Mirdametinib

导语：真正的“致病基因”不一定藏在基因里 2024年，Stankey、Bourges、Haag等人在Nature发表研究“A disease-associated gene desert directs macrophage inflammation through ETS2”。这项研究从一个位于21号染色体q22区域（chr21q22）的非编码风险位点出发，解析了一个长期困扰免疫遗传学的问题：一个没有蛋白编码基因的“基因荒漠”，究竟如何增加炎症性肠病（IBD）等免疫介导炎症病的发生风险？研究最终将机制指向ETS2：该基因编码ETS家族转录因子，是人类炎症型巨噬细胞反应的核心调控因子。 这篇文章的重要性不在于发现了一个“新的炎症因子”，而在于把GWAS非编码风险位点 → 远程增强子 → 关键转录因子 → 原代人巨噬细胞炎症程序 → 疾病组织验证 → 潜在药物干预串成了一条较完整的因果链。对于IBD研究而言，它提供了一个非常典型的范式：遗传风险并不只是“统计学关联”，也可以被解析为具体的细胞类型、调控元件和炎症通路。一、研究背景：GWAS发现了很多风险位点，但真正被“破案”的很少 自身免疫和炎症性疾病正在成为重要公共健康负担。接近5%的人群受到自身免疫或炎症性疾病影响，而进入临床开发的药物最终获批比例约为10%，失败的主要原因之一是疗效不足，这反映出我们对疾病机制的理解仍然有限。对于IBD而言，GWAS已经发现超过240个风险位点，但真正被机制性解析的不足10个。 这正是本研究切入的核心问题：多数疾病风险变异并不位于蛋白编码区，而是位于非编码调控区域。它们可能通过改变增强子活性、染色质开放性、转录因子结合和远端基因表达，最终影响疾病易感性。chr21q22就是这样的典型区域：它位于所谓“基因荒漠”，没有直接编码蛋白的基因，却与IBD、强直性脊柱炎、原发性硬化性胆管炎和Takayasu动脉炎等免疫介导炎症病相关。二、科学假设：chr21q22风险单倍型可能通过巨噬细胞增强子调控远端ETS2 研究团队提出的核心假设是：chr21q22虽然是非编码区域，但其中可能存在一个在髓系细胞中特异活跃的远端增强子；该增强子通过三维基因组互作调控某个远端基因，而这个基因可能是多个炎症性疾病共享的关键病理开关。 通过H3K27ac ChIP-seq，研究者首先在chr21q22位点识别到一个单核细胞/巨噬细胞特异性活跃增强子。随后，利用人类单核细胞的 promoter-capture Hi-C 和 eQTL 数据，团队发现该疾病相关区域与ETS2启动子发生物理互作，而ETS2距离该区域约290 kb；同时，风险单倍型与更高的ETS2表达相关。 换句话说，这片“基因荒漠”并不是无功能区域，而是一个远程调控模块。它并不编码蛋白，却能通过增强子机制“遥控”ETS2表达，从而改变巨噬细胞的炎症状态。三、研究设计：从遗传学定位到原代人细胞功能验证 这项研究采用了多层级功能基因组学策略，技术路线非常完整。 第一步是遗传学定位。研究者对chr21q22相关疾病进行共定位分析，判断不同疾病的遗传关联是否来自同一因果变异或同一分子效应。结果显示，这一区域在多种免疫介导炎症病中的关联具有共同遗传基础。 第二步是候选调控元件验证。研究者在原代人单核细胞中使用CRISPR–Cas9删除chr21q22区域的1.85 kb增强子，随后将细胞置于TPP炎症模型中培养。TPP模型由TNF、前列腺素E2和Pam3CSK4共同刺激，用以模拟慢性炎症环境。结果显示，删除该增强子显著削弱ETS2上调，而对附近候选基因BRWD1和PSMG1影响不明显。扩展数据中显示，该chr21q22增强子平均删除效率为42.4%（n=11）。 第三步是寻找具体因果变异。研究者在原代炎症型巨噬细胞中改造并应用MPRA，对含候选SNP的约2 kb区域进行功能扫描。实验使用来自8名供者的细胞，识别出一个442 bp增强子活性核心区域，坐标为chr21:40466236–40466677（hg19）。该区域包含7个候选SNP中的3个，其中rs2836882具有最强的表达调控效应，风险等位基因G增强转录活性。 第四步是功能因果验证。研究者分别进行了ETS2敲除、ETS2过表达、RNA-seq、代谢流分析、CUT&RUN、疾病组织单细胞转录组、空间转录组以及药物扰动分析。ETS2敲除实验中，两条gRNA的平均编辑效率分别为89.7%（n=31）和78.6%（n=14）；细胞活性未下降，NTC、gRNA1和gRNA2组细胞活率分别约为97.9%、98.3%、98.6%（n=6），说明观察到的炎症变化并非由细胞死亡或分化失败造成。四、关键结果一：rs2836882是增强子活性的关键“分子旋钮” MPRA结果显示，rs2836882风险等位基因G能增强转录活性。进一步机制分析发现，rs2836882位于巨噬细胞PU.1 ChIP-seq峰内。PU.1是髓系细胞中重要的先锋因子，能够促进染色质开放并帮助其他转录因子进入调控区域。研究者在杂合子巨噬细胞数据中观察到明显等位基因特异性结合：PU.1对rs2836882风险等位基因的结合强度超过非风险等位基因4倍。 ATAC-seq进一步显示，rs2836882杂合供者的单核细胞和巨噬细胞在该位点存在等位基因特异性染色质开放差异。H3K27ac ChIP-seq则显示，风险等位基因纯合供者在rs2836882所在增强子处具有更强增强子活性，并使该位点整体调控活性约增加2.5倍。 因此，该研究建立了较清晰的分子链条：rs2836882风险等位基因 → PU.1结合增强 → 染色质开放性增加 → chr21q22远端增强子活性增强 → ETS2表达升高。 Figure1. chr21q22这个IBD相关“基因荒漠”并非无功能区域，而是包含一个在单核细胞/巨噬细胞中特异活跃的调控增强子，该增强子通过远程作用调控ETS2表达。 研究首先显示chr21q22与IBD及其他免疫炎症疾病存在遗传共定位；随后通过H3K27ac ChIP–seq、eQTL和pcHi-C数据，把该非编码风险位点与远端基因ETS2联系起来。功能实验进一步显示，删除chr21q22增强子主要降低ETS2表达，而不是BRWD1或PSMG1。精细定位和MPRA实验将关键功能变异锁定到增强子内，尤其是rs2836882。该位点的风险等位基因增强PU.1结合，并伴随更高的染色质开放性和H3K27ac增强子活性。整体上，图1建立了后续机制研究的基础：IBD风险变异rs2836882通过增强PU.1介导的增强子活性，上调ETS2，从而可能驱动巨噬细胞炎症程序。五、关键结果二：ETS2是炎症型巨噬细胞功能所必需的核心转录因子 为了确认ETS2是否真正驱动炎症程序，研究者在原代人单核细胞中敲除ETS2，并将其分化为TPP炎症型巨噬细胞。结果显示，ETS2破坏后，促炎细胞因子产生明显下降，包括IL-6、IL-8和IL-1β；而抗炎细胞因子IL-10受影响较小。由于TNF本身被加入培养体系中，研究者没有评估内源性TNF分泌变化。 除细胞因子外，ETS2还影响巨噬细胞的效应功能。研究者使用荧光标记zymosan颗粒检测吞噬功能，发现ETS2破坏后吞噬指数下降；同时，ETS2破坏显著降低细胞外ROS氧化爆发，并伴随NADPH氧化酶关键组分表达降低。相关功能实验样本量包括细胞因子检测n=8、吞噬实验n=7、ROS实验n=6。RNA-seq进一步显示，ETS2破坏导致广泛转录变化，许多炎症相关基因表达下降，包括TNFSF10/TRAIL、TNFSF13、IL1A、IL1B、CXCL3、CXCL5、CCL2、CCL5、S100A8、S100A9、MMP14、MMP9、FCGR2A、TREM1、TLR2、TLR6、NOD2、GPR84和NLRP3等。通路富集分析显示，下调最显著的通路集中在巨噬细胞激活、炎症细胞因子产生、吞噬和ROS生成；而氧化磷酸化和有氧呼吸相关通路相对上调。这说明ETS2并不是只调节单个炎症因子，而是控制一个多维度炎症效应模块：细胞因子、趋化因子、吞噬、ROS、模式识别受体和代谢状态均受到其影响。 Figure2. ETS2是炎症型巨噬细胞发挥炎症效应所必需的关键因子。研究者通过编辑/破坏ETS2后发现，巨噬细胞的细胞因子分泌、吞噬zymosan颗粒能力、ROS产生以及NADPH氧化酶相关组分表达均受到影响。RNA-seq进一步显示，ETS2破坏会引起广泛的转录组改变，并通过fGSEA提示这些变化集中在巨噬细胞炎症反应相关通路中。最后，chr21q22增强子删除导致的基因表达变化与ETS2编辑后的变化方向一致，支持该增强子通过调控ETS2来影响巨噬细胞炎症程序。简言之，这张图从功能、转录组和遗传调控三个层面说明：chr21q22–ETS2轴是驱动炎症型巨噬细胞反应的重要机制。六、关键结果三：ETS2过表达足以重建疾病样巨噬细胞炎症状态 如果一个分子是疾病风险轴上的关键节点，那么升高它应该能够推动细胞进入疾病相关状态。研究者因此在静息人巨噬细胞中过表达ETS2，并给予低剂量LPS作为轻度炎症启动信号。结果显示，ETS2过表达可增加促炎细胞因子分泌，而IL-10仍然受影响较小。RNA-seq显示，ETS2过表达以剂量依赖方式诱导此前在ETS2敲除中被抑制的炎症通路，包括巨噬细胞激活、细胞因子产生、ROS生成、吞噬和迁移。更关键的是，ETS2过表达诱导的转录状态与克罗恩病肠道巨噬细胞单细胞RNA-seq特征高度相似，并富集多个治疗靶点相关基因。类似富集也见于其他chr21q22相关疾病的髓系细胞特征，而对流感或肿瘤巨噬细胞特征的富集较弱，提示ETS2并非简单诱导“泛炎症激活”，而是更接近特定免疫介导炎症病中的病理性髓系程序。 Figure3. ETS2过表达足以驱动巨噬细胞进入疾病相关的炎症状态。研究者通过向巨噬细胞转染ETS2 mRNA，提高ETS2表达水平，并比较其与对照细胞的转录组差异。结果显示，ETS2过表达可激活一系列在ETS2敲除时被抑制的炎症相关通路，说明ETS2不仅是炎症反应所必需的调控因子，而且其表达升高本身就能推动炎症程序启动。进一步分析发现，ETS2过表达诱导的基因表达模式与克罗恩病肠道巨噬细胞特征高度相似，也与多种免疫介导炎症病患者来源的巨噬细胞特征相吻合。最后，SNPsea分析显示，IBD遗传风险位点标记的基因在ETS2调控基因集中富集，提示ETS2通路不仅具有细胞功能意义，也与IBD遗传易感性存在联系。整体而言，图3强化了一个核心结论：ETS2是连接遗传风险、巨噬细胞炎症程序和IBD疾病表型的重要转录调控枢纽。 *其他Figure见原文链接七、关键结果四：ETS2通路与IBD遗传风险和严重表型相连 研究者进一步考察ETS2调控基因是否富集IBD遗传风险。结果显示，在ETS2敲除后稳定下调的基因中，研究者发现超过20个IBD风险相关基因，包括与巨噬细胞生物学相关的SP140、LACC1、CCL2、CARD9、CXCL5、TLR4、SLAMF8和FCGR2A等。基于这些变异构建的多基因风险评分在18,249名IBD患者中与更严重疾病特征相关，包括更早发病、更高外科手术需求，以及克罗恩病中狭窄型或瘘管型并发症。研究者还用241个IBD位点对7,658个GO生物通路和ETS2调控基因集进行SNPsea分析，并用500万组匹配随机SNP集构建零分布；结果显示，IBD相关SNP在巨噬细胞ETS2通路中的富集强于许多既往已知IBD通路。这部分结果的意义在于：ETS2通路不仅是体外细胞实验中的炎症模块，而且与真实人群遗传风险和疾病严重程度相联系。八、关键结果五：ETS2直接结合大量炎症与代谢调控基因 为了区分“ETS2相关基因”与“ETS2直接靶基因”，研究者进行了ETS2 CUT&RUN。结果在两个生物学重复中识别到6,560个可重复ETS2结合峰，其中约90%位于启动子或增强子等活跃调控区域。这些结合峰显著富集经典ETS2基序，富集倍数为4.02倍，同时也富集FOS、JUN和NF-κB等ETS2互作因子的基序。从基因层面看，ETS2破坏后发生异常表达的1,560个基因中，有754个（48.3%）在其核心启动子或顺式调控元件中含ETS2结合峰；ETS2过表达后异常表达的2,153个基因中，有1,078个（50.3%）含ETS2结合峰。ETS2直接靶基因包括NCF4、NLRP3、TLR4、HIF1A、PFKFB3、GPI、HK2和HK3等，覆盖ROS生成、炎症小体、细菌模式识别和糖酵解等关键模块。代谢实验也支持这一点。研究者用13C-葡萄糖示踪结合GC–MS观察ETS2破坏后的代谢后果，发现糖酵解和TCA循环代谢物均有下降，其中乳酸和琥珀酸显著减少。使用HIF1α稳定剂roxadustat促进糖酵解后，并不能恢复ETS2破坏造成的转录和功能缺陷，提示代谢改变是ETS2炎症程序的一部分，但不是唯一解释。九、关键结果六：疾病组织中可检测到ETS2炎症足迹 研究者还利用克罗恩病肠道单细胞RNA-seq数据分析疾病组织中的髓系细胞异质性。在髓系细胞内共识别出7个细胞簇。其中，炎症型巨噬细胞簇表达CD209、CCL4、IL1B和FCGR3A，炎症型单核细胞簇表达S100A8/A9、TREM1、CD14和MMP9；这些细胞群在疾病组织中扩增，并且较组织驻留巨噬细胞和常规树突状细胞表达更高水平的ETS2及ETS2调控基因。 在原发性硬化性胆管炎肝组织中，空间转录组也显示炎症型巨噬细胞增加，并且靠近胆管细胞。图注数据显示，距离分析纳入10,532个PSC胆管细胞和13,322个对照胆管细胞，并在21,067个PSC巨噬细胞中按其与胆管细胞距离分析ETS2调控基因表达。结果显示，巨噬细胞越靠近胆管细胞，ETS2调控基因表达越高。 这提示ETS2通路并非仅存在于培养皿中，而是可以在真实病变组织中被捕捉到，尤其是在炎症巨噬细胞与靶组织结构相互作用的空间微环境中。十、药物启示：MEK1/2抑制可模拟ETS2破坏，但不等于现阶段可直接用于IBD 由于目前没有特异性ETS2抑制剂，研究者转向上游调控网络，使用NIH LINCS数据库寻找能够“模拟ETS2破坏效应”的药物转录组签名。该数据库包含超过30,000个细胞小分子扰动转录签名，涉及约6,000种小分子。分析发现，906个签名可模拟ETS2破坏效应，其中最大的一类是MEK抑制剂。 随后，研究者在TPP炎症型巨噬细胞中使用选择性非ATP竞争性MEK抑制剂PD-0325901。在方法学部分，PD-0325901使用浓度为0.5 μM，第4天加入，第6天收集细胞进行RNA-seq分析。结果显示，MEK抑制具有强抗炎作用，并在转录层面模拟ETS2破坏或chr21q22增强子删除的效果。 更接近临床的一步是肠黏膜活检外植体实验。研究者从10名活动性、未接受免疫抑制剂或生物制剂治疗的IBD患者中采集活检组织，其中7例溃疡性结肠炎、3例克罗恩病；每名供者采集6块活检，分别接受DMSO、PD-03259010.5 μM或英夫利昔单抗10 μg/ml处理，培养18小时后检测细胞因子和转录组。结果显示，MEK抑制使炎症细胞因子释放下降至与英夫利昔单抗相近的水平，并降低ETS2调控基因表达，改善活检来源的分子炎症评分。 但这并不意味着MEK抑制剂可以直接作为IBD治疗方案。论文也明确指出，MEK在多种组织中具有生理作用，长期使用MEK抑制剂可能带来副作用；未来更合理的方向可能是开发直接靶向ETS2的策略，例如PROTAC，或通过抗体–药物偶联等方式将MEK抑制剂选择性递送至巨噬细胞。十一、研究结论：一条从非编码遗传风险到炎症执行程序的闭环 这项研究的核心结论可以概括为：chr21q22非编码风险位点中的rs2836882风险等位基因增强PU.1结合和染色质开放，提升远端ETS2增强子活性，从而增加ETS2表达；ETS2作为中心转录因子，驱动人类炎症型巨噬细胞的促炎细胞因子、吞噬、ROS、趋化、模式识别和代谢重编程程序；这一通路在IBD等疾病组织中可被检测到，并可通过上游MEK1/2抑制在体外和离体组织中被药理性压制。从免疫学角度看，ETS2不是一个单一炎症因子的上游开关，而是髓系细胞炎症状态的“程序化调控器”。从遗传学角度看，chr21q22则证明了非编码风险位点可以通过细胞类型特异性增强子远程调控疾病关键基因。十二、科学意义：这项研究为什么值得IBD领域关注？ 第一，它提供了非编码GWAS位点功能解析的范例。过去很多IBD遗传风险位点停留在统计学关联层面，难以说明“变异如何致病”。这项研究把一个基因荒漠中的风险变异具体解析到PU.1结合、增强子活性、ETS2表达和巨噬细胞炎症程序，机制链条相对完整。第二，它强调人类原代细胞的重要性。许多免疫机制在小鼠模型或细胞系中成立，但在人类疾病中未必成立。该研究大量使用原代人单核细胞/巨噬细胞、IBD患者来源细胞、疾病组织单细胞转录组、空间转录组和肠黏膜活检外植体，使结果更接近人类疾病生物学。第三，它把IBD重新放入“髓系炎症程序”的视角中。IBD治疗长期关注TNF、IL-12/23、整合素、JAK、S1P等通路，而这项研究提示，上游转录调控网络可能同时影响多个炎症效应模块。ETS2通路涉及TNF、IL-23、IL-1β等多个治疗相关因子，具有整合性治疗靶点的潜力。局限性、需要谨慎解读的地方 这项研究虽然机制完整，但仍不能被解读为“发现了IBD治愈方法”。目前证据主要来自功能基因组学、原代细胞实验、患者组织数据和离体活检培养，并不是临床试验。MEK抑制剂在IBD中的疗效和安全性尚未通过随机对照临床研究验证。研究者本人也强调，长期MEK抑制可能并不理想，未来需要更安全、更靶向的药物设计。此外，IBD是高度异质性疾病。ETS2通路可能解释一部分患者、特别是一部分髓系炎症占优势患者的病理机制，但不应被视为所有IBD炎症的唯一来源。上皮屏障、肠道菌群、适应性免疫、神经免疫和环境暴露仍然共同参与疾病发生发展。 本文仅限于医学科研进展分享，内容仅供医疗专业人员学术参考，不构成任何诊疗建议。作者及其团队不对因使用本文内容所产生的任何后果承担责任。本文不适用于非专业人士疾病教育或健康指导。如需转载，请在公众号后台联系；转载请注明出处：GI-Insight（微信GIIME-Insight)

Abstract The Hippo signaling pathway prevents unchecked cell growth, coordinates apoptosis, and preserves proper organ function. Dysregulation of this pathway has been implicated in a myriad of diseases, particularly in cancer. The YAP (Yes-associated protein)–TEAD (TEA domain transcription factor) complex, the key transcriptional downstream effector of the Hippo pathway, hence stands out as an appealing target for therapeutic intervention. In this study, we developed a high-throughput screening (HTS) assay leveraging phase separation principles and found that the US Food and Drug Administration–approved clinical drug cobimetinib is a potent inhibitor of the YAP-TEAD complex. Cocrystallization studies of cobimetinib with TEAD showed that cobimetinib bound to the TEAD lipid pocket and disrupted TEAD palmitoylation. Cobimetinib could overcome resistance to mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 inhibitors and to the first-line drug sorafenib in vivo. In addition, cobimetinib suppressed tumor growth and tumorigenesis associated with hyperactivated YAP-TEAD activities in a mouse model of lung cancer. Furthermore, it bolstered the efficacy of the first-line drugs sorafenib and lenvatinib in inhibiting both hepatocellular carcinoma tumor growth and tumorigenesis. These findings establish a strategy for identifying and refining inhibitors of the YAP-TEAD complex in the treatment of cancers driven by aberrant YAP-TEAD activity. 1. 通讯作者研究领域介绍 本文由上海交通大学生命科学技术学院的张雷教授、于晶副研究员，北京师范大学的贺晓静教授，清华大学的李丕龙副教授和北京生命科学研究所的齐湘兵研究员共同担任通讯作者。张雷教授来自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，长期聚焦于Hippo信号通路调控器官大小与肿瘤发生的分子机制研究，其实验室在YAP/TAZ活性调控、蛋白质泛素化降解及肝癌发生模型构建方面有系统性贡献。李丕龙教授任职于清华大学，是相分离领域的国际知名学者，其团队率先发展并应用相分离辅助的生物分子互作富集技术用于高通量药物筛选，为靶向“不可成药”蛋白-蛋白相互作用提供了全新方法学范式。贺晓静教授团队擅长结构生物学手段解析蛋白-小分子互作，在TEAD蛋白的结构功能关系及抑制剂的共晶解析方面具有丰富经验。上述多学科团队的交叉协作，为本研究从技术发明、机制解析到转化应用的全链条推进奠定了坚实基础。 2. 研究背景与科学问题的发现逻辑 2.1 关键蛋白在疾病中的研究进展 Hippo通路是进化上高度保守的抑癌信号轴。其核心效应分子YAP和TAZ作为转录共激活因子，通过与TEAD转录因子家族（TEAD1-4）形成功能性转录复合体，驱动CYR61、CTGF、ANKRD1、Survivin等一系列靶基因表达，进而促进细胞增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡。参与该通路失调的肿瘤类型极为广泛，包括但不限于肝细胞癌、间皮瘤、肺癌、结直肠癌及胰腺癌等。 从结构生物学角度看，YAP/TAZ因其内含的固有无序区而缺乏经典的可成药口袋，直接靶向YAP/TAZ蛋白本身面临结构性困难。反而，TEAD蛋白被证实含有一个位于中心的疏水性脂质口袋，该口袋能够容纳棕榈酸并以自棕榈酰化的方式促进TEAD构象成熟，这是TEAD与YAP高效结合并启动后续转录程序的关键前提。这一发现使得靶向TEAD脂质口袋、阻断YAP-TEAD相互作用成为研发Hippo通路抑制剂最有前景的突破口。 2.2 研究瓶颈与未满足的临床需求 已报道的TEAD抑制剂多为靶向脂质口袋的变构结合分子，包括VT-104、K-975、GNE-7883及TED-347等。然而，绝大多数处于临床前研发阶段，且普遍存在阻断YAP-TEAD结合效率不高、抗增殖活性有限、体内药效不足等问题。少数竞争力强的化合物如NVP-IAG933通过直接与YAP/TAZ竞争TEAD上的Ω-loop结合位点发挥作用，但至今尚无一个TEAD靶向结合剂获得FDA正式批准上市。与此同时，在肝癌领域，一线标准药物索拉非尼及仑伐替尼由于总体响应率有限以及原发性与继发性耐药的普遍存在，其临床获益被严重削弱。大量的临床前证据显示YAP-TEAD过度激活是驱动上述靶向治疗耐药的重要机制之一。 2.3 从相分离技术优势到研究问题的提炼 近期，李丕龙团队成功开发了CEBIT技术，其核心原理是利用YAP蛋白内在的相分离能力，在体外形成富集YAP蛋白的液-液相分离凝聚体，再利用生物分子在凝聚体内和溶液间的分配差异，敏感且定量地检测蛋白-蛋白相互作用。与传统荧光共振能量转移、AlphaScreen或表面等离子体共振等技术相比，CEBIT具有所需蛋白量极低、信噪比高、可适配384孔板高通量成像分析等显著优势。基于上述积累，研究团队提出核心科学问题：是否可以利用CEBIT技术大规模筛选YAP-TEAD相互作用抑制剂，并从中发现具有确定临床背景的小分子药物，通过老药新用策略实现快速的临床转化？ 3. 主要研究内容与研究思路 本研究的整体逻辑遵循“技术开发-高通量筛选-分子机制解析-多模型药效验证-联合用药策略评估”的全产业链研究范式。 研究主线包括：首先，利用融合EGFP-SH3-YAP(50-100)与EGFP-PRM的相分离系统及mCherry-TEAD4-YBD荧光报告探针，建立基于高内涵成像的YAP-TEAD结合抑制剂筛选平台。其次，对包含6365个化合物的分子库进行筛选，鉴定出具有明确FDA批准背景的MEK1/2抑制剂Cobimetinib可作为高效的YAP-TEAD抑制剂。接着，通过GST pull-down、微量热泳动、共免疫沉淀与CoPIC分析验证其在体外与体内破坏YAP-TEAD结合的能力；进一步，通过共结晶学、分子动力学模拟和体外自棕榈酰化检测解析其作用于TEAD脂质口袋的分子机制。然后，在MEK1/2双敲除细胞中排除经典靶点干扰，并在MEK1 Δ98-103突变、NF2缺失型间皮瘤、LATS1/2缺失以及索拉非尼耐药模型等多维度生物体系中验证其对YAP-TEAD活跃型肿瘤的特异性抑制活性。最后，在多种异种移植瘤模型和转基因肝癌模型中系统评估Cobimetinib单药及与索拉非尼、仑伐替尼联用的治疗潜力与安全性。 4. 详细研究方法 4.1 高通量筛选体系的构建 将YAP的TEAD结合域（YAP50-100）与增强型绿色荧光蛋白- SH3结构域串联融合为多价态探针，与带mCherry荧光且融合TEAD4 YAP结合域的探针共存于由多价态PRM介导的相分离液滴中。特异性结合导致mCherry荧光信号在EGFP标记液滴内显著富集。通过高内涵成像系统定量mCherry/EGFP信号比，反映化合物对结合强度的抑制效果。使用已知干扰肽Super-TDU和化合物VT-104验证体系的灵敏性与特异性，并计算Z'因子确认其适用于高通量筛选。 4.2 细胞和分子生物学验证 使用GST pull-down实验在体外确认Cobimetinib对YAP-TEAD4YBD结合的直接破坏作用。利用微量热泳动分析定量评估其与TEAD4YBD的解离常数。在NCI-H226和HEK293T中，通过内源性与外源性共免疫沉淀分别验证Cobimetinib对全长蛋白复合体的解聚效应。CoPIC法在细胞内重现液滴富集系统检测YAP-TEAD抑制效果。反向定量PCR与Gal4-TEAD4荧光素酶报告系统分别检测Cobimetinib对靶基因mRNA水平和TEAD转录活性的影响。 4.3 结构生物学与分子动力学分析 生物素标记的Cobimetinib衍生物用于pull-down实验证实其与TEAD4的物理结合。以TEAD2 YAP结合域为模板，解析Cobimetinib-TEAD2复合物分辨率达2.7 Å的共晶结构。同时，进行多系统（Apo TEAD及Cobimetinib、MGH-CP1、GNE-7883、VT-105等结合型）的全原子分子动力学模拟，分析配体结合对蛋白构象波动和关键残基接触数的影响。体外自棕榈酰化实验通过炔基标记的棕榈酰辅酶A和点击化学标记检测Cobimetinib对TEAD活性成熟过程的直接抑制。 4.4 耐药与遗传背景定义的模型系统 构建HeLa-MEK1/2双敲除细胞以消除Cobimetinib经典型MEK靶点的干扰。引入致癌突变MEK1 Δ98-103及索拉非尼耐药细胞系评估Cobimetinib对YAP依赖型耐药的逆转。利用NF2缺陷的人间皮瘤细胞系列和LATS1/2缺失细胞验证其对YAP活跃型增殖抑制的特异性。 4.5 体内药效及肝致癌模型评价 在A549-MEK1突变体异种移植、NCI-H226 CDX、HeLa-LATS1/2 DKO CDX及Huh7 CDX模型中，每日口服给药，比较Cobimetinib、Selumetinib、PD0325901及索拉非尼的抑制瘤重效果，结合免疫组化（Ki67、cleaved caspase-3、pERK1/2、CYR61）解析增殖与凋亡改变。在Myc; sg-p53及Mst1/2 DKO转基因肝炎癌模型中观察对肿瘤数量、肿瘤分级、血清转氨酶水平的影响，评估功能保护。 5. 主要结果 5.1 高通量筛选与Cobimetinib的发现 CEBIT体系的Z'因子为0.574，显示优秀筛选窗口。在单浓度10 μM初步筛选中，Super-TDU作为阳性对照表现稳定。针对6365个化合物，最终确认Cobimetinib以IC₅₀约7.11 μM抑制YAP-TEAD相互作用。 5.2 分子机制与TEAD脂质口袋的共占 GST pull-down与MST分析显示Cobimetinib直接将YAP-TEAD4YBD复合物的结合亲和力大幅降低。内源性及外源性co-IP实验均表明处理后YAP-TEAD4复合物丰度显著下降。共晶结构表明Cobimetinib深嵌入TEAD2的疏水脂质口袋，被Phe²⁵¹、Phe³⁸²及Phe⁴²⁸等形成的高度疏水环境包围，其空间位置与天然配体棕榈酸完全重叠。分子动力学模拟进一步指出结合导致TEAD表面原子波动显著降低，说明脂质口袋占据变构稳定了蛋白表面，从而不利于YAP结合。体外自棕榈酰化实验直观显示Cobimetinib以剂量依赖方式阻断TEAD4的棕榈酸修饰。 5.3 MEK非依赖的抗YAP-TEAD效应 在MEK1/2双敲除HeLa细胞中，Selumetinib及PD0325901处理完全丧失对ERK1/2磷酸化和其下游靶基因FOSL2、JUN表达的影响，但Cobimetinib仍能显著抑制细胞增殖、克隆形成及CYR61、CTGF表达，并在HEK293T中破坏YAP-TEAD结合，确认其独立于MEK的YAP-TEAD靶向功能。 5.4 突破MEK突变驱动与获得性耐药的疗效 MEK1 Δ98-103缺失突变上调YAP报告活性与靶基因表达，且该效应依赖于ERK1/2激酶途径对YAP的磷酸化激活，并可被YAP S94A突变或YAP敲低消除。Cobimetinib在MEK1 Δ98-103异种移植模型中的抑瘤效果显著优于PD0325901和Selumetinib，机制归因于促进凋亡与降低CYR61表达水平的协同。此外，Cobimetinib同样克服了A549-TramR细胞以及Huh7-SorR细胞的获得性耐药，实现显著抗增殖与克隆抑制。 5.5 抑制YAP高度活化相关肿瘤 在NF2缺陷的间皮瘤细胞和LATS1/2缺失的HeLa细胞中，Cobimetinib相较PD0325901显示出更强的细胞活力抑制能力。体内数据亦表明，Cobimetinib治疗可显著延缓NCI-H226和HeLa-LATS1/2 DKO肿瘤生长，降低肿瘤组织中CYR61、CTGF、ANKRD1的mRNA水平。敏感性分析进一步揭示TEAD1或LATS1/2状态与Cobimetinib的响应正相关。 5.6 肝肿瘤生长及肿瘤发生的遏制效应 在Huh7肝癌CDX中，Cobimetinib抑制增殖和克隆形成，体内给药显著减小瘤体积与瘤重，且作用机制关联Ki67信号减弱与cleaved caspase-3活化。在Myc; sg-p53肝炎癌模型中，Cobimetinib三周给药后显著减少肝肿瘤数量，大量缩小病灶面积，同时明显降低血清ALT与AST水平。在Mst1/2 DKO及Nras(G12V); Myr-Akt遗传模型中，Cobimetinib同样表现出对肿瘤数目、分级和靶基因转录的强力抑制。 5.7 索拉非尼及仑伐替尼的协同增效 索拉非尼单药处理可反映性增强YAP活性，而在体外及体内联合Cobimetinib后，细胞增殖与克隆生成的抑制效果均优于各单药组。在Myc; sg-p53与Nras(G12V); Myr-Akt模型中，联合用药较单药进一步削减肿瘤数目与Ki67阳性信号，降低血清转氨酶。仑伐替尼尽管对pYAP及CYR61无明显影响，与Cobimetinib联用同样显示出叠加性抗肿瘤和抗肿瘤生成作用。此外，Cobimetinib还在NF1敲低和GNE-7883耐药模型中克服了由MAPK活化介导的代偿性耐药，体现双靶点阻断优势。 6. 研究创新性 本研究创新性主要体现在三个层面。技术创新上，将相分离原理创造性地转化为可定量的高通量药物筛选系统，实现了在接近生理低浓度条件下灵敏检测蛋白-蛋白互作阻断剂，为靶向固有无序蛋白的化合物发现提供了通用性平台。靶点发现上，首次系统证实临床药物Cobimetinib具备直接结合TEAD脂质口袋并阻断其棕榈酰化、从而瓦解YAP-TEAD转录复合体的全新药理作用，颠覆了此前仅作为MEK1/2抑制剂的认知。转化应用上，在涵盖MEK突变耐药、NF2缺失、LATS缺失、HCC及索拉非尼耐药等多层次遗传和耐药背景模型中，全面推进了Cobimetinib单用或与肝癌一线药物联用的有效性证据链，为临床上YAP依赖性肿瘤的精准治疗和联合方案设计提供了立即可供临床检验的候选策略。 7. 总结与展望 本研究从液-液相分离技术原理出发，结合多学科交叉的筛选、结构、计算和模型生物验证，成功将已上市MEK1/2抑制剂Cobimetinib鉴定为一类作用于TEAD脂质口袋、抑制自棕榈酰化进而破坏YAP-TEAD功能性复合物形成的变构型抑制剂。在大量YAP过度激活的细胞系及动物模型中，cobimetinib独立于经典MEK靶点，均展现强效抗增殖、促凋亡及协同增效临床一线药物治疗HCC和耐药肿瘤的价值，同时具有良好的体内安全性特征。 然而，未来该领域仍需重点关注以下方向：基于患者来源异种移植模型或患者来源类器官的药效验证；不同体细胞突变背景下Cobimetinib最优联合方案的剂量和时序优化；TEAD棕榈酰化占位的药效学生物标志物开发；以及对长期用药导致TEAD获得性突变或YAP转录重编程潜在耐药机制的解析。总的来看，相分离辅助的蛋白互作筛选策略和TEAD脂质口袋的可成药性有机结合，正在为长期以来“不可靶向”的转录因子复合体提供一套系统性解决方案，并有望推动以YAP-TEAD为核心节点的抗肿瘤精准治疗进入新阶段。 8. 相关研究进展补充 近年来围绕YAP-TEAD靶点的药物开发呈加速态势。IAG933作为首个进入临床研究的直接竞争性YAP-TEAD抑制剂，其在间皮瘤和NF2突变相关肿瘤中的I期试验数据值得关注。另一方面，靶向TEAD脂质口袋的PROTAC分子以及基于mRNA展示技术筛选的环肽类TEAD结合分子也逐渐兴起。最近有团队报道，通过构建TEAD-YAP双荧光互补成像报告系统进行活细胞高通量筛选，同样发现了新颖骨架的先导化合物。功能上，有工作揭示代谢压力下AMPK激酶可通过对YAP的多位点磷酸化改变其相分离行为与转录因子活性，提示营养感知与YAP凝聚体形成的交联可能形成未来的干预层面。在肝癌转化研究方面，多项真实世界数据均提示核YAP免疫组化评分联合血清CTGF水平或可作为索拉非尼/仑伐替尼疗效预测及耐药监测的整合生物标志物。上述进展表明，靶向YAP-TEAD转录网络的药物研发和伴随诊断策略正日益成熟，为该领域的基础研究向临床输出提供了源源动力。