Pasireotide Diaspartate

意义 在过去的15年里，超过15种获批的药物结构中含有脯氨酸类似物。这些类似物的环状结构提供了构象受限的三维支架，增强了生物活性分子和肽类的活性和生物利用度。在这项工作中，我们分析了当前药物发现中最具代表性的脯氨酸类似物，重点讨论氟脯氨酸、α-甲基脯氨酸、氨基脯氨酸和双环类似物。此外，我们提供了详细的物理化学数据和创造性建议，以指导未来的研究工作。 1. 引言 近年来，许多肽类和肽类衍生的治疗药物已获得临床使用批准，其中许多含有脂肪族环。(1,2) 药物化学家对环状结构非常关注，从小环到大环，这些支架有助于限制构象的灵活性，并提供更为明确的三维分子框架。(3,4) 从这个角度来看，使用脯氨酸基础的构建块既直接又具有优势，因为脯氨酸天然呈现出脂肪族环结构——与自然肽和蛋白质中编码的其他20种氨基酸结构不同。此外，环状氨基酸构建块的种类已经通过各种脯氨酸类似物得到了成功扩展，其中许多已成为商业药物和候选药物的组成部分。我们所指的脯氨酸类似物是指通过向吡咯烷环上添加取代基或桥接元素从脯氨酸衍生出的结构，后者是脯氨酸残基在自然界中的特征性特征（图1A）。 图1. A 脯氨酸及本文中讨论的脯氨酸类似物类型。B FDA在过去三年内批准的五种药物结构：达利多雷桑（daridorexant）、特罗非奈肽（trofinetide）、瑞扎佛辛（rezafungin）、尼玛特韦（nirmatrelvir）和达尼科潘（danicopan）。C 含有(4R)-羟基脯氨酸作为分支点的抗HCV大环药物结构。D 用于PROTAC应用中的冯·希佩尔-林道配体VH032结构。在此及以下，脯氨酸残基用浅红色突出显示，脯氨酸类似物用浅蓝色突出显示。 迄今为止，脯氨酸类似物主要出现在以下药物结构中：抗真菌药物——孢霉素类（echinocandins）、抗高血压药物——ACE抑制剂、抗糖尿病药物——DPP-4抑制剂以及直接作用抗HCV药物。(5) 在过去三年里，FDA已批准了五种含脯氨酸类似物的新药结构（图1B）。(6−11) 鉴于这些最新进展，我们认为现在是时候分析脯氨酸类似物在新型小分子药物开发中的最新应用，并结合来自模型和肽类研究的最新物理化学数据进行补充。为了分析，我们选择了几种趋势性结构，包括氟脯氨酸、α-甲基脯氨酸、双环脯氨酸类似物和氨基脯氨酸。此外，我们还将单独讨论一些值得注意的案例，其中非脯氨酸残基被脯氨酸类似物替代，以增加分子刚性并消除不需要的NH氢键供体位点。(10,12,13) 在进入讨论之前，我们需要指出，最常见的脯氨酸类似物是(4R)-羟基脯氨酸，它通常通过天然肽类和蛋白质中脯氨酸的翻译后羟基化产生。在商业药物中，这一片段可以在几种针对HCV的NS34A蛋白酶的抗病毒药物中找到，包括帕立普韦（paritaprevir，2014年FDA批准）、格拉佐韦（grazoprevir，2016年）和格列卡韦（glecaprevir，2017年）（图1C）。(5) 此外，(4R)-羟基脯氨酸是靶向冯·希佩尔-林道泛素连接酶的蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）的关键组分，例如VH032（图1D）。(14−17) 许多含羟基脯氨酸的PROTAC分子已作为抗癌剂进入临床试验。(18−22) 此外，我们将不讨论瑞扎佛辛（rezafungin，2023年FDA批准）结构中的脯氨酸类似物，因为这些类似物源自其母体结构——安尼多夫辛（anidulafungin，2006年FDA批准），而后者又来源于天然产物孢霉素B。（11） 2. 药物设计中的氟脯氨酸 4-氟脯氨酸和4,4-二氟脯氨酸最早在1960年代至1970年代被引入，用于研究脯氨酸残基的翻译后修饰作用。(23,24) 然而，长时间以来，它们的使用受到限制，因为这些化合物在商业供应商处稀缺。几十年来，它们要么完全无法获取，需要定制合成以供研究使用，要么价格昂贵，通常每克的价格超过数百美元。然而，近年来，它们的成本显著下降，现在每克只需几美元，这促进了它们在各个研究领域的快速应用。相比之下，3-氟脯氨酸和3,3-二氟脯氨酸仍然相对昂贵，我们在药物设计中的应用实例较少，这一点可以通过SciFinder子结构搜索中识别到的专利数量（图2A）得到证实。 图2. A 药物设计中的氟脯氨酸（此处及以下为N-Boc氨基酸的最低价格，以及根据2024年6月SciFinder搜索结果提到的氟脯氨酸衍生物专利数量）。B 除草剂氟氟唑的结构。 1990年代末，杜邦公司开发了一种基于4-氟脯氨酸的除草剂——氟氟唑（图2B）。（25）然而，其合成需要使用对映纯的(2R,4S)-氟脯氨酸，（26）这种化合物的成本过高，无法满足商业农用化学品的需求，最终导致该产品的停产。在过去的二十年中，4-氟脯氨酸已被广泛应用于多项药物发现研究。其研究成果最终导致了2024年达尼科潘（danicopan）获批用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿症（PNH）（图1B），同时也促进了其他多个药物候选物和先导化合物的开发，这些将在下文中讨论。 2.1. 达尼科潘（ACH-4471） 达尼科潘于2024年3月获得FDA批准，用于治疗成人阵发性夜间血红蛋白尿症中的血管外溶血症，这是一种罕见的遗传性疾病，免疫系统攻击血细胞，导致红细胞过早降解。该药物作为补体因子D的竞争性抑制剂，补体因子D是一种参与免疫反应激活的胰蛋白酶类型的丝氨酸蛋白酶。通过抑制因子D，达尼科潘选择性地抑制了替代途径，同时保持经典途径和凝集素途径的完整性。这使得该药物能够抑制对血细胞的不必要免疫反应，同时不影响固有免疫系统的正常功能。（9） 诺华公司最初的药物骨架设计将在第4.2节中描述。（27,28）在他们的原始专利中，Achillion团队测试了191种包含脯氨酸类似物作为中心片段的化合物，这些化合物周围是特定类型的异芳香族和芳香族基团（图3）。测试的脯氨酸类似物包括(4R)-氟脯氨酸和反式4,5-甲脯氨酸。（29）在随后的实验中，候选分子ACH-4471（达尼科潘）在纳摩尔浓度下表现出优异的蛋白水解活性抑制作用，并在十亿分之一摩尔浓度下完全抑制了替代途径介导的溶血。（9）该药物在成功的三期临床试验后获得了临床使用批准。（30）在他们更近期的专利中，Achillion团队测试了264种化合物，包括在脯氨酸位置上替代的各种结构，如双环结构、螺环结构、取代结构，还测试了作为分支点的脯氨酸类似物的大环结构。（31） 图3. 达尼科潘（ACH-4471）的开发。 2.2. DPP-4抑制剂，普鲁索格列汀 DPP-4抑制剂是用于治疗2型糖尿病的药物，其中许多抑制剂源自含脯氨酸的短肽片段，这些片段通常包含脯氨酸类似物。2003年，葛兰素史克公司的一支团队推出了基于(4S)-氟脯氨酸腈的化合物，作为强效的DPP-4抑制剂。在这些化合物中，登格列汀（DB16134）被选为药物候选物。然而，在2005至2007年间进行的2-3期临床试验后，该药物被停用（图4A）。(32) 图4. 含(4S)-氟脯氨酸的DPP-4抑制剂的开发。 2005年，该团队报告了针对含(4S)-氟脯氨酸腈的选择性结构的结构-活性关系研究。他们鉴定出了一种具有优异DPP-4抑制选择性的化合物，同时对其他可能受到影响的酶（如DPP-2和分离酶）影响较小（图4B）。该化合物还在大鼠和犬类体内表现出最长的药代动力学持续时间。通过将氟化的候选分子与其非氟化的类似物进行比较，发现氟化版本在药代动力学特性上优于非氟化版本，并且具有较低的内分子环化倾向（33）。 2010年，研究人员筛选了一系列新的含(4S)-氟脯氨酸的DPP-4抑制剂。他们发现了一个候选分子——DBPR108（普鲁索格列汀），该分子对DPP-4酶具有高度选择性，同时对其他筛选的肽酶几乎没有活性。此外，他们还发现该化合物在人体血清中表现出纳摩尔级的活性，并在大鼠中提供了持久的抑制作用（图4C）（34）。此后，该物质已通过一系列人体临床试验。在2024年，该团队报告了在2型糖尿病患者中进行的三期临床试验的有希望的结果，表明其疗效令人信服，并且与已建立的DPP-4抑制剂西格列汀相比并不劣效（35）。 比格列汀（KRP-104）（36）、美格列汀（GRC-8200）（37）和贝西格列汀（SHR-117887）（38）是2000年代开发的其他含(4S)-氟脯氨酸衍生的DPP-4抑制剂。这些化合物都进入了二期临床试验，但在开发过程中被终止（图4D）。 2.3. 抗肿瘤药物DS-5272 在过去的十年里，来自第一三共的科学家们研究了抑制p53-MDM2相互作用的化合物，作为潜在的抗癌药物。这一相互作用是癌细胞的一个著名标志，导致p53蛋白的降解，而p53蛋白本应作为肿瘤抑制因子发挥作用。研究小组最初发现了一种包含脯氨酸残基的候选分子，但其代谢稳定性极低（39）。通过结构优化，他们发现了一种代谢稳定性更好的候选分子，其中包含(5R)-甲基脯氨酸（图5）（40）。随后的优化工作导致了前临床候选分子DS-5272的发现，该化合物展示了理想的代谢稳定性、纳摩尔级活性和较高的水溶性（41）。在癌症组织和小鼠模型中的研究表明，DS-5272能够有效抑制白血病；然而，肿瘤细胞最终通过干细胞发展出了对p53激活的免疫性（42）。尽管DS-5272未最终开发为药物，但它仍然是一个有效的、选择性的MDM2抑制剂，可用于各种研究目的（43）。 图5. DS-5272的开发，一种强效的p53-MDM2相互作用抑制剂。 2.4. 利用UAMC1110进行肿瘤靶向 成纤维细胞激活蛋白（FAP）是一种类似二肽基肽酶的脯氨酸寡肽酶，其活性与肿瘤发生相关。2010年，贾昂（Jiaang）团队开发了针对FAP的抑制剂，具有较高的活性（IC50 ≈ 20 nM），同时对二肽基肽酶的活性影响较低（IC50 > 100 μM）。他们筛选出两种高度活跃且选择性强的候选分子，这些分子在氰基部分包含(4S)-氟脯氨酸和4,4-二氟脯氨酸（图6，步骤1）。在小鼠中测试其口服生物利用度时，含4,4-二氟脯氨酸的化合物表现出大约两倍的半衰期，使其成为一个有前景的进一步探索的候选分子（44）。2014年，范德维肯（Van der Veken）团队将该分子与先前开发的抑制剂结合，发现了两种具有纳摩尔级活性、较高生物利用度和低毒性的化合物（图6，步骤2）（45）。其中一种分子——UAMC1110，证明是一种优异的载体，能够选择性靶向在动脉粥样硬化、关节炎、纤维化，尤其是癌症等疾病中上调的FAP组织。在2020年代，基于UAMC1110开发了几种放射性示踪剂，使用177Lu、18F、99mTc、68Ga和131I等同位素进行肿瘤靶向（图6，步骤3）（46−51）。 图6. 用于肿瘤成像的成纤维细胞激活蛋白抑制剂UAMC1110的开发。 2.5. 其他实例 在2020年代，Kim等人开发了一种靶向免疫蛋白酶体的环氧酮抑制剂，作为潜在的阿尔茨海默病治疗药物。他们优化了一种含脯氨酸的宏环肽，包括用不同的类似物替代脯氨酸残基（52,53）。分子对接研究表明，(4R)-氟脯氨酸可以作为氢键受体与蛋白质中附近的组氨酸残基形成氢键。活性测试确认，含(4R)-氟脯氨酸的宏环表现出最佳活性，而含4,4-二氟脯氨酸的化合物活性大约低三倍。相反的对映体(4S)-氟脯氨酸则表现出较差的活性，这可能是由于不利的立体效应（图7A）。此外，在Caco-2细胞中的外排测试显示，含(4R)-氟脯氨酸的化合物外排较低，使其成为缓解阿尔茨海默病症状的有前景的候选化合物（53）。 图7. 4-氟脯氨酸在药物设计中的多种应用实例。 2023年，霍夫曼-拉罗什（Hoffman-La Roche）的一组研究人员报道了开发一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶天冬氨酸内肽酶抑制剂。该抑制剂旨在防止淀粉样蛋白形成，针对阿尔茨海默病的根本原因，而不仅仅是改善其症状。研究小组优化了该抑制剂，其中包括对中心脯氨酸残基的变化。虽然含(4R)-氟脯氨酸的分子未显示出最高的活性，但与其他候选分子相比，它表现出最低的脂溶性、更好的代谢稳定性和更好的渗透性（图7B）。该物质有效地抑制了蛋白酶，导致小鼠中tau蛋白裂解的减少（54）。与蛋白酶的共晶结构（PDB条目：7FQK）表明，脯氨酸残基位于靠近Tyr217的位置，暗示了吡咯烷环和苯环之间可能存在芳香-脯氨酸堆积（55）。这种排列意味着氟原子指向酪氨酸残基的羟基，这可能增强蛋白质-配体的相互作用（图7C）。 在2020年代，来自东阳光药业（中国）的一组研究人员优化了单胺氧化酶B抑制剂，用于治疗帕金森病。他们用各种脯氨酸类似物替代了脯氨酸残基，包括对映异构体4-氟、4-羟基和4-甲基脯氨酸。最好的表现出现在含(4S)-甲基脯氨酸和(4S)-氟脯氨酸的候选分子中（图7D，步骤1）。值得注意的是，含(4S)-氟脯氨酸的分子在对MAO-B的选择性上有显著改善（IC50 19 nM），相比之下，对MAO-A的选择性较差（IC50 46 μM）。分子对接研究表明，氟原子增强了与Phe343、Tyr398和FAD辅因子的疏水相互作用（56）。在随后的工作中，该小组进一步优化了抑制剂结构。含(4S)-氟脯氨酸的结构再次显示出优越的表现，即使与4,4-二氟脯氨酸相比，后者的更高疏水性有助于其在疏水口袋中的适应（图7D，步骤2）。此外，含(4S)-氟脯氨酸的分子在人体微粒体中的代谢稳定性最佳，且表现出良好的血脑屏障透过性，表明其作为进一步开发的候选分子（57）。 2022年，两个研究小组报道了选择性抑制p300/CBP组蛋白乙酰转移酶的抑制剂，作为潜在的抗肿瘤药物。来自葛兰素史克（GlaxoSmithKline）的一组研究人员确定了一种基于脯氨酸的命中结构，并通过测量p300的抑制作用和Myc致癌蛋白水平的降低对其进行了优化。代谢研究表明，脯氨酸环可能容易发生降解。令人惊讶的是，用4-氟脯氨酸替代该残基并未增强代谢稳定性，尽管它改善了预期的活性并降低了脂溶性（图7E）（58）。与此同时，来自第一三共（Daiichi Sankyo）的一组研究人员开发了一个相似的结构作为p300/CBP抑制剂。他们修改了脯氨酸残基，并发现4-氟脯氨酸提供了最佳的抑制效果（图7F）。与p300的共晶结构（PDB条目：8GZC）表明，脯氨酸残基与Pro1439和Leu1398的骨架相互作用。氟化促进了C4-内端翘曲，使得抑制剂构象更加紧凑，并改善了其在结合口袋中的堆积。随后对清除率和口服生物利用度的优化导致了DS-9300的开发，且在小鼠中表现出抑制前列腺癌的效果（59,60）。 2015年，来自百时美施贵宝（Bristol-Myers Squibb）的一组研究人员开发了BMS1166，一种含羟脯氨酸的小分子抑制剂，靶向PD-1/PD-L1相互作用用于癌症治疗（61）。2023年，Dömling及其同事为该化合物开发了氟脯氨酸类似物，用于18F放射性示踪癌症（图8A）。该氟脯氨酸类似物展示了适合这一应用的实验特性，包括高放射化学纯度和在血清中的长时间稳定性（62）。 图8. 4-氟脯氨酸在药物设计中的多种应用实例（续）。 2023年，来自中国的一个合作团队报道了对SARS-CoV-2主要蛋白酶的优化，并选择了一种含4,4-二氟脯氨酸的候选分子，其活性与已批准的药物奈玛特韦（nirmatrelvir）相当（图8B）。该分子与蛋白酶的共晶结构（PDB条目：8I30）显示，二氟吡咯烷环有助于限制分子的构象（图8C）（63）。 Borics团队修改了莫非肽四肽（Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2），发现将脯氨酸残基替换为4,4-二氟脯氨酸后，得到的激动剂活性约提高了100倍（图8D）。对接研究显示，二氟吡咯烷环增强了与由Trp133、Val143和Ile144残基形成的疏水口袋的结合，这是由于与脯氨酸相比，4,4-二氟脯氨酸具有更高的疏水性（64）。 在2000年代，礼来公司（Eli Lilly）的一组研究人员开发了LY466195，一种竞争性GLUK5选择性卡那酸受体拮抗剂，作为治疗偏头痛的潜力药物。该物质在其结构中加入了4,4-二氟脯氨酸，并表现出当时已知的最高受体活性（图8E）。该化合物的双乙酯也作为前药展现出很高的活性（65）。值得注意的是，许多卡那酸受体拮抗剂采用了各种脯氨酸衍生的结构，因为卡那酸本身就是3,4-二取代脯氨酸（66）。 这些示例展示了氟脯氨酸在药物分子调控中的多面性和适用性。这些修饰可以影响极性、构象特性、对代谢降解的易感性以及化学反应性。值得注意的是，脯氨酸被氟脯氨酸残基替代后，分子量和体积的增加非常有限，这使得它们在筛选活动中具有不可替代的价值。随着研究的推进，预计氟脯氨酸类药物的开发将会增多。因此，回顾氟脯氨酸的一些基本特性显得尤为重要。 2.6. 氟脯氨酸在分子水平上起什么作用？ 尽管提供的示例展示了氟脯氨酸在药物设计中的应用，但原始报告通常对特定氟脯氨酸如何影响分子提供的讨论有限。药物发现报告常常省略了对脯氨酸到氟脯氨酸替代所产生的各种分子效应的详细分析，因为这类深入的分析并不是药物发现活动的主要关注点。然而，了解氟脯氨酸特性的潜在范围，对于未来研究中做出更为明智的决策非常有益。 关于模型化合物和肽类的专门研究表明，氟化会对脯氨酸产生多种影响（67）。具体来说，氟原子稳定了某些吡咯烷环的构象：对于4-单氟脯氨酸，（4S）-异构体稳定C4-内端翘曲，而（4R）-异构体则稳定C4-外端翘曲（23）。相比之下，未取代的脯氨酸和4,4-二氟脯氨酸结构没有表现出翘曲偏好（图9A）（5,68）。这并不意味着在某些特定的结构背景下不能出现非优选的翘曲，但不利的构象会在自由能上产生惩罚（69）。 图9. 4-氟脯氨酸的理化性质。 氟化还会影响脯氨酸的其他性质：它降低了氨基的碱性（图9B），增加了羧基的酸性（图9C），改变了酰胺键对s-trans和s-cis旋转状态的内在偏好（图9D），加速了酰胺键的旋转（图9E），并且改变了脂溶性（图9F）。（67）值得注意的是，单氟化导致的脂溶性降低可能对药物设计应用有所帮助。此外，氟化还影响脯氨酸环与芳香族侧链的堆叠现象——即芳香族-脯氨酸相互作用——这一现象可以通过氟原子增强其受体特性而得到增强（图9G）。（70,71） 最后，一些研究报告指出，氟脯氨酸与酪氨酸残基之间的C–F和O–H键存在共定位现象（图9H）。（54,72）这一相互作用可能提供的结构稳定性尚未完全理解，因此在未来的研究中，监测这类接触类型非常重要。 2.7. 4-羟基脯氨酸的含氟类似物 近年来，脯氨酸残基的氟化在药物化学中得到了探索。缺氧诱导因子α（HIF-α）中的保守Pro402和Pro564残基的羟基化，导致在这些位置形成(4R)-羟基脯氨酸。这一修饰促进了该蛋白质被冯·希佩尔–林道（VHL）泛素连接酶识别，进而将HIF-α泛素化，导致其通过泛素-蛋白酶体系统降解。这一过程对于细胞的氧气感知至关重要。该系统已成为PROTAC剂开发的靶点。这些分子降解剂通常由VHL结合片段、目标蛋白的配体和共价连接器组成。其目的是在一端结合目标蛋白，另一端与VHL泛素连接酶结合后，诱导其依赖泛素的蛋白酶体降解（图10A）。已有超过750个利用这一机制的PROTAC系统被报道，其中一些已进入临床试验。（19-22）小分子结合剂靶向Hyp564位点，其中(4R)-羟基脯氨酸残基对于结合至关重要，且无法与其他结构互换。该残基延伸至连接酶的疏水核心的空隙中，并与结合口袋中的Ser111和His115形成重要的相互作用。（73） 图10. VH032作为PROTAC配体的初步设计及其通过3-氟化改造中心(4R)-羟基脯氨酸残基的工程化。 2014年，Ciulli团队优化了小分子结合剂VH032的结构（图10B）（PDB条目：4W9H），该分子自那时起便被用作众多PROTAC剂中的结构片段。（16）2018年，他们进一步通过引入氟原子对(4R)-羟基脯氨酸残基进行了工程化改造。研究人员合成了一系列4-羟基-3-氟脯氨酸，以增强结合位点的氢键作用（图10C）。令人惊讶的是，氟化对氢键作用几乎没有影响。尽管如此，它改变了吡咯烷环的构象特性，从(4R)-羟基脯氨酸典型的C4-exo结构转变为类似C4-endo的构象。对含氟残基的配体分析表明，(3R,4S)-异构体保持了原始非氟化配体的亲和力，而(3S,4S)-异构体的亲和力则下降了数倍（图10D）。共晶结构（PDB：6GFY）（图10E）表明，这种亲和力的变化是由于电势的改变。针对溴域蛋白的PROTAC降解剂模型中的(3R,4S)-异构体的较高活性得到了证实。（74） 尽管这些结果很有趣，氟化并没有显著增强活性；最多只是保持了原有的活性。然而，一个值得注意的发现是，(3R,4S)-异构体改善了大约2倍的渗透性。这个例子还突显了通过在单个残基内进行多次取代，稳定脯氨酸类似物的其他不利构象的潜力。额外的氟化支撑了4-羟基脯氨酸的非典型构象，导致羟基的赤道定向与常规不同。有趣的是，Krow和Raines在双环脯氨酸类似物中观察到非典型的氟/羟基定向，其中取代基被捕获在通常不利的赤道定向（图10F）。（75）此外，Linclau团队引入了各种3,4-二氟脯氨酸的立体异构体，通过双氟化进一步调控吡咯烷环的拱起（图10G）。（76,77） 3. α-甲基脯氨酸在药物设计中的应用 3.1 Trofinetide（NNZ-2566）的开发 α-甲基脯氨酸是另一种经济实惠的脯氨酸类似物，价格大约为每克几美元（图11A）。普遍认为，α-甲基化能够阻止内源性肽酶对肽骨架的接触，从而增强肽类的生物利用度。几项研究已成功证明了脯氨酸α-甲基化增强代谢稳定性的潜力，解决了肽类作为治疗药物的著名“致命弱点”。此外，α-甲基化还具有其他几种作用，具体内容将在讨论特定案例和物理化学时提及。 图11. α-甲基脯氨酸在药物设计中的应用：Trofinetide的开发。 1987年，Thaisrivongs等人开发了一种含有α-甲基脯氨酸的肾素抑制剂，该抑制剂源自血管紧张素。他们将这种脯氨酸类似物引入到多个肽的N端，最终筛选出一个具有纳摩尔活性的候选分子（图11B）。最显著的是，与其他已知的抑制剂不同，这种新型肽在经过60分钟与胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶或大鼠肝脏匀浆处理后，仍然保持不变，支持了增强抗代谢降解稳定性的理论。此外，体内研究表明，该肽模仿物能够在大鼠中产生期望的剂量依赖性降压反应；然而，其口服生物利用度仍然相对较低。（78） 受到这一策略的启发，新西兰Brimble团队设计了一种短小的神经保护肽——glypromate（Gly-Pro-Glu）。Glypromate最初来源于胰岛素样生长因子-1，这是体内对脑损伤的反应产生的蛋白质，引发复杂的神经介质反应（图11C）。Brimble团队的目标是通过在中心脯氨酸残基上引入α-烷基基团来增强肽的效力。2005年，他们合成了一系列α-烷基化肽（7），并在同年由与该研究团队紧密合作的Neuren公司（新西兰）提交了一个专利申请，展示了含有α-甲基脯氨酸类似物（NNZ-2566）用于治疗神经退行性疾病的潜力（79）。与此同时，西班牙García-López团队也开发了一个含有α-甲基脯氨酸的glypromate类似物，以研究其对谷氨酸受体的活性。然而，他们的研究纯粹是科学探索，最终在得出谷氨酸受体活性与神经保护效应之间未呈现强相关性的结论后放弃了该肽（80,81）。 Neuren公司继续研究glypromate和NNZ-2566（后命名为trofinetide）在治疗脑损伤方面的临床潜力。在他们的药代动力学研究中，结果表明trofinetide在大鼠体内的血浆半衰期（49分钟）明显长于glypromate（<5分钟）。此外，他们还发现，trofinetide可以通过微乳剂有效口服给药，改善大鼠中风后的恢复（8）。自那时以来，trofinetide已进行了一系列临床试验，针对各种脑损伤疾病。2023年3月，它获得FDA批准，以口服溶液的形式治疗一种罕见的神经系统疾病—— Rett综合症。这一例子展示了通过α-甲基化增强代谢稳定性的整体成功。同样的策略也用于daridorexant的开发，尽管结果稍显不确定。 3.2. Daridorexant（ACT-541468） Orexin A和B是神经肽，在调节觉醒和应激反应中起着至关重要的作用。几种作用于orexin受体的拮抗剂药物已经被开发出来用于治疗失眠，如almorexant和suvorexant。2010年代，瑞士Actelion公司的一研究团队开始寻找能够同时拮抗OX1R和OX2R两种orexin受体的双重拮抗剂。他们筛选了约250种化合物，最终发现一种含有脯氨酸的临床候选分子ACT-462206，具有十亿分之一摩尔活性（图12A）。（82）然而，在完成I期临床试验后，ACT-462206的临床开发被终止，该化合物被重新用于动物实验。（6） 图12. Daridorexant的开发。 在随后的优化过程中，研究团队将脯氨酸残基替换为多种类似物，最终聚焦于α-甲基脯氨酸结构。之所以做出这一选择，是因为预期α-甲基化能够增强化学和代谢稳定性，并防止手性中心的外消旋化。（6）进一步优化了邻接的芳香结构后，发现了daridorexant（ACT-541468），它在两种orexin受体上表现出亚纳摩尔活性。（6）该药物在2022年通过FDA批准用于治疗失眠，经过了成功的第三阶段临床试验。 与人类orexin 1型受体的共晶结构（PDB：6TP3）揭示，α-甲基基团被Ala127残基容纳（图12B）。（83）有趣的是，该物质表现出了s-cis酰胺构象，这通常在溶液中对α-烷基脯氨酸是不利的。（84）此外，最近的代谢研究显示，该物质在人体肝微粒体中的清除主要通过细胞色素P450酶进行，后者将吡咯烷环的5位进行羟基化，导致其重新排列为哌啶醇（图12C）。（85）这些发现提出了一个问题：最初选择的α-甲基结构是否确实最优。一个可能更好的脯氨酸类似物骨架可能是5-烷基脯氨酸，它通常更倾向于s-cis酰胺构象（84），并可能阻止主要的氧化代谢途径攻击C5位。 3.3. 其他例子 2009年，Abbott公司的一组研究人员开发了苯并咪唑衍生物ABT-888（veliparib），作为一种多（ADP-核糖）聚合酶抑制剂用于癌症治疗（图13A）。他们特别关注于提高该药物的生物利用度。他们尝试了α-甲基化，并发现它增强了该物质的酶和细胞活性。此外，在小鼠、大鼠、狗和猴子中的药代动力学研究显示，veliparib具有良好的口服生物利用度，且其血浆清除半衰期为1.2至2.7小时，具有较好的前景。（86）在最初报告之后，veliparib已经经历了多次临床试验，且在多种癌症类型上已进入第三阶段临床试验。veliparib与多（ADP-核糖）聚合酶2的催化域的晶体结构揭示，尽管甲基基团没有在结合位点形成疏水性接触，但它有助于创造一个非极性环境，从而增强了与结合口中Tyr473和Glu558的其他极性稳定相互作用（PDB：3KJD）。(87) 图13. α-甲基脯氨酸在药物设计中的应用。 在2020年代，一组来自默克的研究人员优化了一个宏环肽抑制剂，针对前蛋白转化酶 subtilisin-like/kexin类型9（PCSK9）。这种酶是低密度脂蛋白和胆固醇的重要调节因子，也是治疗高胆固醇血症和冠状动脉疾病的临床靶点。研究团队选择了一个包含脯氨酸的候选肽。代谢物鉴定研究显示，脯氨酸-半胱氨酸肽键是小鼠血液中的主要代谢位点。因此，他们将脯氨酸残基替换为α-甲基脯氨酸，以减少对脯氨酸内肽酶的敏感性（图13B）。令人惊讶的是，得到的肽在小鼠中表现出适中的清除率和较短的半衰期，未能抑制代谢降解。然而，α-甲基化却导致了活性意外提高了8倍。晶体结构分析揭示，这一活性提升与α-甲基脯氨酸残基的定位有关，它靠近关键的5-氟色氨酸残基，增强了其在结合口袋中的位置（PDB条目：6XIB）（图13C）。(88) 在进一步的结构优化中，α-甲基脯氨酸残基得以保留，最终开发出了MK-0616（enlicitide），该药物目前正在进行第三阶段临床试验，作为一种口服药物用于治疗各种心血管疾病。（13） 2022年，来自盐野义的一个研究小组旨在开发一种人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）蛋白酶抑制剂。他们发现一个候选的大环结构，具有亚微摩尔的活性，并着重于优化其代谢稳定性。由于怀疑脯氨酸-缬氨酸肽键可能容易降解，他们分别对两种残基进行了甲基化处理。结果发现，脯氨酸残基的α-甲基化使人类T细胞的活性提高了大约10倍，并显著改善了代谢稳定性（图13D）。相比之下，缬氨酸的α-甲基化仅使活性提高了约3倍，并且代谢稳定性改善较小。随后的优化产生了一种包含α-甲基脯氨酸的肽类先导结构，该结构在大鼠药代动力学研究中表现出较高的活性和良好的生物利用度。（89） 总体而言，本节讨论的示例表明，α-甲基化确实是一种直接且有效的策略，用于解决基于脯氨酸的肽类药物中的代谢稳定性问题。然而，需要认识到，α-甲基化也可能影响分子构象和其他性质，其中一些将在下一节中介绍。 3.4. α-甲基化对分子层面的影响 模型研究表明，α-甲基脯氨酸与脯氨酸具有相似的酸碱过渡特性（图14A）。(84) 由于立体原因，α-甲基化导致在肽模型中，s-trans酰胺键构象相较于s-cis构象有显著的固有偏好（图14B），(84,90) 其中s-cis到s-trans酰胺旋转速率加快了约2倍，而s-trans到s-cis的逆向旋转速率则比脯氨酸慢了约3倍。（84）此外，在N-Boc-α-甲基脯氨酸中的碳酸酯旋转速率约比N-Boc脯氨酸慢2倍。（91） 图14. α-甲基脯氨酸的物理化学性质。与脯氨酸的比较见图9。 在模型肽中，α-甲基脯氨酸稳定了γ-转角构象（图14C）。(90) 然而，目前尚不清楚α-甲基化是否会对吡咯烷环的褶皱方式产生内在的偏好。例如，一种模型化合物的晶体结构显示了C4-exo型褶皱（图14D）(92)，而其他结构，如前蛋白转化酶抑制剂（图10F）和达立多沙（daridorexant，图12B），在其与蛋白质结合的形式中分别展示了C4-endo和C4-exo型褶皱。（83,88）一项理论研究也表明，α-甲基脯氨酸的吡咯烷环褶皱的优选方式依赖于二级结构的环境。（93）此外，α-甲基化使小分子模型的亲脂性提高了0.44个logP单位。（84,94） 4. 双环脯氨酸衍生骨架在药物中的应用 双环脯氨酸类药物包括基于脯氨酸骨架的各种桥联、螺环和融合结构。含有这些结构的最大一类药物是从卡托普利（captopril）衍生的抗高血压药物，统称为“—pril”类（ACE抑制剂）。（5）自1990年代以来，几种此类化合物已获得FDA批准用于临床使用，其中包括双环结构的药物（培哚普利、雷米普利、特兰多普利）、含硫药物（螺普利、左氟普利），以及一些双环哌啶酸类衍生物（奎那普利、莫昔普利）（图15A）。这些脯氨酸类衍生物中的桥联和疏水性元素增强了其在ACE结合口袋中的疏水相互作用，从而促进了其作为抑制剂的效能。（95）其他含双环脯氨酸的FDA批准药物包括：萨克拉格列汀（saxagliptin），一种DPP-4抑制剂，于2009年获批用于治疗2型糖尿病（图15B）；（96,97）伊卡替班（icatibant），一种短肽型缓激肽拮抗剂，于2011年获批用于治疗遗传性血管性水肿；（98）替拉普韦（telaprevir）（99）和博奕韦（boceprevir）（100），这两种药物是与NS34A型丙型肝炎蛋白酶催化丝氨酸共价结合的抑制剂，均于2011年获批用于治疗丙型肝炎，但在2015年因更有效的抗病毒治疗方法的出现而停用；利达帕韦（ledipasvir），一种丙型肝炎蛋白酶NS5A的抑制剂，于2014年获批用于治疗丙型肝炎；（101）2023年获批用于治疗新冠肺炎的奈玛特韦（nirmatrelvir），并将在第5节中进一步讨论（图1B）。（10）总体而言，双环分子片段的使用已成为当代药物发现项目中的常规做法。这些结构构建模块已经出现在市售药物中，通常具有较低的成本，因为它们在工业环境中大量生产，因此在药物发现和其他研究中广泛可用（图15C）。 图15. 双环脯氨酸衍生物在药物中的应用。A 从卡托普利衍生的抗高血压药物中的脯氨酸类衍生物。B 其他已批准的药物。C 最具成本效益的双环脯氨酸衍生物及其在专利文献中的出现统计（2024年6月的SciFinder检索结果）。 4.1. 利达帕韦及其他直接作用抗HCV药物 利达帕韦（GS-5885）是一个显著的例子，其药物结构来源于两种不同的双环脯氨酸衍生物，最早由吉利德公司于2014年报道。（101）该药属于NS5A抑制剂类，对抗HCV感染至关重要。NS5A抑制剂的历史可以追溯到2000年代，当时布里斯托尔-迈尔斯·斯奎布（Bristol-Myers Squibb）的一组研究人员在HCV基因型1b复制子上进行了小分子筛选。他们发现了一种具有极高纳摩尔抑制活性的物质，后来发现这一活性是由于自由基重组后形成二聚体。二聚体形式是活性抗病毒剂。（102）这一发现促使开发了一种二聚体药效基，其特点是具有线性寡芳香核的l-脯氨酸残基，且在两端附有相邻的片段（图16A）。（102）这种类似二聚体的结构成为了未来NS5A抑制剂的标志。进一步的优化促使布里斯托尔-迈尔斯·斯奎布开发了达克他韦（daclatasvir，BMS-790052），其中脯氨酸酰胺被咪唑异构体取代。（103）达克他韦于2015年获得FDA批准。 图16. 含有脯氨酸衍生物的HCV NS5A蛋白酶抑制剂的开发。 与此同时，吉利德（Gilead）的一组研究人员正在研究该药效基中的脯氨酸衍生物。他们发现，用哌替啶酸替代脯氨酸，并将脯氨酸-哌替啶酸嵌合物应用于该药效基时，取得了有希望的结果，尤其是后者表现出更好的代谢稳定性，在狗体内的半衰期超过5小时（图16B）。进一步的改进包括用螺环类衍生物替代第二个脯氨酸残基，这导致了利达帕韦（GS-5885）的发现。该药对HCV基因型1a和1b表现出皮摩尔级别的活性，在健康人志愿者体内的半衰期长达45小时。（101）尽管取得了成功，利达帕韦在其他HCV基因型中的效果远不如1a和1b型，这促使后续研究中开发了泛基因型药物及其组合。（104−106） 在利达帕韦发现的同时，默克（Merck）的一组团队开发了艾巴斯韦（elbasvir，MK-8742），该药保留了未改造的脯氨酸环，并于2016年获得FDA批准（图16C）。(107) 艾巴斯韦在多种HCV基因型中展示了皮摩尔到纳摩尔级的活性，使得病毒通过突变形成抗药性更加困难。2016年，团队尝试用衍生物替代脯氨酸环，以增强对可能导致抗药性的HCV基因型变异的活性。他们发现了一种含有单一trans-4,5-美克脯氨酸的分子，相比于未改造脯氨酸的最佳候选分子，其活性有所提高。然而，这种脯氨酸变体仍然在对抗主要的1a基因型时优于该衍生物。（108）在随后的研究中，他们发现了一种优越的候选药物（MK-8325），具有泛基因型抑制谱和优异的药代动力学特性，包含了非双环脯氨酸衍生物，如Silaproline和4,4-二氟脯氨酸。（105）尽管如此，MK-8325在1期临床试验后被停用，转而选择其他泛基因型候选药物，如Ruzasvir（MK-8408），其含有未改造的脯氨酸残基。（104,109） 与此同时，吉利德开发了Velpatasvir（GS-5816）作为一种泛基因型NS5A抑制剂（图17，左）。与主要对HCV基因型1a和1b活性的利达帕韦不同，Velpatasvir对所有六种主要HCV基因型均表现出皮摩尔级的活性。（106）当与索非布韦（sofosbuvir）和由吉利德开发的NS34A丝氨酸蛋白酶抑制剂Voxilaprevir联合使用时，该药物在感染患者中实现了较高的治愈率（图17）。(106,110) 后者含有一个羟基脯氨酸残基，具有背骨-侧链的大环结构，并在脯氨酸的3号位置添加了一个乙基基团，该乙基基团增强了与催化His57残基结合时的范德华相互作用（PDB条目：6NZV）。(110) 图17. 具有泛基因型活性的Velpatasvir、Voxilaprevir和Sofosbuvir混合物对抗HCV。 尽管如此，大多数增强NS5A靶向抗病毒药物的活性和选择性的努力集中在修改中心的多芳香核上，而脯氨酸的改造通常处于次要地位，尽管它们在药物开发中起着重要作用。利达帕韦仍然是临床应用中用于靶向HCV的抗病毒药物之一，尽管近年来其市场份额有所下降。 4.2. 4,5-美克脯氨酸在药物设计中的应用 4,5-美克脯氨酸首次由Hanessian团队于1997年引入。（111）2004年，布里斯托尔-迈尔斯·斯奎布（Bristol-Myers Squibb）的一组研究人员研究了二肽腈类化合物作为DPP-4酶抑制剂，发现一种顺式4,5-美克脯氨酸类似物的效能与未修饰的二肽腈相当，但由于分子内环化较慢，其化学稳定性提高了约1.5倍（图18A）。（96）在随后的研究中，他们将叔-亮氨酸部分替换为基于金刚烷的片段，导致活性增加了10倍。（97）这种分子，即沙格列汀（saxagliptin，BMS-477118），后来被批准用于治疗2型糖尿病，成为这一类药物中的早期代表之一。尽管品牌版本的沙格列汀由于商业原因后来被停产，但几种仿制版本已于2023年获得FDA批准。 图18. 使用4,5-美克脯氨酸的药物开发示例。 结构和生化研究表明，沙格列汀与DPP-4的疏水口袋结合，其美克吡咯烷环与残基Val711、Val656、Tyr662、Tyr666、Trp659和Tyr547相互作用（PDB条目：3BJM）。催化残基H740随后促进了腈基与催化Ser630之间共价键的形成，导致酶失活（图18B）。（112）一旦DPP-4被抑制，它就失去了灭活肠促胰岛素激素的能力，从而刺激胰岛素的释放，进而降低糖尿病患者的血糖水平。2014年，Dong等人评估了沙格列汀的八种立体异构体的DPP-4抑制活性。他们发现，原始的对映体具有皮纳摩尔的活性，而含有trans-4,5-美克脯氨酸的对映体具有微摩尔活性（图18C），其余的立体异构体则是无效的，Ki值超过10 μM。（113） 2016年，诺华公司的一组合作研究小组开发了靶向补体因子D的de novo设计抑制剂，补体因子D是先天免疫反应中的关键酶。（27）抑制因子D可以缓解与免疫过度激活相关的多种病症。该小组采用了碎片化筛选（从52,000个碎片开始）、对接到不同的因子D活性位点、配体观察NMR和共结晶等组合方法，发现了一个含脯氨酸的候选分子。经过广泛的化学优化，得到了一个含有trans-4,5-美克脯氨酸的结构，具有纳摩尔活性（图18D）。与人类补体因子D的共结晶结构揭示，美克桥改善了Ser195、His57和Cys58形成的口袋中的填充（PDB条目：5FCK）（图18E）。最终，他们发现了一种有效阻断替代通路激活并抑制阵发性夜间血红蛋白尿红细胞溶解的化合物。在进一步的研究中，诺华小组继续筛选，并发现trans-4,5-美克脯氨酸和（4R）-氟脯氨酸具有最佳活性。（28）与此相关的丹尼科潘的后续开发，已在2.1节中描述。 2024年，Cytokinetics公司的研究小组报告了选择性心脏肌钙蛋白激活剂nelutroctiv（CK-136）的发现，旨在为患有先天性心脏病等心血管疾病的患者提供治疗。（114）通过高通量心脏肌纤维蛋白ATP酶测定，他们发现了一种化合物，能够以低微摩尔范围内的AC40提高心脏肌纤维蛋白ATP酶速率（图18F）。在随后的优化过程中，他们将中心的l-哌啶酸片段替换为l-脯氨酸，这保持了所需的活性，并显著减少了大鼠和人类肝脏微粒体的代谢清除率。进一步的代谢途径检查显示，脯氨酸环呈现出二级代谢位点。为了解决这个问题，研究小组用其cis-4,5-美克类似物替代了脯氨酸环，从而提高了代谢稳定性。最终化合物CK-136在多项生化测定中表现出良好效果，支持其进入I期临床试验。（114） 4.3. 环状和双环精氨酸酶抑制剂 精氨酸酶的高活性是癌细胞的特征，它们利用这种酶抑制免疫反应。环境中精氨酸的耗竭及其分解产物的积累会对免疫细胞造成损害。2020年代，默克公司的一组研究人员报告了基于脯氨酸的精氨酸酶抑制剂在癌症免疫疗法中的开发。（115,116）他们首先以开放链硼酸抑制剂作为候选结构（图19A），并通过引入分子内桥接来限制其构象，创建出更紧凑的抑制剂分子。在4、5、6成员的氨基酸系列中，基于5成员环（脯氨酸）的结构表现出最高的活性（图19B）。与精氨酸酶的共结晶结构（PDB条目：7K4G）揭示，脯氨酸环没有完全填充结合口袋，为额外的极性取代基提供了空间，从而改善了分子堆积，并促进了与Asp181和Asp183的相互作用（图19C）。随后的筛选发现了具有增强活性的4-氨基酰氨基脯氨酸结构。然而，这些修饰的结构（图19D）在小鼠和大鼠中的生物利用度较差，而生物利用度最好的结构出人意料地是极性较强的，计算的logP值位于-4.0到-1.0的非典型范围内。（115）这些精氨酸酶抑制剂的奇特生物利用度特征可能是由于精氨酸酶是一个细胞外酶，意味着抑制剂无需穿透细胞，但口服吸收仍然很重要，因此偏好极性但分子量较小的结构。 图19. 精氨酸酶1抑制剂在癌症免疫治疗中的开发。 默克公司同一小组做出了一个有趣的发现：他们的抑制剂在酶结合状态下（图19C）表现出脯氨酸环的C4-exo扭曲，这在溶液中通常是不稳定的，根据DFT计算，它仅占构象平衡的2%，而C4-endo扭曲占98%（图19E）。因此，在随后的分子工程工作中，他们合成了一系列基于双环脯氨酸类似物的精氨酸酶抑制剂，旨在通过添加适当的桥接元素来强化所需的C4-exo扭曲。他们发现，在C4-exo替代物中，活性确实如预期那样得到了提高（图19F）。有趣的是，他们还观察到，在一种偏好C4-endo扭曲的结构中，活性也得到了增强（图19G）。晶体结构揭示，在后者的情况下，分子在酶结合形式下采用了C4-exo扭曲，结合通过二级氨基与Asp181和Asp183的有利相互作用得到了增强（PDB条目：7K4K）（116）。这一精巧的设计表明，通过环化来限制构象，可以成为创造有效小分子结合剂的有利策略。 4.4. 双环脯氨酸类似物的分子效应 已有一些关于几种双环脯氨酸类似物的模型研究，尽管这些研究并不是系统性的。在研究的这些类似物中，螺环类似物（图20A，从左第二个）可能是最不起眼的。它在肽链中的酰胺旋转异构体比例、环扭曲构象和酰胺旋转动态方面与脯氨酸有相似之处，尽管它具有更大的空间体积和更高的疏水性。（117）八氢吲哚-2-羧酸，另一种疏水性脯氨酸类似物，具有几个有趣的特征。它的双环结构由一个类似椅形的环己烷环与一个C4-exo脯氨酸环连接，晶体结构中可以观察到这一点（图20B）（118）。这种类似物表现出较高的s-trans酰胺含量，从而稳定了诸如聚脯氨酸-2螺旋等肽链构象。（118）相比之下，将芳香苯环与相同位置的双环连接，则稳定了相反的s-cis酰胺构象（图20A）（119），有利于形成一些不寻常的肽链构象，如聚脯氨酸-1螺旋。（120） 图20. 一些已知的桥接脯氨酸类似物的效应。 顺式和反式4,5-美克脯氨酸在溶液中表现出较高的s-trans酰胺含量（图20A）（121），并且在寡肽的晶体结构中，脯氨酸环呈扁平化，这支持了将环丙烷化脯氨酸类似物设计为“扁平化”脯氨酸的构想（111,122）。Raines和Krow研究了3,5-美克脯氨酸，发现与脯氨酸相比，s-trans酰胺仅略微不稳定。该结构类似于两个融合的C4-扭曲脯氨酸环，功能团的排列与脯氨酸相似（图20C）（75）。这一发现与2,4-美克脯氨酸相反，后者表现出显著的扭曲结构，具体内容将在下一节讨论。此外，桥接在2位和5位之间的脯氨酸类似物，在形成酰胺键时，通常会表现出显著的金字塔化效应（图20D），从而导致酰胺旋转速率的显著加快（123-125）。 4.5. 2,4-Methanoproline的特殊情况 2,4-Methanoproline表现出几个显著的现象。首先，它目前是已知的唯一作为天然产物存在的桥接脯氨酸类似物，某些植物以其自由形式产生（图21A）（126）。第二，这一结构缺乏手性，既不代表L型也不代表D型氨基酸，而是两者的混合体。在形成肽键时，2,4-Methanoproline经历了空间冲突和氮金字塔化的组合，从而导致s-trans/s-cis比率的剧增。这个比率从脯氨酸的个位数跃升到2,4-Methanoproline的约150，与形成二级酰胺的其他氨基酸相当（图21B）（92,127）。此外，酰胺旋转速率增加了约1000倍（92）。进一步的晶体结构揭示，羧基被推离酰胺键平面，重新创造了α-碳原子的某些手性。这从晶体结构中观察到的非零φ-扭曲中可以明显看出（图21C）（92）。 图21. 2,4-美克脯氨酸的一些异常性质。 2,4-Methanoproline的亲脂性表现出一个有趣的异常。2018年，阿斯利康的一个研究小组发现，通过在吗啉和哌嗪环中桥接一个额外的碳原子，尽管增加了碳原子，亲脂性（logD）却出乎意料地降低。他们将这一效应归因于碱性和极性表面积暴露的变化（128）。同年，我们Enamine小组观察到，桥接一个碳原子到吡咯烷中会导致亲脂性（logD）降低。有趣的是，当我们研究2,4-Methanoproline衍生物时，桥接后亲脂性保持不变（图21D）（129）。在另一项模型化合物的实验中，我们发现脯氨酸和2,4-美克脯氨酸衍生物的亲脂性（logP）值相同（图21B）。此外，4位的氟化增加了2,4-美克脯氨酸骨架的亲脂性（图21B），而在脯氨酸中，氟化反而降低了亲脂性（图9F）（84,94）。 2,4-Methanoproline缺乏手性可能会阻碍其在药物化学中的应用，因为它不被视为脯氨酸的直接替代物。然而，这些结构可能作为一种独特的替代骨架有其价值，代表了L型和D型脯氨酸之间的混合体，正如展望部分所讨论的那样。 5. 类似于其他天然残基的脯氨酸基础结构 通常情况下，药物候选分子不应拥有那些未直接参与靶点结合的氢键供体位点，因为过多的氢键供体会降低分子的代谢稳定性和渗透性（12）。N-甲基化是消除此类氢键供体位点的常见策略，尤其是在环肽中（130−132）。另外，用脯氨酸类似物替代氨基酸残基提供了一种减少不必要氢键的有前景的方法（图22A），其应用已报告取得了令人鼓舞的结果。 图22. 使用脯氨酸类似物去除氢键供体位点的策略。MK-0616治疗高胆固醇血症的研发。 2021年，默克的研究小组继续优化之前讨论过的PCSK9大环肽抑制剂（见图13B），以增强其效力和口服生物利用度（88）。在他们早期的工作中，他们发现封闭谷氨酰胺骨架的氮原子对蛋白酶稳定性至关重要，但N-甲基化不利于分子构象，削弱了与靶点的相互作用。为了解决这个问题，他们将谷氨酰胺残基替换为脯氨酸类似物，特别选择了（3S）-羟基脯氨酸。这一修改使酶抑制活性提高了三倍，并增强了在大鼠和猴子中的代谢稳定性（图22B）。与酶的共晶结构证实，谷氨酰胺到脯氨酸的替换保留了关键的相互作用（PDB条目：7S5G）（图22C）（13）。随后的优化结果导致了MK-0616（enlicitide）的发现，这是一种口服可用的PCSK9抑制剂，目前正在进行高胆固醇血症的III期临床试验（图22D）。 另一项利用上述策略的显著近期进展是奈玛特韦（nirmatrelvir），这是首个获批用于治疗COVID-19的药物。在2019-2020年疫情爆发后，辉瑞公司开始寻找有效的抗COVID-19药物。他们以PF-00835231作为领先分子，优化抑制SARS-CoV-2主蛋白酶的活性。在他们的研究中，替换了中央的亮氨酸残基为一个双环脯氨酸类似物（图23A），这导致被动吸收透过性提高了10倍（10）。这一替换并不新颖；类似的替换曾被Schering-Plough用于研发抗丙型肝炎药物boceprevir（图15B），该药物靶向一种丝氨酸蛋白酶（100）。辉瑞的优化工作最终导致了PF-07321332的发现，该分子现在被称为奈玛特韦（nirmatrelvir）（10）。共晶结构揭示，疏水性的脯氨酸类似物占据了一个相同的亲脂性口袋，该口袋由Met49、Met165、His41和Gln189形成，之前被亮氨酸残基占据（图23B）。然而，由于缺乏氢键供体，无法再与Gln189形成氢键（PDB条目：7RFS）。2023年5月，PF-07321332（奈玛特韦）被FDA批准为首个口服COVID-19药物，并与利托那韦联合使用。利托那韦通过抑制细胞色素P450 3A4的代谢作用，提高了奈玛特韦的暴露水平。尽管如此，奈玛特韦的代谢清除特性仍不理想，这一缺点促使辉瑞继续进行进一步优化。 图23. A–H 使用脯氨酸类似物去除氢键供体位点的策略。COVID-19治疗药物的研发。I，帕瑞肽（Pasireotide）作为生长抑素受体抑制剂。 2024年，辉瑞公司报告了PF-07817883（伊布扎特韦，ibuzatrelvir）的研发，这是一种第二代COVID-19药物，具有更好的口服效果和血浆浓度（图23C）（133）。在优化过程中，团队将中央残基替换为多个脯氨酸类似物（图23D）。4-三氟甲基脯氨酸类似物展示了最低的脂溶性，以及在活性和代谢清除方面的良好平衡。优化后的化合物PF-07817883在大鼠中的半衰期大约是其前体奈玛特韦（nirmatrelvir）的两倍（图23E）。这种改进的生物利用度与其晶体形态的增强吸收有关，且这种晶体形态与氨基酰胺的旋转动力学增加相关。具体而言，PF-07817883的水溶性是奈玛特韦的约两倍，且其氨基酰胺的旋转速度约为奈玛特韦的50倍（133）。之前的模型研究还表明，4-三氟甲基脯氨酸的氨基酰胺旋转速率比脯氨酸快2–3倍（图23F）（117）。伊布扎特韦目前正在进行临床试验。已经报道了伊布扎特韦与主蛋白酶的共晶结构，显示三氟甲基基团精确地适配于由His41和Met49形成的S2底物结合口袋中（PDB条目：9BPF）（134）。有趣的是，在辉瑞报告之前，黄博士团队于2023年开发了一种双功能PROTAC分子，靶向SARS-CoV-2主蛋白酶，通过将病毒蛋白酶抑制剂与cereblon配体结合（图23G）。该PROTAC包含4-二氟甲氧基脯氨酸残基，在HEK 293T细胞中展现了亚微摩尔活性（135）。 帕瑞肽（SOM230），是一种源自生长抑素释放抑制因子的肽类药物，是一种参与分泌过程和神经调节的十四肽激素。帕瑞肽由诺华公司在2000年代开发，是一种环状六肽，具有修饰过的羟基脯氨酸残基。在羟基脯氨酸位点添加二氨基乙基氨基甲酰扩展部分，模拟了赖氨酸残基，从而增强了其对多种生长抑素受体类型的抑制活性（136）。帕瑞肽于2012年获得FDA批准，用于治疗库欣病。 在6.2节中将讨论一个有趣的案例，其中在基质金属蛋白酶抑制剂中将二氨基丁酸替换为脯氨酸类似物。总体而言，用脯氨酸类似物替换非脯氨酸残基的策略似乎具有巨大的潜力。 6. 药物设计中的氨基脯氨酸 （4R）-氨基脯氨酸和（3S）-氨基脯氨酸是一些特定生物体中以游离形式存在的天然产物（5）。目前只有4-氨基脯氨酸被广泛应用于药物发现项目，而且其两个对映异构体近年来变得更加经济（图24A）。相比之下，3-氨基脯氨酸异构体仍然相对罕见。4-氨基脯氨酸的正交保护通常涉及双重Boc/Fmoc保护，以及在羧基上的酯化，此外，4-叠氮基脯氨酸也可以通过Staudinger还原反应转化为4-氨基脯氨酸及其衍生物。 图24. 药物设计中的氨基脯氨酸 氨基脯氨酸在药物设计中的典型应用包括天奈格列净（Teneligliptin）和达尼肽（Danegaptide）（图24B）。天奈格列净是一种抗高血糖药物，作为DPP-4抑制剂发挥作用。它由三菱制药公司发现，并已在日本及其他几个国家获得临床使用批准。天奈格列净与人DPP-4结合的晶体结构显示，（4S）-氨基脯氨酸残基处于一种略不利的C4-exo弯曲构象中，吡咯烷环位于Tyr666和Glu205之间，协调次氨基团（PDB条目：3VJK）（图24C）（137）。达尼肽（图24D），最初由Wyeth和Zealand Pharma公司于2000年代发现（138），在2010年代进入了针对初次经皮冠状动脉介入的二期临床试验，但与对照组相比未显示出显著改善。在其他药物设计案例中，氨基脯氨酸主要作为一个方便的残基，用于附加基团、分支和二聚化。从这个角度来看，氨基脯氨酸通常被视为比羟基脯氨酸更极性的版本。 6.1. 含（4S）-氨基脯氨酸的IAC结合剂 第二线粒体源性半胱天冬酶激活因子（SMAC）是一种线粒体蛋白，在释放到细胞质后与凋亡抑制因子（IAP）结合，从而通过半胱天冬酶介导的机制触发程序性细胞死亡（凋亡）。SMAC通过其N端四肽序列与IAP结合，四肽序列为Ala1-Val2-Pro3-Ile4（图25A）。从该四肽衍生出的IAP抑制剂被用来诱导癌细胞的凋亡死亡（139）。这些抑制剂通常包含（4S）-氨基脯氨酸残基，已被证明是一个适合附加其他基团和进行二聚化的位点。采用这种设计的癌症靶向IAP抑制剂已由多个公司开发，例如诺华（Novartis）（140）、Pharmascience（141）、霍夫曼-拉罗什（Hoffman-La Roche）（142）、百时美施贵宝（Bristol-Myers Squibb）（143）等（图25B）。 图25. 来源于SMAC N端结构域的药物相关结构示例 IAP结合剂的另一个应用是用于设计一种特定类别的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）化合物。与脑蛋白（cereblon）和冯·希佩尔-林道蛋白（von Hippel–Lindau）一起，IAP作为一种泛素连接酶，触发与其结合的蛋白质的泛素化，从而导致其随后的蛋白水解降解。靶向IAP的PROTAC化合物统称为“特异性非遗传性IAP依赖蛋白擦除剂”（SNIPERs）（144）。典型的SNIPER结构由一端的IAP配体、另一端的靶蛋白配体以及连接两者的链路器组成。SNIPER的结合导致靶蛋白在细胞内的降解，而这种蛋白质如果不被去除，可能对细胞造成伤害并引发恶性效应。氨基脯氨酸（4S）残基常被用作链路器附着的分支点。引入氨基脯氨酸可以降低原本具有疏水性的IAP结合剂配体的疏水性。例如，2021年，来自葛兰素史克（GlaxoSmithKline）的一个研究小组开发了一种靶向受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2的PROTAC，该蛋白与多种炎症性疾病相关。他们选择了一种具有通过哌啶基团附着的链路器的候选化合物。该候选化合物在大鼠皮下注射后的药代动力学表现良好，但在氧化条件下，特别是在过氧化氢存在下，其半衰期显著下降（图25C）。该小组改变了IAP结合配体，发现基于（4S）-氨基脯氨酸的配体显示出最低的疏水性，并且在大鼠和狗体内具有良好的半衰期（145）。 布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是治疗B细胞恶性肿瘤的靶点。2023年，辉瑞（Pfizer）的一组研究人员研究了一种与BTK共价结合的SNIPER（图25D），这展示了一个独特的共价结合剂示例，能够促进该蛋白的蛋白酶体降解（146）。为了与细胞内IAP结合，他们使用了常用的含（4S）-氨基脯氨酸的配体A410099.1（图25D，虚线框）。 6.2. 基质金属蛋白酶-2（MMP-2）抑制剂 基质金属蛋白酶2（MMP-2）是开发抗癌药物的已知靶点。它是一种锌依赖性的内肽酶，参与降解细胞外基质，这一过程对于癌细胞的迁移至关重要。因此，MMP-2抑制剂被认为是潜在的抗肿瘤药物。2004年，由徐教授（山东，中国）领导的小组筛选了基于4-氨基脯氨酸的MMP-2抑制剂，并发现了LY52（图26A）。该化合物表现出纳摩尔级的活性、可接受的疏水性，并在小鼠静脉注射后抑制了肺肿瘤的生长（147）。2014年，同一小组筛选了（4S）-氨基脯氨酸的磺酰衍生物，并发现了一种具有优越活性的N-磺酰肽类化合物，该化合物在体外酶抑制和人卵巢癌细胞系中均表现出良好的效果（图26B）（148）。2018年，他们设计了具有一氧化氮释放活性的双重MMP-2抑制剂，展示了对多种肿瘤细胞系的广泛抗增殖作用（图26C）（149）。选择（4S）-氨基脯氨酸残基是为了模拟原始胶原底物中存在的4-羟基脯氨酸（148）。此外，氨基脯氨酸有助于在蛋白质的S1′口袋中适当排列取代基，正如在分子对接中观察到的那样（148, 149）。在2010年代，来自意大利的另一个小组基于N-磺酰-4-氨基脯氨酸（d-立体构型）开发了MMP-2抑制剂（图26D）。最佳化合物在体外对MMP-2和MMP-9的活性达到亚微摩尔水平，并通过抑制血管生成减少了黑色素瘤细胞的侵袭（150）。 图26. 含（4S）-氨基脯氨酸的基质金属蛋白酶-2抑制剂在药物化学中的应用 基质金属蛋白酶-2（MMP-2）小分子抑制剂的一个普遍挑战是它们对其他基质金属蛋白酶的广泛活性，这可能在治疗过程中引起不良反应。在2020年代，来自大正制药（Taisho Pharmaceutical）的一组研究人员开发了一种选择性的MMP-2肽类抑制剂，具有出色的亚纳摩尔级活性。然而，实验表明，该化合物在酸性条件下水解不稳定，这对其药物递送提出了重大挑战。为了解决这一问题，他们进行了进一步优化，发现了TP0597850，一种具有高化学稳定性和延长抑制活性的化合物（图26E）。关键的创新在于用（4S）-氨基脯氨酸替代了二氨基丁酸。这一巧妙的修改消除了主要的肽降解途径，例如氨基丁酸残基对前一肽键的亲核攻击以及戊二酰亚胺的形成。同时，（4S）-氨基脯氨酸保留了与酶位点中Glu130的关键静电相互作用，使得该化合物具有较高的预期活性。（151） 6.3. 其他示例 我们还想介绍几个包含4-氨基脯氨酸的生物活性化合物的例子。2013年，来自默克（Merck）的一组研究人员筛选了基于噁唑的磷酸二酯酶抑制剂，发现了一种对4型酶具有优异选择性的化合物（IC50 0.07 nM），而对10型和11型酶的IC50分别为1-6 μM。该化合物在通过吸入给药后对慢性阻塞性肺病显示出良好的治疗前景（图27A）。（152）2023年，吕教授领导的小组开发了双重抑制剂，针对磷脂酰肌醇3激酶和组蛋白去乙酰化酶，作为潜在的抗癌治疗药物。他们结合了已批准抗癌药物的现有结构，包括含有脯氨酸残基的阿帕利西布（alpelisib），该脯氨酸残基被转化为（4S）-氨基脯氨酸，以作为双重抑制剂的连接点（图27B）。领先候选化合物在体外对这两个靶标表现出纳摩尔级活性，并对癌细胞系表现出微摩尔级活性。（153）2023年，Oehler等人基于4-氨基脯氨酸创建了一个DNA编码化学库，包含370万个成员，用于筛选药物相关靶标（图27C）。（154）2024年，Gimenez等人使用4-氨基脯氨酸衍生物附加了各种基团，揭示了黑色素皮质激素受体与一系列配体肽的相互作用的结构信息。（155） 图27. 4-氨基脯氨酸最近应用的其他示例 现有的例子表明，氨基脯氨酸主要作为通过N-酰化作用的附着位点使用。与从羟脯氨酸得到的衍生物相比，氨基脯氨酸形成的酰胺在水解稳定性和极性方面表现得更好。此外，氨基脯氨酸衍生物表现出较弱的内在构象偏倚，正如下一节所讨论的那样。 6.4. 4-氨基脯氨酸的分子效应 与氨基脯氨酸在结构中存在的最显著特征可能是它获得正电荷的能力。最近，(4R)-氨基脯氨酸残基的酸-碱转变在若干肽的背景下被重新审视，揭示了其pKa值为7.5-7.7，接近生理pH（图28A）（156）。这种离子化导致在中性pH下实验性脂溶性的显著波动（图28B）（94）。4-氨基/铵基团还会影响吡咯烷环和肽键的构象，类似于前面第2.6节讨论的氟的效应（图9A）（156）。有趣的是，氨基基团的影响较氟或羟基弱，因为氮的电负性不如氟强。这一点在从脯氨酸到(4R)-氨基脯氨酸再到(4R)-羟脯氨酸的C4-拱形偏好变化中得到了体现，观察到C4-外拱形内容增加（图28C）（156）。氨基基团施加的相对较弱的拱形偏好解释了为何在氨基脯氨酸与蛋白质结合物的晶体结构中，氨基脯氨酸环拱形通常处于非优选状态（例如，PDB条目：3VJK，8DSO）（137,146）。从这个角度来看，氨基脯氨酸的环构象表现出高度的适应性。有趣的是，在(4S)-异构体中，在模型化合物中观察到了一种跨环N–H···O═C氢键，如在N-乙酰基甲基(4S)-铵基脯氨酸的晶体结构中所见（图28D）（157）。 图28. 4-氨基脯氨酸的理化性质 7. 讨论与展望 自2009年以来，FDA已批准至少17种含有脯氨酸类似物的药物结构（图29）。其中，六种药物含有4-羟脯氨酸（分别是icatibant、pasireotide、paritaprevir、grazoprevir、glecaprevir、rezafungin），这是自然界和化学实践中最常见的脯氨酸类似物。此外，六种药物包含了各种双环脯氨酸类似物（分别是saxagliptin、icatibant、telaprevir、boceprevir、ledipasvir、nirmatrelvir）。 图29. FDA在过去15年内批准的含有脯氨酸类似物的药物时间线。 (4R)-羟脯氨酸用浅蓝色标出，双环类似物用酒红色标出，氟脯氨酸用绿色标出。 最近，首批含有2-甲基脯氨酸和4-氟脯氨酸的药物获得了批准。上述文献综述表明，基于脯氨酸类似物的更多药物可能会随之出现。例如，氟脯氨酸提供了一种简单有效的手段来调控脯氨酸残基的构象和电子性质，同时分子体积仅有轻微增加（见第2节）（67）。由于与蛋白质靶点的结合可能涉及脯氨酸基药效团的特定构象，因此氨基酸构象的预组织可以减少与结合相关的熵增成本。类似于4-氟取代的基团提供了一种简单的方法，通过偏向吡咯烷环的构象来提高活性。有趣的是，类似的构象偏倚也可以通过3-氟和4-甲基取代实现，这些取代基根据立体化学不同稳定特定的环形状态（5）。这些修饰还会改变局部的极性和静电特性。 关于酰胺键，(4R)/(4S)-氟、(3R)/(3S)-氟、(4R)/(4S)-甲基以及位置异构的2-/5-甲基脯氨酸对可以将s-trans/s-cis平衡推动至一个方向（图30A）（5）。在筛选过程中尽可能包括这些对的组合，可能有助于阐明生物活性变化的潜在原因。此外，取代基的组合可能会产生更复杂的拱形偏倚（见第2.7节）（74−77），这一概念仍在等待在药物研究中适当的应用。 图30. 脯氨酸类似物在药物设计中的有前景策略 我们还预见到双环脯氨酸类似物将在小分子和肽模仿药物设计中得到进一步探索。尽管市场上已有六种此类药物分子，但我们仍处于探索其调控分子几何形态潜力的早期阶段。脯氨酸的吡咯烷环所施加的构象限制特征表现为狭窄的φ扭曲值范围，通常在−45°到−90°之间。d-脯氨酸对映体则产生相反符号的φ扭曲值，范围从+45°到+90°。如2,4-美噻烯脯氨酸和2,5-乙烯脯氨酸等桥联结构消除了这种手性，导致φ角度范围收窄至±0°附近（92,123）。此外，逐渐增大的桥结构可能允许占据中间扭曲值（图30B）（158）。 许多其他双环脯氨酸类似物可用于限制分子构象，从而创造饱和的三维形状脯氨酸替代物。通常，最理想的结构是原子数较少的那些，它们不会显著增加分子量或体积。从这个角度看，基于2-氮杂双环[2.1.0]戊烷骨架的脯氨酸类似物，特别是具有2,4或3,5连接的结构尤其具有吸引力（图30C）。2023年，Chang等人报告了通过水解脯氨酸衍生物的分子内环化合成该类结构的首个2,4连接体（图30D）（159）。这种氨基酸很快进入了商业市场。具有3,5连接的结构在1970年代末被描述为由链霉菌（Streptomyces zaomyceticus）产生的具有抗生素活性的天然产物（160,161）。然而，其合成方法仍不明确，且目前没有化学供应商提供该物质。 最小的桥联脯氨酸类似物被称为美噻烯脯氨酸。在所有可能的美噻烯脯氨酸中，只有2,5-美噻烯脯氨酸尚未被发现（图30E）。它的同分异构体2,5-乙烯脯氨酸（158）和2,6-美噻皮可氨酸（162）分别在1990年代和2010年代被描述，并已出现在多个专利中。 我们还想提到二氟化脯氨酸美噻烯类似物（图30F）（163,164），它们偶尔在药物化学领域出现（165,166）。在我们看来，它们具有一定的潜力，因为母体美噻烯脯氨酸骨架已被纳入药物结构中。 其中一个最有趣的结构如图30G所示。该结构代表了已知的唯一一个氨基酸，其中氟原子与氨基基团处于邻位。该化合物最近由我们小组合成，并将在适当时候报告。与此同时，它已经可以从我们以及其他供应商处购买。与化学直觉认为邻氟胺可能不稳定不同，这种物质作为游离氨基酸保持稳定，并且可以常规方式进行酰化形成N-酰基衍生物。这种意外的稳定性源于氟原子位于桥头原子上，这表明该化合物可能还具有独特的化学特性，可能在药物化学中具有潜在的应用。 我们相信，替代天然氨基酸残基的嵌合氨基酸探索将继续，特别是在替代极性或带电的氨基酸残基时。例如，在阳离子脯氨酸骨架中，市售的构建块允许调节侧链氨基相对于主链的位置和距离，以及由吡咯烷环的拱形或连接氨基与脯氨酸环的链连接类型所定义的构象限制程度（图30H）。这种策略已经在双环硼酸精氨酸酶抑制剂中得到了验证（见第4.1节），并取得了非常有前景的结果（116）。在本文修订过程中，Hanessian小组报道了几种双环氨基脯氨酸类似物，可能有助于探索这种类型的分子设计（167）。 我们预期，随着伊布曲普韦（ibuzatrelvir）的问世，含有三氟甲基基团的更多结构将成为未来药物候选物。值得注意的是，α-三氟甲基脯氨酸可以被视为α-甲基脯氨酸的改进版：它更具脂溶性，体积更大，并且对形成s-trans酰胺具有更高的构象偏倚（图31A）。鉴于α-甲基化策略的成功（见第3节），将三氟甲基和二氟甲基类似物纳入筛选是合理的。然而，由于氟化基团的立体和电子效应会导致合成中主链基团的失活，这在一定程度上阻碍了其应用，至今只有少数研究报告了其使用。最近，Brigaud小组通过开发创新方法解决了这一问题，使α-三氟甲基脯氨酸能够被引入肽链的不同位置（168,169），我们希望这些方法能够引起药物化学家的关注并得到应用。 图31. 一些含氟烷基的脯氨酸类似物 4-三氟甲基脯氨酸和4-三氟甲氧基脯氨酸是另外两种有前景的脯氨酸类似物。值得注意的是，这些结构表现出相反的拱形偏向（图31B）。虽然(4S)-三氟甲基脯氨酸偏好C4-外拱形（170），但最近的研究表明，(4S)-三氟甲氧基脯氨酸则偏好C4-内拱形（171）；尽管如此，这两种氨基酸的脂溶性几乎相同（133,171）。其他位置异构体，如3-三氟甲基脯氨酸（172）和5-三氟甲基脯氨酸（173-175），以及3-五氟乙基脯氨酸（图31C）（172），最近已被合成，但在药物化学领域的研究较少。当然，市场上已经有更多的含氟烷基脯氨酸类似物被描述，特别是在含氟的双环氨基酸中。总体而言，含氟烷基和氟烷氧基的脯氨酸类似物在药物设计中非常适用，考虑到它们在取代基类型、位置以及对构象、脂溶性和蛋白水解稳定性等方面的多样性（84,170,171,176）。 总体来说，尽管现代药物中有许多脯氨酸类似物的例子，我们对它们真正潜力的探索仍然只是刚刚开始。通过将前沿的合成化学与深入的物理化学知识结合，并与当代药物设计方法相结合，我们可以期待在未来发现新的药物。 我们想指出，本文只涵盖了一些选定的脯氨酸类似物，主要关注几种取代和桥联结构。脯氨酸类似物的化学空间可以通过包括吡咯谷氨酸（177）以及其他环状氨基酸结构（如皮可氨酸）进一步扩展，后者也是天然和合成源的生物活性化合物中的常见结构片段，有时也被视为脯氨酸类似物。此外，含杂环的脯氨酸类似物，通常称为伪脯氨酸，是另一类有前景的类似物。关于伪脯氨酸的进一步阅读，我们推荐Knah等人最近的优秀综述（178）。 参考文献： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c01987

Consolidated net revenue of € 1,743.1 million in the first nine months, +12.0% or +9.3% on a like-for-like basis(3) and at constant exchange rates (CER)EBITDA(1) of € 665.7 million, +11.8%, revenue margin of 38.2% Adjusted net income(2) of € 445.4 million, +9.5% Net income of € 338.4 million, +11.1% Free cash flow(4) at € 434.3 million, +€ 42.5 million vs prior yearNet debt(5) at € 1,317.3 million, just below 1.6x EBITDAFinancial targets for FY 2024 confirmed, excluding any potential contribution from Enjaymo® Global Rare Diseases business to be further strengthened by announced agreement with Sanofi to acquire the global rights to Enjaymo®; deal expected to close by end of 2024, subject to regulatory approvals Isturisa®approved in China for the treatment of adult patients with Cushing syndromeResolution to distribute an interim 2024 dividend of € 0.60 per shareApproval of a new share buy-back program to service the stock option and performance shares plans Milan, November 8th, 2024 – The Board of Directors of Recordati S.p.A. approved the Group’s Interim Report on 30th September 2024, representing additional voluntary financial reporting (6). The Report was prepared using the assessment, measurement and recognition criteria prescribed by international accounting standards (IFRS). The Group’s Interim Report dated 30th September 2024 will be available on 11th November at the company’s offices and on the company’s website (www.recordati.com) and can also be viewed on the authorized storage system 1Info (www.1Info.it). Rob Koremans, Chief Executive Officer of Recordati, commented: “During the first nine months, we delivered double-digit revenue and profit growth, reflecting the strong performance across the business with more patients benefiting from our therapies. These results reflect the continued commitment of all our people, who are instrumental to our success. With a positive outlook for the remainder of the year, we are well positioned to achieve our upgraded financial objectives for FY 2024. Together, we will continue to build on our momentum and create lasting value for our stakeholders. “I am also pleased to highlight our recent agreement with Sanofi to acquire the global rights to Enjaymo®, the only approved treatment option for patients with cold agglutinin disease. This transaction will reinforce our strong commitment to serving patients with rare diseases and is a strong strategic fit to our portfolio, bringing a product with a robust profile, supported by a strong team, with attractive financial contributions expected on both the top and bottom lines.” Financial highlights Consolidated net revenue for the first nine months of 2024 was € 1,743.1 million, up 12.0% versus the first nine months of 2023 or 9.3% on a like-for-like(3) basis at CER. This was driven by strong business momentum across both Specialty & Primary Care and Rare Diseases. The adverse FX impact for the first nine months of 2024 was € 35.9 million (-2.3%), mainly driven by the devaluation of the Turkish lira, particularly in the first and third quarters, which was compensated by high price inflation in Türkiye. Specialty & Primary Care revenue totaled € 1,094.4 million in the first nine months of 2024, growing 11.1% or 6.5% on a like-for-like(3) basis at CER (+2.6% excluding Türkiye). This reflects a particularly strong performance from the Urology franchise with 51.4% growth versus the previous year, driven by the double-digit growth of Eligard® and the € 82.9 million contribution of Avodart® and Combodart®/Duodart®(7) (versus € 3.8 million in the third quarter of 2023). The Cardiovascular and Gastrointestinal franchises remained resilient and delivered slight growth, while the Cough and Cold business reflected solid in-market performance in the context of a softer flu season as compared to the previous year.Rare Diseases revenue totaled € 605.6 million in the first nine months of 2024, up 14.1% as compared to the first nine months of 2023, or 14.5% at CER, driven by the key growth franchises of Oncology and Endocrinology which continue to show substantial further growth potential. The Endocrinology franchise achieved net revenue of € 239.4 million, an increase of 36.0% and reflecting the continued strong performance of Isturisa® and double-digit growth of Signifor®. The Oncology franchise achieved net revenue of € 175.9 million, an increase of 17.1%, driven by double-digit growth from both Qarziba® and Sylvant®. The Metabolic franchise achieved net revenue of € 190.2 million, a decrease of 6.9%, mainly due to generic competition for Carbaglu® in the US and EMEA, with growth in other international markets. Adjusted operating income(8) was € 539.5 million for the first nine months of 2024, up 9.7% over the previous year, and 31.0% of net revenue versus 31.6% in the same period last year. Operating income was € 504.1 million in the first nine months of 2024, up 14.9% over the first nine months of 2023, absorbing gross margin-related non-cash charges of € 28.1 million (versus € 47.2 million in first nine months of 2023), arising from the unwind of the fair value step up of the acquired rare oncology inventory. Non-recurring costs were € 7.3 million in the first nine months of 2024, versus € 5.4 million in the first nine months of 2023, which includes € 2.5 million related to the agreement with Sanofi for the global rights to Enjaymo®.EBITDA(1) was € 665.7 million for the first nine months of 2024, up 11.8% compared to the first nine months of 2023, with margin of 38.2% of net revenue, in line with the previous year. Strong revenue and operating leverage were, in part, offset by a reduction in adjusted gross profit margin due to the consolidation of Avodart® and Combodart®/ Duodart® and product mix.Financial expenses were € 62.3 million, up by € 13.3 million compared to the previous year, including € 2.8 million in FX losses (mostly unrealized, compared to losses of € 0.3 million in the first nine months of 2023) and € 3.9 million of net monetary losses from hyperinflation accounting (compared to a gain of € 1.8 million in the first nine months of 2023). Adjusted net income(2) was € 445.4 million, 25.6% of revenue, up by 9.5% compared to the same period of 2023, with higher adjusted operating income partially offset by an increase in financial expenses and a higher tax rate, following a statutory tax rate increase in some countries. Net income was € 338.4 million, 19.4% of revenue, an increase of 11.1% versus first nine months of 2023, with the higher tax rate and financing expenses offsetting the higher operating income. Free cash flow(4) was € 434.3 million for the first nine months of 2024, an increase of € 42.5 million versus the the first nine months of 2023, driven by higher EBITDA which was slightly offset by higher interests and income taxes paid. Net debt(5) as of 30th September 2024 was € 1,317.3 million, or leverage of just below 1.6x EBITDA(6), compared to net debt of € 1,579.4 million on 31st December 2023. Shareholders’ equity was € 1,876.1 million. Pipeline and Corporate Development The Isturisa® new drug application (NDA) was approved by the China National Medical Products Administration (NMPA) in September for the treatment of adult patients with Cushing syndrome. On October 4th, the Group announced an agreement with Sanofi to acquire the global rights to Enjaymo®, a biologic which is the only approved targeted product for the treatment of cold agglutinin disease (CAD), a rare B-cell lymphoproliferative disorder. In 2022, Enjaymo® was granted approval by the U.S. Food and Drug Administration (FDA), the European Commission (EC) and the Japanese Ministry of Health, Labor and Welfare. Enjaymo® generated approximately € 100 million in revenue over the last 12 months as of August 2024 and is expected to generate revenue in excess of € 150 million in FY 2025, with peak sales potential of € 250-300 million. The transaction is expected to be immediately accretive at the EBITDA level, with margin above the current Rare Diseases average as of 2025. Under the terms of the agreement, Recordati will make an upfront payment of US$ 825 million and additional commercial milestone payments of up to US$ 250 million if net sales reach certain thresholds at or above the top end of peak year sales expectations. The transaction is expected to close by the end of 2024, subject to regulatory clearances (see also press release issued on October 4th 2024). The deal will be funded by existing cash and new committed bank debt facilities. Business outlook Thanks to continued strong momentum, the Group is on track to deliver the targets for FY 2024 as adjusted upward on July 30th (excluding any potential contribution from Enjaymo®): Net revenue between € 2,300 and € 2,340 millionEBITDA(1) between € 845 and € 865 million; margin of +/- 37%Adjusted net income(2) between € 560 and € 580 million; margin of +/- 24.5%Minimal contribution expected from Enjaymo®, subject to timing of regulatory approvals Additional resolutions Interim dividend 2024 The Board of Directors passed a resolution to distribute an interim 2024 dividend to shareholders of € 0.60 (gross of tax withholdings) per share outstanding at the ex-dividend date, thus excluding treasury stock held in the Company’s portfolio on that date. The 2024 interim dividend will be payable as of 20th November 2024 (record date 19th November 2024), with coupon no. 34, to shareholders registered on 18th November 2024. The Independent Auditor EY S.p.A. has issued the opinion required by Art. 2433 – bis, paragraph 5 of the Italian Civil Code, which is available at the company’s offices. The Directors’ Report and Recordati S.p.A. financial statements as of 30th June 2024, based on which the latter’s Board of Directors resolved the distribution of the interim dividend, are available at the company’s office and website (www.recordati.com), and can also be viewed on the authorized storage system 1Info (www.1Info.it). Limited assurance on sustainability reporting In compliance with the Italian Legislative Decree No. 125/2024 – transposing in Italy the EU Directive No. 2022/2464 on Corporate Sustainability Reporting (so called “CSRD”) – the Board of Directors, upon proposal of the Board of Statutory Auditors, has resolved to integrate – starting from this financial year 2024 - the mandate for activities regarding the limited assurance attestation on sustainability reporting, set forth by the aforementioned decree, to Ernst & Young S.p.A., by extending to such activities the current engagement granted by the Shareholders Meeting held on 29th April 2020 with respect to the attestation of the non-financial disclosure. Appointment of the new Financial Reporting Officer pursuant to art.154-bis of TUF The Board of Directors has appointed, until revocation and upon favourable opinion of the Board of Statutory Auditors Niccolo Giovannini - VP Group Finance, reporting to Luigi La Corte, Group Chief Financial Officer - as Financial Reporting Officer pursuant to art.154-bis of TUF and art.25 of the Articles of Association. The appointment is effective as of today, following the approval of Group’s Interim Report on 30th September 2024. Approval of a new share buy-back program to service the stock option and performance shares plans Today, the Board of Directors has also approved the launch of a new share buy-back program under art. 5 of (EU) Regulation no. 596/2014 for a maximum of 1,500,000 ordinary shares with a maximum cash outlay of € 90,000,000. This implements the resolution adopted by the Shareholders’ meeting held on 22nd April 2024 to purchase Recordati ordinary shares in order to service current and future stock option/performance shares plans in favour of the Recordati Group’s management or share-based incentive plans that might be approved by the Company in the future. All details required by the applicable regulations on the launch of the share buy-back program - whose start is envisaged on 12th November 2024 until 15th April 2025, following the end of the current buyback programme envisaged by 11th November 2024 as announced on 9th May 2024 - will be included in a specific press release that will be issued according to law and to which reference is made. (1) Net income before income taxes, financial income and expenses, depreciation, amortization and write-downs of property, plant and equipment, intangible assets and goodwill, non-recurring items and non-cash charges arising from the allocation of the purchase price of EUSA Pharma to the gross margin of acquired inventory according to IFRS 3. (2) Net income excluding the amortization and write-down of intangible assets (except software) and goodwill, non-recurring items, non-cash charges arising from the allocation of the purchase price of EUSA Pharma to the gross margin of acquired inventory pursuant to IFRS 3, and monetary net gains/losses from hyperinflation (IAS 29), net of tax effects. (3) Pro-forma growth calculated excluding revenue of Avodart® and Combodart®/ Duodart® for both 2024 and 2023.(4) Total cash flow excluding financing items, milestones, dividends, purchases of treasury shares net of proceeds from exercise of stock options.(5) Cash and cash equivalents, less bank debts and loans, which include the measurement at fair value of hedging derivatives. (6) Please note that Italian Legislative Decree 25/2016, which implements Directive 2013/50/EU, no longer stipulates the submission of an interim management report, which was previously required in terms of paragraph 5 of Art. 154- ter of Italian Legislative Decree 58/1998.(7) Trademarks are owned by or licensed to the GSK group of companies. Transition of commercialization effectively concluded.(8) Net income before income taxes, financial income and expenses and non-recurring items, non-cash charges arising from the allocation of the purchase price of EUSA Pharma to the gross margin of acquired inventory according to IFRS 3. Conference Call Recordati will host a conference call today, November 8th at 4:00 p.m. CET (3:00 p.m. GMT) to present the results for the first nine months of 2024. The dial-in numbers for the conference call service are: Italy + 39 02 802 09 11, toll free 800 231 525UK + 44 1 212818004, toll free (44) 0 800 0156371USA +1 718 7058796, toll free (1) 1 855 2656958France +33 1 70918704Germany +49 6917415712 Participants are invited to dial in 10 minutes before conference time. If conference operator assistance is required to connect, please dial *0. The slides that will be referenced during the call will be available at www.recordati.com under Investors/Company Presentations. The audio conference live webcast will also be available at the following link Recordati is an international pharmaceutical group listed on the Italian Stock Exchange (XMIL: REC), with roots dating back to a family-run pharmacy in Northern Italy in the 1920s. We are uniquely structured to provide treatments across specialty and primary care, and rare diseases. Our fully integrated operations span clinical development, chemical and finished product manufacturing, commercialization and licensing. We operate in approximately 150 countries across EMEA, the Americas and APAC with over 4,450 employees. We believe that health is a fundamental right, not a privilege. Today, our purpose of “unlocking the full potential of life” aims at empowering individuals to live life to the fullest, whether addressing common health challenges or the rarest. Investor Relations Eugenia Litz +44 7824 394 750 investorelations@recordati.itGianluca Saletta +39 348 979 4876 investorelations@recordati.itMedia Relations ICR Healthcare US:Alexis Feinberg +1 203 939 2225 recordatiuspr@westwicke.com UK, Europe & Rest of World:Jessica Hodgson +44 7561 424 788recordati@consilium-comms.com This document contains forward-looking statements relating to future events and future operating, economic and financial results of the Recordati group. By their nature, forward-looking statements involve risk and uncertainty because they depend on the occurrence of future events and circumstances. Actual results may therefore differ materially from those forecast for a variety of reasons, most of which are beyond the Recordati group’s control. The information on the pharmaceutical specialties and other products of the Recordati group contained in this document is intended solely as information on the activities of the Recordati Group, and, as such, it is not intended as a medical scientific indication or recommendation, or as advertising. RECORDATI GROUP Summary of the consolidated results,prepared in accordance with International Financial Reporting Standards (IFRS)(€ thousands) INCOME STATEMENTFirst nine months 2024First nine months 2023Change %NET REVENUE1,743,0811,556,17412.0Cost of sales(556,171)(490,495)13.4GROSS PROFIT1,186,9101,065,67911.4Selling expenses(360,709)(345,506)4.4Research and development expenses(204,849)(182,239)12.4General and administrative expenses(110,014)(93,630)17.5Other income/(expenses), net(7,240)(5,553)30.4OPERATING INCOME504,098438,75114.9Financial income/(expenses), net(62,319)(49,054)27.0PRE-TAX INCOME441,779389,69713.4Income taxes(103,379)(85,205)21.3NET INCOME 338,400304,49211.1Adjusted gross profit (1)1,214,9861,113,1679.1Adjusted operating income (2)539,518491,6089.7Adjusted net income (3)445,361406,5669.5EBITDA (4)665,666595,57311.8Net income attributable to: Equity holders of the Parent338,400304,49211.1Non-controlling interests00n.s.EARNINGS PER SHARE (euro) Basic(5)1.6401.48110.7Diluted(6)1.6181.45611.1(1) Gross profit adjusted from impact of non-cash charges arising from the allocation of the purchase price of EUSA Pharma to the gross margin of acquired inventory according to IFRS 3. (2) Net income before income taxes, financial income and expenses, non-recurring items and non-cash charges arising from the allocation of the purchase price of EUSA Pharma to the gross margin of acquired inventory according to IFRS 3.(3) Net income excluding amortization and write-downs of intangible assets (except software) and goodwill, non-recurring items, non-cash charges arising from the allocation of the purchase price of EUSA Pharma to the gross margin of acquired inventory (IFRS 3) and monetary net gains/losses from hyperinflation (IAS 29), net of tax effects.(4) Net income before income taxes, financial income and expenses, depreciation, amortization and write-downs of property, plant and equipment, intangible assets and goodwill, non-recurring items and non-cash charges arising from the allocation of the purchase price of EUSA Pharma to the gross margin of acquired inventory according to IFRS 3.(5) Earnings per share (EPS) are based on average shares outstanding during the respective period, 206.299.160 in 2024 and 205.421.410 in 2023. These amounts are calculated deducting treasury shares in the portfolio, the average of which was 2.825.996 shares in 2024 and 3.703.746 shares in 2023.(6) Diluted earnings per share is calculated by taking into account rights granted to employees.COMPOSITION OF NET REVENUEFirst nine months 2024First nine months 2023Change % Total revenue1,743,0811,556,17412.0 Italy258,631234,30410.4 International1,484,4501,321,87012.3 RECORDATI GROUP(€ thousands) Reconciliation of Net income to EBITDA(1) First nine months 2024First nine months 2023Net income338,400304,492Income taxes103,37985,205Financial income/(expenses), net62,31949,054Non-recurring expenses7,3445,369Non-cash charges from PPA inventory uplift28,07647,488Adjusted operating income(2)539,518491,608Depreciation, amortization and write-downs126,148103,965EBITDA(1)665,666595,573 Reconciliation of Net income to Adjusted Net income(3) First nine months 2024First nine months 2023Net income338,400304,492Amortization and write-downs of intangible assets(excluding software)100,15781,180Tax effect(22,619)(17,405)Non-recurring operating expenses7,3445,369Tax effect(1,943)(1,340)Non-cash charges from PPA inventory uplift28,07647,488Tax effect(7,019)(11,881)Monetary net (gain)/losses from hyperinflation (IAS29)3,900(1,759)Tax effect(935)422Adjusted net income(3)445,361406,566 (1) Net income before income taxes, financial income and expenses, depreciation, amortization and write-downs of property, plant and equipment, intangible assets and goodwill, non-recurring items and non-cash charges arising from the allocation of the purchase price of EUSA Pharma to the gross margin of acquired inventory (IFRS 3).(2) Net income before income taxes, financial income and expenses, non-recurring items and non-cash charges arising from the allocation of the purchase price of EUSA Pharma to the gross margin of acquired inventory (IFRS 3).(3) Net income excluding amortization and write-downs of intangible assets (except software) and goodwill, non-recurring items, non-cash charges arising from the allocation of the purchase price of EUSA Pharma to the gross margin of acquired inventory (IFRS 3) and monetary net gains/losses from hyperinflation (IAS 29), net of tax effects. RECORDATI GROUPSummary of the consolidated results, prepared in accordance with International Financial Reporting Standards (IFRS)(€ thousands) ASSETS30.09.202431.12.2023Property, plant and equipment187,848178,657Intangible assets1,847,7041,938,197Goodwill789,123778,350Other equity investments and securities16,86521,555Other non-current assets13,87112,458Deferred tax assets92,56776,674TOTAL NON-CURRRENT ASSETS2,947,9783,005,891 Inventories410,107404,831Trade receivables474,514445,193Other receivables102,46699,401Other current assets26,78219,924Derivative instruments measured at fair value6,71011,079Cash and cash equivalents235,020221,812TOTAL CURRENT ASSETS1,255,5991,202,240TOTAL ASSETS4,203,5774,208,131 RECORDATI GROUPSummary of the consolidated results, prepared in accordance with International Financial Reporting Standards (IFRS)(€ thousands) EQUITY AND LIABILITIES30.09.202431.12.2023 Share capital26,14126,141Share premium reserve83,71983,719Treasury shares(139,881)(127,970)Reserve for derivative instruments(2,180)(286)Translation reserve(301,627)(264,700)Other reserves61,53761,219Profits carried forward1,809,9971,636,451Net income338,400389,214Interim dividend0(117,396)Shareholders’ equity attributable to equity holders of the Parent1,876,1061,686,392Shareholders’ equity attributable to non-controlling interests00TOTAL SHAREHOLDERS’ EQUITY1,876,1061,686,392 Loans - due after one year1,264,8841,353,216Provisions for employee benefits21,40521,239Deferred tax liabilities134,488144,208TOTAL NON-CURRENT LIABILITIES1,420,7771,518,663 Trade payables276,907263,979Other payables198,213174,407Tax liabilities100,73867,110Other current liabilities4,6165,307Provisions for risks and charges19,24116,596Derivative instruments measured at fair value14,21219,993Loans - due within one year270,337355,752Short-term debts to banks and other lenders22,43099,932TOTAL CURRENT LIABILITIES906,6941,003,076TOTAL SHAREHOLDERS’ EQUITY AND LIABILITIES4,203,5774,208,131 RECORDATI GROUPSummary of consolidated results prepared in accordance with International Financial Reporting Standards (IFRS) (€ thousands) CASH FLOW STATEMENTFirst nine months 2024First nine months 2023OPERATING ACTIVITIES Net income338,400304,492Income taxes103,37985,206Net interest54,41848,158Depreciation of property, plant and equipment24,00321,577Amortization of intangible assets97,59182,304Write-downs4,55484Equity-settled share-based payment transactions10,1207,515Other non-monetary components41,06955,772Change in other assets and other liabilities(11,985)(20,538)Cash flow generated/(used) by operating activities before change in working capital661,549584,570Change in: - inventories(41,813)(31,681)- trade receivables(36,418)(73,753)- trade payables14,22330,082Change in working capital(64,008)(75,352)Interest received4,0073,923Interest paid(64,284)(50,314)Income taxes paid(82,634)(53,282)Cash flow generated/(used) by operating activities454,630409,545INVESTMENT ACTIVITIES Investments in property, plant and equipment(21,743)(17,998)Disposals of property, plant and equipment1,385329Investments in intangible assets(15,377)(345,597)Disposals of intangible assets2,351287Sale of non-current assets held for sale2,0003,000Cash flow generated/(used) by investment activities(31,384)(359,979)FINANCING ACTIVITIES Opening of loans144,872348,256Repayment of loans(320,185)(214,701)Payment of lease liabilities(8,311)(8,116)Change in short-term debts to banks and other lenders(71,722)(45,008)Dividends paid(130,220)(129,071)Purchase of treasury shares(78,087)(6,483)Sale of treasury shares52,74419,681Cash flow generated/(used) by financing activities(410,909)(35,442)Change in cash and cash equivalents12,33714,124Opening cash and cash equivalents221,812284,734Currency translation effect8713,422Closing cash and cash equivalents235,020302,280 DECLARATION BY THE FINANCIAL REPORTING OFFICERThe Financial Reporting Officer, Luigi La Corte, declares, pursuant to paragraph 2 of Article 154-bis of the Consolidated Law on Finance, that the accounting information contained in this press release corresponds to the Company’s documentation, books and accounting records.