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摘要 细胞依靠复杂的分子网络感知和处理外部及内部信号，进而产生定制化响应。通过整合人工基因回路对细胞进行工程化改造，可增强和修饰这些细胞功能，用于开发细胞疗法。本综述概述了指导合成基因网络设计的工程学原理，重点阐述如何优化合成基因网络的敏感性、检测范围和特异性以适应体内功能需求。我们特别探讨了合成分子模块（包括转录调控、翻译调控和翻译后调控回路），这些模块能够根据动态疾病状态信号对治疗性细胞功能进行定制化调整，或通过临床适用的外部分子信号或物理信号进行远程控制。此外，我们还探索了多输入可控逻辑门程序在提高癌症工程化细胞免疫疗法疗效和安全性方面的潜力，并重点介绍了合成基因回路在基因治疗和治疗性微生物设计中的应用。最后，我们探讨了受合成生物学启发的疗法如何受益于不断发展的基因组工程技术以及与人工智能的协同作用。 核心要点 - 能够在DNA、RNA或蛋白质水平响应外部或内源性信号的合成大分子开关，为开发安全有效的治疗性细胞提供了极具前景的工具。 - 每种调控模式都存在固有权衡（包括动态范围、响应时间、遗传足迹和组件来源），充分考虑这些因素对于其优化治疗应用至关重要。 - 合成转录系统已整合到癌症基因治疗和细胞治疗产品中，翻译和翻译后开关正在临床前研究中探索应用。 - 基于高质量数据集训练的机器学习模型，有助于设计和优化合成大分子回路以满足临床需求，同时降低开发时间和成本。 - 为促进整合胞外可控逻辑运算的大型回路的临床转化，必须改进用于体外或体内细胞工程的基因转移方法。 引言 合成基因网络最初建立的目的是理解天然基因调控基序的结构和功能。特别是在细菌和哺乳动物细胞中设计的合成toggle开关（即双稳态生物回路）和振荡器（即节律性转录或翻译反馈回路）表明，通过将转录调控因子及其同源DNA结合序列等基本构建块组装成具有负反馈和正反馈回路的特定架构，可以工程化实现复杂的生物学行为。基于这些生物构建块，可以构建包含转录、翻译和翻译后调控组件的稳健合成大分子开关，赋予细胞新功能以满足多种应用需求。 具体而言，遵循一系列设计原则，可组装合成调控网络以实现所需的响应功能（专栏1）。构建胞外可控合成转录网络的策略包括：使用异源转录因子（其与特定DNA序列的结合受所选输入信号调控）；天然或合成受体（感知同源输入信号后启动内源性或合成信号级联反应，最终激活转录）；或诱导性二聚化系统（在二聚化剂作用下使DNA结合结构域与调控结构域靠近，重建转录因子活性，从而调控基因表达）。此类诱导性翻译开关可能依赖于RNA结合蛋白（其与目标基因非翻译区的特定RNA结构的结合可受输入信号调控以抑制翻译），或直接响应输入信号的RNA结构（如核酶和可变剪接装置）。此外，诱导性翻译后开关可通过可抑制蛋白酶或诱导性降解结构域直接调控目标蛋白的活性。 专栏1 合成调控网络的设计原则 响应功能 合成调控网络的特征在于响应功能，该功能决定输入信号的变化如何影响输出响应，通常以目标蛋白质的稳态浓度来评估。输入范围从输出信号的完全抑制到完全饱和，低背景和宽动态范围是理想特性。整合多个调控水平可最大限度地减少泄漏，同时对最大表达水平的影响最小。响应曲线可能表现出梯度行为（输入的轻微变化产生成比例的输出调整）或更陡峭的开关样响应（输入的最小变化导致显著的输出变化）。前者有利于治疗性负载的滴定，而后者在控制细胞分化的二元决策回路中观察到。通过级联、正反馈回路或多聚化可实现超敏感性。 响应时间 响应时间定义为添加刺激后输出信号达到其稳态值一半所需的时间。与转录或翻译调控回路相比，翻译后调控回路的响应时间通常更快，因为跳过了DNA转录为前体mRNA、加工为成熟mRNA以及转运到细胞质（RNA可能在细胞质中发生降解或翻译为目标蛋白质）的步骤。为了缩短输入信号去除后转录调控回路关闭的时间延迟，可在回路中操纵mRNA和蛋白质的稳定性，例如在编码序列的3'非翻译区（UTR）中添加核酶，或在蛋白质上添加诱导性降解标签。 特异性和交叉反应性 高特异性基因回路仅对预期刺激做出响应，过滤掉不需要的类似信号。当在细胞内组合多个基因开关进行多重控制时，必须仔细选择以防止其响应功能受到干扰。必须仔细考虑交叉反应性（小分子结合非同源调控因子）和资源竞争（由于共享细胞资源，一个回路的激活间接影响另一个回路）等因素。通过优化这些参数，可以精确工程化合成基因回路，使其在各种生物学背景下实现可靠高效的性能。 本综述重点介绍在DNA、RNA和蛋白质水平发挥作用的可控合成开关，这些开关可响应外部施加的分子信号或物理信号，或疾病状态固有的内源性信号。我们进一步探讨了每个系统相关的权衡，如可实现的动态范围、组件大小和来源。然后，我们讨论了这些大分子开关在编程人类和微生物细胞以感知特定目标信号并计算适当治疗响应方面的应用，重点关注其在慢性疾病治疗中的优化。与小分子药物或蛋白质生物制剂不同，此类活体疗法能够对环境做出响应，并为个体提供定制化治疗。最后，我们强调了从合成生物学和转化角度仍需解决的关键问题。 转录调控回路 转录过程是遗传信息从DNA流向蛋白质的初始阶段，是研究最广泛的分子调控水平。这一重要地位使得转录调控回路成为合成生物学应用中的首选。尽管与其他调控机制相比，蛋白质合成的转录调控涉及更长的响应时间，但它通过避免RNA和蛋白质合成过程中不必要的能量和代谢物消耗，节省了细胞资源。转录因子、细胞表面受体和核受体等多种天然大分子可作为介质，响应外部分子信号或物理信号调控内源性基因表达。这些大分子通常具有模块化特性，包含多个独立发挥作用的结构域。这种模块化特性允许通过交换或组合天然或合成结构域来创建杂合转录因子或合成受体。 作为传感器的单链合成转录因子 转录因子通常包含负责与特定DNA序列相互作用的DNA结合结构域、影响基因转录的激活结构域或沉默结构域，以及通过响应信号调节DNA结合亲和力来影响转录因子活性的信号接收结构域。为了在哺乳动物细胞中构建外部可控的合成基因开关，可以使用携带响应小分子、肽、光或温度等环境信号的信号接收结构域的细菌转录因子（图1a）。特别是，异源转录因子可与病毒或哺乳动物转录调控结构域融合，其同源操纵子位点可用于构建控制转基因表达的合成启动子（专栏2）。尽管这些系统通常在响应特定触发信号时表现出广泛的转基因表达动态范围，但由于需要特定的DNA结合区域，其在内源性基因调控中的应用受到限制。相反，其异源特性具有与内源性哺乳动物调控网络交叉反应最小的优势。 图1 设计响应分子信号或物理信号的转录调控网络 a 基于天然或可编程DNA结合结构域（DBDs）的诱导性单链转录因子。变构细菌转录因子响应特定输入信号，调整其与目标DNA区域的结合亲和力。人类类固醇激素受体在与激素配体结合触发核转位之前，与分子伴侣（例如热休克蛋白90）结合并被封存于细胞质中。与强大的哺乳动物转录激活结构域（TADs）融合，可生成能够响应特定分子信号或物理输入信号激活转基因表达的单链转录因子。基于锌指（ZFs）、转录激活因子样效应子（TALEs）或失活的CRISPR相关蛋白（dCas）的可编程DNA结合结构域与转录激活结构域融合，可通过连接诱导性降解结构域（DDs）（例如基于二氢叶酸还原酶（DHFRDD）、人类雌激素受体（hER50）和FK506结合蛋白（FKBPF36V）的突变体）或可抑制病毒蛋白酶（例如丙型肝炎病毒蛋白酶（HCVp）、人类免疫缺陷病毒蛋白酶（HIVp）、人类鼻病毒（HRVp）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）主蛋白酶（Mpro））及其相应的切割位点（CS）进行外部控制。b 与二聚化蛋白融合的分裂型转录因子的诱导性结合。化学诱导或光诱导二聚化系统可通过将这些蛋白质与响应雷帕霉素（FKBP-雷帕霉素结合（FRB）结构域/FKBP）、脱落酸（pyrabactin抗性样蛋白1（PYL1）/脱落酸不敏感1（ABI1）蛋白）、赤霉素（赤霉素不敏感矮化1（GID1）/赤霉素不敏感（GAI）蛋白）、蓝光（例如隐花色素2（CRY2）及其相互作用伴侣CIB1）或红光（例如光敏色素B（PHYB）及其相互作用伴侣PIF6）的异二聚化结构域融合，增加DNA结合结构域和转录激活结构域之间的邻近性。配体结合后发生二聚化的变构细菌转录因子，可用于增加具有明确DNA结合区域的第二种细菌转录因子与转录激活结构域之间的邻近性。c 合成转录因子的诱导性蛋白水解释放。特定外部信号激活合成受体，触发两种嵌合蛋白的结合：一种含有蛋白酶或蛋白酶片段（通常是烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶，TEVp），另一种含有合成转录因子（synTF），或同时含有合成转录因子和通过蛋白酶切割序列与二聚化伴侣融合的蛋白酶另一片段。膜结合配体或可溶性配体激活合成Notch受体（SynNotch），诱导内源性蛋白酶（例如γ-分泌酶）切割连接的胞质合成转录因子。对于正交化学激活受体（OCAR）框架，两个合成Notch受体链（每个含有一个脱落酸（ABA）诱导性二聚化伴侣（PYL1/ABI1））在暴露于脱落酸后发生二聚化，同时诱导γ-分泌酶切割。蛋白水解切割使合成转录因子能够核转位，激活目标转基因或内源性基因的转录。d 内源性转录因子的诱导性激活。异位表达的天然质膜受体和通道，或基于促红细胞生成素受体的合成受体（带有用于目标配体识别的模块化胞外结构域和来自内源性信号通路的胞内结构域）的激活，启动内源性信号级联反应（例如分别为钙-NFAT和Janus激酶/信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）通路），最终导致含有激活的内源性转录因子（eTF）结合位点的合成启动子的转基因表达。此外，与受体酪氨酸激酶催化结构域融合的光-氧-电压（LOV）结构域在蓝光暴露后可诱导受体二聚化，触发丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）信号传导。GEMS=通用胞外分子传感器；GOI=目标基因；GPCR=G蛋白偶联受体；gRNA=向导RNA；NFAT=活化T细胞核因子；TMP=甲氧苄啶；4OHT=4-羟基他莫昔芬；Shld1=小分子shield。 专栏2 转录回路的调谐 调控结构域 转录激活结构域通过与不同的共激活因子蛋白质相互作用募集转录机制，从而影响最大转录激活水平。哺乳动物细胞中常用的转录激活结构域包括单纯疱疹病毒的VP16、VP16衍生结构域的串联重复序列（例如VP64）、EB病毒R转录激活因子（RTA）、人类NF-κB衍生的p65以及强效的三联体VP64-p65-RTA（VPR）。高通量筛选进一步鉴定了与VPR一样强效的新人类转录激活结构域，例如三联体NFZ（结合了核受体共激活因子3（NCOA3）、叉头框O3（FOXO3）和锌指蛋白473（ZNF473）转录因子的结构域）、嵌合转录激活结构域（由核因子红细胞2相关因子2（NRF2）、心肌素相关转录因子A（MRTF-A）和信号转导子和转录激活子1（STAT1）的结构域组装而成），以及包含NRF2结构域和来自心肌素（MYOCD）和心肌素相关转录因子B（MRTF-B）的9个氨基酸转录激活结构域的紧凑型系统。至于通常募集辅抑制因子蛋白质以沉积表观遗传标记来抑制DNA可及性的沉默结构域，人类ZFN10衍生的Krüppel相关框（KRAB）结构域是常用的。此外，已鉴定出更强效的KRAB结构域，包括源自人类ZNF705和ZNF471蛋白质的结构域。 启动子设计 对于基于转录激活的回路，DNA结合位点通常克隆在最小启动子上游，而对于基于转录抑制的回路，DNA结合位点位于组成型启动子下游。改变转录因子结合位点的数量及其间距可以调谐启动子强度。更多的操纵子位点可能会增加最大表达水平，因为募集了更多的转录激活结构域。然而，驱动合成转录因子表达的组成型启动子的强度也起作用。转录因子过度表达或DNA结合位点数量过多，可能导致配体非依赖性转录因子结合，影响开关的泄漏和最大输出。因此，探索参数设计空间对于确定每种应用的最佳启动子组合至关重要。 核转位 转运速率取决于蛋白质大小和翻译后修饰（如磷酸化）。尽管小转录因子（小于约40 kDa）可以被动扩散，但较大的蛋白质需要选择性转运，这由识别核定位和输出序列的核受体促进。可以操纵这些基序以影响结合亲和力，从而影响蛋白质输入和输出速率以及核浓度，最终影响基因开关的响应功能。 敏感性 对配体输入的敏感性取决于转录因子与其配体和DNA结合位点的结合亲和力。可通过对转录因子进行合理诱变或随机诱变，然后通过功能筛选以获得最佳性能，来调节这些亲和力。某些响应小分子的转录开关的敏感性，还可通过共表达促进哺乳动物细胞摄取的特定转运蛋白来增强。 核激素受体（如人类雌激素受体（hER）和孕酮受体）也可用于工程化外部可控的合成转录因子。这些受体具有相似的多结构域结构，包括转录激活结构域、DNA结合结构域、激素配体结合结构域和二聚化结构域，天然发挥配体激活转录因子的功能。在没有激素配体的情况下，这些受体通过与分子伴侣结合被封存于细胞质中（图1a）。配体结合后，受体易位至细胞核，与目标DNA序列结合并激活基因转录。此外，包含激素受体配体结合结构域与其他DNA结合结构域和转录调控基序融合的嵌合转录因子，仍保持激素响应性。为了构建正交的基于激素受体的转录因子，可以对其配体结合结构域进行诱变，使其选择性结合合成配体而非内源性激素。 除天然DNA结合结构域外，还可基于设计的DNA结合蛋白创建合成转录因子，这些蛋白经工程化改造后可高特异性结合目标序列。例如，在人类基因组中广泛存在的锌指转录因子，由串联结构域组成，每个结构域包含约28个氨基酸，可结合三个DNA碱基对，且序列特异性可定制。源自细菌植物病原体的转录激活因子样效应子（TALEs）由33-35个氨基酸结构域阵列组成，每个结构域识别一个核苷酸。连接多个锌指或TALE阵列能够特异性识别和靶向用户指定的长核苷酸序列，从而最大限度地降低脱靶风险。此外，可利用细菌来源的CRISPR技术组装合成转录因子，无需通过蛋白质工程即可实现DNA序列特异性。相反，单向导RNA（sgRNA）靶向原间隔序列邻近基序（PAM）上游的序列，使失活的CRISPR相关蛋白（dCas）（如化脓性链球菌SpdCas9）能够结合（或诱导其相互作用）适当的基因调控结构域。 与只能调控外源导入转基因的天然DNA结合结构域转录因子不同，人工锌指转录因子、TALEs和CRISPR-dCas9可被编程靶向任何基因组区域，从而能够调控内源性基因。尽管基于锌指的转录因子在单基因靶向中具有最小的遗传足迹，但通过共表达针对不同目标基因的sgRNA，dCas9系统可实现多基因调控。此外，由于锌指转录因子在人类基因组中广泛存在，与细菌CRISPR和TALE系统相比，合成锌指结构域的免疫原性预计更低。 目前尚未工程化出能够直接响应外部信号改变其与目标DNA序列亲和力的基于锌指、TALEs或dCas9的转录因子。然而，为了实现外部控制，已探索了多种涉及单链融合蛋白的策略。例如，包含设计的DNA结合结构域、转录激活结构域和源自激素受体的配体结合结构域的嵌合转录因子，在未添加合成激素配体时被保留在细胞质中，添加配体后则发生核转位。类似地，可将病毒蛋白酶连接在合成转录因子的一端，或连接在DNA结合结构域与调控结构域之间，并带有同源切割序列，使得转录因子在默认状态下通过蛋白水解失活。在蛋白酶抑制剂存在的情况下，两个结构域保持连接，维持转录因子活性以实现精确的基因调控。丙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）和人类鼻病毒（HRV）的蛋白酶及其临床安全抑制剂可通过这种方式控制合成转录因子的活性（图1a）。 此外，可将响应小分子的降解结构域（也称为降解标签）与合成转录因子融合，通过小分子实现对其稳定性的外部控制。在“开启型”系统中，降解标签默认引导转录因子进入蛋白酶体降解途径，而配体的添加可保护融合蛋白免受降解。通过突变体文库筛选已获得多种配体-降解标签对，包括响应合成小分子shield-1的FK506结合蛋白（FKBP）突变体（FKBPF36V）、响应甲氧苄啶的大肠杆菌二氢叶酸还原酶（DHFR）降解结构域（DHFRDD）以及响应4-羟基他莫昔芬的hER不稳定结构域（hER50）。 考虑到这些方法的潜在机制差异，与涉及激素介导的转录因子核转位和降解标签诱导稳定的系统相比，基于蛋白酶水解诱导失活的系统可能需要更多时间启动目标基因的转录。这种较慢的响应源于蛋白水解的不可逆性：只有在添加蛋白酶抑制剂后，新翻译的转录因子分子才能保持活性，而其他系统中的转录因子可随时启动基因转录。 分裂型转录因子的诱导性结合 通过与诱导性二聚化结构域融合，可使调控结构域与结合目标DNA序列的天然或可编程DNA结合结构域靠近，从而创建双组分基因调控系统。特别是，化学诱导或光诱导的蛋白质-蛋白质相互作用系统可应用于从两个分裂的结构域中条件性重建功能性转录因子（图1b）。例如，化学诱导二聚化对FKBP/FRB（FKBP-雷帕霉素结合结构域）可实现雷帕霉素依赖性相互作用，植物来源的PYL1/ABI1（pyrabactin抗性样蛋白1/脱落酸不敏感1蛋白）和GID1/GAI（赤霉素不敏感矮化1/赤霉素不敏感蛋白）系统分别以脱落酸和赤霉素作为二聚化剂。此外，许多具有用于DNA识别的螺旋-转角-螺旋结构域的细菌转录因子在效应分子存在时会发生二聚化。这些转录因子可融合成功能性嵌合体，利用一种转录因子（TF₁）对特定DNA序列的高亲和力，同时通过第二种转录因子（TF₂）整合对新信号的响应；在此，配体诱导二聚化的TF₂与含有DNA结合结构域的TF₁或转录激活结构域融合，从而在TF₂效应子存在时启动TF₁响应启动子的转录。类似地，可通过将截短的蜕皮激素受体（EcR）和视黄酸X受体（RXR）变体与Gal4 DNA结合结构域和转录激活结构域融合，设计基于EcR与RXR异二聚化的合成分裂型转录因子。这些融合蛋白形成功能性转录激活因子，在蜕皮激素存在时相互靠近，驱动含有Gal4识别元件的启动子的基因表达。为了扩大诱导剂化合物的范围，可通过结构导向的蛋白质工程和高通量筛选改变天然基于脱落酸的化学诱导二聚化剂的配体结合特异性，使其能够响应天然和合成大麻素。此外，人类蛋白（如Lyn激酶和糖皮质激素受体2）可分裂为两个片段，分别在临床批准的小分子药物达沙替尼和地塞米松存在时重新组装。类似地，基于临床批准的HCV蛋白酶抑制剂的化学诱导二聚化系统可促进HCV蛋白酶突变体（蛋白水解活性降低）与通过噬菌体展示技术分离的单克隆抗体之间的相互作用。该系统已整合到自杀开关中，在小鼠体内植入肿瘤细胞后，通过蛋白酶抑制剂治疗可快速诱导肿瘤细胞凋亡。 光诱导二聚化可用于创建光依赖性基因开关。例如，在拟南芥中，隐花色素2（CRY2）及其相互作用伴侣CIB1表现出蓝光依赖性结合，而光敏色素B（PHYB）及其相互作用伴侣PIF6表现出红光依赖性结合。因此，将这些隐花色素对与DNA结合结构域和激活结构域融合，可在哺乳动物细胞中实现转录的光激活。此类光诱导二聚化系统可实现时空精准控制，使其在特定时间点靶向体内特定组织或细胞具有吸引力。此外，与化学诱导二聚化相比，这些系统通常具有更快的开关动力学且可逆，可提供更精确的时间控制。然而，有限的光穿透性限制了光控基因调控在浅表组织中的应用。近红外光（700-900 nm）的组织穿透深度最大，可达7毫米。相比之下，小分子（小于1 kDa）可穿透许多组织和细胞膜，使其适用于多种组织和细胞类型。因此，化学诱导二聚化和光诱导二聚化的选择取决于具体应用，需考虑时空精度、组织穿透性、可逆性和临床转化的难易程度。值得注意的是，与单链合成转录因子相比，基于分裂型化学诱导或光诱导的转录因子通常具有更大的遗传尺寸，这可能限制其治疗应用，特别是当使用腺相关病毒载体进行递送时（这些载体最多可容纳约4 kb）。 合成转录因子的诱导性核转位 通过将合成转录因子与细胞表面受体或跨膜结构域连接，可将其保留在细胞核外。然后，在天然或合成传感器结构域检测到特定信号后触发其释放。这可通过信号诱导的受体激活导致两个独立蛋白质二聚化来实现（图1c）；例如，二聚化可发生在两个受体链之间（如受体酪氨酸激酶中观察到的），或发生在受体与募集的蛋白质之间（如激活后与β-抑制蛋白结合的G蛋白偶联受体中观察到的）。与一个相互作用伴侣连接的蛋白酶（或蛋白酶片段）与另一个通过蛋白酶切割序列连接转录因子（或另外还连接蛋白酶另一片段）的伴侣靠近。这种相互作用导致合成转录因子的蛋白水解释放，使其能够转位到细胞核中调控目标基因。分子信号和物理信号均可通过控制转录因子的定位来调控基因表达。或者，可将合成转录因子与Notch受体核心连接，在邻近细胞上的膜结合配体或可溶性配体诱导受体激活后，通过内源性蛋白酶将其切割下来。此类传感器具有高度多功能性，因为它们允许将针对与疾病状态相关的目标抗原的亲和结合结构域整合到合成受体中，这些受体在抗原结合后可被激活。然而，它们的基线表达通常较高，而动态范围相对较低（通常诱导倍数低于10倍），低于通过转录因子直接传感的系统（通常可实现超过100倍的诱导倍数）。尽管如此，探索可用的参数空间（如启动子、连接子、DNA结合结构域和转录激活结构域）仍有改进的机会；例如，可设计具有低背景水平和高激活倍数的合成Notch（synNotch）受体。 内源性转录因子的诱导性激活 内源性转录因子可在感知外部信号后直接（或通过细胞表面受体或通道检测外部信号后触发的信号效应子间接）采用能够结合目标DNA序列的分子状态（图1d）。胞外传感结构域可以是天然的或合成的。对于光遗传学控制的受体酪氨酸激酶（Opto-RTKs），光传感结构域（例如用于蓝光诱导同源二聚化的光-氧-电压结构域）在细胞内与受体的催化结构域融合。这种配置能够在暴露于特定波长的光后，启动丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）信号传导，并激活含有血清反应元件的启动子的转录。调控目标可以是内源性基因或置于由针对内源性激活转录因子定制的多个响应元件下游的外源基因。这些方法利用内源性途径的信号放大作用，通常可提供高诱导倍数。尽管如此，异位表达的受体或通道可能与其他内源性受体共享共同的信号中间体，因此可能被非目标分子激活，或无意中激活内源性基因。此外，由于它们是人类细胞天然存在的，其诱导可能具有多效性。 翻译调控回路 翻译调控通过绕过转录阶段提供快速的响应动力学，与翻译后控制的基因回路相比，能量和营养利用效率更高。然而，与蛋白质结构相比，RNA分子的结构研究较少，因此通过外部信号控制RNA活性的系统发展相对滞后。可将天然RNA适配体或通过体外指数富集配体系统进化（SELEX）合成产生的适配体整合到目标mRNA分子中，以响应目标蛋白质或小分子调节其翻译。 RNA结合蛋白调控 古细菌L7Ae或噬菌体MS2外壳蛋白等异源序列特异性RNA结合蛋白可应用于哺乳动物细胞的翻译控制。这可通过将其识别基序（RNA适配体）置于目标基因的5'非翻译区（UTR），通过RNA-蛋白质相互作用抑制翻译起始来实现（图2a）。为了实现外部控制，可通过连接诱导性降解结构域或可抑制蛋白酶（能够切割策略性置于RNA结合蛋白结构内的同源切割位点）来修饰RNA结合蛋白。或者，RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用可通过特定配体或光直接控制。RNA结合蛋白也可与翻译起始因子相关联，例如轮状病毒非结构蛋白3，其强烈促进在3'非翻译区含有多个RNA结合蛋白特异性RNA适配体且位于自切割多聚腺苷酸尾上游的mRNA的翻译。通过将RNA结合蛋白和非结构蛋白3与化学诱导或光诱导二聚化结构域融合，可响应特定触发信号组装合成翻译起始因子。尽管这种双组分系统比其他RNA开关尺寸更大，但它提供了与转录开关相当的宽动态范围。 图2 设计响应外部信号的翻译调控网络 a 小分子对RNA结合蛋白的调控，要么介导其与适配体的结合，要么诱导其降解。目标RNA适配体置于目标基因（GOI）的5'非翻译区（UTR）。与哺乳动物DEAD盒解旋酶6（DDX6）蛋白融合的四环素阻遏蛋白（TetR）在没有多西环素（Dox）的情况下与其适配体结合，从而抑制翻译，添加多西环素后抑制解除。与二氢叶酸还原酶降解结构域（DHFRDD）融合的L7Ae蛋白在小分子甲氧苄啶（TMP）存在时稳定，使其能够结合其RNA适配体，从而阻止翻译起始。在没有甲氧苄啶的情况下，融合蛋白发生降解，失去抑制翻译的能力。b 包含位于3'非翻译区的适配体核酶的RNA自切割调控，其中触发物是小分子或反义寡核苷酸。在没有触发物的情况下，适配体核酶发生切割，使转录本不稳定，导致蛋白质低表达。与核糖开关结合影响核酶自切割，进而稳定转录本并增加蛋白质表达。使用寡核苷酸作为输入信号的基于适配体核酶的开关通常具有高动态范围。c 可变剪接调控。来自SMN2基因的外显子（其特征是中间假外显子两侧是两个对小分子药物LMI070高度响应的内含子序列）置于目标基因上游。在药物存在时，假外显子内的起始密码子被纳入，目标基因被主动表达。相反，在没有药物的情况下，起始密码子的排除阻止了目标基因的翻译。d RNA切割和可变剪接调控。整合在Y形四环素（Tc）适配体内的合成多聚腺苷酸信号（PAS）插入目标基因5'非翻译区的两个内含子（内含子2（IVS2）和内含子G-四链体结构（G4s））之间。在没有四环素的情况下，典型内含子剪接与合成多聚腺苷酸信号切割的耦合导致mRNA降解。四环素与Y形适配体结合后，假设发生G-四链体结构的局部强化，迫使可变剪接朝向下游3'剪接位点（SS），从而去除多聚腺苷酸信号并激活基因表达。POI=目标蛋白质。 RNA自切割调控 适配体可赋予其他功能性RNA分子（如核酶）变构控制特性，使外源配体浓度与翻译速率耦合。核酶-适配体模块（称为适配体核酶）置于目标转录本的3'非翻译区时，可响应小分子切割多聚腺苷酸尾，从而影响mRNA稳定性（图2b）。尽管如此，体外筛选的适配体在哺乳动物细胞环境中通常折叠不佳，即使在细菌细胞中经过多轮分选后也是如此。这种限制可能导致响应多种配体（包括四环素、茶碱和鸟嘌呤）的基于适配体核酶的核糖开关的动态范围受限。“开启型”开关的诱导倍数很少超过10倍。为了充分释放这类紧凑型人工基因回路的潜力，需要开发具有高切割效率的适配体核酶库，以实现低泄漏和响应正交且临床兼容化合物的宽动态范围调控输出。尽管使用寡核苷酸作为输入信号的基于核酶的RNA装置比使用小分子的装置可实现更高的动态范围，但体内递送仍然具有挑战性。 可变剪接调控 可变剪接使前体mRNA转录本能够加工生成具有不同稳定性或编码潜力的mRNA异构体。这一过程影响约95%的人类mRNA转录本，极大地促进了蛋白质多样性。可利用配体介导的可变剪接机制在哺乳动物细胞中进行人工翻译控制。然而，通过四环素适配体控制蛋白质编码外显子的纳入或跳过显示出非常窄的动态范围。一种使用临床测试的剪接修饰药物（LMI070，NCT02268552）的RNA开关，可通过将Kozak序列和起始密码子整合到LMI070响应剪接位点中，调控合成外显子的纳入和排除（图2c）。在默认剪接途径中，去除起始密码子会阻止翻译起始。药物给药后，可剂量依赖性地纳入含有AUG的假外显子，促进mRNA翻译和目标蛋白质产生。这种核糖开关的激活倍数超过100倍，远高于基于适配体核酶的开关。 可通过在转基因的5'非翻译区放置合成多聚腺苷酸信号，组装利用可变剪接和转录本切割同时调控的顺式作用RNA装置。合成多聚腺苷酸信号嵌入由三个四环素适配体组成的经验性Y形RNA结构中，从而在没有四环素的情况下促进转录本切割，阻止下游编码序列的翻译。四环素对转录本切割的剂量依赖性抑制导致转基因表达超过40倍的诱导，经过多次经验性优化后。由G-四链体RNA结构介导的与可变剪接的协同作用，进一步允许在四环素存在时剪接去除多聚腺苷酸信号（图2d），导致转基因表达大幅增加（高达900倍）。通过载体递送到小鼠体内后，这种RNA装置在3个月内实现了荧光素酶报告基因的可逆和可重复诱导。将这种设计推广到其他配体结合适配体，可能使这种紧凑型人工基因调控系统得到广泛应用，特别是随着对可变剪接调控的进一步深入了解。 以RNA形式递送 人工转录后调控网络可编码为RNA，并在体外转录后递送，从而避免与基因组插入突变相关的风险。例如，可在体外转录过程中掺入化学修饰的核苷酸，以产生免疫原性低且体内稳定性高的转录本。此外，可设计自扩增RNA（saRNAs）来克服传统mRNA在体内基因表达瞬时且强度有限的固有局限性。这些自扩增RNA利用单链RNA病毒基因组的一个片段，该片段编码非结构蛋白（包括用于在细胞质中自我扩增的复制酶），随后是驱动目标蛋白质表达的亚基因组启动子。在自扩增RNA中纳入响应小分子的RNA结合蛋白，以及在目标蛋白质上游的相应RNA适配体，可进一步实现小分子依赖性翻译水平调控。给小鼠注射编码促红细胞生成素的甲氧苄啶响应自扩增RNA（在甲氧苄啶存在时关闭促红细胞生成素产生），与未接受甲氧苄啶的小鼠相比，接受甲氧苄啶治疗的小鼠的血液促红细胞生成素水平降低。尽管如此，自我复制机制和RNA结合蛋白调控模块的需求极大地扩大了此类系统的尺寸和潜在免疫原性，这可通过在自扩增RNA中整合可变剪接调控和5'非翻译区的多聚腺苷酸信号来解决。 翻译后调控回路 与转录或翻译开关相比，翻译后装置通过调控蛋白质活性、稳定性和定位发挥作用，提供更高的时间分辨率和可扩展性（专栏1）。实现目标蛋白质的翻译后调控需要蛋白质工程。蛋白质开关通常通过将模块化结构域插入目标蛋白质的末端或结构内生成，以响应输入信号破坏或增强其活性，或改变其定位。然而，蛋白质开关的潜力尚未完全实现，部分原因是外部可控降解标签和蛋白酶系统的工具库有限。 条件性不稳定结构域 可利用降解标签控制目标蛋白质的降解速率，影响其稳态浓度。这些标签在特定信号（通常是小分子配体，包括雷帕霉素类似物、植物激素生长素、抗生素药物甲氧苄啶和小分子药物4-羟基他莫昔芬）存在（关闭模式）或不存在（开启模式）时，引导蛋白质进入蛋白酶体降解途径。重要的是，甲氧苄啶和4-羟基他莫昔芬分子对其目标降解结构域变体（DHFRDD和hER50）具有高亲和力，但对人类内源性DHFR和hER蛋白具有低亲和力。与这些结构域融合的蛋白质会发生显著的基础蛋白酶体周转，除非存在相应的稳定配体（图3a），表现出宽动态范围。尽管这些系统以“开启模式”运行，但也有多种“关闭模式”系统可用，其中添加配体触发蛋白质降解。最有效的“关闭”方法涉及称为降解标签（dTAGs）的异双功能小分子，这些小分子通过将雷帕霉素类似物shield-1与E3泛素连接酶复合物组件的配体共价连接形成，从而诱导基于FKBP的降解结构域与泛素化复合物的二聚化。在dTAG分子处理后1小时内，可实现多种目标蛋白质的稳健降解。 图3 翻译后调控系统的应用 a 通过诱导性降解结构域或可抑制蛋白酶调控嵌合抗原受体（CARs）。与CAR分子的胞内结构域融合的降解结构域（例如二氢叶酸还原酶降解结构域（DHFRDD））在没有小分子稳定剂的情况下触发CAR快速降解，从而防止T细胞激活。在默认条件下，插入CAR结构中配体传感结构域和信号结构域之间且两侧带有其切割位点的病毒蛋白酶（例如丙型肝炎病毒蛋白酶（HCVp））导致CAR片段化。在蛋白酶抑制剂存在时，蛋白酶活性受到抑制，使CAR保持完整且功能齐全，能够在与目标抗原相互作用后介导T细胞激活。b 紧凑型诱导性基因组编辑器。在默认状态下，N端带有人类鼻病毒蛋白酶（HRVp）且结构内带有同源切割位点（CS）的CRISPR相关蛋白（Cas）9，除非存在蛋白酶抑制剂，否则会片段化为两个失活部分。在抑制剂存在时，活性Cas9与目标基因前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）启动子区域的向导RNA（gRNA）结合，在PCSK9基因中引入突变。这导致产生非功能性蛋白质，无法抑制低密度脂蛋白（LDL）-胆固醇受体，从而降低血液LDL-胆固醇水平。c 快速分泌系统的调控。目标蛋白质（胰岛素）在C端与烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEVp）切割位点（TCS）和内质网（ER）保留信号（KDEL氨基酸序列）融合。在没有脱落酸（ABA）的情况下，工程化胰岛素构建体通过与KDEL受体（KDELR）的相互作用在ER内积累。运输小泡中的ER回收信号确保它们通过回收途径从顺式高尔基体返回ER。添加脱落酸后，与pyrabactin抗性样蛋白1（PYL1）或脱落酸不敏感1（ABI1）蛋白融合的两个分裂TEV片段发生二聚化，使TEVp具有催化功能。这切割KDEL保留信号，允许胰岛素沿着分泌途径推进并最终分泌到细胞外空间。TMP=甲氧苄啶。 蛋白水解激活和失活 基于蛋白酶的蛋白质开关使带有蛋白酶切割位点修饰的蛋白质在响应蛋白酶抑制剂结合时条件性激活。在其抑制剂存在时，蛋白酶活性被阻断，使新翻译的蛋白质保持活性（开启模式），或者如果在蛋白质和二聚化结构域之间存在切割位点，则发生降解（关闭模式）。已鉴定出几种临床安全的蛋白酶抑制剂，作为针对HIV、HCV、HRV和SARS-CoV-2的抗病毒疗法的一部分。例如，可将HCV蛋白酶和降解标签与目标蛋白质连接，使蛋白酶抑制剂能够防止降解标签去除并诱导蛋白质降解。或者，在目标蛋白质结构内暴露含有HCV蛋白酶、SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）、HIV蛋白酶或HRV蛋白酶切割位点的单链蛋白质开关，通过同源蛋白酶切割使蛋白质保持在失活状态，而蛋白酶抑制剂可阻断这种切割，从而维持蛋白质功能（图3a）。此类蛋白质开关可在引入蛋白酶抑制剂后几百秒内激活目标蛋白质，而抑制蛋白酶以激活控制蛋白质表达的转录因子（图1a）则需要数小时才能检测到蛋白质活性。HRV蛋白酶及其抑制剂鲁平特里韦已被确定为调节10种不同蛋白质活性的最有效基于蛋白酶的系统，表现出宽动态范围。例如，调节核因子-κB（NF-κB）信号通路的效应子，能够响应蛋白酶抑制剂精确激活和抑制下游事件。通过这种方法，可通过挽救NF-κB超阻遏物的活性，在脂多糖处理和鲁平特里韦处理的小鼠中抑制细胞因子释放。此外，靶向PCSK9基因的鲁平特里韦激活Cas9可降低小鼠血液中的低密度脂蛋白（LDL）-胆固醇水平（图3b）。 诱导性快速分泌系统 对于在生物标志物失调后需要快速生理控制的疾病（如糖尿病中的低血糖或高血糖），由于响应时间长，在转录或翻译水平调控治疗性蛋白质并不理想。或者，可通过在给予二聚化剂后切割内质网保留信号，利用分裂蛋白酶片段和诱导性二聚化结构域实现蛋白质的快速分泌，这与专业分泌细胞（如用于血糖控制的胰岛素产生β细胞，或释放心钠素以调节血压的心肌细胞）的快速响应类似。在此，通常使用两种内质网保留信号中的一种，决定蛋白酶切割发生的位置：用于可溶性蛋白质的KDEL和用于膜结合蛋白质的KKXX（信号面向细胞质）（图3c）。对于带有KKXX标签的蛋白质，诱导性释放机制在给予二聚化信号后在细胞质中组装，随后切割目标蛋白质以推进其通过分泌途径。在跨膜结构域和目标蛋白质之间添加弗林蛋白酶切割位点，确保其分泌到细胞外。相反，对于带有KDEL标签的蛋白质，具有强切割内质网定位底物效率的烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶变体的分裂片段与诱导性二聚化结构域融合，通常还会进行突变以消除半胱氨酸和N-糖基化位点，以增强在内质网环境中的正确蛋白质折叠。此类合成快速分泌系统可在糖尿病小鼠模型中，在血糖失调后快速分泌胰岛素。 大分子开关的生物医学应用 可控基因治疗 已有多种基因治疗获批用于临床，包括使用腺相关病毒（AAV）载体进行体内基因递送，以治疗血友病、脊髓性肌萎缩症和视网膜疾病等疾病。随着该领域的发展，越来越多的配备有停止或控制其转基因表达机制的基因治疗载体正在临床前和临床试验中进行研究。可在载体设计中整合不同的控制元件，以实现体内基因转移后响应外部信号对蛋白质表达的时间调控。此类策略能够微调疗法的强度和持续时间，最终提高安全性和有效性。例如，RheoSwitch治疗系统已在胶质母细胞瘤临床试验中进行了测试。在该系统中，蜕皮激素类似物对白细胞介素（IL）-12的可控表达被编码到腺病毒载体中，该载体被注射到肿瘤部位（图4a）。IL-12是一种强效细胞因子，能够引发先天免疫和适应性免疫，但全身给药时表现出毒性。在接受不同每日剂量诱导剂的胶质母细胞瘤患者中，已证明单次瘤内注射腺病毒载体的可行性和耐受性。尽管大多数可控基因治疗主要涉及治疗性基因的转录控制，但也已开发出整合转录后调控的基因回路，特别是仅RNA装置，无需表达辅助异源蛋白质，从而最大限度地减少回路的DNA碱基对总数。由于其尺寸紧凑，这些回路非常适合包装到AAV载体中，并且已在动物模型中证明其能够递送到目标细胞和组织。 图4 靶向癌症的可控工程化细胞 a 病毒载体递送基因回路。编码人类白细胞介素（IL）-12（位于响应蜕皮激素类似物（veledimex）的合成启动子下游）的腺病毒载体被瘤内注射到胶质母细胞瘤患者体内。当veledimex全身给药时，产生IL-12并激活T细胞，产生抗肿瘤微环境。b 体外工程化的“与”门控嵌合抗原受体（CAR）-T细胞。可使用针对两种不同癌症相关抗原（CAAs）的两个CAR分子对T细胞进行工程化改造，每个CAR分子与信号蛋白LAT（激活T细胞的连接子）和SLP-76（含SH2结构域的76 kDa白细胞蛋白）之一融合，这两种信号蛋白形成支架。只有在两个抗原结合以进行信号传导和T细胞激活后，才会触发T细胞在肿瘤微环境（TME）中的激活，抑制肿瘤生长并提高存活率。c 体外工程化的造血干细胞（HSCs）。用慢病毒载体转导HSCs，该载体编码组成型表达的IL-12，其与诱导性二聚化结构域（DHFRDD）融合。在胶质母细胞瘤小鼠模型中植入工程化细胞后，甲氧苄啶（TMP）小分子触发IL-12释放，导致免疫激活。d 基于细菌的癌症治疗。工程化大肠杆菌Nissle 1917（EcN）将肿瘤微环境（TME）中的代谢副产物氨转化为氨基酸精氨酸（Arg），促进T细胞介导的抗肿瘤免疫。pA=多聚腺苷酸化信号；TF=转录因子。 编程人类设计细胞 可对人类细胞进行基因工程改造，以修饰或增强其功能用于疾病治疗。人类细胞源自自体或异源来源，通常在体外进行工程化改造，以整合治疗程序，使其在植入后能够特异性响应疾病状态或外部信号。 不断发展的CAR-T细胞疗法 可对患者来源的T细胞进行工程化改造，使其表达设计用于靶向肿瘤细胞上存在的抗原的嵌合抗原受体（CAR）分子，从而诱导强效的抗肿瘤细胞毒性响应。CAR-T细胞疗法的临床成功标志着六种治疗血液系统恶性肿瘤的疗法获批。尽管如此，相关副作用（如细胞因子风暴和神经毒性）在部分患者中构成危及生命的风险。此外，嵌合受体的组成型表达可能导致T细胞加速耗竭，因此需要更复杂的合成基因回路来确保疗效和安全性。此外，实体瘤对这种疗法的临床响应有限，主要原因是抗原特异性不足和免疫抑制性肿瘤微环境（TME），这会影响CAR-T细胞的功能、扩增和存活。特别是，靶向在健康组织中也表达（尽管水平较低）的抗原可能导致严重毒性。即使鉴定出一种独特表达的肿瘤抗原，仅依赖一种抗原可能不足以实现持续响应，因为抗原丢失是肿瘤对CAR-T细胞疗法产生耐药性的常见原因。 通过将逻辑门整合到嵌合抗原受体中以同时检测多种抗原，可能解决这些挑战，旨在提高肿瘤与健康组织的区分能力，并避免抗原丢失导致的耐药性。例如，synNotch受体可通过识别启动抗原以诱导第二种抗原的CAR转录，赋予T细胞布尔逻辑，从而在小鼠模型中提高肿瘤特异性以及持久性和效价（图4b）。其他逻辑门控CAR激活策略已在临床前研究中得到验证，包括针对两种肿瘤抗原的“与”门设计；在此，CAR与不同的下游信号分子融合，这对信号传导和T细胞功能至关重要。在小鼠模型中，两种抗原结合后T细胞激活，导致杀伤表达双抗原的肿瘤细胞，但不杀伤表达单一抗原的健康细胞。 对植入的CAR-T细胞进行外部调控，可实现对其治疗功能和给药的时空控制。通用CAR利用含有肿瘤抗原识别结构域的可溶性衔接分子，促进输注的CAR-T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，为靶向新的和多种肿瘤抗原提供灵活性。通过小分子依赖性受体降解，或使用基于可抑制病毒蛋白酶的系统，实现CAR的翻译后调控，可通过调整诱导剂剂量精确调节CAR活性（图4b）。这些时间控制机制可增强CAR-T细胞的疗效、特异性和持久性。此外，合成回路可使T细胞在局部产生炎症细胞因子（如IL-2），以激活更多T细胞并克服肿瘤抑制的某些方面。此类方法也可扩展到其他疾病，如感染性疾病和自身免疫性疾病。 CAR-T细胞之外的设计细胞疗法 也可对人类细胞进行基因工程改造，用于治疗代谢和自身免疫性疾病，包括糖尿病、痛风性关节炎和银屑病。可给细胞配备治疗性基因回路，其活性可通过给予小分子或物理信号，或通过内源性疾病生物标志物进行调控。后一种策略使细胞能够根据需要自主产生治疗性效应子。在此，通常应用转录调控基因回路，使用质膜受体或转录因子作为传感组件。此外，已设计了翻译后开关。重要的是，此类细胞疗法的临床转化需要能够进行高效基因操作的原代细胞，以赋予它们稳健和稳定的治疗功能以及持续的治疗活性，同时避免免疫原性和致瘤性。例如，自体细胞或低免疫基因组编辑异源细胞可用于细胞治疗。体外基因转移或校正后的自体造血干细胞（HSC）移植已获批用于治疗多种疾病，包括β-地中海贫血和X连锁严重联合免疫缺陷。通过增强造血干细胞的诱导性蛋白质递送系统，可进一步扩大其治疗潜力。例如，在胶质母细胞瘤小鼠模型中，移植的造血干细胞释放甲氧苄啶诱导的DHFRDD标记细胞因子，促进肿瘤微环境中的免疫细胞激活，从而减少肿瘤生长并提高存活率（图4c）。源自诱导多能干细胞（iPS细胞）的异源细胞提供了无限的细胞来源，可在分化前进行多次基因操作。例如，可首先使用CRISPR-Cas9技术对iPS细胞进行基因组编辑，以敲低所选基因并降低其免疫原性，然后用治疗性“感知-响应”基因回路进行工程化改造。在筛选出具有所有所需改变的最佳性能细胞后，可将其分化为所需的细胞表型。尽管如此，如果被残留的未分化增殖细胞污染，源自iPS细胞的成熟异源细胞可能在体内形成肿瘤，因此需要稳健的生产工艺来避免此类风险。正在进行的使用源自iPS细胞的异源CD19靶向CAR-T细胞治疗B细胞恶性肿瘤患者的临床试验，代表了迈向“现成”iPS细胞衍生细胞疗法的重要一步。 编程治疗性菌株 与人类可植入细胞类似，可对微生物进行工程化改造，使其配备“传感器-执行器”基因回路，作为活体治疗剂，能够响应特定信号在原位产生效应分子，为治疗多种慢性疾病（包括胃肠道感染性疾病、代谢和炎症性疾病以及肿瘤疾病）提供治疗选择。 可设计智能益生菌用于治疗细菌感染，以应对抗生素耐药菌株增加带来的重大挑战。例如，可对大肠杆菌Nissle 1917益生菌菌株进行工程化改造，使其在检测到致病性铜绿假单胞菌分泌的群体感应分子后，产生病原体特异性抗菌效应子（紫菌素S5和抗生物膜酶）。检测到自诱导物后，激活大肠杆菌Nissle 1917中裂解蛋白E7的产生，当达到阈值浓度时，E7破坏大肠杆菌膜，释放积累的杀伤蛋白。在小鼠感染模型中，用配备自主回路的这种益生菌菌株治疗，可显著降低粪便病原体滴度。也可对大肠杆菌Nissle 1917进行工程化改造，使其感知由抗生素诱导的艰难梭菌感染引起的肠道损伤特征分子（例如细胞外唾液酸），并通过产生胆盐水解酶来响应，以恢复肠道中的胆汁盐代谢。这种工程化益生菌可改善艰难梭菌感染小鼠模型的临床症状。 由于某些细菌具有优先在肿瘤组织中积累的固有能力，因此可进一步对其进行工程化改造以递送抗肿瘤药物。例如，可实施同步裂解回路，使细菌在达到特定种群密度时释放环状抗肿瘤蛋白。可使用此类群体感应系统对非致病性大肠杆菌和沙门氏菌进行工程化改造，以周期性释放不同的效应蛋白，如细胞毒性负载、靶向某些肿瘤过表达的抗吞噬受体CD47以激活肿瘤浸润T细胞的纳米抗体，以及检查点阻断纳米抗体，从而在同源肿瘤小鼠模型中实现肿瘤快速消退。或者，可设计细菌以响应肿瘤微环境的信号。例如，肿瘤微环境中由谷氨酰胺和天冬酰胺代谢增加产生的高氨浓度，会降低T细胞激活和增殖，导致T细胞耗竭。经工程化改造可将氨持续转化为精氨酸（Arg，肿瘤微环境中的限制性氨基酸）的细菌，在定植后可显著提高瘤内精氨酸浓度，并促进抗肿瘤免疫（图4d）。 尽管此类设计菌株尚未获批用于临床，但部分已在临床试验中进行了测试，例如口服给药工程化大肠杆菌Nissle 1917菌株治疗苯丙酮尿症和高氨血症等代谢疾病。此外，可在此类菌株中整合安全开关以控制其复制和活性持续时间，旨在减轻与细菌诱导的全身性免疫反应相关的风险。 与人工智能的协同作用 在日益丰富的数据集的推动下，人工智能（AI）方法有望在个性化疗法的开发中发挥变革性作用，类似于其在蛋白质结构预测和合成酶设计中的影响。特别是，机器学习（ML）模型长期以来一直用于优化基于细胞的生产过程中的宏观参数，如培养基组成、随时间的营养补充以及其他环境因素（例如溶解氧、pH、温度），以提高小规模生物反应器培养中生物制药的产量和质量。这些模型可通过高效的计算机筛选替代资源密集型实验，并且最近已用于识别仅通过实验难以发现的优质生物组件（图5a）。例如，为了克服腺相关病毒载体作为治疗性回路递送载体的局限性（包括在某些组织中转导效率低、器官特异性差和预先存在的体液免疫），可使用机器学习模型开发新的衣壳。尽管大多数变异空间是非功能性的，但基于先前筛选轮次的实验数据训练的机器学习模型，能够学习识别可能破坏衣壳功能的突变，从而富集含有高度多样化且仍能包装DNA负载的可行衣壳变异体的文库（图5b）。这种机器学习指导的腺相关病毒设计可进一步允许同时搜索具有多种功能特性（如载体产量、向目标组织的转基因递送效率和衣壳存活率）的高性能变异体。 图5 利用人工智能推进受合成生物学启发的疗法 a 可通过使用机器学习（ML）算法优化合成大分子回路生物组件的核苷酸或氨基酸序列，增强其性能。首先在计算机中生成合成回路组件（例如合成转录因子的DNA结合结构域或配体结合结构域、目标基因上游的启动子区域以及核糖开关中的RNA结构）的遗传文库。然后合成变异体文库的子集并进行实验测试，收集的数据用于训练和验证机器学习模型。这些机器学习模型的输入节点可以是待优化区域的核苷酸/氨基酸序列，输出节点可以是所得回路性能的度量，例如在输入信号存在时报告基因的诱导倍数。建立的机器学习模型随后可预测其余变异体的性能，加快设计过程并确保高效结果。b 载体设计。机器学习模型能够发现具有高度多样性和高衣壳存活率的腺相关病毒（AAV）载体。将含有AAV2野生型蛋白28个氨基酸片段突变的衣壳文库转染到人类胚胎肾293细胞（HEK293T）中以产生病毒。从纯化的病毒衣壳中提取病毒基因组，并进行下一代测序（NGS）。为每个检测到的衣壳变异体分配存活率分数，这些数据用于训练和验证机器学习模型。最佳模型用于预测新的衣壳变异体，然后进行实验验证。c 嵌合抗原受体（CAR）设计。机器学习模型能够预测由不同信号基序排列组成的抗CD19 CAR分子相关的CAR-T细胞表型。源自天然免疫受体的12种信号基序可用于构建在跨膜结构域和CD3ς信号结构域之间具有1个、2个或3个基序的CAR分子，产生超过2,300种受体。从中测试约250种CAR，并将所得T细胞细胞毒性和干性数据用于机器学习模型训练和验证。建立的模型随后可预测由其余信号基序组合编码的CAR-T细胞表型，允许对顶级候选物进行排名以进行实验测试。Cas9=CRISPR相关蛋白9；sgRNA=单向导RNA；SynTF=合成转录因子；TF=转录因子；WT=野生型。 此外，深度学习方法可辅助设计锌指蛋白，以实现对一系列目标基因的高效可编程调控。基于锌指蛋白-DNA相互作用的大型数据集训练的人工智能模型，可考虑相邻指的影响，指导针对特定DNA结合区域的锌指阵列设计。例如，经工程化改造以结合合成启动子内四环素阻遏蛋白（TetR）结合位点的锌指阵列，可激活绿色荧光蛋白（GFP）表达，其水平与强效的基于TetR的转录因子相当。此外，将机器学习与组合诱变相结合，可从筛选的变异体库的小亚集中预测高性能Cas9蛋白变异体，显著减少实验工作量。人工智能在优化合成诱导型启动子方面也发挥了重要作用。例如，使用从人类胚胎肾293细胞基因组中提取的增强子序列训练的模型，对操纵子位点之间的侧翼序列进行基于模型的优化，能够生成与哺乳动物细胞中经典多西环素响应启动子相比，多西环素诱导基因表达得到改善的合成启动子。在RNA开关设计领域，深度生成模型已应用于自切割核酶的设计，产生的功能序列比天然序列具有更强的活性。 人工智能还可辅助探索CAR信号结构域的设计空间，以可预测地生成新的细胞表型，旨在增强T细胞抗肿瘤细胞毒性，并通过降低耗竭敏感性确保长期T细胞持久性。在此，基于来自250种不同CAR内信号基序组合的表型数据建立的预测神经网络模型，被用于探索包含超过2,300种可能性的组合基序空间（每个CAR在跨膜结构域和CD3ς信号结构域之间包含12种基序中的1种、2种或3种），能够识别有助于增强表型的模式（图5c）。然而，这仅代表CAR设计领域的一小部分，通过将池化文库筛选与细胞分选和单细胞CAR测序相结合，可扩大其覆盖范围。通过每个受体使用超过三个信号基序，或同时改变其他CAR模块（如抗原结合结构域或跨膜序列），扩大信号基序库，可能会发现具有更高治疗功效的受体。 展望 工程化细胞正在越来越多的临床研究中取得进展，但编码的合成调控回路仅发挥了其全部潜力的一小部分。在癌症临床试验中，简单的合成转录系统正被用于调节局部IL-12的产生，以刺激免疫系统对抗肿瘤细胞。此外，凋亡蛋白的合成翻译后调控可为CAR-T细胞配备诱导性自杀开关，在出现不良反应时，通过添加信号输入快速杀死输注的细胞。特别是，在检测到生物标志物超出正常范围时需要快速治疗干预的疾病（如糖尿病中的高血糖发作，或有心肌梗死风险个体的血栓），可能受益于快速作用的翻译后回路。例如，通过人工智能方法微调的振荡回路、记忆回路、带通信号滤波器、多输入逻辑门和多稳态回路，可能改善治疗性细胞的控制和临床效果。 重要的是，合成传感模块通常包含非人类组件，利用其卓越的性能和与人类调控网络的正交性。例如，细菌转录因子与特定DNA序列的结合可通过水果和蔬菜中发现的天然小分子进行调控，这表明其作为诱导剂具有良好的安全性。然而，与人类来源的组件相比，这些组件可能具有更高的免疫原性风险。人工智能方法可能有助于寻找低免疫原性的变异体。同样，可对人类来源的传感模块进行微调，以最大限度地减少与内源性网络的相互作用，增强其在治疗应用中的兼容性和有效性。 尽管如此，开发具有逻辑运算的复杂回路的治疗性细胞，给临床转化带来了额外挑战，包括与递送载体、细胞产品一致性和安全性相关的问题。目前获批的CAR-T细胞疗法的制造过程产生的细胞产品具有高度异质性。慢病毒载体通常用于将CAR递送到T细胞中，因为它们具有高转导效率和低插入致癌风险。这导致CAR整合位点可变的异质性细胞群体，可能影响T细胞增殖和治疗效果。此外，慢病毒有限的遗传负载容量（高达9 kb）限制了可与CAR一起包装的合成调控组件的大小。克服这些限制需要改进替代病毒或非病毒基因转移方法，使工程化CAR-T细胞能够克服实体瘤中的免疫抑制性肿瘤微环境和抗原逃逸。 此外，精准控制活体疗法的开发将受益于体外和体内细胞工程方法的进步以及对异源细胞来源的关注。从自体细胞来源转向异源细胞来源，将降低制造成本（目前使用获批的CAR-T细胞疗法治疗每位患者的成本约为50万美元），并扩大合格患者群体，特别是那些T细胞计数过低无法收集和体外工程化的危重患者。令人鼓舞的是，最初引入源自库藏脐带血细胞或iPS细胞的异源CAR工程化自然杀伤细胞的临床试验，在B细胞癌症患者中显示出了有希望的结果。同时，正在进行的改善分化方法效率和可扩展性、推进细胞工程策略以及创建可整合到合成调控网络中的稳健生物组件的努力，正在为下一代疗法奠定更坚实的基础。此外，可使用人工智能设计的病毒载体或类病毒颗粒在体内对细胞进行工程化改造，以实现精确的目标细胞递送和最小的脱靶效应。