研究显示，与LNPs和AAVs相比，通过EVs递送血管内皮生长因子A诱导的细胞因子释放最低，免疫激活也最小。然而，供体细胞来源、纯化方法和生物工程化步骤都可能影响EV免疫原性，这强调了随着临床应用扩展，仍需进一步开展安全性评估。 2. 临床转化方面的考量 AAVs、LNPs和EVs具有不同的生物学和理化特征，因此若要实现成功的临床转化，需要为其量身定制生物工程化、生产制造和递送策略。每个平台在规模化、靶向性、安全性和监管合规方面都面临独特挑战，因此需要根据预期治疗应用制定相应的定制化解决方案。配方和工程化策略 AAV载体的转导效率可通过遗传修饰来提高，包括衣壳工程和表达盒优化（图3a）。利用定向进化或理性设计进行衣壳工程，可以重新编程组织嗜性和免疫逃逸能力；而优化表达盒（例如密码子使用、启动子强度或多载体策略）则可用于应对载荷限制。通过改善受体结合、内体逃逸和第二链合成等步骤，还可以进一步提升效果。若干下一代衣壳（例如AAV-PHP.eB、AAV-CAP.B10/B22、AAV9.452sub.LUNG1、AAV-MYO和PAL家族衣壳）已显示出有效的嗜性重定向能力，尤其是在肝脏去靶向方面，并正在推进临床转化。然而，旨在降低先天免疫激活的方法，例如插入可避免TLR9识别的寡核苷酸或去除CpG，显示出的临床获益并不一致，并且常常增加复杂性和成本，却没有明确疗效。同样，用于递送大型基因的多载体系统与单载体方法相比仍表现较差，这是由于其转导效率较低、生产成本增加，并且存在产生异常转基因产物的风险。 图3. 工程化策略、平台杂交与给药途径。 LNPs为基因递送提供了模块化且可规模化的平台框架。LNP设计涉及定制化脂质化学（例如pKa、结构和含量）、表面修饰（例如PEG化和用于主动靶向的配体）以及核酸工程（例如假尿苷或N1-甲基假尿苷），以提高稳定性、递送特异性和内体逃逸能力（图3a）。严格的RNA纯化对于减少dsRNA污染物和免疫原性是必要的。高通量筛选结合AI驱动的脂质库和配方设计，正越来越多地用于预测和优化结构–功能关系。计算算法进一步帮助匹配新型脂质与mRNA载荷，以增强递送效率和翻译水平。LNP生产相对稳健且可规模化，但在获取GMP级脂质、维持批次间一致性以及实现高RNA包封效率方面仍存在挑战。 尽管EVs具有生物相容性和天然嗜性，但在大规模生产和高效基因装载方面仍面临持续挑战。生物工程化策略（图3a）包括外源性修饰（例如表面偶联、膜融合和杂交）以及内源性细胞工程（例如遗传操作和物理刺激）。尽管外源性方法可提供更直接的控制，但通常存在包封效率和回收率较低的问题。内源性策略更具规模化潜力，但也存在免疫激活或不需要的生物活性污染物风险。这两类方法都劳动密集、成本高昂，并且难以在GMP条件下标准化。此外，EV亚型的内在异质性使可重复性更加复杂，并仍然是主要的转化障碍，使EVs成为工程化难度最高的平台。 2.1 杂交递送系统 除平台特异性生物工程化之外，跨平台杂交策略也已出现，用于整合不同递送系统的互补优势（图3b）。病毒–非病毒杂交体，例如包裹于脂质膜中的LNP或EV相关AAVs，可降低免疫原性、提高血清稳定性、增强跨屏障效率，并实现剂量降低。同样，合成–天然杂交体（主要是EV相关LNPs）将LNPs的高载荷容量与EVs的天然嗜性和低免疫原性结合起来，从而改善组织穿透和屏障跨越能力。 尽管具有应用前景，杂交纳米颗粒平台仍面临规模化和制造方面的障碍。对于EV–AAV杂交体而言，其生物发生机制的不匹配限制了共包装效率；传统AAV生产无法有效富集EV相关AAVs，导致杂交体产率较低（例如，对于EV相关AAV1/2/5/6/8/9，其占总载体基因组的比例低于20%），并且会夹带游离AAV颗粒，因此需要额外的分级分离步骤（例如密度梯度或尺寸排阻色谱）。对于LNP–EV杂交体，关键转化障碍包括颗粒群体异质性，以及在剧烈干预下由融合诱导的载荷损失；例如，基于冻融循环的融合可促进EV聚集或破裂，从而扩大粒径分布并导致载荷泄漏。与EV–AAV类似，LNP–EV杂交体融合后的混合物中也会引入未融合组分、残留试剂或泄漏载荷，因此在GMP条件下需要额外的纯化和质量控制步骤。近期利用具有正高斯曲率的促融合立方液晶纳米颗粒（fusogenic cubosomes）的创新方法，可在10 min内实现自发融合，并在无需额外生物工程化的情况下实现接近100%的mRNA装载，这代表了杂交配方效率方面的重要进展。这些杂交体的成功转化需要在平衡两种组分优势的同时，减轻任一组分的主要弱点。 2.2 给药途径和递送设计 给药途径是治疗成功的另一个关键决定因素，必须通过定制化配方、剂量指标和递送设计与疾病适应症相匹配（图3c）。AAVs通常以水性配方进行静脉给药，临床剂量通常以单次给药中每千克体重的载体基因组总数表示。被转导组织可维持长期表达（例如Roctavian可维持凝血因子VIII水平长达5年），但AAVs会从血浆中快速清除，并且大多数衣壳在系统性注射后优先转导肝脏。局部给药途径（例如视网膜下、颅内或气管内）以及与包封材料（例如聚合物或水凝胶）联合使用，已被开发用于重定向嗜性，并通过增加靶部位暴露、同时减少系统性暴露和中和抗体接触来改善靶部位药代动力学，从而增强组织特异性并提高安全性。对于LNPs，剂量通常表示为每千克体重或每剂的核酸质量。LNPs循环时间短，并迅速被肝脏摄取（例如，约90%的静脉注射LNP剂量可在1 h内被肝脏摄取），其表达通常在数小时内达到峰值，并在数天内下降。基于这些特征，临床方案通常采用重复给药，并以数周为间隔（例如Onpattro（patisiran）每3周给药一次）。EV剂量通常以颗粒数和/或蛋白或RNA载荷表示。从药代动力学角度看，天然EVs循环时间最短（血浆半衰期为数分钟量级），并主要被肝脏和脾脏摄取；因此，研究通常采用连续给药方案，包括在某些适应症中每2–3天给药一次。 这三类平台都可以被制备为水溶液以外的形式，而非水性形式更常用于LNPs和EVs，因为与AAVs相比，它们通常产生短暂表达、稳定性较低，并且在体内清除更快，因此需要能够保存其功能并提供更持久组织暴露的配方。在实践中，冻干粉末和可吸入气溶胶可实现局部肺靶向递送；LNP–mRNA疫苗和EVs均已被工程化为可吸入载体，其中肺来源EVs与合成LNPs或脂质体相比，表现出较低的黏液黏附性、在细支气管和肺泡内更深的分布，以及增强的抗体反应。将LNPs或EVs嵌入缓释生物材料（例如胶囊、水凝胶、微球或微针）可进一步改善局部滞留和疗效，而微流控和生物打印等技术能够精细控制释放动力学和结构特性。然而，这些非水性递送形式需要谨慎配方设计，以维持囊泡完整性和生物活性。整合到生物材料中也会增加复杂性，需要对无菌性、释放动力学和功能保留进行额外验证，以确保临床成功。 2.3 跨平台GMP生产和质量保证 将基因递送系统推进至临床应用，需要在GMP标准下严格优化上游和下游工艺（图4）。这些工艺包括起始材料选择、细胞基质、可规模化生物工程化、纯化流程以及平台特异性质量控制，以确保安全性、一致性和疗效。 图4. AAVs、LNPs和EVs在生产制造与转化流程中的关键差异及特异性考量。 对于AAVs、LNPs和工程化EVs，质粒DNA或合成寡核苷酸是基础输入材料。AAV生产通常依赖生产细胞的三质粒转染或感染。尽管目前尚无通用的质粒标准，但FDA和欧洲药品管理局（EMA）均建议根据其对最终产品质量的影响，采用基于风险的GMP合规要求。对于由LNPs和工程化EVs递送的合成RNA治疗产品（主要通过外源性装载），GMP流程始于化学合成寡核苷酸，或使用DNA模板和RNA聚合酶进行体外转录，随后进行酶促加帽、化学修饰（例如假尿苷）和纯化，以增强翻译和稳定性并降低免疫原性。 生产细胞是AAV和EV平台的关键GMP材料。HEK293细胞因其高转染效率、可规模化能力和监管先例，被广泛用于AAV和EV生产。对于AAVs，还可使用HeLa、A549或Sf9昆虫细胞等其他细胞系，每种细胞系都需要完整的来源证明、双层细胞库体系和安全性检测。然而，EV平台涵盖更广泛的来源，包括间充质干细胞、诱导多能干细胞、树突状细胞，甚至植物、乳制品或细菌来源材料。这种多样性增加了生物工程化和监管复杂性，尤其是在使用原代免疫细胞或应激刺激系统时，这些系统可能释放不需要的副产物，因此需要严格控制培养条件。当前工作强调建立GMP级细胞库（例如经供体资质确认的主细胞库和工作细胞库），并进行身份或遗传稳定性检测、外源因子控制、来源适配且经过验证的培养基（例如用于人源细胞来源EVs的明确成分无异种培养基），以及采用生物反应器系统（例如中空纤维、灌流或填充床系统）来稳定关键工艺参数。 AAVs和LNPs的纯化策略更为成熟。AAV纯化采用可规模化色谱方法（亲和、离子交换或整体柱色谱），可提供超过50%的产率和超过99%的宿主杂质清除率；新兴的非色谱方法，如三相分配和阴离子交换流穿式精抛光，也提供了具有成本效益的替代方案。LNP纯化包括两个阶段：核酸纯化（通过色谱或沉淀去除dsRNA和截短转录本）以及LNP配方清理（使用尺寸排阻色谱、切向流过滤或基于PEG的方法）。新型纤维素基柱可回收超过65%的mRNA，并清除超过90%的dsRNA，从而提高saRNA疫苗效力。由于缺乏GMP标准化流程，EV纯化仍然具有挑战。现有方法（超速离心、尺寸排阻色谱、切向流过滤和免疫亲和）显示出很大的变异性（5–60%产率），常常以牺牲纯度为代价，并可能富集不需要的亚群或游离生物活性污染物。工程化EVs进一步加剧了这一问题，因为修饰过程（例如用于基因装载）可能引入更难分离和去除的外源材料。 质量保证和关键质量属性（CQAs）的识别对于一致性和监管批准至关重要（图4）。AAVs和LNPs受益于已建立的GMP流程。AAV CQAs包括衣壳化学计量、满/空颗粒比例、基因组完整性和残留宿主污染物，可通过PCR、酶联免疫吸附测定、分析型超速离心或质谱进行定量。LNP质量保证强调理化性质（例如粒径及其分布、表面电荷）、包封效率、药典检测（例如无菌、内毒素和渗透压）以及被包封核酸的稳定性和完整性，可使用动态光散射、色谱和核酸效力测定等工具。然而，批次间变异仍是共同关注点，包括AAV空/满衣壳比例的波动，或LNP脂质组成和理化性质的变化。缺乏标准化杂质清除方法和参考材料也使CQA定义更加复杂，尤其是对于个体化产品而言。 基于EV的治疗仍处于质量保证标准化的早期阶段。诸如《细胞外囊泡研究最低信息指南》（Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles）等指南强调的指标包括供体细胞活力、EV大小、表面标志物、纯度和生物活性。分析平台包括纳米颗粒追踪、纳米流式细胞术、冷冻电子显微镜，以及越来越多使用的液相色谱–质谱和单EV分析（例如全内反射荧光显微镜）。定量基因载荷并评估其生物活性仍是一项主要障碍。由于囊泡异质性、效力测定不一致以及缺乏统一载荷标准，EVs的批次变异尤其突出。生物工程化EVs由于制造过程中引入的游离核酸或副产物，使污染控制进一步复杂化。迫切需要借鉴AAV和LNP的先例，采用经过验证的GMP流程，以支持EV产品的标准化、可重复性和临床安全性。 2.4 配方稳定性和储存考量 保质期和储存是影响基因递送系统成本效益和治疗可靠性的关键因素。这些平台的长期稳定性取决于其活性药物成分的性质、配方形式、配方是水性、冷冻还是冻干状态，以及是否使用甘油、蔗糖、海藻糖、甘露醇或PEG等冷冻保护剂。三大主要载体系统在超低温条件下（低于−65 °C）均具有较高稳定性，其中AAVs和LNPs在此类条件下可保持感染性和转染效率超过12个月。相比之下，EVs在长期超低温储存过程中更容易发生聚集和功能退化。这种脆弱性归因于其天然来源以及对其来源细胞的依赖性。 对超低温储存的依赖给所有平台都带来了物流和成本相关挑战，尤其是在大规模生产和全球分发中。为解决这一问题，用于−20 °C或4 °C短期储存的配方通常会加入稳定剂和冷冻保护剂。例如，AAV载体通常包含Pluronic F-68和甘油，以减轻聚集并在反复冻融循环中保持感染性，在4 °C下可维持感染性长达两周。LNP–mRNA配方在2–8 °C储存时可维持效力长达30天，这得益于添加5%（质量/体积）蔗糖或海藻糖等稳定糖类。 与合成载体相比，EVs在常规储存条件下的稳定性面临更大挑战。储存在4 °C或−20 °C下的EVs通常会在一个月内开始降解，并常观察到粒径增大和聚集。将冻干与冷冻保护剂结合的新兴方法在提高天然EVs的货架稳定性方面显示出前景，可能将其在室温（>25 °C）下的储存时间延长至超过一个月，并减少对冷链基础设施的依赖。然而，生物工程化EVs，尤其是那些带有非共价结合表面修饰基团或敏感腔内载荷（如内源性mRNA）的EVs，仍容易受到热不稳定性的影响，尤其是在冻融循环过程中。仍需进一步研究，以确定能够在多种储存条件下保持这些复杂构建体完整性和功能的最佳配方。 2.5 监管合规和安全性考量 监管合规和安全性评估对于确保基因治疗产品符合GMP标准、接受严格患者安全性检测，并监测潜在长期风险至关重要。对于基于AAV和LNP的治疗，由于其较早进入临床试验并获得上市批准，监管预期相对明确。FDA、EMA及其他监管机构维持着相互协调的标准，涵盖材料质量、工艺验证、可追溯性和产品安全。 AAV治疗受益于广泛的全球指导原则，包括EMA的基因治疗指南以及FDA关于基因治疗化学、制造和控制（CMC）信息的要求，并且针对基因组编辑另有专门文件。这些文件概述了有关载体设计、基因组完整性、生物分布、病毒脱落、免疫原性、脱靶效应和长期安全性监测的预期。 LNP平台在mRNA疫苗紧急批准期间获得了监管推动，这加速了相关指导文件的发展，例如FDA关于病毒安全性的ICH Q5A(R2)，以及世界卫生组织和EMA关于mRNA疫苗质量与疗效的立场文件。然而，非疫苗类LNP治疗的监管框架仍在演变中，包括用于蛋白替代或基因组编辑的LNP治疗。在重复给药、肝脏以外组织靶向、辅料安全性以及通过TLR7/8等受体激活先天免疫方面，仍存在挑战。LNPs正越来越多地在纳米医学框架下进行评估，这类框架要求对脂质和核酸组分进行详细的理化特征和安全性表征。 相比之下，基于EV的基因治疗处于更加模糊的监管环境中，目前尚无获批产品，也尚未建立正式框架。分类工作主要由国际细胞外囊泡学会主导，该学会提出可将天然EVs归类为生物药物或非活性辅料，在这种情况下通常只评估安全性。然而，生物工程化EVs引入了更大的复杂性。其分类取决于修饰性质和预期功能。例如，装载外源性载荷的EVs可能被视为辅料，而膜修饰EVs或来源于基因工程细胞的EVs则可能被指定为活性生物制剂或先进治疗药物。这种监管分层仍不完善。在实践中，很难将EVs本身的治疗作用与其工程化载荷的作用区分开来，尤其是考虑到生物工程化可能改变EV生物发生过程，并产生影响功能或安全性的副产物。因此，全球监管机构和EV领域研究群体呼吁建立更加细致、基于共识的指南，以应对EV治疗所特有的挑战，尤其是那些包含工程化或具有生物活性载荷的EV治疗。 3. 平台特异性治疗部署 AAVs、LNPs和EVs不同的生物学特性决定了它们在不同疾病背景和基因治疗模式中的应用价值。每个平台在应对系统性疾病、涉及生理屏障的疾病以及免疫学复杂疾病时，都具有独特优势和局限。随着基因治疗越来越多地从离体方法转向直接体内给药，尤其是在基因组编辑和过继性细胞治疗领域，对具有更高精准性、效率和安全性的递送系统的需求持续增长。这一不断演变的格局凸显了临床实施中持续存在的转化挑战以及平台特异性考量。 3.1 系统性疾病 系统性基因递送对于治疗影响多个器官系统的血液系统疾病、代谢性疾病和原发性肌肉疾病仍然至关重要。 AAV载体目前在临床转化方面处于领先地位，已有三种获得FDA或EMA批准的治疗产品，即valoctocogene roxaparvovec（Roctavian）、etranacogene dezaparvovec（Hemgenix）和fidanacogene elaparvovec-dzkt（Beqvez），它们在血友病A和B中显示出持久的治疗性凝血因子表达，并减少出血。例如，在Hemgenix的III期HOPE-B试验中，96%的患者在维持凝血因子IX水平的同时停止了预防性治疗；Roctavian在GENEr8-1研究中显示出持续至第5年的持久疗效。这些成功推动了基于AAV的治疗在代谢性疾病（例如用于芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症的eladocagene exuparvovec）和肌肉疾病（例如用于杜氏肌营养不良症（DMD）的delandistrogene moxeparvovec）中的应用探索，目前已有多项III期试验正在进行。然而，近期AAV基DMD试验（Elevidys）中因急性肝衰竭导致的患者死亡，再次引发了人们对免疫原性和肝毒性的担忧。除当前的衣壳工程和免疫抑制策略外，临床前生物材料包封和局部化AAV方法（例如聚（β-氨基酯）包被载体以及水凝胶或微球储库）已经实现了靶向肌肉组织转导，同时扩散最小，并可保护载体免受中和抗体影响，提示其可能成为一种降低风险的途径。 LNPs已成为系统性基因治疗中一种有前景的非病毒替代方案，尤其适用于血液系统和代谢性疾病中的基因组编辑。与AAVs不同，LNPs能够容纳大型载荷，例如碱基编辑器和引导RNA，并且可进行静脉给药（框3）。体内LNP介导的编辑已实现对造血干细胞和祖细胞的高效靶向，包括利用CD117–LNP递送腺嘌呤碱基编辑器和单向导RNA，以纠正镰状细胞病中的β-珠蛋白基因，在长期重建细胞中编辑率最高可达48%，并强效诱导胎儿血红蛋白。在代谢性疾病中，NTLA-2001在转甲状腺素蛋白淀粉样变性患者单次输注后，使转甲状腺素蛋白降低最高达96%。靶向遗传性血管性水肿中激肽释放酶B1的NTLA-2002，使蛋白敲低超过85%，并使几乎所有患者达到无发作状态。其他例子包括用于家族性高胆固醇血症的VERVE-101，以及用于氨甲酰磷酸合成酶1缺乏症的N-of-1碱基编辑治疗，二者均显示出显著临床获益和良好安全性。这些结果标志着LNPs在系统性应用，尤其是体内基因编辑中的转折点。 基于EV的系统性基因治疗仍处于早期开发阶段，受到组织蓄积低、快速清除以及活性成分定义不清的限制。CAP-1002（HOPE-3）是一种用于DMD的心球来源EV产品，但因疗效有限以及化学、制造和控制问题尚未解决而未获FDA批准。尽管如此，生物工程化策略正在帮助EVs克服关键局限。表面修饰以及明确的RNA和蛋白载荷装载已经改善了其循环时间和靶向性。临床前研究已证明，可通过工程化EVs递送CRISPR–Cas9 RNP，实现体外和体内Pcsk9沉默约28%的编辑效率，从而降低低密度脂蛋白胆固醇。然而，EVs的包装效率仍低于LNPs，并且仍缺乏可规模化、标准化的GMP制造流程。与AAVs和LNPs相比，这些障碍使EVs在系统性基因治疗中处于相对劣势。 3.2 生理屏障相关疾病 血脑屏障（BBB）、肺上皮、眼部屏障和肿瘤基质等生理屏障对体内基因递送构成重大挑战。由于具有内源性膜组成，EVs已显示出通过受体介导的跨胞转运和膜融合跨越这些屏障的独特能力。临床试验正在研究天然EVs在CNS疾病（例如帕金森病、卒中和阿尔茨海默病）、眼部疾病以及肺部疾病气溶胶递送中的应用。为进一步增强EV嗜性和循环时间，生物工程化策略引入了抗吞噬信号（例如CD47）以及RGD肽等靶向配体，以跨越BBB或眼部屏障。雾化或干粉等配方可在肺组织中实现EV–mRNA的强效转基因表达；可生物降解聚合物包封系统（例如聚乳酸-羟基乙酸共聚物ExoCap微胶囊）可在眼内持续释放EV超过一个月，延长囊泡半衰期并改善视网膜修复。尽管目前尚无基于EV的产品获批用于这些适应症，但其天然生物分布和低免疫原性使其成为克服屏障限制性疾病背景的有力候选平台。 尽管AAVs和LNPs在临床上更加成熟，但它们通常需要局部递送或特定患者背景才能绕过屏障。例如，基于AAV2的治疗产品Luxturna通过视网膜下递送治疗遗传性失明；基于AAV9的Zolgensma能够进入脊髓性肌萎缩症婴儿的CNS，是因为婴儿BBB尚未成熟。在成年人中，完整的生理屏障限制了系统性AAV和LNP递送，因此需要侵入性给药途径（例如鞘内或脑室内给药；见AAV试验NCT04120493、NCT05243017和NCT02362438，以及LNP试验NCT05034497）。鼻内递送提供了一种侵入性较低的选择，但仍处于临床前开发阶段。 衣壳工程创新已扩展了AAVs的能力；例如，BI-hTFR1等工程化衣壳通过靶向脑内皮上的人转铁蛋白受体，可实现比AAV9高约40–50倍的CNS转导。类似地，LNP设计也在快速推进，具有脑穿透能力的脂质化学（例如MK16）以及利用肽或寡核苷酸与跨BBB内源性转运机制相互作用的功能化配方正在发展。在肺部应用中，优化LNPs正在接受研究（例如用于囊性纤维化的MRT5005），尽管历史上黏液屏障和先天免疫一直是挑战。将EV样特性引入合成载体，或使用囊泡相关LNPs（主要是脂质体）和AAVs的杂交方法，显示出增强的屏障穿透能力，尤其是在CNS和视网膜中。与此同时，以口服胶囊RNACap形式存在的生物材料包封LNPs，通过在胃肠道转运过程中保护LNP–IL-10 mRNA，并触发肠道释放，克服了严苛的胃肠屏障，实现了局部肠道表达。这些进展表明，对于屏障受限疾病，有效基因治疗的关键将是配方创新，而不仅仅是平台类型本身。 3.3 免疫学疾病 基因递送平台在感染性疾病、癌症和自身免疫性疾病治疗中正发挥越来越核心的作用。LNP–mRNA疫苗引领了这一变革，COVID-19疫苗的快速开发和全球部署确立了其临床实用性。目前正在进行的试验正在检测LNP–mRNA疫苗用于流感（NCT04956575、NCT06602024和NCT05827978）、呼吸道合胞病毒（NCT05127434和NCT06067230）、巨细胞病毒（NCT03382405和NCT05085366）、Epstein–Barr病毒（NCT05164094）、寨卡病毒（NCT03014089）、疟疾（NCT05581641）和人类免疫缺陷病毒（HIV）（NCT05217641）；肿瘤学项目也正在利用类似平台推进个体化和共享抗原癌症疫苗。其设计速度快、载荷容量灵活和安全性良好，已经加速了预防性和治疗性适应症中的转化。 除疫苗外，AAV载体还通过在体内表达具有免疫活性的蛋白质（如抗体或抗原）提供一种互补策略，从而实现长期保护。例如在HIV中，单次注射编码广谱中和抗体（VRC07）的AAV8，可在人类体内维持表达长达3年。类似方法在新生儿和临床前模型中进一步扩展了这一概念，用于围产期免疫预防；在出生时向恒河猴一次性注射编码HIV-1广谱中和抗体3BNC117的AAV，可实现持续数年的抗体表达，并对猿猴免疫缺陷病毒攻击提供强效保护。AAV介导的表达也正在被探索用于对抗埃博拉等病原体，以及用于泛呼吸道病毒保护，为传统疫苗提供一种“一针式”替代方案。 基于EV的疫苗则源于另一种范式：利用树突状细胞或肿瘤细胞来源的囊泡递送具有免疫学相关性的信号。黑色素瘤和肺癌中的早期试验显示了其安全性和免疫原性；新的研究则利用植物来源EVs进行口服递送，或工程化EVs以携带免疫调节性mRNA，用于炎症性肠病和结肠癌（NCT01294072和NCT04879810）。例如，与脂质体相比，吸入IL-12 mRNA装载EVs在肺癌模型中表现出更强的免疫激活和肿瘤退缩，这提示EVs作为递送系统具有独特的生物分布和耐受性优势。 过继性细胞治疗也正在经历递送平台变革，尤其是在癌症和自身免疫性疾病背景下。利用基因递送载体在体内工程化CAR-T细胞或携带T细胞受体的免疫效应细胞，旨在取代复杂的离体制造流程（框3）。AAVs能够提供持久表达，但受到大小限制和整合风险的制约。相比之下，LNPs可提供短暂、可滴定的CAR表达，并能够在不同免疫细胞类型中再次给药或重新靶向。临床前数据显示，抗体导向的LNPs可将CAR mRNA递送至T细胞，从而导致肿瘤清除；首批使用基于LNP–mRNA的CAR治疗的临床试验正在开展，靶向髓系细胞（例如MT-302（NCT05969041）），类似的体内CAR-T治疗平台预计也将很快跟进。 EVs为体内过继性免疫治疗提供了一种受细胞启发的平台。工程化EVs可被靶向至免疫细胞亚群，并装载CAR mRNA，以在原位直接重编程免疫细胞。其非免疫原性以及不含病毒成分的特点降低了安全性担忧。然而，低载荷容量、产率不一致和生产挑战仍是关键障碍。创新性制造方法正在被开发，以克服这些障碍。 总体而言，这些应用表明，AAVs、LNPs和EVs为免疫驱动性疾病提供了不同但互补的能力（表3）。它们在持久性、靶向性、免疫原性和可规模化方面的相对优势，将继续塑造疫苗和免疫治疗的未来。 4. 结论和未来方向 基因治疗的发展受到三大主要递送平台的塑造，即AAVs、LNPs和EVs，它们涵盖了从病毒载体到非病毒载体、从合成载体到天然载体的不同类型。每个平台都具有不同的优势和挑战，而比较分析对于指导基于疗效和安全性的合理平台选择至关重要。AAVs因其高转基因表达水平、相比其他整合型载体更低的插入突变风险，以及成熟的GMP生产体系，在病毒基因递送领域处于领先地位，并支持了全球范围内的产品批准。然而，安全性问题，尤其是免疫原性和有限的载荷容量，推动了人们对非病毒替代方案的兴趣。LNPs在COVID-19疫苗成功的推动下，展现出可规模化生产、高效核酸递送和良好的安全性特征。然而，与AAVs类似，LNPs也面临免疫原性问题，并且在很大程度上受限于肝脏或局部递送。目前的创新工作集中于优化脂质化学和配方，以增强靶向性、屏障穿透能力和内体逃逸。EVs提供了一种低免疫原性并具有天然跨屏障能力的自然替代方案，使其在CNS等难以到达的组织中具有吸引力。近期进展已改善EV装载和靶向，但规模化生产、异质性和监管不确定性仍是障碍。借鉴AAV和LNP开发中已建立的框架，可能会加速EV转化。与其将这些平台视为相互竞争，不如将其视为互补平台。整合其优势的杂交设计和定制化递送途径，为拓展基因治疗的应用范围提供了有前景的策略。 4.1 对标准化比较研究的需求 尽管这些平台已经取得令人鼓舞的进展，并出现了若干从实验室到临床的转化案例，但在功能表现和转化能力两个层面对AAVs、LNPs和EVs进行头对头比较的研究仍然稀少。这一空白阻碍了知情的平台选择、适应症特异性优化以及个体化治疗的合理设计。 尽管比较研究和综述正在增加，但其中许多研究无意中存在偏倚，往往旨在强调某一特定平台的优越性，或使用不等效的对照或次优配方，从而限制了其普适性。因此，仍需要无偏倚且标准化的比较评估，并严格控制关键变量，包括匹配的理化性质、等效剂量方案、一致的给药途径、可比的活性药物成分，以及相似的细胞摄取或表达动力学。此类控制良好的研究对于建立具有广泛适用性的设计原则至关重要，可用于指导临床转化和平台选择。 4.2 整合生物学背景和计算工具 生物学复杂性是基因递送平台选择中另一个常被忽视的维度。年龄、性别、代谢状态和免疫状态等患者特异性因素，可显著影响生物分布、载荷表达和免疫反应，并最终塑造治疗结果。然而，临床医生和研究人员通常缺乏能够在实时决策中纳入这些因素的框架。 为应对这一挑战，计算工具已开始支持配方设计和平台优化。基于大型数据集训练的深度学习模型能够捕捉配方变量与生物学表现之间细微的非线性关系。大型语言模型，如生成式预训练转换器变体，正作为智能助手出现，可快速分析文献并提出合理的设计策略。 例如，AI copilot NanoSafari从超过20,000篇纳米医学出版物中提取配方知识，并在提出有效递送策略方面优于标准生成式预训练转换器模型。作为这些计算方法的补充，多组学和高分辨率成像技术如今能够提供对递送平台–生物学相互作用的精细理解。当与计算分析整合时，这些工具可将递送结果与患者特异性分子特征相关联，为个体化递送平台选择奠定基础。 4.3 成本、监管和规模化 基因治疗更广泛采用的一个主要障碍是成本。由于载体制造成本高昂，并且需要个体化GMP流程，针对罕见病的AAV基治疗每剂费用通常超过200万美元。LNPs在个体化应用中也面临障碍。EVs虽然具有前景，但由于生产不一致以及缺乏效力标准，带来了更大的成本和监管复杂性。 为应对这些挑战，监管改革正在出现。FDA Modernization Act 2.0目前允许使用非动物测试替代方法，例如器官芯片模型和计算模拟。FDA也正在试点用于基因递送候选物的AI安全性预测工具，这可能降低临床前负担并简化审批路径。然而，这些进展也带来了新的验证需求，需要协调各方努力，以建立可重复的标准和支持性监管框架。最终，整合平台比较分析、患者定制化设计和监管创新，对于充分实现基因治疗潜力至关重要，可使其更安全、更高效，并惠及更广泛人群。 你可能还想看 关于BioMedDaily：我们比过去更渴望疾病知识 #遗传学与药物发现 Nature | 首次发现肌萎缩性侧索硬化症存在针对C9orf72蛋白的自身免疫反应 Nature | 用新鲜的免疫细胞交换大脑中的旧免疫细胞可以治疗疾病 Nature | 全球首次使用基因疗法治疗亨廷顿舞蹈症 Nat Biomed Eng | 四川大学华西医院魏霞蔚团队报道新型鼻喷联合疫苗为奥密克戎提供更优免疫保护 Nat 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