Deoxycholic Acid

最新文献解读 派言派语   写在前面 慢性胆汁淤积性瘙痒是胆汁淤积类肝病十分棘手的并发症。这类瘙痒区别于普通组胺介导的急性瘙痒，使用传统抗组胺药、糖皮质激素往往收效甚微，会长期折磨患者，严重破坏睡眠质量与日常生活。当前临床上熊去氧胆酸、利福平等对症药物仅能对一小部分患者起到部分缓解效果，始终缺少针对发病机制的靶向治疗方案。现有研究表明，主要表达在人感觉神经元上的 MRGPRX4 G 蛋白偶联受体，是介导胆汁淤积性瘙痒的核心分子，胆汁酸能够激活该受体向下游传递痒觉信号，是止痒新药开发的明星靶点。 鉴于此，2026 年 10 月 12 日成都中医药大学联合四川中医药高等专科学校的研究团队在 《Molecules》上发表研究成果，文章旨在挖掘靶向 MRGPRX4 的小分子先导化合物，为胆汁淤积性瘙痒靶向药物研发提供新候选分子。研究首先基于 MRGPRX4 晶体结构开展分层高通量虚拟筛选，从中药化合物库中筛选候选小分子；借助分子对接、分子动力学模拟评估候选分子与受体的结合能力、构象稳定性与相互作用模式，并完成 ADMET 成药性预测。在仿真计算的基础上，进一步构建 MRGPRX4 稳定过表达细胞模型，通过钙流功能实验、CETSA 与 DARTS 实验验证活性分子的靶点结合与功能抑制效果 图文速览   结果讨论 图 1. MRGPRX4 抑制剂分层虚拟筛选的技术路线 a、三维结构预处理流程示意图 b、逐级虚拟筛选漏斗图 c、经虚拟筛选得到的前五名候选化合物的化学结构式     药物虚拟筛选不是一步到位的计算，而是一套逐级淘汰的漏斗式工作流。本研究整套计算方案如图 1 所示：首先完成受体三维结构预处理，修复蛋白结构、优化质子化状态，搭建可靠的受体模型；随后启动分层虚拟筛选，由粗筛到精筛层层过滤海量化合物；最终从 TCMSP 中药化合物库中，筛选出 5 个综合打分最优的候选分子，得到它们的化学结构，进入后续分子对接验证环节 图 2. 排名前五候选分子与 MRGPRX4 的对接打分及结合模式 a、5 个候选分子以及 MRGPRX4 原始共晶配体的 Glide XP G 打分与 MMGBSA 计算得到的结合自由能（ΔGbind） b–f、6′‑O‑丙二酰大豆苷  b、4‑咖啡酰奎宁酸 c、亚叶酸 (d)、灵芝酸 C6 e、三磷酸腺苷  f、在 MRGPRX4 结合口袋中的三维结合模式（右上子图）与二维配体‑残基相互作用图（右下子图）。（紫色箭头：氢键；绿色线条：π‑π 堆积；红色线条：π‑阳离子相互作用；红蓝线条：盐桥）关键氢键相互作用标注了对应的键长     经过漏斗筛选，5 个候选分子进入高精度 Glide XP 对接评估。研究同时对比候选分子与 MRGPRX4 原始共晶配体的 G 打分以及 MMGBSA 结合自由能，量化分子和受体的结合亲和力。 图 2 展示了每个分子在 MRGPRX4 结合口袋内的三维空间结合姿态，以及二维配体 - 残基相互作用图，直观呈现氢键、π‑π 堆积、π‑阳离子相互作用、盐桥等关键作用力，并且标注了核心氢键键长。从结果能够直观看到，6′‑O‑丙二酰大豆苷与受体之间形成丰富的分子间相互作用，在 5 个候选分子中表现突出 图 3. (a,b) 将共晶配体（PDB 编号 8K4S）重新对接到 MRGPRX4 结合口袋，完成对接方法验证。二维相互作用图展示关键分子间相互作用；重原子 RMSD=2.7 Å（重新对接构象与实验晶体构象之间）     分子对接的结果是否可信，需要先验证对接方案本身。作者采用重对接策略：将 PDB 8K4S 晶体结构中原有的共晶配体提取出来，重新对接到 MRGPRX4 的结合口袋中。对比重对接构象和晶体天然构象，重原子 RMSD 为 2.7 Å，一般 RMSD 小于 3 Å 即认为对接方法可靠。二维相互作用图也证明，重对接后配体依然可以重现晶体中原有的关键分子接触，说明这套对接参数设置合理，后续候选分子的对接结果具备参考价值 图 4. MRGPRX4‑候选分子复合物 50 纳秒分子动力学模拟常规分析结果 a、5 组独立复合物体系中 MRGPRX4 蛋白 Cα 原子的均方根偏差（RMSD） b、MRGPRX4 的回转半径（Rg），用于表征蛋白整体结构紧凑程度 c、MRGPRX4 结合口袋的溶剂可及表面积（SASA） d、MRGPRX4 各氨基酸残基的均方根波动（RMSF），用于评估局部柔性  e–i、模拟过程中 MRGPRX4 分别与 6′‑O‑丙二酰大豆苷 (e)、4‑咖啡酰奎宁酸 (f)、亚叶酸 (g)、灵芝酸 C6 (h)、三磷酸腺苷 (i) 之间稳定氢键的数量     静态分子对接只能捕捉某一瞬间的结合构象，而分子动力学模拟可以观察蛋白 - 配体复合物在水溶液环境下随时间的动态变化。研究对 5 组复合物分别开展 50 ns MD 模拟，使用一系列经典指标评价体系稳定性。 RMSD 反映蛋白骨架整体波动，判断体系是否达到平衡；回转半径 Rg 表征蛋白整体结构紧凑程度；SASA 用来观察结合口袋暴露程度；RMSF 用来定位蛋白各个氨基酸残基的柔性热点；同时统计模拟全程复合物之间稳定氢键数量。综合全部指标，6′‑O‑丙二酰大豆苷体系的蛋白骨架波动更小，结合口袋封闭效果更好，复合物整体动态稳定性优于其余候选分子 图 5. 经主成分分析后 MRGPRX4‑候选分子复合物的吉布斯自由能地貌图（FEL） a、6′‑O‑丙二酰大豆苷复合物 b、4‑咖啡酰奎宁酸复合物 c、亚叶酸复合物 d、灵芝酸 C6 复合物 e、三磷酸腺苷复合物。图中同时给出自由能二维等高线图与三维插值曲面图，蓝色区域代表复合物的低能（构象稳定）构象簇     分子动力学轨迹包含海量构象信息，主成分分析 PCA 可以把高维构象数据降维，绘制自由能地貌图 FEL，用来寻找复合物最稳定的优势构象。 图 5 同时展示二维等高线图和三维插值曲面图，图中蓝色区域代表低能稳定构象簇。5 组复合物均存在明显的低能构象盆地，说明候选分子与 MRGPRX4 结合后，蛋白 - 配体复合物能够收敛到稳定构象状态。其中 6′‑O‑丙二酰大豆苷体系的低能区域集中，构象稳定性表现优异，进一步支撑前面 MD 指标的结论 图 6. 5 个候选化合物的类药性及 ADMET（吸收、分布、代谢、排泄、毒性）预测 a、雷达图对比候选分子的关键理化性质与口服类药性可接受范围，包含分子量（MW）、亲脂性、氢键供体 / 受体、可旋转键及其他拓扑描述符。 b、5 个候选分子的核心 ADMET 预测性质，涵盖肠道吸收、转运体抑制、代谢稳定性及药代动力学参数 c、堆叠柱状图汇总 5 个候选分子在多项临床相关毒性终点下的预测毒性特征     虚拟筛选不能只看结合能力，成药性评估是先导化合物筛选必不可少的一环。作者使用 ADMETlab 3.0 对 5 个候选分子进行计算机毒理与药代预测。 雷达图对比各分子理化参数和口服药物的理想区间；汇总肠道吸收、转运体抑制、代谢稳定性等核心药代参数；堆叠柱状图直观展示多个毒性终点的预测结果。计算结果提示，5 个候选分子基本满足先导化合物类药特征，其中 6′‑O‑丙二酰大豆苷毒性风险最低，并且预测无血脑屏障穿透能力，有望只在外周发挥止痒作用，规避中枢相关副作用。需要注意，ADMET 仅为计算预测，后续仍需要体外实验验证 图 7. MRGPRX4 稳定过表达 HEK293 细胞株的构建与鉴定 a、空载对照质粒 PMT860 的图谱示意图 b、MRGPRX4 重组表达质粒 PSE8284 的图谱示意图  c、抗生素筛选获得的稳定细胞系明场（白光）及红色荧光蛋白（RFP）荧光成像图 d、对照组（HEK293-PMT860）与 MRGPRX4 过表达组（HEK293-PSE8284）稳定细胞株中 MRGPRX4 的定量扩增结果 e,f、目的基因 / 内参基因扩增的 qPCR 熔解曲线，用于验证扩增特异性 g、FLAG 标签 MRGPRX4 蛋白表达的蛋白质免疫印迹（Western blot）验证，以 β- 肌动蛋白（β-actin）作为上样对照。*1：HEK293-PMT860；2：HEK293-PSE8284     计算仿真给出了极具潜力的候选分子，但分子层面的结合不等于细胞水平存在活性。想要开展功能实验，首先需要构建 MRGPRX4 稳定过表达细胞模型。 研究构建空载对照质粒 PMT860 与重组 MRGPRX4 表达质粒 PSE8284；质粒转染 HEK293 细胞，抗生素筛选后通过明场与 RFP 荧光成像观察细胞；qPCR 检测 MRGPRX4 基因表达水平，熔解曲线验证扩增特异性；Western blot 验证带 FLAG 标签的 MRGPRX4 蛋白成功表达，β‑actin 作为上样内参。一系列鉴定结果证明稳定细胞系构建成功，为后续钙流功能实验打下基础 图 8. 脱氧胆酸（DCA）与熊去氧胆酸（UDCA）通过 Gq-PLC 通路触发 MRGPRX4 介导的细胞内钙信号 a、基于 Fluo-4 AM 的细胞内钙流检测实验流程  b、MRGPRX4 下游信号通路示意图  c,d、在第 20 秒给予 10 μM DCA（c）或 UDCA（d）刺激后，具有代表性的钙响应曲线。 e,f、采用 PLC 抑制剂 U73122 预孵育 30 min 后，再给予 DCA（e）或 UDCA（f）刺激所得到的代表性钙响应曲线。 g、DCA 与 UDCA 激活 MRGPRX4 的浓度 - 效应曲线，附带拟合得到的 EC₅₀值     在筛选抑制剂之前，作者先确认 MRGPRX4 激活后的下游信号通路。研究采用 Fluo‑4 AM 钙流检测体系，DCA、UDCA 作为 MRGPRX4 天然激动剂，刺激细胞后可以诱发明显的细胞内钙升高。 提前使用 PLC 抑制剂 U73122 预孵育细胞，DCA/UDCA 诱导的钙信号显著被抑制，证明胆汁酸激活 MRGPRX4 之后，是经由 Gq-PLC 通路触发胞内钙信号。同时作者拟合 DCA、UDCA 激活 MRGPRX4 的浓度‑效应曲线，得到二者 EC₅₀，建立成熟的钙流活性评价体系，用于后续候选分子抑制活性检测 这套研究完整呈现了虚拟筛选→分子模拟→成药性预测→细胞模型构建→体外功能验证的天然产物先导化合物发现完整链路。研究从中药化合物库筛选得到 6′‑O‑丙二酰大豆苷，该分子可直接结合 MRGPRX4，有效抑制胆汁酸诱发的钙信号，是胆汁淤积瘙痒新药开发的优质先导物。 当然文章也存在局限：全部体外实验基于 HEK293 过表达细胞，缺少人原代感觉神经元与人源化动物模型验证；结合模式也还需要定点突变、蛋白共晶结构进一步确认。总体来看，这项工作为 MRGPRX4 靶向止痒药物研发提供了新思路，也为天然来源 GPCR 小分子抑制剂挖掘提供了一套可参考的研究范式 搞学术不秃头发文章更轻松 长按二维码 了解关于分子动力学的一切