Glycerin

1.介绍 哺乳动物的组织由许多不同类型的细胞构成，形成各种器官。它们都源自同一个受精卵，然后分化成具有截然不同特性的细胞，使用相同的遗传信息，却走向非常不同的命运。一个多世纪前，科学家们开始从外植组织中分离细胞。在第1章中，我们简要讨论了使细胞培养成为研究工具和生产宿主的促进性进展，包括培养基的开发及其膜灭菌和细胞胰蛋白酶化和传代。大多数从组织中生长出来的细胞只能被培养几代，但最终有一些细胞成功建立，可以传代许多代。在冷冻保存方法建立后，细胞可以被“储存”以备将来使用，这允许产生对研究和生产至关重要的可复制结果。在细胞培养的早期几十年中建立的大多数细胞都是从肿瘤中衍生的。这些细胞在形态上与从正常组织中生长出来的原代细胞不同。即使是那些最初从正常组织中分离出来并且可以连续传代的细胞，看起来也更像来自肿瘤的细胞。随着对生长因子和细胞外基质的认识的增加，从20世纪70年代开始培养正常和分化的细胞。成体干细胞的分离以及随后小鼠胚胎多能干细胞的分离，与更多生长因子和细胞因子的广泛可用性，开始改变细胞培养的研究格局。20世纪90年代大量生产治疗蛋白的需求改变了我们对细胞的看法。它们现在是生物制造的主要工作马。本章将讨论影响细胞生长和细胞生产蛋白产品能力的细胞结构组成部分的关键方面。 2.组织细胞及其分离 2.1.细胞系、细胞株和衰老 从哺乳动物组织中分离出的绝大多数细胞都是锚定依赖性的，这意味着它们需要表面粘附才能增殖。它们通常通过组织（图2.1）的酶解离来分离。解离后去除未解离的块状物，将细胞种植在与培养基覆盖的兼容表面上。培养基悬浮液中的细胞团附着在表面，并逐渐有一些细胞从组织团中生长出来。随后，细胞延伸其体长，展开，并开始增殖。当它们开始覆盖整个表面积时，生长速率减慢，最终在表面上形成一层“单层”细胞。达到融合后，细胞分裂停止。虽然相邻细胞的细胞体可能会相互交叉，但它们的细胞核永远不会重叠。这被称为细胞生长的接触抑制。接触抑制的细胞可以通过胰蛋白酶处理从表面解离。在更大的表面上重新种植并提供新鲜培养基后，细胞生长恢复，直到再次达到融合。这个过程可以重复以扩大种群。每次解离和扩展称为“传代”。每个传代中发生的细胞倍增数量由分裂比决定，或每次传代中扩展的表面积比（见参考文献1以供进一步阅读）。 图 2.1. 正常二倍体细胞培养中的锚定依赖性和接触抑制。 直接从组织中分离的细胞称为原代细胞（面板2.1）。大多数原代细胞在非常少量的细胞倍增后停止生长。这对于从特殊组织中分离的细胞尤其如此，如肝脏和卵巢。它们通常很快在培养中失去其典型的组织相关特性。体内大多数组织中的细胞是静止的，这意味着它们不分裂（面板2.2）。静止状态不仅仅是由于缺乏生长所需条件的被动结果，例如缺少必需的营养物质。相反，静止状态是由生物体的调节强加于细胞的。例如，我们体内的干细胞大部分时间处于静止状态，这是通过细胞周期调节，通过细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、转录因子和肿瘤抑制因子。从组织外植中生长出来的细胞已经经历了细胞生长控制机制的变化，使其能够在培养中增殖。 在某些情况下，从分离的组织中生长出来的细胞可以连续传代并在许多传代中仍然保持正常的形态和细胞行为。它们甚至可以在液氮中冷冻保存，并被“储存”以备将来的研究、分发或生产目的。然而，这种反复的传代和细胞培养中的扩展不能无限期地继续。最终，会达到衰老。在衰老之前，这些细胞在形态上是正常的。它们的核型是二倍体，即具有两套正常染色体。几乎所有来自哺乳动物组织的正常的二倍体细胞在培养中的寿命都是有限的，胚胎干细胞和诱导多能干细胞除外。与组织细胞相比，癌细胞在体内增殖。它们通常携带多种突变，使它们能够绕过通常会保持它们处于静止状态的生长控制机制。因此，它们更容易从肿瘤组织中分离出来进行体外培养。有时，也可以通过病毒或癌基因转化的“永生化”从正常组织中建立细胞系。那些可以无衰老地连续生长的细胞通常与它们的正常对应物没有相同的形态。它们的核型不是二倍体，它们的增长不受接触抑制。在充足的营养物质和生长因子供应下，它们甚至可以相互叠加形成多层细胞。这样的细胞包括常用的工业细胞系，如来自中国仓鼠卵巢的CHO细胞，来自绿猴肾的Vero细胞，以及人类肾脏细胞HEK293。 在没有使用特殊培养条件来丰富分化细胞的情况下，成纤维细胞是从正常哺乳动物组织中分离出的主要细胞类型。从小鼠胚胎中分离出的成纤维细胞可以在体外培养大约60次倍增（图2.2）。随着这一极限的临近，细胞开始未能达到融合，并最终停止生长。这种衰老，或者说这些细胞增殖潜力的限制，被称为“海夫利克现象”。这是所有正常二倍体细胞（再次，胚胎干细胞和诱导多能干细胞除外）的共同现象，它们来自脊椎动物。 图 2.2. 不同细胞类型的寿命和增长率。 在半个世纪前进行的一项历史性实验中，将小鼠成纤维细胞持续传代超越危机，产生了一小部分幸存者。这些细胞最终生长、扩展，并且可以在体外无限制地连续培养。它们被命名为3T3，因为细胞每三天传代一次，每次在20平方厘米的培养皿中扩展3×10^5个细胞。这些细胞看起来正常，并在典型的培养条件下受到接触抑制。然而，与危机前的鼠成纤维细胞不同，3T3细胞具有异常的非二倍体染色体组。那些屈服于海夫利克限制的细胞（例如，那些是二倍体并且有有限寿命的细胞）被称为“细胞株”。可以在培养中无限生长的细胞被称为“细胞系”，包括那些在危机过后重新建立的，直接来自正常或肿瘤组织。一般来说，细胞系是非整倍体的（没有正常的染色体组）。 因此，受衰老影响的细胞似乎“计数”它们的倍增次数。衰老是由细胞事件调节的，通常被认为与衰老有关。它本质上是一种生长停滞，但与静止状态不同。处于静止状态的细胞可以恢复到它们的生长阶段，但进入衰老的细胞经历了不可逆的生长停滞。衰老也可能因应激或癌基因过表达而发生，或由端粒缩短引起。端粒是染色体末端的特殊重复序列。它们在DNA复制过程中不被DNA聚合酶复制，而是由端粒酶合成。DNA聚合酶反应不能准确复制端粒的串联重复次数。因此，细胞间的端粒长度有很大差异。随着传代次数的增加，端粒会变得更短，除非它们被端粒酶修复。例如，在胚胎干细胞中，端粒酶活性很高，以维持端粒长度。与细胞株不同，胚胎干细胞不表现出衰老。 2.2.干细胞和分化细胞 从正常或癌变的分化组织中分离出的细胞通常根据化学和物理环境的不同程度保留它们的分化特性。许多从癌症组织中分离出的分化细胞，包括HepG2细胞（来自肝细胞癌）、Jurkat细胞（来自白血病的人类T淋巴细胞）和PC12（从大鼠肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤中分离出的神经细胞，在培养中可以诱导形成树突，几十年来对生物医学研究非常有价值。它们都是连续的细胞系。尽管它们保留了一些它们衍生的组织的分化表型，但许多重要的组织特性都丢失了。过去三十年来，细胞表征和生长因子的研究工具的进步，使得从正常组织中培养各种分化细胞成为可能，包括内皮细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、单核细胞和平滑肌细胞。这些原代组织细胞保留了许多组织特异性活性，不仅在研究中很有价值，而且可能对组织修复或再生有价值。然而，正如本章后面将讨论的，体内大多数分化细胞处于G0阶段的细胞培养中，并且不增殖。从这些组织中分离出的细胞具有非常有限的增殖潜力，并在培养中表现出表型不稳定性。对于可能的再生医学应用，从组织中分离出的分化细胞不是可持续的细胞来源。 干细胞必须能够自我更新（即，能够制造更多的自己）并分化为目标细胞。它们存在于许多成人组织中，并在它们的生态位中处于静止状态，只有在需要时才扩展和分化。一些成人干细胞已经被分离并在培养中生长了几十年，包括从骨髓中分离出的造血干细胞（HSC）和间充质干细胞（MSC）。它们的增殖潜力有限，在培养几代后，它们失去了更新和分化能力。这些成人干细胞是多能的，意味着它们可以分化成多种但数量有限的细胞系。即使增殖潜力不到无限，成人干细胞也有能力产生大量分化细胞（如来自MSC的骨细胞和肌肉细胞）用于异体应用。 与成人干细胞相比，在胚胎发育的非常早期阶段分离出的胚胎干细胞在体外具有几乎无限的自我更新能力，并且是多能的，意味着它们可以分化成所有成人组织类型的细胞。它们不会经历衰老，在再生应用中具有巨大的潜力。然而，由于它们来自受精的人类卵子，它们的使用在伦理上是有争议的。为了缓解这些伦理担忧，设计了一种过程，将成人体细胞重新编程为未分化的胚胎状态。这些诱导的多能干细胞（iPSC）可以通过引入四个外源基因（OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc（OSKM））对成人组织细胞如成纤维细胞进行表观遗传重新编程来获得。iPSCs具有与胚胎干细胞相似的分化成不同细胞系的潜力。胚胎干细胞和iPSC都可以被引导分化成各种类型的细胞，包括造血干细胞、肝细胞（肝细胞）和胰岛细胞，方法是使用一系列生长因子的鸡尾酒来模拟体内分化条件。 2.3.生物制剂制造的细胞 通常用于生产生物制剂的细胞来自不同物种的不同组织。从不同物种中分离出的细胞在染色体数量和基因组序列上有所不同。然而，在生理和转录组水平上，来自不同物种相同组织的细胞非常相似。它们的相似性比来自同一物种的不同细胞类型要大得多。例如，鸡胚成纤维细胞在形态上非常类似于来自肺部或包皮的人类成纤维细胞，而上皮MDCK细胞看起来与狗成纤维细胞非常不同，尽管它们都来自同一物种。 尽管脊椎动物体内大约有两百种类型的细胞，用于生产生物制剂的大多数细胞要么是上皮细胞要么是成纤维细胞（表2.1，面板2.3）。这两种细胞类型通常容易从组织中分离并在体外培养，这一点在半个多世纪前的组织细胞分离的早期探索中已经得到证实。 NS0和CHO是用于治疗性重组蛋白生产的两个突出的宿主细胞系。它们表现出不同的行为，并且源自两种不同的组织和两种不同的物种。CHO细胞是从中国仓鼠的卵巢中分离出来的，而NS0细胞来自小鼠的骨髓瘤。用于重组蛋白生产的细胞主要是上皮细胞和淋巴细胞。成纤维细胞和上皮细胞也常用于病毒疫苗的生产。重组蛋白生产与疫苗生产对细胞系的选择基于根本不同的需求。前者要求易于遗传操作和分泌大量蛋白，而后者需要与病毒的嗜性相匹配的细胞以及最小的抗病毒反应。 上皮细胞排列在组织的“边界”，而成纤维细胞构成了更大的结缔组织部分。上皮细胞形成紧密连接的片层，这些片层经常受损、死亡并由“新”细胞补充。成纤维细胞大多处于静止状态。它们迁移到伤口中，并在受到各种信号刺激时才开始生长。骨髓瘤细胞衍生的终末分化的浆细胞分泌针对特定抗原的抗体。这些抗体只在宿主暴露于抗原后的有限时间内需要。这些细胞在分化为活跃的抗体分泌细胞后的两到三周内会经历凋亡，以便宿主不会继续在循环中拥有大量不需要的抗体分子。许多原始组织细胞的原生特征通常在组织来源的细胞系中仍然明显。 3.细胞膜 关于在生物反应器中培养哺乳动物细胞的一个过时但之前普遍持有的信念是，细胞极其脆弱，容易受到机械应力的影响，因为唯一阻止细胞内容物溶解到水环境中的是脂质双层膜。然而，在现代制造工厂中，细胞在数十立方米体积的生物反应器中，在高度湍流的条件下茁壮成长。包围细胞的质膜不仅仅是一个简单的脂质双层，细胞的完整性不仅仅由其膜包装决定。 3.1.脂质双层 构成脂质双层的脂质是两性磷脂。每个磷脂分子由一个甘油骨架连接一个包含带电磷酸基团的亲水头基和一个由两个脂肪酸组成的疏水尾基（图2.3）。疏水尾中的脂肪酸提供了在温和温度下形成有序膜结构所需的疏水相互作用。当悬浮在水溶液中时，两性分子可以形成胶束。在这样的胶束中，亲水头向外，疏水尾向内。胶束的组织使得它很容易在内部包裹疏水分子，而内外都没有水环境。相比之下，由脂质双层膜形成的球体则疏水尾向双层中间投影，亲水头在外部和内部表面。它可以很容易地在内外都有水环境（图2.4）。 图 2.3. 一个磷脂分子，其甘油与乙醇胺、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸结合。 图 2.4. 凝胶态和液晶态的脂质双层膜。 脂质双层膜的行为类似于流体（面板2.4）。如果在特定位置用荧光染料标记脂质分子，由于分子扩散，荧光会迅速分散。双层膜中磷脂分子的侧向扩散系数约为10^-8 cm^2/s。气体物种在脂质双层中的扩散速度与在水中一样快。甚至大的蛋白质分子也在脂质双层膜中扩散。 尽管脂质双层膜是流体，但通过形成紧密堆积的有序结构，它成为了一个非常好的屏障，阻止大多数分子自由进出细胞。脂质分子在没有膜结合磷脂转位蛋白的帮助下不会翻转（即，改变其在脂质双层的侧面）。大多数生物大分子穿过脂质双层膜的通透性相当低。即使是最小的营养物质，如葡萄糖和简单的氨基酸，也不能频繁地通过以支持细胞生长。 所有主要的生物大分子（例如，DNA、蛋白质、多糖）是由共价键合的单体构成的生物聚合物。脂质双层膜不是聚合物，而是脂质单体的组装。细胞膜的非共价性质使其能够快速扩张、收缩、断裂、改变形状和融合。随着细胞的生长，细胞膜可以快速扩张，动态改变其组成和形状以满足细胞需求，而不会像聚合物生物分子那样分解许多共价键。 脂质双层膜不仅构成包裹细胞的细胞膜，它还包裹各种细胞器以分隔细胞内用于特殊功能的区域。细胞中的主要细胞器包括细胞核、线粒体、内质网（ER）、高尔基体和溶酶体。这些细胞器中的许多都处于不断的动态膜出芽和融合过程中。例如，在细胞器之间转运和蛋白质分泌过程中，“货物”在从一个细胞器转移到另一个细胞器时被包裹在膜囊泡内。 三种类型的脂质构成细胞和细胞器中的脂质双层膜：磷脂、糖脂和神经节苷脂（磷脂最常见）（面板2.5）。有几种不同类型的磷脂。最丰富的类型是甘油磷脂，它使用甘油作为骨架。其甘油的3-羟基团与磷酸基团相连，连接着乙醇胺或丝氨酸。甘油的其他两个羟基团通过酯键连接到两个脂肪酸。通常，这两个脂肪酸中的一个饱和，另一个不饱和，在C14和C24之间有一个顺式双键（面板2.6）。不饱和程度影响脂质双层的堆积。饱和脂肪酸允许更密集的堆积，而不饱和脂肪酸中的双键则产生弯曲，减少堆积并增加膜的流动性。 像其他脂质一样，脂质双层膜在相对温和的温度下经历从液态（或液晶态）到凝胶态的相变（图2.4）。脂质双层可能处于凝胶态或液晶态，这取决于温度和水合程度。脂质双层的相变温度受其脂肪酸和胆固醇组成的影响。 随着温度的降低，脂质双层从液晶态变为结晶态（或凝胶态）。较短的不饱和脂肪酸含量越高，脂质双层的流动性就越大，其相变温度就越低。 胆固醇是影响动物细胞膜性质的另一个关键分子（图2.5）。胆固醇有一个小的极性羟基头基连接到一个刚性的平面类固醇环区域，这些环区域又连接到一个更灵活的非极性尾部。胆固醇与磷脂相互作用，稳定靠近头基的区域，使脂质双层不易变为结晶态。总体而言，胆固醇增加了膜对小分子的通透性，并使膜流动性降低。不同脂质双层膜中的胆固醇含量各不相同。其在细胞质膜中的含量较高，但在细胞器膜中含量很低或不存在。 图 2.5. 胆固醇分子与脂双层膜一个单层中的两个磷脂分子相互作用的示意图。 3.2.膜蛋白 典型的生物膜大约含有50%的脂质和50%的蛋白质（按质量计）（表2.2，面板2.7）。在分子数量方面，脂质与蛋白质的比例约为50:1，因为蛋白质的分子量远高于脂质。膜的蛋白质含量受到来源组织和细胞器的极大影响。线粒体膜通过许多分子（例如，氨基酸、丙酮酸、各种离子和许多其他蛋白质）以高通量通过，其蛋白质含量约为75%。另一方面，作为神经细胞与其周围环境之间的保护鞘的髓鞘膜，其蛋白质含量约为25%。 脂质双层膜将细胞内容物与其周围环境分隔开，并将细胞器与细胞质分隔开。它们不仅作为物理保留细胞内容物的屏障，而且还可以创建膜两侧不同的化学环境。例如，细胞在质膜上维持约80毫伏的电势，在线粒体膜上维持约140毫伏的电势。内质网膜将氧化环境（内质网内）与还原环境（细胞质中）分隔开。 通过各种膜蛋白维持跨膜的各种化学、电和氧化还原势。大鼠小肠上皮细胞每细胞约有150,000个Na+泵，共同使每个细胞每分钟将约45亿个Na+离子运输出细胞。这些泵产生的钠和钾膜梯度，以及细胞质和线粒体膜上的电势，对细胞生物能量学至关重要。 3.3.膜动态 细胞膜处于动态状态；膜成分不断被添加和移除。这不仅是为了膜扩张和细胞生长，也是为了更新和囊泡运输。像其他细胞组分一样，细胞膜的更新是必要的，以替换被氧化或损坏的脂质分子，或允许细胞改变其膜组成以适应新环境。细胞膜蛋白也会被更新（面板2.8）。 细胞器间的运输和蛋白质分泌到细胞外环境也有助于膜的动态状态。注定要分泌或用于细胞表面的蛋白质分子通过居住在膜囊泡内，在细胞器（内质网和高尔基体）和细胞质膜之间运输。到达细胞质膜内表面时，这些囊泡与细胞质膜融合并释放其内容物到细胞外。 在肝脏中，每个肝细胞每分钟合成约120×10^3个白蛋白分子（相当于每天每细胞15皮克）。所有这些分子都被包裹在280-400纳米的膜囊泡中，并被运送到细胞的基底质膜。这些膜囊泡的注入将导致膜表面以每分钟0.5%的速率扩张（面板2.9）。然而，由于肝细胞通常处于G0状态（即，不分裂），它们的细胞质膜的大小不需要增加以适应细胞生长。即使它们正在增殖，由膜囊泡融合引起的膜扩张速率也远远高于细胞生长的需要。因此，添加到细胞质膜的脂质分子必须被回收回细胞内细胞器（高尔基体），以维持细胞质膜处于稳态。 同样，活跃的内吞作用的细胞可以内化高达每分钟0.8%的质膜。内吞作用引起的膜脂质损失必须得到补充，以维持细胞外膜的大小。因此，细胞膜，无论是细胞质膜还是与细胞器相关的膜，都是动态的，并处于稳态。 4.细胞质和细胞器 细胞质和细胞核都被细胞的细胞质膜包围。细胞质大致可分为两组：细胞器和高粘度的细胞溶胶。细胞溶胶含有非常高浓度的蛋白质（100-300毫克/毫升）。相比之下，血浆中的蛋白质含量仅为90毫克/毫升。细胞溶胶还含有无机溶质、构建块以及代谢反应的中间体和代谢物。 细胞溶胶不仅充满了可溶性组分（面板2.10）。它还包含大型颗粒（或聚集体）。核糖体是制造蛋白质的主要机械；它是一个由许多核糖蛋白和核糖核酸（rRNA）组成的复杂颗粒。每个细胞包含数千个约30纳米大小的核糖体。许多核糖体位于内质网的细胞溶胶表面，在电子显微镜下观察时呈现为黑点。一些酶也形成大型复合物，可以在电子显微镜下看到，如丙酮酸脱氢酶复合物。 细胞骨架的纤维状结构在细胞溶胶中也很丰富。这些大型蛋白质颗粒、酶复合物、细胞骨架蛋白和细胞器使细胞的细胞质非常拥挤，使其溶液相非常密集。在光学显微镜下，动物细胞似乎主要是被膜包裹的细胞质，中心附近有一个占据细胞直径一半以上的细胞核。除了细胞核，各种细胞器包括线粒体、内质网、高尔基体、过氧化物酶体、内体等，只能通过电子显微镜看到（图2.6）。 图 2.6. 哺乳动物细胞中的细胞器。 4.1.核 核是细胞中最大的细胞器，并且是除了线粒体外唯一具有双层膜的细胞器，它包含外核膜和内核膜，而不是仅有一个脂双层膜。核包含基因组，这些基因组被分隔成多个DNA分子，每个分子形成一个染色体。作为二倍体，哺乳动物的每个体细胞中都有两套染色体，一套来自母亲，一套来自父亲。DNA分子被分隔到核内的不同区域。一个对生物加工感兴趣的啮齿类动物的单倍体基因组大小约为2.8 Gbp（10^9个碱基对）。人类的约为3.3 Gbp。这相当于一个二倍体细胞中大约有6-7皮克的DNA。如果伸展开来，总的DNA（来自两套染色体）将超过2米长。通过形成DNA-蛋白质（组蛋白）复合物，大量的DNA被打包进核的小空间内。 核的外膜的细胞质侧与许多核糖体相关联。稍后将讨论，内质网是活跃翻译的场所。这些位于外膜上的核糖体在内质网膜表面的细胞质侧继续存在。 大量的物质通过核孔复合体在核质和细胞质之间进行交换，这些复合体穿过外膜和内膜（面板2.11）。DNA复制、各种RNA（信使RNA、转运RNA、核糖体RNA、非编码RNA、小核RNA等）的合成以及核糖体组装发生在核内区域。它们与细胞质中发生的代谢过程和蛋白质合成是分隔开的。在细胞质中合成的核苷酸和脱氧核苷酸被导入到核中用于RNA和DNA合成。包括信使RNA和转运RNA在内的许多RNA产物被导出到细胞质中，在那里进行翻译。核糖体由核糖体蛋白和rRNA在核仁中组装而成，随后被导出到细胞质中参与蛋白质合成。由于翻译发生在细胞质中，核糖体蛋白也是在细胞质中合成的，然后被导入到核中用于核糖体组装。在特定时刻决定哪些DNA片段或哪些基因将被转录成RNA的任务发生在核中。大量的转录因子和其他转录调节因子也在细胞质中合成，然后被导入到核中，它们在那里结合到特定的遗传位点上，以执行它们在转录中的作用。 因此，核与细胞质之间的物质交换量是巨大的。这种大量的交通，从小分子到蛋白质再到复杂的蛋白质-RNA核糖体组装，必须进行分类，以便不同的物种朝正确的方向移动。 4.2.线粒体 线粒体是细胞中数量最多的细胞器。每个细胞大约有1700个，占细胞体积的20%（面板2.12）。线粒体的大小与细菌相似，被认为起源于原始真核生物所获得的类似细菌的结构。 线粒体充当细胞的发电厂。细胞中最活跃的反应（例如，氧化营养物质并通过电子传递和氧化磷酸化产生能量）发生在线粒体中。具有不同能量需求的细胞具有不同数量的线粒体。在高能量需求的细胞中，可以多达3000个线粒体。 像核一样，线粒体也有双层膜（图2.7）。外膜维持它们的宏观形态，而内膜高度折叠，通常称为嵴，以产生更多的表面积。内膜是溶质运输的屏障。外膜富含由porin蛋白构成的孔，允许小于5000道尔顿的分子自由通过。由内膜和外膜包围的空间的化学环境与细胞质大致相同。内膜内的空间，称为基质，富含酶，是代谢中间体从葡萄糖代谢到CO2的最终分解发生的地方。当它们在某些生理条件下被用来产生能量时，脂肪酸和氨基酸的最终降解也发生在这里。 图 2.7. 质子和电位（电荷）梯度，以及物质流动，穿过线粒体内膜。主要物种的通量方向由箭头指示。注意，NADH氧化与电子传递耦合，会泵送质子逆着质子和电荷梯度，而驱动ATP合成的质子移动方向是顺着质子和电荷梯度。 通过TCA循环的丙酮酸氧化的化学势能储存在NADH中。在线粒体内膜上，NADH中处于高能状态的电子通过由多个蛋白质复合物组成的电子传递链（NADH脱氢酶、细胞色素C还原酶复合物和细胞色素C氧化酶复合物）传递，并泵出内膜中的H+。在电子传输结束时，电子与氧反应形成H2O。 ATP生成过程是通过位于内线粒体膜上的ATP合酶发生的。细胞中所有线粒体内膜的总表面积大于细胞质膜的表面积。因此，线粒体富含潜在的有害自由基。细胞将这些潜在的有害反应限制在线粒体内。 线粒体不仅在大小上类似于细菌，而且还拥有一个圆形DNA分子形式的基因组。每个哺乳动物线粒体包含一个或多个约15-17 kbp的线粒体基因组，编码一些线粒体蛋白和RNA分子。线粒体DNA复制的控制与基因组DNA复制的调节是分开的。线粒体拥有自己的核糖体和tRNA用于翻译，以及RNA聚合酶用于转录。然而，许多线粒体蛋白编码在细胞的基因组中，并在细胞质中合成后被导入到线粒体中。像其他细胞器一样，线粒体不能仅从其组分或来自核的遗传内容中生成；相反，细胞必须已经拥有一个线粒体，以便为其增殖生成更多的线粒体。线粒体的生物合成（即复制）是独立于细胞分裂的。 一个活跃的呼吸线粒体有一个大约-140毫伏的电位（内部为负）和内膜上几乎1个单位的pH差异。线粒体基质的pH值高于细胞质（即内部的H+浓度较低），因为H+是通过电子传递链逆浓度梯度泵送的。pH梯度和电位对于将NADH的化学势能转移到ATP至关重要。 当细胞的能量需求在很长一段时间内变得高时，它通过增加线粒体的数量来响应。在正常（非饥饿）培养条件下，碳能源（主要是丙酮酸）和氧进入线粒体的通量似乎在一个狭窄的范围内。虽然进入糖酵解的葡萄糖通量可以在很宽的范围内变化，但进入线粒体的丙酮酸通量受到更多限制。 4.3.溶酶体、过氧化物酶体、自噬体、内体 溶酶体是细胞内进行许多材料降解的小细胞器。其腔体内环境呈低pH值（约4.5），含有许多能够水解蛋白质、核酸和脂质的酶（面板2.13）。溶酶体膜上有质子泵以维持内部的低pH值。它是细胞摄入的材料和细胞不再需要的细胞材料降解的场所。大多数细胞材料都有有限的寿命，无论它们是催化化学反应还是起结构或机械作用。随着时间的推移，任何细胞材料都可能在结构的某部分被氧化或以其他方式进行化学修饰。这种“损伤”的积累可能会使蛋白质失去功能。因此，大多数蛋白质和其他细胞材料，如RNA和脂质，在有限的时间内被更新。许多这样的过程发生在溶酶体中。对于一些蛋白质，这发生在蛋白酶体中。蛋白酶体是由蛋白水解酶组成的复合物，能够降解蛋白质。需要更新的蛋白质被泛素标记并送往蛋白酶体降解。溶酶体不是垃圾箱，而更像是回收中心。它们在脂质稳态中起着重要作用。从细胞外环境和其他细胞器中摄取的脂质被处理后重新分配，以维持不同细胞器膜中适当的脂质组成。 像溶酶体和蛋白酶体一样，自噬体参与细胞的“大扫除”。然而，它们具有双层膜，可以将受损的材料包裹起来。它们可能很大，因为它们可能需要吞噬受损的细胞器、摄入的微生物或受损的蛋白质（这个过程称为自噬）。然后它们将内容物运送到溶酶体。 通过内体，真核细胞可以通过将颗粒包裹在细胞膜内并将其作为被脂双层包裹的囊泡摄取进来，从而摄取外部颗粒（面板2.14）。本章稍后将讨论的内吞途径也参与了涉及蛋白质分泌的细胞材料的回收。在更高生物中，一些细胞是专门的“清道夫”，它们吞噬外来颗粒或死亡的细胞。 在脂肪细胞中，脂质的分解发生在过氧化物酶体中（面板2.15）。这些代谢过程中的反应产生大量的活性氧，因此需要被包含在这些专门的细胞器内。 4.4.内质网 内质网从核膜延伸出来，是蛋白质折叠以供分泌或输送到许多细胞器和表面的细胞器（面板2.16）。它也是脂质合成的主要场所。根据其在透射电子显微镜下的形态，大致分为光滑内质网和粗糙内质网。光滑内质网富含参与化学转化反应的酶。在肝细胞中，光滑内质网扮演解毒的角色；在卵巢和睾丸中，它产生激素。粗糙内质网的细胞质表面有核糖体结合，因此在电子显微镜下看起来粗糙。它是为某些细胞器、质膜和分泌而预定的蛋白质的合成、折叠和加工的场所。据估计，大约有30%的所有细胞蛋白质是在粗糙内质网中合成的。体内专业的分泌细胞，如分泌胰岛素的胰岛β细胞和分泌抗体的浆细胞，拥有丰富的内质网。当B细胞（非抗体分泌）分化成浆细胞时，内质网和高尔基体急剧扩张，超过15倍（面板2.17）。 肝细胞分泌许多蛋白质，包括白蛋白和血液中的许多蛋白质成分。在肝脏中，一些肝细胞专门从事蛋白质分泌，而其他细胞在氧化解毒中扮演主要角色。这些肝细胞具有独特的内质网。那些参与蛋白质分泌的肝细胞拥有丰富的粗糙内质网，而那些专门从事异生物质代谢的肝细胞则拥有丰富的光滑内质网。 内质网也是蛋白质翻译后修饰的主要场所（面板2.18）。内质网腔富含促进蛋白质折叠的蛋白质。二硫键在内质网中形成，天冬酰胺残基（N-糖基化）上的糖基化初始步骤也在那里发生。内质网参与Ca2+稳态，其高Ca2+作为维持细胞质Ca2+浓度低的储备，除非需要。内质网也是脂蛋白和胆固醇合成的场所。 4.5.高尔基体和蛋白质翻译后修饰 高尔基体在细胞质的不同位置呈现为几十堆三到七个扁平囊的形态（面板2.19）。它们通常靠近内质网，堆叠连接成丝带状结构。高尔基体大致分为四个隔间：顺式、中间、反式和反式高尔基网（TGN）（图2.8）。分泌和膜蛋白在内质网中折叠后被转移到高尔基体，首先到顺式高尔基体，然后通过膜囊泡到中间和反式隔间。然后，在TGN中，蛋白质被分类并运输到不同的细胞器或质膜以分泌。当蛋白质通过不同的高尔基隔间时，它通过糖基化、硫酸化等化学修饰（面板2.20）。这些化学修饰所需的酶在四个高尔基隔间中的分布并不均匀。因此，不同的反应在不同的隔间中发生。估计有100-200个糖基转移酶，各种核苷糖的转运蛋白，是构成高尔基酶大部分的膜蛋白。 图 2.8. 蛋白质的合成和分泌到细胞外环境。详见第2.21节和文本以获取详细信息。 5.通过内质网和高尔基体的蛋白质分泌 据估计，在真核基因组编码的所有蛋白质中，有20-30%是膜蛋白，这些蛋白质通过内质网和高尔基体进行处理。对于一个工业重组蛋白生产细胞系来说，分泌的重组产品构成了通过内质网和高尔基的蛋白质的很大一部分。这些细胞将很大一部分蛋白质处理能力投入到分泌蛋白产品中。 尽管有些蛋白质在细胞质中完全合成后被转位到内质网，但大多数（包括典型的重组蛋白产品）是作为新生蛋白分子被转位的（图2.8，面板2.21）。注定要分泌、质膜和细胞器的蛋白质在氨基末端有一个五到三十个氨基酸的前导序列。这些信号序列作为每个蛋白质目的地的标志。成熟的mRNA带有聚腺苷酸尾（polyA尾）从细胞核导出到细胞质后，一个核糖体绑定到mRNA的翻译起始位点并开始翻译。 新生蛋白质的信号肽被合成，然后被内质网附近的信号识别颗粒（SRP）识别。SRP与信号序列的结合导致翻译暂停，并将新生蛋白质（仅具有整个序列的初始片段）以及核糖体和mRNA停靠到内质网膜上的一个转位器（也称为translocon或转位通道）。然后新生多肽通过转位器转入内质网腔，但核糖体和mRNA留在内质网的细胞质表面。随后，翻译延伸恢复，延伸的多肽通过转位器的通道进入内质网腔。随着翻译沿着mRNA的下游进行，新的核糖体继续绑定到mRNA的翻译起始位点，启动信号肽的合成，并重复将新生蛋白质转入内质网的过程。因此，在内质网的细胞质侧，每个mRNA分子都有多个核糖体积极翻译靠近转位器的蛋白质。 多肽的折叠在转入内质网腔后立即开始。在内质网腔中延伸的多肽上的信号肽在进入内质网时被切除。一类内质网分子伴侣和其他促进蛋白质折叠的蛋白质作用于新生蛋白质分子，防止它们聚集并促进折叠。它们的作用需要细胞能量（ATP）。内质网腔分子伴侣的一个重要成员，BiP（也称为GRP78），也是转位器复合物的一个组成部分。BiP结合在未完全折叠蛋白质的疏水氨基酸上，防止它们聚集。除了BiP，主要的内质网腔分子伴侣包括蛋白二硫键异构酶（PDI），它促进正确的二硫键形成。 在蛋白质分泌过程中，N-糖基化发生在蛋白质上，从内质网开始并持续到高尔基（图2.8）。它被称为N-糖基化，因为寡糖与特定序列上蛋白质的天冬酰胺残基相连。当蛋白质正在合成和折叠时，一个预装的含有三个末端葡萄糖残基的寡糖被转移并共价连接到天冬酰胺上（图2.9）。将糖基添加到蛋白质上增加了其以可溶形式的稳定性。它也是蛋白质折叠的一个重要标志。当蛋白质经历折叠时，葡萄糖残基被切除。一个葡萄糖基转移酶向任何未正确折叠的蛋白质上的非糖基化糖上添加一个葡萄糖，留下完全折叠的蛋白质有一个没有末端葡萄糖的N-糖基。Calnexin和calreticulin是凝集素（糖基结合蛋白）。它们结合在只有一个葡萄糖残基的蛋白质上的糖基上，并将其保留在内质网中以进一步折叠。一旦蛋白质完全折叠并且没有末端葡萄糖，它就准备好转移到高尔基体了。然后未正确折叠的蛋白质分子被导出到细胞质并在蛋白酶体中降解。 图 2.9. 从N-糖基化物上修剪葡萄糖作为正确蛋白质折叠的信号。 完成折叠过程的蛋白质分子定位在内质网的一些区域，那里的内质网膜被COPII蛋白覆盖。含有折叠蛋白质并被COPII覆盖的膜囊泡随后从内质网出芽并被导出到顺式高尔基。在高尔基中，进一步的翻译后修饰发生。顺式、中间、反式高尔基和TGN由一系列连接的微管组成，不同的酶在蛋白质上进行不同的修饰。通常包含三到七个囊泡堆叠的中间高尔基是糖蛋白糖链延伸的主要场所。从隔间出芽和与另一个隔间的分裂是蛋白质从内质网到高尔基以及高尔基隔间之间运输的主要形式。高尔基隔间的表面装饰有形成卷曲螺旋的蛋白质（golgin），它们几乎像触手一样帮助捕获囊泡。 除了分泌，蛋白质还针对不同的细胞器和不同区域的质膜。在TGN中，蛋白质根据目的地被分类到膜囊泡中。囊泡被不同蛋白覆盖以标记它们的目的地。膜囊泡的运输由微管协助。稍后将讨论，微管可以快速聚合和解聚，形成轨道状，因此可以用来引导囊泡货物到达正确的位置。 随着物质的运输，早期隔间的膜和内容物被转移到ER的后期隔间、高尔基体、不同的细胞器和质膜。这样的物质流动需要通过相反方向的类似物质流动来平衡。因此，蛋白质分泌过程不仅涉及将膜囊泡前向转移到后期隔间和质膜，还涉及通过内吞作用和逆行运输将膜和其他成分返回到它们原始的隔间，以维持每个隔间处于稳态。因此，内质网、高尔基体、溶酶体和内体都是分泌网络的一部分。它们通过膜囊泡的动态运输进行通信。翻译完成后，蛋白质分子需要有限的时间进行折叠、糖基化，然后被排泄。一个平均长度约为350个氨基酸的蛋白质的完整翻译仅需约一分钟。相比之下，根据蛋白质的性质，合成的蛋白质分子的分泌需要从数十分钟到几个小时不等。α1-抗蛋白酶是分泌最快的蛋白质之一，半衰期约为28分钟（表2.3）。转铁蛋白和IgG的分泌大约需要两个小时。一般来说，分泌的蛋白质分子在内质网中花费的时间比在高尔基体中多。 我们可以将蛋白质货物通过不同隔间向TGN行进的过程视为通过一系列生物反应器的生产流。关于蛋白质分子如何通过，有两种理想化的情况，一种类似于连续流动反应器（PFR），另一种类似于连续搅拌槽反应器（CSTR）。这两种反应器类型将在第8章讨论。在PFR模型中，所有分子像游行中的乐队一样一起移动，同时进入反应器的分子一起离开。在CSTR模型中，分子进入反应器然后在内部循环，每个分子被随机取出的机会相等，不管它在反应器中待了多久。如果高尔基体中的蛋白质分泌过程表现得像PRF，所有分子将受到相同程度的酶修饰；如果它表现得像CSTR或一系列CSTR，一些分子将在反应器中花费更多时间，可能比其他分子更广泛地被酶修饰。蛋白质分泌的性质可能既不是PFR也不是CSTR。然而，分泌蛋白质的停留时间可能分布在一个范围内。 实验观察确实表明，同一蛋白质的不同分子的分泌时间不是均匀的，而是分布在一个范围内（面板2.22）。这通过使用药物阻止蛋白质分泌然后移除该药物来说明；在蛋白质分泌恢复后，荧光标记的蛋白质分子以不同的速率通过不同的细胞隔间。高尔基中的糖基化反应，从一个核心寡糖到完全延伸的产物，涉及分布在不同隔间的十多种酶。由于不同的分子在每个隔间中花费不同的时间，它们受到不同程度的不同反应的影响。在高尔基中的停留时间分布有助于糖基化的异质性。 6.跨细胞膜的运输 将细胞与其环境分隔开的脂双层膜，以及将细胞器与细胞质分隔开的膜，对物质交换构成了障碍。它对大型和小型分子的渗透性都非常低（图2.10）。在细胞的营养物质和代谢物中，只有氧气、脂肪酸、乙醇和一些脂质能够足够快地通过膜以满足细胞生长的需要。需要专门的运输机制来介导绝大多数营养物质的运动和代谢物的排泄。 图 2.10. 一些溶质通过脂质膜的渗透性的数量级。 细胞拥有大量运输蛋白（有时称为渗透酶），允许小分子（约1千道尔顿，例如糖、寡糖、氨基酸、小肽、核苷酸、胆固醇、离子、有机酸等）穿过细胞质膜和各种细胞器的膜。大分子通过膜囊泡（如通过内质网和高尔基体的分泌过程）、胞饮作用或外泌作用穿过膜。特定的受体参与吸收大型蛋白质和复合物，如低密度脂蛋白（LDL）和转铁蛋白。 6.1.溶质运输蛋白的类型 主动和被动运输 细胞溶质跨膜运输可以分为两种类型：被动运输，它沿着其浓度梯度运输溶质，从膜的高浓度侧运输到低浓度侧；主动运输，它从低浓度侧运输溶质到高浓度侧（图2.11，面板2.23）。前者在热力学上是有利的，而后者必须与放热过程耦合才能使运输成为可能。提供主动运输所需的化学势能的耦合过程之一是ATP的水解。另一个是跨膜的大浓度梯度的第二种溶质的共转运。第二种溶质的共转运的化学势能变化提供了足够的净能量变化，以驱动第一种溶质逆其浓度梯度运输。例如，肠道钠依赖的葡萄糖转运蛋白依赖于外部超过10倍的钠浓度来驱动葡萄糖从肠道腔内的低水平区域运输到内部细胞中具有更高葡萄糖水平的区域。因此，钠转移的驱动力“推动”葡萄糖逆其浓度梯度移动。 图 2.11. 主动运输和被动运输。主动运输需要由ATP水解或共转运溶质如H+或Na+提供的化学势能。 转运蛋白和通道蛋白 从结构角度来看，溶质沿浓度梯度的运输可以通过载体蛋白（转运蛋白）或通道蛋白进行（图2.12，面板2.24）。 图 2.12. 通道蛋白和转运蛋白。 通道蛋白在膜中形成一个管道状结构，特定于某些溶质，如水、Na+或K+。通道蛋白存在于开启或关闭状态。一旦通道打开，溶质的转移在降低浓度梯度的方向上非常快。通量非常快，受膜上通道蛋白分子数量和通道开启时间的影响。 载体介导的转运介导的是促进扩散。首先，来自膜高浓度侧的溶质扩散进入转运蛋白并停靠在转运蛋白的结合域。接下来，溶质被转移到膜的低浓度侧。一旦到达低浓度侧，溶质被暴露并可以自由扩散。在正常培养条件下，葡萄糖和一些氨基酸通过促进扩散进行运输。 促进扩散的转运蛋白介导可逆运输。转运蛋白的运输速率取决于膜两侧溶质的浓度差。通常，转运蛋白对捐赠侧的溶质有很高的亲和力，这有助于促进溶质的结合，而在下游侧有较低的亲和力以促进溶质的释放。如果一侧的溶质浓度远大于另一侧，则速率通常仅取决于捐赠侧的溶质水平。这种运输机制类似于典型的酶催化将底物转化为产物。运输速率对溶质浓度的依赖可以用米氏-门顿动力学方程来描述。在低浓度下，运输速率与溶质浓度成正比。在高浓度下，随着转运蛋白饱和，速率保持恒定。米氏常数（KM）用于将运输速率表示为溶质浓度的函数。KM是运输速率为最大值一半时的溶质浓度。 葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）是一种无处不在的葡萄糖转运蛋白。GLUT1的米氏常数（KM）约为0.1-1 mM。在0.1-1 mM范围内，细胞的葡萄糖进口速率随着葡萄糖浓度的增加而增加。在细胞培养基中常用的浓度范围（1-10 g/L，或5.5 mM至55 mM）内，葡萄糖运输速率接近最大值，不受葡萄糖浓度的影响。 单向转运体和共转运体 促进扩散和主动运输的转运蛋白也可以根据每个转运蛋白携带的溶质数量和溶质流动方向进行分类（图2.13，面板2.25）。 图 2.13. 单向转运体以及两种共转运体：同向转运蛋白和反向转运蛋白。 单向转运体从高浓度侧向低浓度侧转移单个溶质，例如葡萄糖的GLUT1转运蛋白和果糖的GLUT5转运蛋白。共转运体和反向转运体同时转移两个溶质。将两个溶质朝相同方向传递的转运蛋白称为共转运体。相反，反向转运体将两个溶质朝相反方向转移。共转运体和反向转运体统称为共转运体。共转运体通常用于运输带电的有机分子。可解离的溶质与对离子一起移动以维持电荷中性。当带电溶质从膜的一侧移动到另一侧时，必须维持电荷中性。否则，净电荷将在膜上积累并产生电位，这将减缓溶质的进一步转移。例如，乳酸在中性pH的水溶液中以乳酸盐的形式存在。如果乳酸盐从膜的一侧移动到另一侧而没有伴随正电荷的物种，如H+，细胞膜将在乳酸盐接收侧变为负电荷，在乳酸盐捐赠侧变为正电荷，最终在膜上产生电压，阻止带负电的乳酸盐的进一步运输。因此，许多解离的有机酸通过共转运体运输，以防止膜上产生电荷。 通常采用两种机制来维持膜上的电荷中性：a）通过共转运体与对离子（如乳酸盐的H+）共转运，b）与相同正电荷或负电荷的离子共转运，但方向相反（如HCO3-的Cl-）。 在共转运体介导的转移中，运输速率不仅受膜两侧溶质的浓度差的影响，还受共转运离子的浓度梯度的影响。例如，单羧酸盐转运蛋白（MCT）运输乳酸的速率不仅受乳酸浓度的影响，还受细胞质和培养基之间的pH差异的影响。 类似“泵”的转运蛋白 我们使用泵来运输水。有时，泵被用来克服重力并将水提升到更高的位置，而其他时候水本来就在向下流动，但泵被用来更快地移动它。在溶质跨膜运输中，有时使用能量来克服浓度梯度（主动运输），如在泵水上山的情况；在其他情况下，能量被用来加速运输（图2.14）。 图 2.14. “泵”式转运蛋白。 肠道上皮的Na+/葡萄糖转运蛋白（SGLT）即使在葡萄糖水平低于细胞时也可以从消化道中吸收葡萄糖。这是通过使用Na+/葡萄糖转运蛋白从肠道腔室中运输两个Na+进入细胞实现的，其中Na+水平非常低（图2.14）。随着钠离子的运输，葡萄糖分子也结合到转运蛋白上并同时被运输。Na+穿过膜的倾向如此之高，以至于它可以驱动葡萄糖逆着大的浓度梯度移动。Na+穿过膜的驱动力不仅来自Na+的浓度差异，还来自负膜电位的吸引力，膜电位为-80 mV。 主动运输的另一种类似泵的转运蛋白是ATP结合盒（ABC）转运蛋白，它利用ATP作为能量源运输某些疏水化合物（图2.14）。它的突变涉及许多人类疾病。它还涉及通过将药物泵出细胞，导致药物在细胞内浓度低，从而对许多药物产生耐药性。即使其外排沿其浓度梯度，运输速率也会很低。有了ATP驱动的转运蛋白，速率就提高了。在长期暴露于氨甲喋呤后，一些癌细胞可以通过使用ABC转运蛋白将药物泵出细胞，从而产生耐药性。第三种类似泵的转运蛋白，Na-K ATP酶，将在下文描述。 离子运输和膜电位 细胞内液含有多种无机离子。一些微量元素（Fe^3+、Zn^2+、Co^3+、Se^2+）的浓度非常低。许多离子种类（Na^+、K^+、PO4^3-、Mg^2+、HCO3^-、Cl^-）的浓度在毫摩尔范围内（面板2.26）。所有这些都依赖于转运蛋白穿过细胞膜。其中一些还通过通道蛋白以受控的方式运输，以控制膜电位并维持细胞内的稳态水平。这些离子在细胞质中的浓度差异很大。它们在细胞膜上也面临不同的浓度差异。例如，Na^+和K^+在质膜上的浓度梯度方向相反。细胞内K^+的浓度比细胞外高20-50倍，而Na^+的浓度则比细胞内高10-15倍。 除了主要离子的浓度梯度外，细胞还维持其质膜上-80 mV的电位梯度（细胞内为负）。这个电位对许多化合物跨膜运输至关重要。由于脂双层膜的电容很大，只需要转移极少量的正电荷离子（例如K^+、Na^+）从细胞质到细胞外空间就能产生80 mV的电荷差异。产生膜电位所需的离子转移数量比细胞内总离子数低几个数量级，它们的转移不会引起它们细胞内浓度的任何变化。 钠-钾ATP酶在维持细胞内Na^+和K^+水平中发挥关键作用（图2.14）。它使用ATP作为能量源，将2个K^+转移到细胞质内，将3个Na^+从细胞质外排。它存在于所有哺乳动物细胞的细胞膜中。细胞质膜对离子并非绝对不通透。它允许Na^+和K^+以非常慢的速率跨膜扩散。由于它们在膜通透性上的微小差异，K^+比Na^+扩散得更快。细胞内的K^+也通过钾通道泄漏出来。Na^+/K^+ ATP酶和通道及膜的泄漏的联合作用有助于平衡Na^+和K^+梯度和膜电位。细胞还有氯离子泵将带负电的Cl^-泵出细胞。在一些细胞中，Na^+和Cl^-通道蛋白也有助于维持膜电位在正确的范围内。跨膜的电位在溶质运输中起着重要作用，如Na^+/葡萄糖转运蛋白所示。 7.细胞形状、力学和运动 细胞呈现出许多不同的形状。在血液中循环的大多数是球形的。许多上皮细胞是立方体，而在培养皿上培养的成纤维细胞像煎蛋一样展开，还有长长的纺锤。培养的细胞形状可以告诉我们很多关于细胞类型、其分化状态和其健康状态的信息。在现代生化和分子生物学分析工具可用之前，观察细胞形状是，现在仍然是，判断细胞“状态”的主要工具。细胞的形状是细胞内部结构组织之间的力量平衡以及细胞与相邻细胞和它所附着的表面之间相互作用的结果。因此，细胞形状是细胞力学特性的反映。 细胞形状是动态的。细胞出于各种原因从一个地方移动到另一个地方。在胚胎发育中，它们可能移动到新的位置分化成新的组织。在成年人中，它们可能移动以修复受损的组织。两个子细胞在细胞分裂后彼此远离。当细胞移动或分裂时，其力学特性、形状以及与其他细胞和表面的相互作用也会发生变化。简而言之，细胞的内部力学结构、与相邻细胞的相互作用以及与它所附着的表面的相互作用共同影响其形状、运动以及细胞内和细胞外的力学作用。 细胞的内部力学结构由细胞骨架蛋白控制。细胞-细胞相互作用受接合蛋白和许多细胞-细胞粘附分子的影响。细胞分泌细胞外基质，这些基质覆盖在表面上，具有促进自身或其他细胞分化的特性。这些细胞外基质在发育过程中也会经历动态修改。 这些细胞培养方面以前对过程工程师的兴趣较小，当焦点仅集中在悬浮生长的高度适应的重组细胞上时。随着对再生医学和细胞治疗应用中细胞的兴趣日益增加，维持细胞的分化状态至关重要，更好地理解细胞-细胞和细胞-表面相互作用变得重要。 7.1.细胞骨架 细胞的细胞骨架由三个主要组成部分构成：肌动蛋白丝、微管和中间丝。这些赋予细胞形状并在其内部传递力量（图2.15）。肌动蛋白丝和微管分别是它们的单体肌动蛋白和微管蛋白的球状蛋白的组装。单体的组装需要以ATP（肌动蛋白）或GTP（微管蛋白）形式的化学势能。单体堆叠成组装体时，单体之间不形成共价键。中间丝也是聚合物，但由单体丝蛋白制成。 图 2.15. (a) 肌动蛋白丝，(b) 微管，(c) 中间丝。 肌动蛋白丝、微管和中间丝都是多股的螺旋型纤维，可以延伸到相当的长度。直径约8纳米的肌动蛋白丝是三者中最小的。微管是空心的，直径约为25纳米。中间丝直径约为10纳米。 肌动蛋白丝和微管可以通过组装或解聚单体迅速增长或缩短长度。由于单体以头对尾的方式形成组装体，它们的纤维是极化的。纤维和单体与许多辅助蛋白相互作用，这些辅助蛋白将纤维调节为动态或静态状态，并决定纤维形成的网络类型。单体蛋白还含有核酸（肌动蛋白中的ATP，微管蛋白中的GTP），在组装过程中转化为ADP或GDP。 肌动蛋白丝 肌动蛋白丝由两股或三股细丝组成，像绳子一样扭曲形成单股丝（图2.15，面板2.27）。 这种几何形状增强了它们的结构完整性，同时保持了高度的灵活性。大量的辅助蛋白控制肌动蛋白单体的成核，并指导它们组装成不同类型的网络，这些网络具有不同长度的肌动蛋白丝、交叉链接、捆绑和固定到细胞膜。这些辅助蛋白帮助调节细胞内不同类型肌动蛋白网络的空间分布。在细胞的质膜下方通常可以看到大量的肌动蛋白，形成一个凝胶状结构，称为皮层。在免疫荧光显微镜下，用抗肌动蛋白抗体对细胞进行染色后，肌动蛋白呈现网状束状。皮层作为外部机械扰动的首个吸收器，赋予脂双层其局部形状。许多细胞类型，如成纤维细胞，在组织和培养中都延伸其身体并在表面上铺展平坦。附着细胞的边缘有一个不规则的形状，很像在平底锅上放置的鸡蛋。在突出的区域，肌动蛋白纤维定位在膜伪足和丝状伪足中。在突出的丝状伪足中，肌动蛋白丝形成密集标记的平行纤维束。而在膜伪足中，它们形成交叉链接的非平行网络。这两种类型的网络可以重组，丝状伪足区域在细胞运动期间从膜伪足中突出。在静止的细胞中，肌动蛋白纤维形成长应力纤维，可能跨越整个细胞长度的大部分。应力纤维连接到焦点粘附（细胞质膜与基质表面接触的位置）并建立细胞与细胞外基质之间的张力。应力纤维也通过粘附连接到相邻的细胞。 微管 微管是由13根α-和β-微管蛋白（称为原丝）组装而成的中空管（图2.15和图2.16，面板2.28）。像肌动蛋白丝一样，单体的头对尾组装使微管具有方向性，产生一个“+”和一个“−”端。微管的两端可以通过组装或解聚反应快速延伸或收缩。许多微管的负端汇聚在一个称为微管组织中心（MTOC）的区域。最大的MTOC是中心体，从中延伸出大量的微管“+”端向外。许多辅助蛋白与微管和微管蛋白结合并相互作用。一些微管相关蛋白（MAPs）稳定微管或促进微管与细胞组分的相互作用，如结合到细胞膜。其他辅助蛋白促进解聚、成核、捆绑或交叉链接。因此，微管是影响细胞形状的主要结构组分，无论是静态还是动态。 图 2.16. 培养上皮细胞层中培养的成纤维细胞的细胞骨架。肌动蛋白丝显示为交叉的井号标记，中间丝为流动的灰色线条，微管显示为虚线复合线条。 微管也是细胞运动功能的主要参与者。它们通过作为马达蛋白（如驱动蛋白和动力蛋白）可以沿其滑动的轨道，消耗ATP来实现这一点。马达蛋白通过与其他结合各种货物的蛋白质形成复合物，例如分泌膜囊泡或细胞器，然后可以沿着微管运输货物。 中间丝 与所有真核细胞普遍存在的肌动蛋白丝和微管不同，中间丝只出现在一些动物中，包括脊椎动物、线虫和软体动物（图2.15和图2.16，面板2.29）。尽管所有中间丝共享常见的结构特征，它们由许多不同的分子组成，其表达是组织特异性的。例如，核纤层蛋白存在于细胞核中，波形蛋白在许多间充质细胞中，角蛋白在上皮细胞中。中间丝的主要作用是传递机械力和提供细胞的机械特性。例如，中间丝角蛋白赋予皮肤外层其韧性。虽然多样的中间丝在氨基酸序列上并不保守，但它们在主要蛋白域上是保守的，并在分子组织上共享共同特征。中间丝的一个共同特征是它们形成头对尾的卷曲异源二聚体，然后一对二聚体形成一个反平行和对称的四聚体。因此，中间丝与肌动蛋白丝和微管根本不同，后两者是具有“+”和“−”端的极性。四聚体亚基堆叠在一起形成纤维。每个中间丝纤维由多个微丝组成，这些微丝又由一系列亚单位蛋白组成。 这些中间丝纤维是灵活的。与可以具有数十微米持久长度的微管和肌动蛋白丝不同，中间丝可以在短距离内弯曲，并能够吸收外部力量施加的能量并将其传递到细胞的其他区域。在组织中或在培养中相互连接的细胞中，中间丝也有助于在细胞之间传递力量。 7.2.细胞外基质和整合素 身体中的绝大多数细胞都嵌入在由蛋白质和多糖组成的非细胞组织结构中（图2.16，面板2.30）。在组织分化过程中，这些结构可能钙化为骨骼、软骨、上皮层下的结缔组织或其他特殊组织，或者形成细胞所坐的基底膜（也称为基底板层）。各种细胞分泌的多种糖蛋白（与寡糖连接的蛋白质）和蛋白聚糖（核心蛋白与一个或多个糖胺聚糖（GAG））提供了细胞外基质（ECM）的核心成分（面板2.31）。例如，成骨细胞分泌胶原蛋白、其他骨骼形成蛋白和羟基磷灰石；软骨细胞分泌胶原蛋白、透明质酸和蛋白聚糖；成纤维细胞分泌胶原蛋白和纤维连接蛋白。 组织细胞不仅分泌不同的ECM组分，还将其组织成不同的结构，赋予不同组织的特殊特性。例如，胶原纤维可能朝一个方向排列，而不是随机盘绕。ECM的化学成分以及作为细胞局部环境的物理组织影响细胞分化和维持分化特性。当在塑料或玻璃表面上体外培养时，细胞在附着后将这些物质分泌到表面上，形成它们所居住的ECM。对于胚胎干细胞的体外培养，使用层粘连蛋白涂层培养皿以维持它们的多能性；而在培养从肝脏分离的原代肝细胞时，使用I型胶原蛋白。许多ECM组分具有高度的负电荷。这允许许多蛋白质生长因子被吸附到ECM上并释放到周围细胞，甚至可能作为趋化因子。因此，它们也在提供细胞迁移和分化的线索方面发挥作用。 整合素和细胞-ECM相互作用 ECM的生物学作用不仅仅是为细胞粘附提供适当的表面，而且还提供与特殊细胞特性表达和生长控制相关的细胞表面相互作用（面板2.32，图2.17）。当在同一类型的ECM上培养时，相同类型的细胞可能表现出非常不同的形状和其他细胞行为。对不同ECM的不同反应是通过称为整合素的跨膜细胞表面受体介导的，它们将细胞外ECM连接到细胞内细胞骨架，并传递细胞外微环境的化学和物理特征到细胞内信号事件。整合素是由不同的α和β链组成的异二聚体。不同的α和β链组合赋予了对不同ECM分子的特异性结合。例如，α5β1整合素与纤维连接蛋白结合，而α6β1整合素与层粘连蛋白结合。在细胞内方面，整合素主要在一些辅助结合蛋白的帮助下与肌动蛋白丝结合。不同的细胞类型表达不同的α和β链，因此形成具有不同结合亲和力的不同整合素复合物，以结合各种ECM组分。因此，不同细胞类型通常对粘附、生长或维持其分化特性有不同的ECM要求。为了建立ECM和细胞骨架之间强大而稳定的相互作用，多个细胞-基质连接复合物聚集在一起形成焦点粘附。 整合素异二聚体可以存在于积极状态，与ECM、肌动蛋白丝和其他相关蛋白结合，或处于非活动状态。这种状态的转换允许细胞施加或解除内部和外部机械相互作用。状态的转换是通过与细胞的信号蛋白耦合来促进的。细胞-基质连接与信号激酶或其他信号系统蛋白相关联。信号传递发生在细胞膜的两侧，从细胞内到细胞外环境，反之亦然。整合素与ECM蛋白的结合可以激活整合素，允许肌动蛋白丝结合。相反，整合素的内部信号激活也可以启动通过整合素的肌动蛋白丝和ECM的连接。 图 2.17. 整合素及细胞外基质与细胞骨架之间的相互作用。 通过细胞-ECM连接的肌动蛋白丝的内拉导致张力力，该力通过细胞骨架纤维传递。在锚定依赖性细胞的情况下，张力力提供了允许细胞周期继续进行的必要信号。 7.3.细胞运动 绝大多数细胞能够在表面上移动。通常，细胞运动可能是由于对可扩散化学物质或表面上有利的ECM的吸引，或随机运动。细胞运动涉及细胞骨架的重组，膜的突出，细胞一侧表面粘附的建立，最后是细胞膜从细胞后端的粘附复合物中脱离。移动细胞的肌动蛋白丝和质膜使细胞延伸成更细长的形状，并形成可能含有称为微刺的伪足的层状伪足（图2.18，面板2.33）。肌动蛋白丝的重组发生在移动细胞前缘的几分钟内。在“开放”表面（即不拥挤）上，细胞随机移动。它们表现出运动和接触回避，这意味着当两个移动的细胞相遇时，两者都会朝相反方向移动。此外，当细胞分裂完成时，分裂的母细胞的两个子细胞会彼此远离。细胞迁移受许多因素调节，包括生长因子。例如，上皮细胞对肝细胞生长因子的反应是相互远离并变得更加分散，而不是形成上皮细胞典型的细胞簇。 图 2.18. 正在移动的成纤维细胞。从前沿伸出的伪足和少量的丝状突起。 在细胞生物加工中，并没有意图控制或操纵细胞迁移。在将粘附细胞培养在表面上的情况下，它们可能在细胞接种后重新分布。然而，由于它们的运动主要是随机的，它们通过接触回避分布自己的能力限制在数十个细胞长度的局部区域。在细胞接种过程中，均匀分布它们仍然很重要。 8.生长控制 动物从胚胎到成年的生长是通过不同组织中细胞水平上对细胞质量和细胞数量增加的控制来调节的。细胞质量和细胞数量的增加可能并不总是同步的，但在几个细胞世代的过程中它们是同时发生的。尽管我们只看到了发展的增长方面，但在细胞水平上，一个生物体的生长和维持不仅涉及细胞生长，还涉及细胞死亡。细胞的生长和死亡都是严格调节的，或者是有计划的。研究得最透彻的计划性细胞死亡是凋亡。细胞生长控制和凋亡将是以下讨论的重点。 细胞生长是细胞对外在和内在信号响应的正向和负向调控之间微妙平衡的表现（面板2.34）。正向调控刺激细胞生长和增殖，抑制细胞死亡机制，而负向调控抑制生长并促进细胞死亡。来自环境的外部信号告诉细胞DNA复制和生物质合成所必需的营养物质和其他因素的可用性或缺失。同时，内部信号评估细胞的结构完整性和细胞分裂的生理准备情况，并调节细胞程序以增加细胞成分含量、分裂或死亡。凋亡的调节与生长控制类似，通过促进和抑制凋亡的因素来响应细胞损伤的内部信号和发育线索的外部信号。 8.1.细胞周期和生长控制 真核细胞在其数量增长的努力中循环地经历四个阶段：G1、S、G2和M期（图2.19，面板2.35）。G1和G2指的是间隙阶段。S和M阶段分别来自DNA合成和有丝分裂的命名。这四个阶段构成了一个细胞周期，每次一个单细胞变成两个子细胞时都会重复。在G1阶段，细胞质量和细胞大小增加。其持续时间取决于培养的化学和物理环境。细胞还将检查内部和外部条件是否准备好进入细胞周期的下一个阶段，即S阶段。在进入S阶段之前，被认为存在一个限制点。只有当细胞条件正确，必要的外部正向有丝分裂因子可用，且负向抑制因子缺失时，细胞才会通过限制点并进入S阶段。例如，成纤维细胞的增殖需要PDGF（血小板衍生生长因子），上皮细胞和许多非上皮细胞需要EGF（表皮生长因子），红细胞前体需要EPO。锚定依赖性细胞进入S阶段还需要整合素与ECM之间的接触建立以及细胞骨架网络中的适当张力。与正向因子的作用相反的是那些提供信号导致生长停滞的因素。例如，TGFβ（转化生长因子-β）抑制许多细胞类型的增殖。锚定依赖性细胞生长到融合状态后的细胞-细胞接触导致生长停止。对于需要建立细胞-细胞接触以生长的细胞，细胞间粘附连接的解离破坏了细胞的内部信号网络并导致生长停滞。有丝分裂和细胞质分裂的过程对于哺乳动物细胞大约需要一个小时，而S阶段大约需要6个小时。虽然在不同的培养条件下翻倍时间（即细胞周期的一段时间）会改变，但G1阶段是最容易被延长的阶段。处于长时间静止状态的细胞，如终末分化细胞，从G1转向退出细胞周期并进入G0阶段。G0阶段可能存在两种不同的类型：一种休息状态允许细胞最终重新进入细胞周期并增殖，或者是一种已永久关闭细胞周期重新进入机制的状态。例如，体内处于永久G0阶段的终末分化细胞，如神经元细胞。在体内和培养中处于氨基酸饥饿条件下的成纤维细胞进入休息的G0阶段。它们可以在适当的条件下重新进入G1阶段并恢复生长。 图 2.19. 哺乳动物细胞的细胞周期。 在S阶段，DNA复制发生。有机体体细胞中的DNA复制具有非常高的保真度，在染色体的序列水平和宏观结构水平上都是如此。我们体内的所有>1012细胞基本上具有相同的基因组序列和染色体组织。在S阶段结束时，一个细胞已经复制了其基因组或DNA内容，顺序正确，错误率极低。对于某些癌细胞或培养中的细胞系来说，情况可能并非如此。例如，在DNA序列水平上，与基因组的其余部分相比，CHO细胞中的基因组DNA片段可以看到增益或丢失副本。当从克隆中衍生出已知具有非整倍体核型的CHO细胞时，它们最初具有相同的染色体组织。然而，几代之后，它们的后代具有非常不同的染色体数量和组成。 在G2阶段之后，复制的基因组以两组染色体的形式，在M阶段（称为细胞质分裂）中分离。随着细胞核分裂成两个，每个细胞核都接收到构成二倍体基因组的一组染色体。随后，细胞质材料和细胞核被分配到两个子细胞中。细胞质分裂的过程具有非常高的保真度。然而，在连续细胞系和癌细胞中并非如此。这些异常细胞中DNA合成和修复的错误导致异常染色体的产生，而细胞质分裂中的错误导致不同细胞具有不同组成的染色体（即异常核型）的异质群体。这种基因组复制控制的缺乏保真度是这些细胞特性的一部分。在分离单个细胞以开始新的细胞群体之后，即使整个群体来自单一祖先核型，群体的染色体组成再次变得异质。 细胞周期蛋白和CDKs 通过细胞周期（G1、S、G2和M）的进展是由细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）正向调节，并由CDK抑制因子（CDIs）负向控制。特定于阶段的细胞周期蛋白对于G1、G1/S、S和M阶段在细胞周期中上升和下降，并与不同的CDKs相互作用形成特定于细胞周期阶段的细胞周期蛋白-Cdk复合物。不同的细胞周期蛋白-Cdk复合物进一步通过激活和失活磷酸化以及与CDI结合在活性水平上进行调节。此外，细胞周期蛋白-Cdk复合物还受到蛋白水解调节（图2.20）。 图 2.20. 细胞生长调控与细胞凋亡调控之间相互作用的示意图。Cdk：细胞周期依赖性激酶，IRF1：干扰素调节因子1，RB：视网膜母细胞瘤蛋白，ERK：细胞外信号调节激酶，FADD：FAS相关死亡结构域蛋白，FLIP：FLICE抑制蛋白，EIF4E：真核生物翻译启动因子4E，Cyc：细胞周期蛋白，XIAP：交联抑制凋亡蛋白，APAF1：凋亡肽酶激活因子1，BAX：Bcl-2相关X蛋白，BAK：Bcl-2同源拮抗剂/杀手，Ub：泛素化，Cyt C：细胞色素C。 这些调节蛋白中的每一个都在整个细胞周期中显示出特征性的动态轮廓（图2.21）。细胞周期蛋白-Cdk复合物的活性轮廓是其组成部分的表达和相互作用的结果，这些部分进一步受到激活、失活和降解的调节，所有这些都按照节奏进行编排。重要的是，这种编排是动态的，能够响应环境线索，如营养物质的丰富或缺乏、DNA损伤或染色体分离紊乱。 图 2.21. 细胞周期不同阶段中细胞周期蛋白的动态表达。 在从G1到S阶段的过渡期间，一个重要的细胞周期检查点会出现。G1/S阶段转换中的关键角色是调节性视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）和Cdk4/6-细胞周期蛋白D复合物（即G1-Cdk复合物）（图2.20）。在生长抑制或静止的细胞中，Rb未磷酸化并结合并抑制其E2F。E2F是一种转录因子，激活S阶段的细胞周期蛋白E和其他蛋白的转录。当处于与Rb结合的状态时，它抑制它们的转录。在生长因子和其他线索的刺激下，ERK（生长调节信号系统的关键角色）激活G1-Cdk复合物（通过像c-Myc这样的转录因子）磷酸化Rb。磷酸化的Rb从E2F上解离，导致细胞周期蛋白E的表达激活，进而推动Cdk2的激活和细胞周期蛋白E-Cdk2（G1/S Cdk复合物）的形成。E2F对Rb磷酸化的正反馈导致Rb的高度磷酸化和Cdk2的激活。S阶段细胞周期蛋白，细胞周期蛋白A，在G1阶段晚期开始积累，但被抑制剂结合。G1-Cdk复合物促进去除抑制以使S-Cdk复合物积累，标志着进入S阶段。 正常细胞严格遵循通过限制点的内部和外部条件的要求，但癌细胞和连续细胞系并非如此。用于治疗蛋白生产的几乎所有细胞系，包括CHO、BHK、HEK293和鼠骨髓瘤细胞，都失去了正常的生长控制。它们的细胞周期检查点控制已经受到损害，对有丝分裂原和细胞粘附复合物形成的要求已经放宽。然而，并非每个细胞系中负责生长控制放宽的分子机制都完全表征。CHO细胞有一个扩增的基因组区域，编码c-Myc基因，一个癌基因，以及一个突变的TP53，一个肿瘤抑制基因。基因TP53的产物，p53，将外部压力信号介导到细胞周期调节器以限制细胞周期。其基因组在DNA复制、删除和染色体重组方面也具有高度的结构异常。CHO细胞中导致其高度不稳定的生长行为（例如，生长因子和锚定独立性）的细胞周期控制中存在哪些额外的基因组变化仍不清楚。 8.2.程序化细胞死亡和凋亡 生物体中的大多数细胞死亡是受调节或程序化过程的一部分，而不仅仅是广泛损伤的结果。凋亡是响应发育线索或累积的非致命压力的受调节细胞死亡过程（面板2.36）。细胞可能因生物体的利益而被编程死亡的原因有很多。在某些发育事件中，生成的细胞数量超过了最终构成分化组织的数量，多余的细胞将经历凋亡并死亡。死亡的细胞随后被邻近细胞吞噬并消失。这在神经组织发育中可以看到，那里生成了大量的神经细胞。这些细胞需要数量有限的积极生存信号。那些接收到足够数量的积极信号的细胞存活下来构成神经组织，而那些没有接收到的则经历凋亡并死亡。一些细胞被生成只为了一段时间的功能。在它们超过预期的活动时间后，它们被编程为死亡。例如，像抗体产生的浆细胞和自然杀伤细胞这样的免疫细胞，为一段时间的功能服务，然后进入凋亡并死亡。被病原体感染和损伤的细胞也进入程序化细胞死亡，从而减少病原体向其他未感染细胞的传播。 程序化细胞死亡的类型传统上根据垂死细胞的形态变化进行分组，尽管近年来分子机制已经变得更加清晰。凋亡以特定的细胞形态变化为标志：线粒体膜破裂、DNA凝缩和碎片化、染色质收缩和膜膨胀。最终的细胞内事件涉及一系列导致细胞破坏的级联反应。在体内，死亡的细胞和碎片通常在它们完全破裂之前被邻近的吞噬细胞吞噬。第二种类型的细胞死亡，坏死，类似于坏死，即由损伤累积引起的细胞死亡。它以细胞质膜的破裂和细胞内容物的释放为标志，因此可能有助于炎症反应，如在免疫细胞的程序化细胞死亡中所见。 与发育事件相关的凋亡是通过将细胞外配体结合到细胞膜上的死亡受体来介导的，称为外在途径。另一条途径，内在途径，在细胞压力下激活，如营养耗尽、生长因子剥夺、病毒感染或代谢物积累。内在途径也被称为线粒体途径。压力诱导的细胞内信号激活内在途径，从而导致细胞死亡。 通过这两种途径的自我毁灭的最终行为在所有凋亡机制中都是相似的。然而，死亡受体途径和线粒体途径的启动“信号”是不同的（图2.20）。 外在途径 在许多发育事件中，单个细胞只服务有限的时间段。这些细胞被编程在达到功能寿命后进入凋亡。它们的生存依赖于积极因子的存在和消极效应因子的缺失。发育相关的凋亡主要由细胞表面的死亡受体调节。死亡受体途径是通过配体与死亡受体的结合来介导的。受发育调控的凋亡细胞在其表面表达死亡受体，例如Fas死亡受体。外部Fas配体与死亡受体的结合招募一个适配分子，Fas相关死亡域（FADD），到受体的细胞质端。FADD的存在导致前体caspase 8或9与死亡受体结合，形成一个死亡诱导信号复合物（DISC）。然后caspase被蛋白水解激活，触发一系列下游效应caspases（3、6和7）的激活。这些效应caspases的激活导致细胞破坏的最后阶段。 内在（线粒体）途径 除了在能量代谢中的作用外，线粒体也在凋亡的调节中起着关键作用。一些促凋亡蛋白被隔离在线粒体外膜和内膜之间的空间中。细胞色素C，一种与线粒体内膜相关的血红蛋白，是电子传递链中细胞色素C复合体的重要组成部分。在应激细胞中释放细胞色素C和那些促凋亡蛋白启动了凋亡的内在途径（图2.22）。释放到细胞质中的细胞色素C与APF1、前体caspase 9和dATP形成复合物，统称为凋亡体。在凋亡体中，不活跃的前体caspase 9被激活，并随后激活下游caspases。 图 2.22. 细胞凋亡的内在（线粒体）途径。 线粒体凋亡途径涉及正向促凋亡和负向抗凋亡因子。由20多个促凋亡或抗凋亡蛋白组成的Bcl-2家族是线粒体凋亡途径的主要角色。促凋亡亚家族包括BAX、BAK和BOK，它们都包含BH1、2和3同源结构域。暴露于死亡信号时，BAX经历构象变化并转移到线粒体，在那里它插入到线粒体外膜并形成通道。这些通道允许细胞色素C和其他促凋亡分子的泄漏。两个抗凋亡蛋白，Bcl-2和Bcl-xL，对抗促凋亡组分的作用。Bcl-2位于线粒体膜上，通过维持膜的完整性来抑制促凋亡分子从线粒体中的释放。Bcl-xL位于细胞质中，与Bcl-2家族的促凋亡成员结合。多个主角和拮抗因子的参与确保了凋亡事件的严格控制。 对于培养中的细胞，凋亡也会在一些应激条件下发生。通过化学手段或遗传改造来延迟凋亡并延长细胞培养的持续时间是诱人的。例如，已经探索了大量caspase抑制剂用于体外以及动物模型。在培养细胞中过表达抗凋亡基因已被证明可以延迟培养后期细胞活性的下降。 9.结束语 本章提供了对生物技术学家实践细胞培养过程所必需的细胞关键生物学特征的简明概述。细胞的结构和组成赋予了它们的功能多样性，但也限制了它们的能力。在利用它们的生物学多样性的同时，我们还必须了解细胞的结构和功能限制以及生物学限制。我们必须记住，细胞生物加工的目标是充分利用细胞的生物学潜力进行技术应用。为此，限制可能不受细胞性质的约束；相反，工程可以用来促进我们目标的实现。通过更好地了解细胞的能力和限制，我们将能够进一步推动技术边界。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。