The primary purpose of this study is to investigate the effectiveness of Ginkgo Diterpene Lactone Meglumine (GDLM) for patients with acute ischemic stroke (AIS) in real-world settings.

开始日期2025-03-01

申办/合作机构

北京中医药大学东直门医院

ChiCTR2300070949

/ Not yet recruiting临床2期IIT

Efficacy and safety of Ginkgo biloba diterpene lactone glumine injection in patients with acute ischemic stroke: a randomized, double-blind, multi-dose, placebo-controlled Phase II exploratory trial

开始日期2023-06-01

申办/合作机构

上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院

ChiCTR2100050965

/ Recruiting临床4期IIT

Clinical study of ginkgo diterpene lactone glumine injection in the treatment of arteriosclerosis small cerebral vascular disease: a single center, self-controlled study

开始日期2021-09-08

申办/合作机构

中山大学附属第三医院（中山大学肝脏病医院）

100 项与钆喷酸葡胺相关的临床结果

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100 项与钆喷酸葡胺相关的转化医学

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100 项与钆喷酸葡胺相关的专利（医药）

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4,687

项与钆喷酸葡胺相关的文献（医药）

2026-04-01·NMR IN BIOMEDICINE

Hypoxia Imaging in Hepatic Fibrosis: A Preliminary Application of CAIX-Targeted MRI Probe in Rats.

Article

作者: Zhou, Xiaoyuan ; Gao, Yuanxiang ; Shi, Xiaojuan ; Duan, Xiaomin ; Xiao, Longyang ; Li, Zhiming ; Wang, Lili ; Zhao, Haichen ; Yu, Haiyang

This study aimed to validate the feasibility of hypoxia-targeted magnetic resonance imaging (MRI) molecular probe (CAIX-Gd) for evaluating hypoxia status in rats with hepatic fibrosis. A macrocyclic ligand compound (Compound 3) was synthesized using the carbonic anhydrase IX (CAIX) inhibitor acetazolamide as the targeting moiety, and its structure was confirmed by ¹H-NMR spectroscopy. CAIX-Gd was then prepared by chelating gadolinium, with free gadolinium content quantified via the xylenol orange assay. In biocompatibility tests, CAIX-Gd administration showed no significant histopathological changes compared with saline controls. For hypoxia detection, rats were divided into three groups: (A) hepatic fibrosis (HF) with CAIX-Gd, (B) HF with DTPA-Gd, and (C) normal controls (NC) with CAIX-Gd. The difference in T1 relaxation time (∆T1) pre- and post-contrast was measured in regions of interest (ROI). HF rats showed increased collagen deposition (Masson staining), α-SMA activation, and elevated hypoxia markers (PIMO/HIF-1α) compared to controls (all p < 0.05). In group C, mild ∆T1 shortening was seen at 10 min post-injection. While ∆T1 continuously decreased in group B, the shortening was significantly greater in group A (p < 0.05), peaking at 10 min. In conclusion, the CAIX-Gd probe was successfully synthesized and demonstrated potential for the non-invasive MRI detection of hypoxia in hepatic fibrosis.

2026-03-01·MAGNETIC RESONANCE IN MEDICINE

Recipe for Hydrogels With Tunable Relaxation and Diffusion Properties for Use as MRI Test Materials

Article

作者: Fritz, V. ; Schick, F.

ABSTRACT:

Purpose:

To develop and evaluate a preparation protocol (recipe) for hydrogels with specific relaxation times and ADC values to be used as tissue‐like test materials for MRI experiments at 3 Tesla.

Methods:

Gd‐DTPA, agarose, and soy lecithin were used as modulators for T1, T2, and ADC. First, systematic measurements were performed to determine the relaxation‐ and diffusion‐modifying properties of the single substances and combinations of them. An algorithm was developed to determine the necessary concentrations of the ingredients to achieve predetermined sets of target values (T1, T2, and ADC). To validate this approach, hydrogels mimicking the relaxation and diffusion properties of different tissues (pancreas, white matter, fibroglandular tissue, liver, prostate) were prepared and evaluated. All measurements (relaxometry, diffusion‐weighted imaging) were performed on a 3 Tesla clinical scanner at 20°C.

Results:

The proposed method allowed the preparation of hydrogels with specific diffusion and relaxation properties by adjusting the concentrations of Gd‐DTPA, agarose, and soy lecithin. Test phantoms containing hydrogels for simulation of various tissue types showed good agreement between targeted and measured properties, with deviations of less than 8% for T1, 7.5% for T2, and 11.5% for ADC. With the present approach, the properties (T1, T2, and ADC) of most known tissue classes could be well approximated; only the gray matter of the brain was slightly outside the selectable range. Temporal stability over 3 months was acceptable.

Conclusion:

This work provides a relatively simple, inexpensive, and reproducible method for the preparation of hydrogels with independently adjustable T1, T2, and ADC values at 3 T.

2026-02-17·LANGMUIR

A Preparation for High Aqueous Dispersion Fe ₃ O ₄ with Controllable Particle Size and Adjustable Aggregation State in a Magnetic Field

Article

作者: Wei, Wei ; Chai, Jinyu ; Zhu, Jinhua ; Liu, Lu ; Guo, Yiwen ; Zhang, Yun

The conventional synthesis of superparamagnetic Fe₃O₄ superparamagnetic nanoparticles (Fe₃O₄SNPs) for biomedical applications often suffers from poor aqueous dispersibility, complex multistep processes, and potential toxicity from organic solvents or surfactants. Achieving precise control over both particle size and magnetic field-driven aggregation state in a biocompatible manner remains a significant challenge. A facile one-pot hydrothermal synthesis strategy was developed using a polysaccharide-iron complex as the precursor to prepare nano-Fe₃O₄ with excellent water dispersibility. With this method, we achieved precise regulation of Fe₃O₄ particle size (3.2-12.5 nm) and magnetic field-driven aggregation behavior by optimizing reaction conditions (such as sugar content, NaOH concentration, and reaction time), making them suitable for different biomedical scenarios such as the separation of active ingredients, in vivo targeted delivery, or MRI contrast agent. The solution of synthesized Fe₃O₄SNPs remained stable at room temperature for up to six months without any precipitation and did not exhibit significant toxicity at different particle sizes. In vitro MRI performance evaluation revealed that Fe₃O₄SNPs with a particle size of 8.1 nm exhibited a high transverse relaxation rate (r2 = 189.8 mM^-1 s^-1) and a prominent r2/r1 ratio of 172.5, demonstrating potential as a T2 contrast agent; nanoparticles with a particle size of 4.0 nm displayed an r1 value approximately 1.6 times that of Gd-DTPA contrast agents, showing application potential as T1 contrast agents. This green synthesis method only uses water and polysaccharide iron complexes, thus providing a technical reference for the production of medical magnetic nanomaterials.

项与钆喷酸葡胺相关的新闻（医药）

2026-01-15

·医药企业项目管理大会

一文彻底搞懂小分子药物的靶点与靶标|新药发现

会议推荐 2026第三届中国医药企业项目管理大会 2026第二届中国AI项目管理大会 2026第十五届中国PMO大会 2026第五届中国项目经理大会本文目录 1、小分子药物靶点的发现策略 2、小分子药物的靶标识别方法总结 3、如何识别小分子药物的靶点(光亲和标记技术) 4、独家原创|谢恬教授、叶向阳研究员:以 G-四链体为靶标的小分子抗病毒药物的研究进展一、小分子药物靶点的发现策略（原创爱谱蒂康爱谱蒂康组学药学研究与创新诊断）背景介绍靶蛋白鉴定在药物研发领域中扮演着至关重要的角色，它对于理解小分子药物的作用机制、评估潜在副作用以及判断药物间的相似性具有决定性意义。传统的“探针标记”方法虽然在一定程度上有效，但其存在的周期长和可能影响药物构象的局限性促使科研人员探索更为高效、准确的方法。近年来，无标记靶点识别方法因其不涉及对小分子药物的化学修饰而备受瞩目。这类方法不仅简化了实验流程，还降低了因化学修饰可能带来的误差，从而提高了靶点鉴定的准确性和可靠性。其中，基于高分辨率质谱（MS）的方法更是为靶蛋白鉴定带来了新的突破。高分辨率质谱技术能够提供更丰富、更精确的信息，帮助科研人员深入解析药物与靶蛋白的相互作用，以及药物在复杂系统中的行为。限制性酶解-质谱分析（LiP-MS）和热稳定蛋白质组（TPP）是两种代表性的无标记靶点识别方法。LiP-MS通过酶解蛋白质并利用质谱技术检测药物结合前后蛋白质结构的变化，从而识别出药物的结合靶点。这种方法具有高通量、灵敏度高的特点，适用于大规模药物筛选和靶点鉴定。而TPP则利用蛋白质的热稳定性差异来识别药物的结合靶点。在药物作用后，某些蛋白质的热稳定性会发生变化，这种变化可以通过质谱技术进行量化分析。TPP方法同样具有高通量、准确性高的优点，并且在药物研发领域得到了广泛应用。这两种方法都无需对小分子药物进行化学修饰，从而避免了可能因化学修饰带来的干扰和误差。同时，它们的高通量特性也使得在药物研发过程中能够更快速、更准确地识别出药物的结合靶点，为药物的后续研发和临床应用提供了有力支持。综上所述，无标记靶点识别方法特别是基于高分辨率质谱的LiP-MS和TPP方法，在靶蛋白鉴定领域展现出了巨大的潜力和优势。随着技术的不断进步和应用领域的拓展，这些方法将在药物研发中发挥越来越重要的作用。 01 限制性酶解-质谱分析（Limited proteolysis mass spectrometry，LiP-MS）：以“蛋白质结构”之钥，开“药物”“靶点”互作之锁 LiP-MS是一种用于研究蛋白质与小分子相互作用的新型质谱技术。LiP-MS技术的核心在于利用蛋白质与小分子结合后构象稳定性的变化，这种变化会影响蛋白质对酶解的敏感性。在生理条件下，蛋白质具有多种空间构象，当小分子（如药物）与蛋白质结合时，可能会增加其结构的稳定性，使其抵抗酶解。通过使用广谱蛋白酶（如蛋白酶K）对蛋白质样品进行有限酶解，再利用胰酶进行二次酶解，并通过质谱检测不同处理条件下的肽段信号强度变化，从而分析蛋白质的构象变化。 02 热稳定蛋白质组（Thermal proteome profiling，TPP）：以“蛋白质稳定性”之钥，开“药物”“靶点”互作之锁 TPP是基于细胞热漂移测定(cellular thermal shift assay, CETSA) 的原理，使用多重定量质谱的蛋白质组学来监测数千种表达蛋白质的熔解曲线Tm。TPP的原理同CETSA原理，是基于蛋白质在加热过程中会发生热变性解折叠，而小分子（药物等）与靶蛋白结合后改变靶蛋白的热稳定性（通常情况下增强）。有小分子（药物等）结合的蛋白与无小分子（药物等）结合的蛋白质相比一般更稳定，Tm也更高，通过对比有无小分子（药物等）结合蛋白质的Tm和熔解曲线是否存在差异即可确定靶蛋白。分析流程 01 LiP-MS分析流程 02 TPP分析流程 03 LiP-MS及TPP对比二、小分子药物的靶标识别方法总结（原创 TSS转化医学谱 TSS转化医学谱）靶标识别是药物研究和研发过程的重要组成部分，特别是对天然活性分子的靶点机制研究和药物研发中的二级药理学研究。靶标发现分为两种主要方法：基于亲和力的pulldown方法和无标记方法。基于亲和力标记方法使用需要与标签偶联的小分子来选择性地分离鉴定靶蛋白，而无标记方法则利用自然状态下的小分子来识别靶标。本文概述了当前基于亲和力标记方法和无标记方法的靶点发现，及其优点和局限性。 1. 背景介绍靶标识别是新药发现和开发的关键阶段，因为它使研究人员了解神秘药物的作用机制。过去两个世纪药物发现和开发取得的大部分进展都可以归功于靶标识别技术的进步。通过发现药物的精确靶点分子，研究人员可以更好地针对特定疾病或靶点优化药物。靶标识别对于优化药物选择性和减少其潜在副作用也很重要。基于亲和力的pulldown方法需要用标签（例如生物素或荧光标签）标记小分子，然后用它从细胞裂解物或其他蛋白质混合物中亲和纯化其结合蛋白。在许多情况下，标记小分子可能很困难，限制了使用基于亲和力的pulldown方法的可能性。为了避免这种限制，已经开发了无标记方法来识别小分子的潜在靶标，而不需要用亲和标签对分子进行化学修饰。此外还有，在细胞水平上寻找新药物靶点的生物学方法，例如诱变和基因筛选等。 2. 基于亲和力的pulldown方法亲和纯化是鉴定小分子靶标的常用方法。在此方法中，将测试的小分子与亲和标签（例如生物素）缀合或固定在树脂（例如琼脂糖珠）上。这种化学修饰的结构用作与细胞/细胞裂解物一起孵育的探针分子。孵育后，使用亲和标签纯化出结合的蛋白质，然后可以使用SDS-PAGE 和质谱法等分离和鉴定纯化的蛋白质。这种方法在药物发现和其他研究领域非常有用。此外，它还能够确定小分子与靶标蛋白的互作构效关系。 2.1 亲和基质方法亲和基质方法是一种使用亲和基质来分离生物活性小分子的靶蛋白的方法。使用聚乙二醇（PEG）等连接子将小分子在特定位点共价连接至固相基质支持物（例如琼脂糖珠），而不改变小分子的原始活性（图1）。然后将小分子亲和基质暴露于含有靶蛋白的细胞裂解物。洗脱并收集与基质结合的任何蛋白质，然后使用质谱法鉴定靶标。该方法已被KL001、Aminopurvalanol、Diminutol、BRD0476和Encephalagen　等分子成功采用。图1. A. 偶联beads上亲和基质探针、 B. 生物素标记探针、 C. 光亲和探针、D. 光反应基团及其反应中间体的示例。 2.2 生物素标记方法生物素是一种小分子，由于其与亲和素/链霉亲和素具有很强的结合亲和力，因此常用于基于亲和力的技术。在此方法中，生物素分子通过化学键连接到感兴趣的小分子上，并将生物素标记的小分子与细胞裂解物或含有靶蛋白的活细胞一起孵育。然后，在链霉亲和素包被的固体支持物上捕获目标蛋白后，使用 SDS-PAGE 和质谱分析法来分析目标蛋白（图1 B）。采用生物素标记的方法成功鉴定了激活蛋白1（AP-1）作为PNRI-299的靶蛋白。优点：低成本且简单的目标蛋白纯化和分离。缺点：需要采用苛刻的条件才能打破它们的相互作用并从树脂中释放结合的蛋白质。释放结合蛋白的一种常见方法是将基质暴露于变性缓冲液中，例如含有 SDS 的溶液和 95-100 °C 范围内的高温。此外，将生物素附着到小分子上也会影响细胞的渗透性和表型结果。 2.3 光亲和标记方法在光亲和标记 (PAL，photoaffinity labelling) 方法中，化学探针在光照下与其靶标共价结合。在该方法中，探针设计涉及选择光反应基团（例如，将光反应基团连接到小分子的接头）和亲和标签（图1 C）。在这种情况下，光反应基团通过暴露在光下被激活，使探针与目标分子形成永久的共价键。这有助于研究目标分子的结构和功能，因为探针可用于标记目标内的特定位点或区域。PAL 中可使用多种类型的光反应基团，包括苯基叠氮化物、苯基二氮丙啶和二苯甲酮（图1 D）。当被光激活时，这些基团中的每一个都会产生不同类型的反应中间体，其具有不同的性质、并且可以以不同的方式使用。其他光反应基团包括重氮羰基、烯酮、重氮基团、硫自由基、卤化底物、重氮盐、硝基苯、以及二氮丙啶和叠氮化物的烷基衍生物等。 PAL 实验中光反应基团的选择取决于研究的具体目标蛋白或分子的特征。最近，芳基二氮丙啶已成为 PAL 中最常用的光反应基团。它们因其良好的化学稳定性和对各种变量的耐受性而受到青睐，例如温度、亲核试剂、酸性和碱性环境以及氧化剂和还原剂。芳基二氮丙啶的三氟甲基衍生物特别受欢迎，因为它的稳定性更高，并且在暴露于特定波长的光下时容易产生高反应性卡宾。然后卡宾中间体可以共价连接到目标蛋白质或分子。 PAL优点：高度特异性，允许以消除误报并提高结果精度的方式标记感兴趣的小分子。此外，它还具有很高的灵敏度，甚至能够检测低水平的蛋白质-配体相互作用。它还可用于识别与多种细胞和组织类型中的小分子结合的蛋白质。此外，它还能够识别蛋白质-配体相互作用，这对于了解小分子的作用机制和识别药物开发的潜在靶点非常有用。该方法已成功用于鉴定各种小分子的靶蛋白，并且已纳入各种功能手柄和光亲和接头以优化该方法的效率。光亲和方法的一般实验工作流程如图2 所示。图2. 光亲和法的标准实验方案。1. 合成光亲和探针。2. 在细胞或细胞裂解物上使用光亲和探针并让它们与其靶标结合。3. 随后使用紫外线 (UV) 来激活探针与处理样品（细胞或细胞裂解物）中目标蛋白的共价交联（如果实验是在活细胞上进行的，则细胞在紫外线照射后会裂解蛋白质）。4. 使用链霉亲和素，提取复合物（靶标+探针）。5. 通过洗涤除去未结合的蛋白质。6. 可以使用 SDS-PAGE 分析目标蛋白，并通过蛋白消化和质谱进行鉴定。 2.4 基于亲和力方法的局限性和挑战由于分子的性质和用于开发探针的接头所发挥的不可或缺的作用，这两个因素都对基于亲和力pulldown方法提出了挑战。例如，在采用这种技术时，重要的是要注意修饰探针的设计和合成。此步骤可能需要在不同附着点对不同探针进行频繁测试和评估，以构建构效关系 (SAR) 模型，从而产生既有效又特异的探针。SAR 研究至关重要，涉及对探针结构的系统修饰，以优化其对目标蛋白的结合亲和力和特异性，以及光反应性和其他特性。用于标记小分子的光反应基团也可能干扰其与靶蛋白的结合，这可能导致假阴性结果。另一个限制是需要用亲和标签修饰小分子，这对于某些化合物来说可能是不可能的，并且亲和标签有可能改变小分子的生物活性并导致意想不到的结果。最后，使用紫外线触发小分子与目标蛋白的共价连接可能对细胞有害，这可能导致错误的结果。尽管存在这些缺点，光亲和pulldown方法仍然是研究蛋白质-配体相互作用的重要工具，可用于深入了解小分子的作用机制并识别潜在的药物靶点。另一方面，光亲和探针中的光亲和标记与生物素标记分子中的化学接头之间的接头或间隔基团对其性能具有显著影响。此外，如果接头太短，探针有可能与其自身交联，从而导致探针不稳定和缺乏特异性的问题。另一方面，如果接头太长，光反应基团可能离目标蛋白太远，无法有效地抓住它。一般来说，理想的接头长度由探针和目标蛋白的特性决定。因此，为了实现目标蛋白的可靠和精确标记，仔细选择接头并调整每个特定应用的条件可能很重要。报告标签是旨在检测探针的存在并确定其与目标的结合位置。可用的识别标签有多种形式，包括荧光染料、放射性同位素以及生物素和亲和素等特定结合配偶体。研究人员可以使用不同的方法（例如荧光显微镜和免疫沉淀）来寻找和分离探针-蛋白质加合物。总而言之，由于与开发 SAR、连接子和标签以创建有效分子相关的挑战，基于亲和力的pulldown方法存在一些缺点，包括需要经验丰富的化学家来合成光亲和探针，这可能是耗费时间和资源。 3. 无标记目标识别无标记方法利用自然状态的小分子，无需对其结构进行任何化学修饰，从而保留小分子的天然确认和功能特性。这种方法通常受到研究人员的青睐，因为它不需要对初级分子进行修饰或标记。这种方法避免了与化合物标记相关的任何潜在问题，它几乎没有任何限制，因为这种无标记分子可以与非预期的蛋白质结合并导致假阳性目标的识别。然而，该方法不适用于以低水平表达的蛋白质（图 3）。 3.1药物亲和力响应靶点稳定性药物亲和力响应靶稳定性技术（DARTS，Drug affinity responsive target stability）是一种基于小分子可以结合并稳定其靶蛋白，从而增加其对蛋白水解（即通过蛋白酶分解）的抗性而开发的技术。DARTS 通过检测结合诱导的蛋白水解抗性增加来识别靶蛋白。为此，将小分子与细胞裂解物一起孵育，然后用蛋白酶处理。如果小分子可以与其靶蛋白结合，则蛋白酶将无法分解它，因为它会增加其稳定性，从而导致处理后剩余的蛋白质量增加。蛋白质稳定性的增加可以使用蛋白质印迹或质谱等技术来检测。图3. 无标记目标识别方法的示意图。 A．药物亲和力响应靶标稳定性 (DARTS)。 3.2 根据氧化速率测定蛋白质的稳定性变性蛋白质比其天然对应物更容易被氧化，基于氧化速率的蛋白质稳定性技术 (SPROX，Stability of Proteins from Rates of Oxidation) 方法利用了这一特性，通过测量存在和不存在小分子的情况下蛋白质表面上蛋氨酸残基的蛋白质氧化水平的速率，并检测可能由以下因素引起的任何变化：小分子结合并稳定其靶蛋白。在此方法中，小分子与细胞裂解液一起孵育，然后进行化学变性处理，然后氧化剂（H2O2）处理，随后使用质谱法对蛋白质氧化速率进行量化。SPROX技术用于评估他莫昔芬的靶点，发现MCF-7细胞中的YBX1，观察到该靶点因小分子的存在而稳定。缺点：SPROX仅适用于含有氨基酸蛋氨酸的蛋白质。这是因为 SPROX 通过测量蛋白质中蛋氨酸残基的氧化水平来确定目标蛋白质。因此，SPROX 可能不适合鉴定缺乏蛋氨酸残基的靶蛋白。此外，SPROX 和 DARTS方法都适用于细胞裂解物，而不适用于活体生物系统，能用于研究从细胞中分离的蛋白质，而不能用于研究细胞内的蛋白质。图3. 无标记目标识别方法的示意图。B．氧化速率的蛋白质稳定性 (SPROX) 。 3.3细胞热位移测定 (CETSA) 细胞热位移测定（CETSA，Cellular thermal shift assay）是根据配体诱导的蛋白质靶标热力学稳定的概念而开发的，靶标结合配体后稳定性的增加可以通过测定蛋白质的热稳定性来评估。与SPROX和DARTS技术不同，它可以用于活细胞和细胞裂解液。为了进行 CETSA，首先用小分子或载体处理细胞/细胞裂解物，然后加热。然后使用蛋白质印迹法确定蛋白质是否以温度依赖性方式变性，以及与样品中小分子结合的某些蛋白质的熔解曲线是否发生了变化。通过比较含有和不含小分子的蛋白质的热稳定性，可以识别小分子是否与蛋白质相互作用并估计关联的亲和力。使用CETSA，证实2′-hydroxy cinnamaldehyde直接与STAT3结合，抑制STAT3活性。缺点：这种方法需要蛋白质印迹，由于抗体的可及性，这限制了它的使用。此外，目前已经开发出了许多用于识别蛋白质靶标的高通量热位移方法，例如 MS-CETSA、HCIF-CETSA 和 ITDR -MS-CETSA。图3. 无标记目标识别方法的示意图。C. 细胞热位移测定 (CETSA)。 3.4诱变诱变是一种很有前途的识别药物靶点的遗传工具，它涉及通过改变DNA或氨基酸的特定序列来操纵基因或蛋白质的表达或功能，并观察这种突变对药物反应的影响。mRNA敲除、定点突变和随机基因组诱变是药物靶标识别中使用的多种遗传筛选方法。其中，CRISPR-Cas9突变作为一种生成基因文库的方法越来越受欢迎，这些基因可用于识别细胞靶蛋白和小分子的分子相互作用位点候选药物。最近，CRISPR 平铺介导的诱变（CRISPR-tiling–mediated mutagenesis）是一种理想的靶标发现方法，可将烟酰胺磷酸核糖基转移酶 (NAMPT) 识别为临床研究中的抗癌药物 KPT-9274 的主要分子靶点 [ Nat Commun, 2018,10.1038/s41467-017-02349-8]。该方法涉及系统设计大型sgRNA基因文库，以靶向和突变已知抗癌药物的特定基因，并开发可转导生成诱变细胞的慢病毒文库构建体。诱变的优点是揭示药物与其靶标和其他细胞成分的直接和间接相互作用。此外，它可以通过改变先导化合物的结构或活性来促进其优化。此外，可以筛选由诱变产生的大量遗传变异，不仅可以检测药物敏感性，还可以了解耐药性。诱变可以帮助揭示药物作用模式中涉及的主要和次要靶点和途径。缺点: 包括耗时、劳动密集型和效率低，特别是对于复杂的基因组和由此产生的表型，这可能会引入不需要的或脱靶效应，从而混淆对结果的解释。诱变可能不准确或不完整，导致假阳性或阴性。多个目标、冗余目标或可能掩盖单个突变影响的补偿机制的存在可能会使诱变变得复杂。 3.5 基因筛选基因筛选是细胞药物靶标识别的另一种独特、无偏倚的方法。在该方法中，设计了感兴趣的选择性靶标的敲除文库（RNAi 或 CRISPR-Cas9）并筛选可能的药物靶标的功能丧失。在最近的一项研究中，利用具有诱导自杀基因表达系统的基于 CRISPR 的靶标识别平台，对带有通过 gRNA 序列测序和功能丧失进行鉴定的被敲除靶标的细胞进行正向富集。利用该平台，作者确认 STING 和 CES1 分别是细胞中小分子 IFN-I 激活剂 BDW568 的主要靶标和关键代谢酶。与传统的基于CRISPR的靶标筛选依赖于药物的抗增殖作用相比，这种智能方法可以适用于任何具有非增殖活性的药物。 4.结论蛋白质靶点识别研究是药物发现过程的重要组成部分，需要投入大量的时间和资源。通过仔细考虑基于亲和力pulldown方法、无标记方法、诱变和基因筛选方法的主要优点和局限性，研究人员能够在选择药物发现的靶点识别策略时做出明智的决定，以选择最合适的方法取决于研究项目的具体要求。三、如何识别小分子药物的靶点(光亲和标记技术) （原创都灵else 明日药物）识别小分子药物的靶点 ——基于生物素的光亲和标记技术编译/都灵 1. 背景知识 1.1 生物素与亲和素生物素（biotin）又称维生素H、维生素B7，是一个含环脲基团的亲水小分子，少量存在于所有的活细胞中。亲和素（Avidin）是一个大小约67 kD的四聚体蛋白质，每一个单体可以结合一个生物素分子。生物素与亲和素的结合是已知的自然界最强的非共价键相互作用，其解离常数KD约为1×10-15 M。并且，这种结合一旦形成，其对有机溶剂、变性剂（如盐酸胍）、洗涤剂（如SDS、Triton X-100）、蛋白水解酶，以及在较高的温度和pH范围内都很稳定（解离通常使用pH = 1.5的8 M盐酸胍，或在SDS-PAGE缓冲液中煮沸进行）。因此，这种结合被用于亲和分离领域。亲和素和生物素之间的强亲和力来源于：1）结合口袋与生物素的形状高度互补；2）在结合部分形成广泛的氢键网络，八个残基（包括Asn23、Ser27、Ser45、Tyr43、Asn49和Asp128等）直接与生物素形成第一层氢键，多个残基又与第一层的残基形成第二层氢键；3）结合口袋是疏水的，特别是其中存在多个色氨酸残基，与生物素有许多范德华力接触和疏水相互作用；4）最后，连接第3和第4 β链（L3/4）的柔性环在结合后也会稳定下来，该环就像一个结合口袋上的“盖子”，在结合后关闭，使得生物素解离非常缓慢。（PDB号1STP）亲和素是糖基化的、带正电荷（等电点pL约为10）的，以及具有假催化活性（例如，亲和素会促进生物素-硝基苯酯的碱性水解过程），并且会产生较多的非特异性结合。因此，研究人员开发了去糖基化的亲和素用于分离领域，被称为中性亲和素（NeutrAvidin），能获得更好的专一性和适用性。亲和素最初从鸡蛋清中分离，与它相似的蛋白质还有来源于亲和链霉菌（Streptomyces avidinii）的链霉亲和素（Streptavidin），它们的区别如下表所示： 1.2 生物素化试剂通常在生物素分子的戊酸侧链进行衍生化，加入各种活性基团，用于将生物素连接到其他分子上。这些生物素化试剂（biotinylation reagents）可针对各种官能团，例如伯胺、巯基、羧基和羧基。常见类型包括：1）用于修饰伯氨（赖氨酸）的生物素-NHS /Sulfo-NHS酯；2）用于与巯基（半胱氨酸）形成硫醚键的生物素-马来西酰亚胺、碘乙酰试剂；3）用于与巯基（半胱氨酸）形成二硫键的生物素-二硫代吡啶试剂；4）通过酸胺缩合反应，用于修饰羧基（谷氨酸、天冬氨酸）的生物素-伯胺试剂；5）能够与醛基反应的生物素-酰肼试剂，以及6）用于点击化学/光催化反应的生物素-叠氮试剂。 1.3. 基于亲和力的小分子靶点识别技术靶点识别是新药开发的关键步骤，因为它能够让研究人员了解药物的作用模式，可以更好地优化药物，使药物达到更好的治疗效果。常见的生物大分子靶点包括酶、细胞受体、离子通道、转录因子和DNA等，由于它们种类繁多，确定一个药物的精确靶点十分困难。基于亲和力的靶点识别技术要求使用带标签的小分子探针（ABP, activity based probe），用它与细胞裂解液或蛋白质混合物孵育。然后，利用亲和标签纯化出伴侣蛋白，纯化后的蛋白可通过SDS-PAGE和MS进行分析鉴定。 ABP中常用的标签是生物素或荧光染料。生物素标记具有很多优点，例如成本低、纯化过程简单。但是，生物素-亲和素复合物需要在苛刻的条件下（例如在SDS-PAGE缓冲溶液中煮沸）才能打破它们之间的相互作用，使结合蛋白从树脂中释放出来。这种变性条件可能会改变所分离蛋白质的结构或活性。并且，生物素附着在小分子上还会影响细胞的通透性和表型结果，这在处理活细胞时可能是一个缺点。例如，用生物素化化合物处理细胞会减少 IL-2 的产生，限制免疫细胞的活化和增殖，从而可能影响它们对免疫刺激的响应。此外，生物素标签还可能改变活性分子在体内的性质及其与靶蛋白的作用模式，限制了探针分子在体内细胞的吸收与分布。因此，实验一般都是在体外进行的，而体外的功能蛋白质组学研究只能大致地揭示活细胞或动物体内组织中蛋白质的功能状态。近年来，发展出了不带标签的探针分子，生物素或荧光染料标签是在探针分子共价标记了靶蛋白后，通过Huisgen 1,3偶极环加成反应（叠氮与炔基形成三氮唑）连接到探针分子上。无论是否带标签，运用基于亲和力的小分子靶点识别技术的前提是：活性小分子能够与靶蛋白不可逆共价结合。但是，在大多数情况下，活性小分子与靶点蛋白之间的作用是可逆的、不牢固的。此时，探针分子的设计就需要引入光反应性基团，其作用是在探针分子与靶蛋白（可逆）结合后，通过光解作用在探针分子与靶蛋白之间引入共价键；这一技术被称作光亲和标记（PAL，photoaffinity labeling）。 1.4 肽图法鉴定蛋白质利用蛋白水解酶作用于特定的氨基酸残基将肽键断开，从而将蛋白质或大的多肽裂解成小的多肽片段（一般包含10个左右的氨基酸），然后用高效液相对肽段进行分析，得到的色谱图即为肽图；通过比较样品与标准品的肽图，能够得出蛋白质的纯度和表达准确性等信息。通过与质谱联用，可以获得每个片段或其碎片更精确的分子量信息，进而鉴定未知蛋白质的初级结构。为获得理想的肽图谱，在进行特异性裂解之前，需要对待测蛋白质样品进行预处理。对于复杂的大分子蛋白，其高级结构形成的空间位阻可能阻碍裂解剂到达裂解位点发挥作用，需要进行必要的变性剂处理、二硫键还原以及随后的游离巯基烷基化保护等步骤。变性可在37 ℃下，6 M盐酸胍或8 M尿素溶液中进行；二硫键还原通常在变性过程中加入DTT等还原剂实现。如果还原后的半胱氨酸巯基保持游离状态，则可能以错误的方式重新形成二硫键，因此通常加入碘乙酸等试剂，使游离巯基烷基化。经过上述处理后，应当进行脱盐和缓冲溶液交换步骤，然后进入蛋白酶裂解过程。根据待测蛋白质的结构特性选择特定裂解方法。几种通用的化学或酶裂解试剂见下表。类型试剂名称特异性蛋白酶胰蛋白酶（Trypsin） Arg或Lys的C端糜蛋白酶（Chymotrypsin）疏水性残基（如Leu、Phe）的C端赖氨酰内肽酶（Lys-C） Lys的C端谷氨酰内肽酶（Glu-C） Glu或Asp的C端天门冬氨酸-N内肽酶（Asp-N） Asp的N端化学试剂溴化氰 Met的C端 2-硝基-5-硫氰苯甲酸（NTCB） Cys的N端邻碘苯甲酸（IBA） Try或Trp的C端粪臭素（BNPS） Trp 影响蛋白质裂解效率和重现性的因素包括反应体系pH、缓冲液类型、反应温度、反应时间以及裂解剂用量等。应当根据经验或者预实验确定最佳的反应条件。有许多商品化的蛋白质裂解试剂盒，可以得到较好的结果。对于多肽分离，首选的色谱柱孔径范围为100 Å至120 Å，而固定相通常选择C18填料。肽谱分析中最常用的溶剂为水（磷酸盐缓冲溶液）和乙腈（用作有机改性剂），某些情况下，会加入丙醇或异丙醇用以溶解酶解成分。还需要加入必要的离子对试剂（不超过0.1%），一般为TFA，这种成分可与多肽的带电基团形成离子对，增加多肽的疏水性，从而增加保留、改善分离。UV检测波长则通常为210~220 nm和/或280 nm。多肽的质谱分析可用于结构鉴定。一般情况下，质谱分析类型包括电喷雾（ESI）和MALDI-TOF-MS，以及快速原子轰击（FAB）。使用ESI或MALDI时，蛋白质水解多肽可完整电离为气相，并可测量它们的精确质量。因为易于与液相色谱连接，大多数多肽质谱分析在ESI-MS仪器上进行。在质谱中被识别的肽段，可选中用于二级质谱检测。被选中的肽段在高能惰性气体撞击下断裂成若干个碎片，这些碎片的离子峰谱图与分子离子峰谱图构成MS/MS谱图，能够为蛋白质鉴定提供更为丰富的信息。单个肽段的断裂是随机的，一次断裂产生一对离子峰；常见的断裂方式为β断裂，即在肽键的C-N键处断裂，产生一系列b离子和对应的y离子。MS/MS谱图创建完成后，需要对二级谱图中的离子峰进行仔细辨别，这一过程过去是手动完成的，需要剔除干扰峰，需要计算各个峰之间的差值，耗时费力。如今已经有非常多的质谱图处理软件，并且能够检索离子峰数据库，可以大大简化这一过程。Comet是一款常用的基于SEQUEST算法的开源软件；SEQUEST HT在蛋白组学（Proteome）研究和TMT（Tandem Mass Tag）分析中更有用；整合在MassQC中的Andromeda程序可用于SILAC（细胞培养氨基酸稳定同位素标记）样品。Byonic程序则适合不严格的氨基酸翻译后修饰（PTM）研究。每种软件都有各自的特点和缺点，但它们在鉴定多肽方面遵循相似的逻辑。 2. 光亲和标记技术 2.1 光亲和标记探针的设计光亲和标记探针分子应具有适当的生物活性，与靶点的作用机制应与其母体化合物（parent compound）保持一致。光亲和标记探针分子的活性越高，就越容易对其受体进行特异性标记。但是当探针分子活性过高时，它与受体的结合是静态的，所得到的受体活性部位的结构信息通常是局部的、不完整的。探针分子活性适中时，它与受体的结合是动态的，所得到的受体活性部位的结构信息通常是比较丰富的、完整的。通常，光亲和标记探针包含四个组成部分：活性部位（activity site）、光反应性基团（photoreactive group）、报告基团（reporter tag）以及连接子（linker）。活性部位即活性小分子，负责与靶点蛋白可逆结合；光反应性基团负责与靶点蛋白形成共价结合；报告基团用于探针-靶点蛋白复合物的检测与分离；各部分通过连接子连接到一起。连接子应具有合适的长度，太短可能发生探针自身的交联，太长则可能导致光反应性基团与靶点蛋白距离不够而损失标记效率。光反应基团可以位于在连接子上（下图A），也可以插入到活性部位（下图B）；具体方案取决于构效关系（SAR）研究。如果活性小分子的结构来源于SAR研究，那么连接子可以附着在那些对活性影响较小的位点，在此基础上，往往需要合成10~50个不同取代位置和连接子长度的类似物用于筛选。需要注意的是，具有较长连接子的完整光亲和标记探针很少能够穿透细胞，因此基于细胞的活性评估往往是不充分的。针对靶点已知的小分子化合物，在设计寻找其它靶点的探针时，可以将已知靶点蛋白作为结合专一性的替代对照（surrogate control）。针对有明显体外细胞活性甚至体内活性，但是作用靶点不明的小分子化合物，设计探针分子时，必须在标记实验中加入相对于探针分子的大大过量的母体化合物（一般相当于探针分子的100~1000倍），考察其是否与母体化合物竞争同一活性位点，以确证其与母体化合物具有相同的作用机制。细胞穿透型探针在捕获活细胞靶点时非常有用。但是，由于包含光反应性基团和报告基团，以及连接子往往含有较长的PEG链，较大的光亲和标记探针分子很难穿透细胞。为克服这一局限，可以设计较小的（截短的，truncated）光亲和标记探针，在其进入细胞后，通过点击化学方法，再引入报告基团（如上图C）。如前所述，通常使用铜（I）催化的Huisgen 1,3偶极环加成反应，叠氮基手柄与炔基手柄的所属单元可以互换。 2.2 光亲和基团/光反应性基团理想的光亲合基团具有以下特点：1）具有一定的化学稳定性，能耐受普通的化学反应；2）在自然光中合理的稳定性；3）在黑暗中稳定，在不对生物样品造成损伤（>300 nm）的紫外光照下很容易光解；4）光解后的活性中间体既能与亲核的X-H（X=N, S, O）官能团反应，也能与C-H 键反应；5）得到的产物比较稳定，能够耐受分离分析处理过程。常用的光亲和基团包括叠氮苯类、（苯基）双吖丙啶类和二苯甲酮类（下图A），分别在特定波长光照下产生氮宾（nitrene）、卡宾（carbene）和双自由基（diradical）活性中间体。其他可用于光亲和标记的基团有重氮基团、重氮羰基、烯酮、硫自由基和硝基苯类等。叠氮苯基的引入相对方便，因此这类光亲和基团最常用。但是必需考虑到它存在一些缺点：1）一般的叠氮苯基有效光解时需要较短波长的光照，这样的波长将对活性大分子造成严重损伤；2）产生的氮卡宾通常也不如卡宾活泼；3）高活性的苯基氮卡宾将迅速重排生成比较稳定的烯亚胺（ketenimine）结构，这种结构只能与亲核性X-H官能团反应（X=O, N, S等），如果活性位点部分没有亲核性官能团，那就可能迁移到离活性位点较远区域标记，产生非特异性标记；4）光解产生的氮卡宾与受体作用时形成不太稳定的C-N键，或很不稳定的N-杂原子键。据报道，多氟取代的叠氮苯由于提高了反应能垒，可以阻止单线态氮卡宾中间体向烯亚胺结构转变。而且邻位被氟取代的叠氮苯，可以大大延长活性中间体氮卡宾的存在时间，保证有充分的时间使其与受体发生分子间反应。多氟取代叠氮苯比较容易制备，而且表现出较高的热稳定性。叠氮苯基光亲和基团的标记效率通常不高（约30%）。二苯甲酮类光亲和基团光解时形成的三线态双自由基分子不发生重排反应，主要与蛋白质分子中的C-H键反应，在质子性溶剂中稳定，几乎不与水反应，使得其激发态只能与靶蛋白作用，通常其标记效率较高。然而，由于其双自由基分子不能被缓冲液萃灭，也可能导致一些非特异性标记，其光解时需要长时间紫外光照，这可能导致蛋白质损伤或实验细胞死亡。三氟甲基苯基双吖丙啶是最接近理想的光亲和基团。它具有以下优点：1）很好的化学稳定性，能耐酸碱；2）光解波长约360 nm，大于蛋白质的紫外吸收波长，因此对蛋白质的损伤很小；3）光解后产生卡宾活性中间体，不仅能与X-H（X=O, N, S等）反应，也能以较高效率完成对C-H键进行插入反应；4）卡宾与受体形成的产物比氮宾的产物更稳定。5）卡宾中间体十分活泼，因此会很快被水淬灭，这对于标记产率来说是不利的，但是另一方面，由于其半衰期很短，能够最大程度减少非特异性标记。在光照下，双吖丙啶可以转化成单线态卡宾，也有约30%转化为重氮化合物。主要形成的加成产物如下图所示： 2.3 报告基团放射性同位素、亲和性标签以及荧光染料都可以作为报告基团。其中生物素是最常见的亲和性标签，抗体（抗原）表位也可以作为亲和性标签。后者的优势是，抗原表位标签很容易从对应抗体固定树脂上系脱下来，这对于生物素-亲和素系统来说是困难的。亲和性标签通常不利于探针穿透细胞，而且由于空间位阻可能影响探针对靶点的亲和力，其处在探针上的位置十分关键。荧光染料标签通常用于基于活性的蛋白组学分析（ABPP，activity based proteomics profiling）。而且是成员种类最为丰富的一类标签。常用的包括荧光素、常用的包括荧光素、BODIPY（二吡咯烷酮二氟化硼）、罗丹明、氰蓝染料（Cy-5和Cy-3）和 NBD（硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑）。每一类染料都有自己的优缺点；总的优点是标签具有疏水性，通常可以穿透细胞膜。与其他替代品相比，荧光素和罗丹明价格低廉，但它们存在光漂白现象。BODIPY和氰基染料具有吸收系数高、吸收峰窄、量子产率高等特点，可提供更清晰的检测和识别。 2.4 光亲和标记技术工作流在大多数操作规程中，细胞或细胞裂解液都要经过光亲和探针处理，并留出时间让探针与受体结合。然后用特定波长的光照射样品，激活光亲和探针与临近的生物分子共价交联。如果在活细胞上进行，则需要裂解细胞后，样品与报告标签进行点击化学偶联。通过亲和标签对应的亲和纯化系统，将被标记的蛋白质从的混合物物中分离。通过SDS-PAGE分析，使用针对报告标签的专用设备和试剂，对标记蛋白质的范围进行可视化。蛋白质从凝胶中分离出来，经过多种蛋白酶消化，产生多肽片段。这些片段可通过MS测序来确定分离蛋白质的特征。还可以得出与光亲和探针反应的氨基酸序列，这可能会提供有关结合位点的额外信息。PAL技术的一个局限是可能的非特异性标记。由于样品蛋白质分子不易获得，在光亲和标记实验中，人们倾向于加入大大过量的探针分子（相对于蛋白质分子），导致在标记实验中产生大量的非特异性标记。此外，光亲和探针通常会与含量较高的或“粘性”蛋白质发生交联。为了区分本底标记和特异性标记，可以进行一些对照实验。例如，评估在没有光亲和探针和没有紫外线辐射的情况下产生的标记量。此外，进行竞争实验也特别有用，它可以突出蛋白质的特异性交联。通常情况下，未修饰的母体化合物比光亲和性探针对受体的亲和力更大。竞争实验的方法是用过量的母体化合物或另一种光稳定性类似物，一起对样品进行孵育，蛋白质的特异性标记可通过报告标签信号的剂量依赖性下降来识别。 3. 基于生物素的光亲和标记实例 3.1 分子靶点的识别通常来说，靶点识别技术可分为两类：基于亲和力的和基于表达克隆的。不过，所有这些方法的一个基础是小分子与其靶蛋白的亲和力。若配体与其靶蛋白可逆结合，则结合的强度决定了这种相互作用是否会在靶蛋白检测和/或分离的过程中持续存在。光亲和探针通过形成共价连接克服了这一问题。探针对靶点的亲和力越高，识别特异性靶点的可信度也越高。如果探针的亲和力较低，那么在疏水效应等作用下，小分子与其他蛋白质之间发生非特异性结合的可能性也会增加。最近，一种有效的光亲和标记探针被用于鉴定齐墩果酸（Oleanolic acid）的靶蛋白。齐墩果酸在癌症、艾滋病和高血糖症等领域具有多种生物活性。Zhang等人成功合成了两种光亲和探针：一种含有生物素标签、二苯甲酮光反应基团和齐墩果酸；另一种是“无标签”探针，其末端的叠氮基团可与含炔基手柄的生物素反应。根据以前的SAR研究，齐墩果酸羟基的修饰对其活性影响很小，因此被认为是探针的合适附着点。齐墩果酸的一个已知靶点是磷酸化酶RMGPa，因此为了确定探针是否仍具有活性，进行了针对RMGPa的酶抑制试验。意外的是，尺寸较小的“无标签”探针的活性最差（比齐墩果酸低五倍），而完整探针的活性仅低两倍。随后，完整探针在HepG2细胞的可溶性裂解液中孵育，两个40~50 kDa的蛋白质被标记并捕获，但是未被作为靶点报道。 Sample: HepG2 liver cancer cell lysate PAG: benzophenone Target: n.a. Ref: Zhang L et al Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 1036–1039 (2012). Pladienolides是一种天然产物，在多种体内和体外模型中表现出抗肿瘤活性，但其靶点到目前仍不确定。Kotake等人制备了三种基于Pladienolide B的探针，分别使用了氚（3H）标记、荧光标记（BODIPY-FL）和生物素标记。用3H探针处理HeLa细胞，评估放射性信号的亚细胞分布。结果表明，细胞核部分的放射性最高，说明了Pladienolides对细胞核蛋白质具有很高的亲和力。为了收缩可能的靶标范围，使用针对一系列核蛋白的特异性抗体对经过3H探针处理的HeLa细胞的核部分进行了免疫共沉淀实验。在六种共沉淀物中检测到了放射性，其中五种是使用能识别核糖核蛋白U2 snRNP成分（与mRNA的3′位剪接密切相关）的抗体形成的。用光亲和探针处理裂解的HeLa细胞后，确定了这类化合物的主要靶标。使用抗SAP155抗体对细胞核部分进行免疫沉淀，然后用紫外线激活光亲和探针，使探针与其靶标之间形成共价键。使用链霉亲和素辣根过氧化物进行Western印迹，发现了一条约140 kDa的重要条带。通过LC-MS/MS肽测序，确定这是一种剪接体相关蛋白。总之，研究结果表明，Pladienolides化合物与SF3b复合物的SAP130具有亲和力，因此可以抑制mRNA的剪接，从而发挥抗增殖作用。 Sample: HeLa cervical cancer cells PAG: benzophenone Target: SAP130 of SF3b Ref: Kotake Y e al. Nat. Chem. Biol. 3, 570–575 (2007). HDAC抑制剂是一种对亨廷顿氏症、弗里德里希共济失调症（FRDA）和癌症等疾病具有治疗潜力的药物。Xu等人发现了一种庚二酰胺，它在FRDA小鼠模型中表现出良好的活性。作者在该化合物基础上开发了使用二苯甲酮光反应基团的光亲和探针，然后通过点击化学反应附着上生物素标签。研究表明，HDAC3是的主要分子靶标，随后的工作揭示了它在 FRDA基因沉默中的作用。对先导化合物的修饰使其特异性从HDAC3转向了HDAC1和2，然而，在抑制HDAC1或HDAC2 时并没有看到所需的活性。这支持了HDAC3抑制是导致所观察到的表型的原因。 Sample: Nuclear extracts from a cell line derived from a FRDA patient PAG: phenyldiazirine Target: HDAC3 Ref: Xu C et al. Chem. Biol. 16, 980–989 (2009). Kotoku等人通过对一系列天然产物和类似物进行细胞筛选，发现了一种新型生物活性化合物Furospinosulin-1。这种小分子是从印度尼西亚海洋海绵Dactylospongia elegans中分离出来的，研究发现它是一种剂量依赖性、缺氧选择性的DU145前列腺癌细胞生长抑制剂。与许多缺氧选择抑制剂不同的是，Furospinosulin-1并不干扰HIF1α的积累，但却消耗了IGF-2的表达，作者因此假设该化合物是通过一种新的作用模式发挥作用的。为了弄清作用机制，作者合成了四种光亲和探针，活性单元和二苯甲酮基团之间的连接子长度各不相同，但均采用生物素都作为报告标签。研究发现，连接子较短的探针保持了最佳活性，并且表现出对缺氧条件的选择性。使用电泳迁移率实验对这些探针进行了评估，结果表明这些探针能破坏核蛋白与DNA的结合，Furospinosulin-1能够破坏可能参与转录的核蛋白复合物形成，尽管还没有确认其直接靶点。 Sample: Nuclear fraction of DU145 prostate cancercells PAG: benzophenone Target: n.a. Ref: Kotoku N et al. Bioorg. Med. Chem. 22, 2102–2112 (2014). 3.2 识别细胞中的非靶点（off-target）相互作用大多数小分子非靶点相互作用都是通过体外筛选试验发现的。例如，在药物发现的早期阶段，GPCR、离子通道、激酶、核受体和转运体的生化测定都经常用于检测非靶点相互作用。这些方法的效率依赖于小分子的体外活性和蛋白质的体外功能。其主要局限是，筛选面板的组成限制了脱靶相互作用的可检测范围。 PAL为鉴定细胞中的分子靶标提供了机会，无需事先选择待筛选的靶标，蛋白质处于天然相对丰度，并存在内源配体和辅助因子。这可以作为上述体外筛选的补充，并为将体外相互作用转化为细胞种的作用提供信息。需要注意的是，连接子与活性单元的连接位点可能影响靶点识别的范围。保留与特定蛋白质结构家族相互作用的已知药效团，就可以检测同类的其他蛋白质，例如下文所述的激酶。如果附着位点破坏了相互作用所必需的结构，那么检测该家族以外的其他靶标的能力就会受到影响。由具有不同连接位点的同一亲和单元构建的多个PAL探针组合可能有助于探测到所有可能的相互作用。许多蛋白激酶抑制剂的特异性并不高，因此了解被抑制的激酶或其他靶点的范围如何影响生物活性非常重要。为了更全面地了解达沙替尼（Src/Abl双重抑制剂，IC50 Src 3.6 nM，IC50 Abl 8.8 nM）在体内的非靶点相互作用，Shi等人开发了达沙替尼的细胞渗透性光亲和探针。在达沙替尼的药效结构中直接加入了重氮基团，以取代羟乙基哌嗪基，后者已被验证被取代不会导致活性的显著降低。利用点击化学方法，添加了一个炔基手柄与报告标签偶联，得到的探针其活性与母体化合物相似。在活细胞和细胞裂解液中进行了“Pull-down”和靶点鉴定实验。除了已知的达沙替尼与Abl和Src家族酪氨酸激酶的相互作用外，还发现并验证了一些丝氨酸/苏氨酸激酶的相互作用，其中最显著的是PKA（IC50为4.8 μM）、PIM-3（IC50为8.2 μM）和PKN2（IC50为11.5 μM），尽管与靶激酶活性相比效力大大降低。 Sample: K562 leukemia cells and cell lysate; HepG2 live cancer cells and cell lysate PAG: diazirine Target: PKA, PIM-3, PKN2 Ref: Shi H, Zhang et al. J. Am. Chem. Soc. 134, 3001–3014 (2012). 3.3 确定结合位点的位置与结构酶、多功能蛋白质和受体可能有多个配体结合位点，其中许多位点的特征已经确定，而另一些位点虽已知晓，但其位置和排列方式尚不清楚。配体结合位点通常存在于多亚基蛋白质复合物中。正如GABAAR和nAChR复合物中的结合位点所证明的那样，位于亚基界面上的结合位点可能很难定位和表征，而PAL可以应用于这些位点，前提是这些复合物能够通过裂解协议或使用细胞渗透探针在完整细胞中进行实验。还可以检测到两个亚基在界面上形成的结合点。一旦复合物中的特定亚基被确定为PAL探针及其同源可逆结合配体的目标，竞争实验就能发现其他类别的抑制剂在复合物中使用相同或不同的结合位点。PAL用于阐明结合位点已有近30年的历史，许多新的结合位点仍在利用这种技术不断被发现。过氧物酶体是一种膜封闭的亚细胞器，含有大量氧化酶，在各种生物合成途径中发挥着关键作用。Kashiwayama 等人合成了棕榈酸的重氮类似物，并用它来探测纯化的大鼠肝脏过氧物酶体的潜在结合位点。一种80 kDa蛋白被重复标记，在竞争条件下标记效率降低。该蛋白质被发现是MFE2，一种 β-氧化过氧化物酶。质谱分析表明，Arg251和Trp249两个残基被探针标记，根据MFE2的晶体结构，作者推断这两个残基位于通向催化位点的疏水口袋的顶部，并提出这个疏水区域对于底物相互作用和向活性位点定向非常重要。 Sample: Rat liver peroxisomes PAG: phenyldiazirine Target: MFE2 Ref: Kashiwayama Y et al. J. Biol. Chem. 285, 26315–26325 (2010). Kisspeptins 是人类蛋白质，是 GPCR GPR54 的内源性配体。Kisspeptin-GPR54 信号轴与激素 GnRH 的分泌密切相关，因此 GPR54 激动剂具有治疗激素分泌疾病的潜力。为了更好地利用这一治疗机会，需要进一步了解GPR54 配体的结合残基。因此 Misu 等人开发了吻肽（kisspeptin）多肽光亲和探针。已知 C 端区域对 GPR54 的结合至关重要，因此在N 端连接了生物素报告标签。根据 Kp-54 肽序列合成了16个光亲和素探针，每个探针上只有一个残基被半胱氨酸取代，半胱氨酸随后被修饰以加入叠氮光基。只有六种探针与GPR54 共价结合，而且所有探针都在相同的18个氨基酸序列中修饰了氨基酸，这表明这一短序列在吻肽与GPR54 的相互作用中起着关键作用。 Sample: HEK293 embryonic kidney cells PAG: phenylazide Target: GPR54 Ref: Misu R et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 2628–2631 (2013). Ras信号转导级联是与人体细胞增殖相关的重要细胞通路。该信号轴的异常与癌症密切相关。蛋白酶Rce1p直接与Ras及其他CAAX（C：半胱氨酸，A：脂肪族氨基酸，X：任意一个氨基酸）蛋白相互作用，并通过内切蛋白水解酶对其进行修饰。Rce1p本身定位于ER膜，但该酶催化残基的拓扑结构尚不清楚。Kyro等人根据K-Ras4b 的部分C端序列合成了一系列光亲和肽。并通过严格筛选确定了标记Rce1p的最佳探针设计。探针含有2-氨基苯甲酰基荧光团、二硝基苯基淬灭剂和二苯甲酮改性异戊烯基（可被Rce1p识别）。此外，还合成了将光敏基团作为独立分子添加到异戊烯基团和报告标签上的探针。当光敏基团位于肽链而不是异戊烯基链时，标记效果最佳。作者发现，不属于Rce1p识别的氨基酸序列的肽也能对Rce1p进行标记，未来设计选择性抑制剂时可能需要考虑这个问题。 Sample:Membrane fraction from Saccharomyces cerevisiae PAG: benzophenone Target: Rce1p Ref: Kyro K et al. Bioorg. Med. Chem. 19, 7559–7569 (2011). Aβ（β淀粉样蛋白）的过量产生和沉积被认为是阿尔茨海默病的根本原因。γ-分泌酶是一种膜内天冬氨酰蛋白酶，可裂解跨膜蛋白，其主要底物是淀粉样前体蛋白。淀粉样前体蛋白被β-和γ-分泌酶蛋白水解后会产生短肽链（17~42个氨基酸），其中Aβ40和Aβ42被认为具有最强的神经毒性。γ-分泌酶是一种多亚基蛋白复合物，其活性取决于四个独立蛋白的正确组装：PS1或PS2、PEN-2、NCT 和APH-1。γ-分泌酶调节剂（GSMs）已被开发为治疗阿尔茨海默病的潜在药物，可减少致病性Aβ42的产生，但不抑制Aβ的形成总量。γ-分泌酶蛋白复合物是一个具有挑战性的药物靶点，为了进一步了解GSMs的结合位点，人们进行了各种PAL研究。Pozdnyakov等人合成了一种光亲和探针（E2012-BPyne），该探针基于咪唑类GSM E2012设计，含有二苯甲酮和炔基手柄，减少Aβ40和Aβ42肽的功效与母体化合物相似。探针在母体GSM存在或不存在的情况下，在活的HeLa细胞中孵育，通过紫外线照射交联到目标物上，通过点击化学与生物素-叠氮化物标记，并通过亲和纯化分离。分离出的蛋白质通过Western blot分析来区分γ-分泌酶的各种成分。作者确定PS1-NTF（N-末端片段）是E2012的靶标。在E2012大量过量存在的情况下，没有观察到PS1-NTF的标记，也没有观察到其他亚基的标记，这表明这是一种高度特异性的相互作用。 Sample: HeLa cervical cancer cell membrane fractions PAG: benzophenone Target: PS1 in the γ-secretase protein complex Ref:Pozdnyakov N et al. J. Biol. Chem.288, 9710–9720 (2013). 普那布林（Plinabulin）是一种微管解聚剂。Yamazaki等人合成了一种光亲和探针，以确定普那布林在微管上的结合位点。作者发现，当报告标签和药效单元之间的连接子很长时可以提高检测效果。药物结合在α-和β-微管蛋白之间的区域，因为这两个亚基都被共价标记。该结合部位与微管抑制剂秋水仙碱的结合部位不同，最初该药物被认为是与秋水仙碱结构域结合的。 Sample: HT1080 fibrosarcoma cell lysate PAG: benzophenone Target: α-tubulin and β-tubulin Ref: Yamazaki et al.Bioorg. Med. Chem. 18, 3169–3174 (2010). 四、独家原创|谢恬教授、叶向阳研究员:以 G-四链体为靶标的小分子抗病毒药物的研究进展（原创药学进展药学进展）以 G-四链体为靶标的小分子抗病毒药物的研究进展 PPS 何兴瑞 #，刘梦婷 #，王子桉，贾译程，叶向阳 *，谢恬 ** （杭州师范大学药学院，浙江省榄香烯类抗癌中药重点实验室，浙产中药材资源开发与应用浙江省工程实验室，浙江省浙八味等浙产中药材综合利用开发 2011 协同创新中心，浙江杭州 311121）摘要：G-四链体（ G-quadruplexes，G4s）是由富含串联重复鸟嘌呤（Guanine，G）的 DNA 或 RNA 折叠形成的核酸二级结构，广泛存在于所有生物的基因组中，参与调控基因的复制、转录和翻译等多种过程。G4s 因其关键的生物学作用而引起人们的兴趣，前期人们主要关注于 G4s 在癌症中的研究并将其作为抗肿瘤药物的靶点。最近，对病毒基因组学的研究发现许多 G4s 出现在病毒基因组的调节区，对调节病毒生命周期发挥关键作用。随着新病毒的出现和现有病毒的快速突变，需要开发新的抗病毒靶标和药物。目前现有的大多数抗病毒药物是以病毒的蛋白质为靶标，直接靶向病毒核酸的研究较少。以 G4s 为靶标的小分子配体的开发有助于帮助理解 G4s 介导的机制在病毒生命周期中的重要作用，也是一种新的抗病毒药物开发策略。通过对以G4s为靶标的小分子配体在抗病毒中的应用进行总结，旨在为基于 G4s 的抗病毒药物研发提供参考。四链体（G-quadruplexes，G4s）是一种在富含鸟嘌呤（Guanine，G）的 DNA 或 RNA 链上形成的核酸二级结构 [1]，通常由两个或更多的 G-四分体（G-quartet）通过 π-π 堆积而成。G-四分体是由Hoogsteen 氢键连接4个G形成的环状平面结构，并由一价或二价阳离子（通常是 K+）参与中心配位（见图 1A）[2]。G4s 可以折叠成不同的拓扑结构，可根据链的方向区分不同的拓扑结构。拓扑结构由环性质、序列长度、序列中的位置和链化学计量等因素决定 [3]。DNA G4s 具有平行、反平行或混合拓扑结构，而 RNA G4s 因其核糖中的 2'-羟基引起的空间位阻和糖苷键的反式构象通常形成平行拓扑结构。此外，G4s 可以在一条富含 G 的 DNA 链或RNA 链中形成分子内 G4s，也可以通过数条富含 G的核酸链形成分子间 G4s[4]。随着生物信息学和高通量测序等技术的发展，目前已经可以分析并鉴定基因组或转录组中的 G4s可形成序列（putative quadruplex-forming sequence，PQS）。根据目前已有的技术，已发现数千个 G4s 广泛存在于各种生物的基因组调节区和 RNA 中，如DNA 端粒的末端、原癌基因的启动子区、信使RNA的5'端非翻译区（5'-untranslated region，5'-UTR）等 [5]，这些基序在 DNA 复制、转录、重组、表观遗传调控和维持端粒稳定性等生物学过程中发挥着重要作用。近几年，G4s 作为一种新的抗肿瘤治疗靶点，被广泛地用于癌症的研究。现已经开发了数千个G4s 配体 [6]。虽然目前还没有 G4s 配体通过美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）的上市批准，但是已有两个 G4s 配体（CX-3543和 CX-5461）进入了癌症治疗的临床试验阶段 [7-8]。这些研究促进了对哺乳动物 [9]、酵母菌 [10]、细菌 [11]、病毒 [12] 等生物的 G4s 探索，尤其是病毒。成熟完整的病毒一般由蛋白质外壳和核酸组成，少数病毒可能存在包膜。虽然病毒基因组表现出多样性，但PQS 在单个病毒物种中表现出显著的保守性。这说明 G4s 在病毒进化中起着至关重要的作用，可能会随着时间的推移影响病毒生命周期 [13]。相关研究表明，G4s 参与调节病毒的复制、转录、组装等关键过程，也可以与病毒共同进化 [14]。因此，G4s 是一个潜在的抗病毒靶标，具有开发广谱抗病毒药物的潜力。随着严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）引发的新型冠状病毒肺炎的流行，抗病毒药物研究被广泛关注。现有的抗病毒药物治疗靶点较少，主要针对病毒或宿主的蛋白质，由于病毒的高度变异性，开发广谱的抗病毒药物比较困难，而G4s 结构相对固定，以 G4s 为靶标发展的抗病毒药物具有一定的普适性。目前已有几种 G4s 配体在多种病毒中被证实具有抗病毒活性[15]，包括丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）[16]、埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）[17] 和 SARS-CoV-2等 [18]。本文旨在对以 G4s 为靶标的小分子配体在抗病毒中的应用进行总结，以期为靶向 G4s 的新型抗病毒药物的研发提供参考。 1 G4s 配体截至目前，研究者已经开发了几个类别的靶向G4s 结构的化合物，主要用于抗肿瘤领域。这些 G4s配体的特征是带有可质子化侧链的多环平面芳香支架，G4s 配体通常通过与末端 G-四分体的 π-π 堆积产生与 G4s 的相互作用，配体侧链的正电荷部分则与环状和沟槽中的磷酸基团相互作用（见图 1B 和图1C）[19]。目前的 G4s 配体可分为几个具有代表性的化学类别，也有一些 G4s 配体进入了临床试验阶段。这些对 G4s 配体的前期探索性研究为 G4s 配体在抗病毒领域的应用提供了经验。鉴于近期 G4s 配体在抗病毒领域的大量的报道，本文将对 G4s 配体在抗病毒研究中的应用进行了汇总和梳理，分别讨论几种代表性 G4s 配体在抗病毒领域的研究，并对配体的结构特征以及与 G4s 结合的特点进行概述，重点讨论配体的抗病毒作用。 1.1 卟啉类化合物TMPyP4 TMPyP4（1）是研究较广泛的 G4s 结合分子之一。它的物理化学特性（如分子结构的大小、平面的核心、带正电荷的取代基以及疏水性）使其非常适合堆叠在 G4s 支架上，因此常被用作 G4s 特定的稳定剂。它的同分异构体——TMPyP2（2）的 2位是 N-甲基基团，空间位阻的效应使 TMPyP2 无法与 G4s 结合，从而使其成为理想的阴性对照分子，可用于假阳性结果的排除，两者的组合促进了TMPyP4 作为 G4s 配体的研究 [20]。该化合物能明显地抑制端粒酶活性 [21]，并可以通过靶向 c-myc[22] 和Bcl-2[23] 等原癌基因启动子序列中的 G4s 区域，降低这些原癌基因的表达 [24]。TMPyP4 的主要缺点是对G4s 的选择性不强，它也会结合双链 DNA 结构 [25]。 TMPyP4 可以通过靶向G4s产生抗病毒活性。由于该化合物细胞毒性较低，目前已被应用于多种病毒的研究，包括人类疱疹病毒（human herpes virus，HHV）、人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）、ZIKV以及SARS-CoV-2 等。 HHV 在人群中广泛传播，可引起终身感染，导致口腔和生殖器疱疹以及癌症等一系列疾病。该类病毒均含有一个大的双链 DNA（double-stranded DNA，dsDNA）基因组，并具有丰富的 GC 含量和 PQS [26]。HHV 包括 α 亚家族：单纯疱疹病毒 1 型（herpes simplex viruses 1，HSV-1）、HSV-2；β亚家族：人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）、HHV-6、HHV-7 以及可诱发肿瘤的γ亚家族：EB病毒（epstein-barr virus，EBV）、人卡波西肉瘤疱疹病毒（Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）。在被 HSV-1 感染的细胞中，TMPyP4 可以与HSV-1 基因组中的 G4s 序列相互作用并使其稳定。这种化合物不影响 HSV-1 的进入和复制，但可以使组装好的 HSV-1 颗粒困在细胞质中，阻断病毒从细胞中释放 [27]。Ravichandran 等 [28] 报道了 TMPyP4可以在 HCMV 中增加 G4s 的形成，并发挥稳定G4s的作用。由于病毒的微RNA（microRNA，miRNA）能抑制病毒调控因子以及宿主基因的表达，因此对病毒毒力的维持非常重要，目前 KSHV和 HCMV 的 miR-K12-1-9,11 簇和 miR-US33 启动子的上游区域都发现了 G4s[29-30]。Kumar 等 [31] 报道了TMPyP4 可以破坏 miRNA 中 G4s 的稳定性，这种破坏效应会导致KSHV miR-K12启动子活性被抑制，并使 HCMV miR-US33 启动子活性增强。这表明，在 HHVs miRNAs 调节区域中的 G4s 可能在感染调制中发挥不同的作用。在 KSHV 中，TMPyP4 还稳定了潜伏相关核抗原（latency-associated nuclear antigen，LANA）的信使RNA（messenger RNA，mRNA）中的 G4s 结构 [32]。LANA 是潜伏期表达最多的蛋白质，也是病毒传播和逃避宿主免疫监视的基础 [33]。用 TMPyP4 处理24 h 后，在 KSHV 感染的细胞中观察到LANA水平的减少，证明LANA mRNA 中 G4s 的稳定会抑制该mRNA 的翻译 [32]。 HPV 是导致上皮结构增生病变的 DNA 病毒，高危型 HPV 会诱发宫颈癌和口咽癌。将 TMPyP4 与7种HPV病毒（HPV9、HPV16、HPV18、HPV32、HPV52、HPV57 和 HPV58）的 PQS 进行孵育，经荧光共振能量传递（fluorescence resonance energy transfer，FRET）和圆二色谱（circular dichroism，CD）进行熔解实验测定，发现所有的测试序列中都具有高的 G4s 稳定性 [34]。 ZIKV 是一种通过节肢动物传播的病毒，在2016 年造成了一次大流行，并演变成了一场公共卫生紧急事件，该病毒感染后可能会在婴儿和成人中引发严重的神经系统并发症。该病毒的正义 RNA基因组中包含多个PQS[35]。TMPyP4 可以作为 ZIKV中 G4s 结构的稳定剂。体内试验显示，该化合物可以以剂量依赖性的方式抑制该病毒的复制，是一种新的对抗 ZIKV 感染的策略 [50]。 Qin 等 [36] 发现 TMPyP4 可以通过靶向 G4s 而在细胞层面显著抑制 SARS-CoV-2 的感染，在两种动物模型中 TMPyP4 可以有效抑制 SARS-CoV-2 的复制并缓解肺部病变，同时该化合物展示了比瑞德西韦更强的抗 SARS-CoV-2 的活性，而化合物 TMPyP2没有表现出显著的活性，这提示 TMPyP4 抗 SARSCoV-2的活性可能与对 G4s 的靶向性有关 [37]。在该化合物的有效抗病毒浓度下，短时间内没有观察到明显的体内毒性 [36]。这显示了该化合物有作为临床抗 SARS-CoV-2 药物的潜力。TMPyP4 也被证明能明显抑制包含 G4s 序列的绿色荧光蛋白基因的表达 [38]。跨膜丝氨酸蛋白酶2（transmembrane serine protease 2，TMPRSS2）因广泛参与了包括流感、SARS 等在内的多种病毒的细胞入侵而“臭名昭著”。TMPRSS2 参与病毒入侵的方式是通过其丝氨酸蛋白酶活性激活病毒的刺突蛋白，从而促进膜融合。TMPRSS2 启动子包含一个能够折叠成 G4s 的富 G 序列，该序列的稳定可以抑制 TMPRSS2 的表达。Liu 等 [39] 报道了 TMPyP4 稳定宿主 TMPRSS2的 mRNA G4s 以抑制 TMPRSS2 的表达，从而抑制 SARS-CoV-2 感染。表明其抗 SARS-CoV-2 的作用可能也与靶向 TMPRSS2 RNA 的 G4s 导致的TMPRSS2 的表达量下降有关。 TMPyP4 在多种病毒中均显示了较好的效果，但是该化合物对 G4s 和 dsDNA 的选择性较低 [40]，在用该化合物进行抗病毒试验时，必须认真评估是否存在独立于 G4s 的作用机制。 1.2 PhenDC3及双喹啉家族的化合物 PhenDC3（3）是双喹啉家族中最具代表性的化合物，该化合物可以与 G4s 形成广泛的 π-π 堆积作用 [41]。由于该化合物对 G4s 的选择性要高于对dsDNA 的选择性，因此具有较高的 G4s 亲和力。该化合物的独特特性是它能够通过一种分子内的氢键使分子保持 syn-syn 构象（见图 2），这是它能与 G4s 结合的关键因素。该化合物能影响端粒酶的功能而被应用于抗肿瘤的研究 [42]，目前也有其在抗HCV、HPV 和 EBV 等病毒研究的报道。 HCV 是肝癌的主要病因之一。它有一个独特的开放阅读框的负链 RNA 基因组，能产生病毒的结构及非结构蛋白质。已有几种 PQS 在该基因组中被鉴定，其中最稳定的 G4s 位于核心基因 [43]。Jaubert等 [44] 发现在 HCV 中，PhenDC3 能够结合并稳定位于HCV 基因组 3' 端茎环 IIy' 处的高度保守的G4s倾向序列（HCV110-131）。PhenDC3 能通过稳定该G4s 而使其解链温度 Tm 升高 7.5℃。同时该化合物可以在体外阻碍该病毒 RNA 的合成，并且能够在不影响细胞活力的情况下减少该病毒的复制。在对 HPV 的研究中，PhenDC3 被证明是大多数 HPV G4s 的强体外稳定剂。尽管该化合物有很好的体外结合能力，但在器官型筏式培养中却未能表现出降低病毒复制及蛋白表达的效果 [34]。 PhenDC3 在病毒学中的研究大多数都是在 EBV上进行的。EBV 关键蛋白 EBNA1 的 mRNA 富含G4s，该G4s可被细胞核仁素蛋白（nucleolin，NCL）识别，两者结合会导致 EBNA1 表达的下调。由于 PhenDC3 对 EBNA1 mRNA 的 G4s 表现出的较高亲和力，PhenDC3 可抑制NCL对 EBNA1 mRNA G4s 的结合，从而增加 EBNA1的表达，激活抗原肽的产生 [45]。因此，PhenDC3 常被用作为模板来设计新的G4s 配体。Reznichenko 等 [46] 最近开发了20个PhenDC3 的衍生物，并在体外和体内的EBV相关模型中测试了这些化合物对 EBNA1 mRNA G4s 的结合活性。其中 PyDH2（4）和 PhenDH2（5）被认为是最有前途的化合物，因为它们能够结合 EBNA1 mRNA G4s，并以 G4s 依赖的方式增强 EBNA1 的表达，阻止 EBNA1 G4s 与 NCL的相互作用，并从整体上阻碍EBV的免疫逃避。化合物 PyDH2 和PhenDH2 的毒性明显低于母体化合物 PhenDC3，因此在 G4s 介导的抗病毒治疗中具有很好的应用前景。 SARS-CoV-2 非结构蛋白3（nonstructural protein 3，Nsp3）蛋白的 SUD 结构域可以与宿主的 G4s 进行结合，两者的结合对SARS-CoV-2 的复制起到非常重要的作用，开发阻断两者结合的小分子是一种潜在的抗 SARS-CoV-2 药物开发策略。PhenDC3 和 PhenDH2 被证实具有抑制 SARS-CoV-2 SUD 与宿主细胞 DNA 或 RNA G4s 结合的作用，因此具有抗 SARS-CoV-2 病毒的潜力 [47]。 1.3 N-甲基中卟啉IX N-甲基中卟啉 IX（N-methyl mesoporphyrin IX，NMM，6）是间卟啉 IX 的 N-甲基化的非平面衍生物。最初鉴定为铁螯合酶的抑制剂，可阻断Fe2+ 与原卟啉 IX 发生螯合从而中断血红素的生物合成 [48]。NMM 是最早被报道能够结合 G4s 的小分子之一。NMM 能特异性地结合 G4s 而不是 dsDNA，同时也对平行的 G4s 表现出比反平行 G4s 更强的亲和力 [49]。NMM 与 G4s 结合后，突出平面的 N-甲基基团可以与 G-四分体的中心空腔很好地匹配，并与钾离子对齐，产生了一个有效的 π-π 堆积作用，能很好地稳定 G4s[50]。NMM 具有作为荧光分子的特性（激发波长为 393 nm，发射波长为 610 nm），当它选择性地结合到 G4s，能大大放大其信号（与平行 G4s 结合后，能将其荧光信号放大 60 倍）。由于 NMM 能优先结合到平行的 G4s 拓扑结构并增强荧光信号，因此可以基于 NMM 引发的荧光增强程度来区分不同的 G4s 结构 [51]，并作为一种简单、高灵敏度且特异性的G4s结构的化学探针[52-55]。在细胞中，NMM 被证明具有调节基因表达，影响表观遗传景观，并通过 G4s 介导的机制影响细胞生长的作用 [56]。 Ravichandran 等 [28] 对 HCMV 的 20 个基因中的36 个 PQS 进行了分析，发现 HCMV 基因调控区的大多数 PQS 实际上被折叠成稳定的 G4s，而 NMM可以稳定 G4s 并增强 G4s 的形成。在细胞试验中发现，NMM 可以通过稳定位于基因启动子内的 G4s，抑制相关基因的转录。甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）是大多数流感发生的原因，它可以影响家禽、人类和其他哺乳动物。其负链 RNA 基因组由编码病毒蛋白的 8 个片段组成，该病毒具有较高的变异性，这也是 IAV 的关键生存机制。Tomaszewska 等 [57] 利用 NMM 对 IAV 基因组中的 RNA PQS 进行了生物物理分析。他们发现了几个保守的 G4s 基序，并用NMM 与 PQS 基序孵育证实了存在 G4s 折叠。 1.4 萘二酰亚胺萘二酰亚胺（naphthalene diimide，NDI）是最通用的 G4s 配体之一，广泛应用于生物医学领域。它们有一个大而扁平的芳香母核，可以通过 π-π 堆积与 G4s 相互作用；它能连接 4 个可质子化的侧链官能团，这有利于该结构与 G4 凹槽中的磷酸基团形成氢键，由此产生的 G4-NDI 复合体非常稳定，并使 NDI 成为诊断和治疗研究的有力工具。通过对NDI 骨架的药物化学研究，相关研究人员研发了几种对 G4s 具有高亲和性和选择性的衍生物，由于这些衍生物能够紧密结合位于端粒和癌基因启动子的G4s 而被广泛用于抗癌研究 [58]。在 NDI 衍生物中，c-exNDIs 在水中的溶解度非常高 [59]，该化合物在对HIV-1 和 HSV-1 的测试中，显示出显著的抗病毒效果，该化合物对病毒 G4s 有着比对细胞 G4s 更高的亲和性，也是首个被证实可通过靶向 G4s 实现抗病毒作用的化合物 [59-60]。最近，化合物 c-exNDI 2（7）被用于分析所有逆转录病毒（retrovirus，RV）整合基因组的长端重复序列（long terminal repeated，LTR）区域的PQS[61]。其中最具代表性的是 HIV-1 病毒 [12]，通过CD 以及 Taq 聚合酶终止试验发现 c-exNDI 2 能稳定所有的测试序列 [61]。Tassinari 等 [62] 将 NDI 与一组肽核酸（PNA）序列进行偶联，偶联物中的 PNA 能与目标 G4s 旁边的 DNA 序列互补，通过该方法实现 NDI 对 G4s 识别的特异性。通过实验他们发现NDI-PNA 偶联物能够特异性识别 HIV-1 LTR 区域内选择的 G4s。这种方法表明：可以通过将 G4s 配体与 PNA 偶联来实现对特定 G4s 的靶向，通过对PNA 的设计与合成，很容易实现对特定 G4s 的靶向。 1.5 吖啶衍生物BRACO-19（B19） BRACO-19（B19）吖啶衍生物 BRACO-19（B19，8) 有明显的端粒酶抑制活性和对 G4s 的高选择性，由于其对 G4s的选择性要远高于 dsDNA 并且具有较低的细胞毒性而被广泛用于 G4s 研究。该化合物可以利用吖啶环与 G4s 形成 π-π 相互作用，两个叔胺侧链在生理 pH下会质子化，有助于对 G4s 凹槽的识别，这些特点增强了该化合物对 G4s 的特异性 [63]。该化合物最早被应用于肿瘤治疗，也是首个在动物模型中被证明具有抗肿瘤活性的 G4s 配体 [64-65]。近几年，该化合物被广泛应用于抗病毒的研究并且常作为研究病毒 G4s 的首选工具。目前，化合物 B19 已被用于 DNA 病毒 [ 如HHV、人腺病毒（human adenovirus，HAdV）、HPV等]、细小病毒以及 RNA 病毒（如RV和ZIKV）。在 α-HHV 中，B19 被用于研究位于即刻早期（immediate early，IE）基因启动子中的 PQS。生物物理相关试验证明了所选序列被折叠成稳定的 G4s。与 B19 孵育可以提高该 G4s 的 Tm，证实了该配体的稳定作用。为了评估 G4s 在 α-HHVs IE 基因转录中的生物学作用，Frasson 等 [66] 在 HSV-1 的两个代表性IE 基因的启动子序列下游克隆了萤火虫萤光素酶基因，发现 B19 会通过稳定 G4s 来降低 IE 基因转录，并以剂量依赖的方式影响两种启动子的活性。病毒转录因子 ICP4 可以与 HSV-1 IE 基因启动子（包括 ICP4基因启动子）中的 G4s 结构相互作用并使其展开，促进病毒转录。Frasson 等 [67] 发现 B19 能在 ICP4 启动子区域与 ICP4 进行竞争，从而降低 ICP4 启动子的活性。由于 ICP4 对病毒复制至关重要，这种干扰ICP4-G4 相互作用的方式可能是一种新的治疗方法。Artusi 等 [68] 发现 B19 能与 HSV-1 基因组非编码区的G4s 结合，导致病毒 DNA 和病毒后期蛋白合成减少，证实了 G4s 在调节 α-HHV 生命周期中的关键作用。 B19 也被用于表征 G4s 在 HAdV 基因组中的存在。HAdV 是一种无包膜的 dsDNA 病毒，可引起严重的眼科、呼吸系统及神经系统疾病。HAdV 全基因组的生物信息学研究揭示了几个保守的 PQS。Majee 等 [69] 通过生物物理研究证实了它们的存在，并发现 B19 能大大提高 HAdV G4s 的稳定性；此外，在经重组腺病毒载体（含有绿色荧光蛋白报告基因）转染的 HEK293 细胞中，用 B19 处理会使荧光发射降低并抑制病毒粒子产生。 Carvalho 等 [34] 报道了 B19 及其吖啶衍生物C8（9）通过靶向 G4s 而产生抗 HPV 的作用。通过荧光嵌插剂置换实验（fluorescent intercalator displacement，FID）发现这两种化合物以高亲和力与 G4s 结合。在感染 HPV16 或 HPV18 的器官型培养模型中，用 C8 治疗 20 d 后，可成功减少病毒的复制。由于目前还没有根治潜伏 HPV 病毒的方法，所以通过靶向 HPV 中 G4s 的方法可以同时实现对复制与潜伏病毒的靶向。 Bua 等 [70] 报道了化合物 B19 对 DNA 病毒——人细小病毒 B19（Parvovirus B19，B19V）的作用。生物信息学工具预测 B19V 基因组中复制起点附近存在潜在的 PQS，但无论是生物物理和生化分析，还是药物治疗，都不支持 G4s 折叠。此外，B19 对感染 B19V 的红系前体细胞（erythroid progenitor cell，EPC）没有显示出任何抗病毒活性，这表明 PQS 的生物信息学预测并不总是反映 G4s 的实际存在。在 RNA 病毒中，RV 的长末端重复序列 U3 区域存在 G4s。Ruggiero 等 [61] 报道了 B19 对该区域的作用。CD 光谱表明，在 B19 存在的情况下，所有 RV 的亚家族的几个序列都形成了稳定的 G4s 结构。B19 的加入稳定了 G4s，并使 Taq 聚合酶停滞，最终使全长扩增产物减少。在 RVs 中，G4s 因其在HIV-1 调节中的作用而被广泛研究。B19 被证明对HIV-1 生命周期的整合前和整合后都有抑制作用。这可能与 RNA 基因组及前病毒 DNA 的 U3 区域均存在 G4s 有关。B19 可以在整合前抑制 DNA 合成，也可以在整合后阻止 DNA 模板上的聚合酶对病毒的转录和复制，从两个方面有效地抑制 HIV-1的进展 [71]。HIV-1 G4s 可以与病毒核壳体蛋白 7（nucleocapsid protein 7，NCp7）结合，该蛋白发挥G4s 去折叠活性。凝胶迁移实验和 CD 分析显示，NCp7 能结合 RNA G4s，促进逆转录进程中的 DNA/RNA 中间体的形成。B19 能够部分抵消 NCp7 对G4s 的展开活性。因此，由 B19 介导的 G4s 在 RNA水平上对 HIV-1 的抑制是由对逆转录酶的阻滞以及对 NCp7 伴侣蛋白活性的抑制双重原因导致的 [72]。在感染 MR766 ZIKV 的 Vero 细胞中，B19 能够减少病毒蛋白表达和基因组复制，总体抗病毒效果可能与该化合物可以稳定病毒 RNA 上的 PQS 有关 [16]。同时，B19 能明显抑制包含 G4s 序列的绿色荧光蛋白基因的表达，而在 SARS-CoV-2 的基因组中，发现了多个保守的G4s序列，这提示 B19 对 SARSCoV-2复制具有抑制作用 [38]。 1.6 Pyridostatin及其衍生物 Pyridostatin（PDS，10) 是一个根据多种已知的G4s 配体分子的结构，理性设计出的新 G4s 配体，该化合物对 G4s 具有较高的选择性，是 G4s 研究的代表性配体 [73]。该化合物结构的富电子平面结构、芳香性的表面以及参与氢键的能力都使其能与 G4s有效结合。PDS 可以通过稳定端粒的 G4s 而发挥抗肿瘤作用 [74]。PDS 及其衍生物对 G4s 的特异性识别已通过核磁共振波谱法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）进行了阐明 [75]。目前已有多种以 PDS 为母体的类似物被报道，并表征了它们在G4s 介导抗肿瘤中的作用 [74]。目前，PDS 及其类似物已被广泛用于对抗几种病毒如 HHV、HPV、HCV 以及 SARS-CoV-2。在KSHV 和 HCMV 中，Kumar 等 [31] 研究了 PDS 对miRNA 近端启动子中的 PQS 的作用（KSHV 中的miR-K12，HCMV 中的 miR-US33）。CD 光谱显示，两个序列都形成了稳定的平行 G4s，形成的 G4s 能进一步被 PDS 稳定。与化合物 TMPyP4 相反，通过稳定 G4s，PDS 可导致 KSHV miR-K12 启动子活性增强，并使 HCMV miR-US33 启动子活性被抑制，对两个启动子产生相反的作用，这种结果的产生可能是由与 G4s 无关的因素导致的。在 EBV 中，NCL 可以与位于 EBNA1 mRNA中 GAr（glycine-alanine repeat）结构域的 G4s 结合。Prado 等 [45] 研究了 PDS 在阻止两者互作中的作用，通过邻近连接分析发现 PDS 不能减弱 NCL和 EBNA1 mRNA 之间的相互作用。此外，在牵出试验中，PDS 也不能抑制包被 EBNA1 G4s 的磁珠对 NCL 的成功下拉，导致这种结果的原因可能与PDS 对该特定 G4s 结构的亲和力较弱或形成了 PDS/NCL/ENBA1 三元复合物有关。 PDS 可以与来自 7 种不同 HPV 基因型的 PQS结合，但却表现出比其他测试的 G4s 配体更弱的亲和力，PDS在体内对HPV的作用仍需进一步研究[34]。在 HCV 中，Bian 等 [76] 报道了 PDS 类似物PDP（11）具有抑制 NCL 与病毒 RNA G4s 相互作用的能力。通过牵出试验和在 Huh-7.5.1 细胞中进行的免疫荧光实验证实 PDP 可竞争结合 G4s。最近，PDS 对 ZIKV 的抗病毒作用也有报道。PDS 能够结合并稳定 3 个富含 G 的 ZIKV RNA 序列。在用最稳定的 RNA G4s 转染的 Vero 细胞中，通过免疫荧光分析发现 PDS 的加入可导致 RNA G4s信号的增强。PDS 能够降低 ZIKV 导致的细胞病变效应并降低 mRNA 合成，显示出在 ZIKV 感染治疗中的抑制作用。但也发现了 PDS 可以影响 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶活性，这对病毒蛋白的生产至关重要。总之，由于存在多靶点抑制作用，这些结果使 PDS 在抗 ZIKV 中具有较好的潜力。 PDS 及其衍生物 cPDS 能通过靶向 G4s 使TMPRSS2 的表达降低，从而在细胞层面抑制 SARSCoV-2假病毒的感染，同时没有明显的细胞毒性 [39]。PDS 的另一个衍生物 PDP 也被用于 SARS-CoV-2的 G4s 研究。PDP 可以稳定 SARS-CoV-2 基因组中RG-1 从而降低了 SARS-CoV-2 N 蛋白的表达 [77]。该蛋白在病毒的复制与组装中发挥着关键作用。尽管 PDS 及其衍生物在细胞短期用药中的毒性较低，该化合物是否有望被推广还需要经过生物利用度、成药性以及临床试验的检验。 1.7 其他 G4s 配体化合物目前也有其他一些 G4s 的配体被证实可以通过靶向G4s产生抗病毒的作用，包括CX-5461（12）、CX-3543（13）、利巴韦林（ribavirin，14）以及苯并硒杂蒽类似物（化合物 15 和 16）等。 CX-5461 最初是被作为 Pol I 转录的选择性抑制剂 [78]，这种化合物能诱导衰老和自噬，最终导致癌细胞的死亡 [78-79]，后来证实 CX-5461 的抗癌活性是G4s 介导的 [8]。在近期对 HCMV 的测试中，该化合物被证实可以在人成纤维细胞中抑制 HCMV 病毒的复制和 pre-RNA 的合成。用该化合物处理 48 h 后，能显著降低病毒的复制，干扰病毒 DNA 和后期蛋白质的合成。该化合物的抗 HCMV 活性可能与激活细胞免疫反应有关，据相关报道，该化合物激活了细胞应激反应，并抑制病毒的生长 [80]。 Shen 等 [81] 开发了一系列苯并硒杂蒽衍生物，这类化合物可以稳定 G4s，并以剂量依赖的方式降低了 Calu3 细胞中 TMPRSS2 的表达和 IAV 复制。 CX-3543 是首个被用于临床试验的靶向 G4s 的小分子 [7]，最初被用于作为抗肿瘤的化合物，近期的实验表明，CX-3543 可以与包含 G4s 结构的 SARS-CoV-2 RG-1 RNA 序列结合 [82]，暗示了 CX-3543 在抗 SARS-CoV-2 中的潜力。利巴韦林是一种知名的新型冠状病毒肺炎治疗药物 [83]，具有多种作用机制，最近一项研究表明，利巴韦林能够调节 TMPRSS2 启动子上的 G4s，介导 TMPRSS2 表达的降低 [84]，说明了在病毒感染过程中病毒和宿主的G4s 都发挥了重要的作用。 Tong 等 [85] 通过药物重定位策略，从已知的 G4s配体库中筛选出 5 种用于临床研究并且无严重心肺毒性的化合物。通过分子对接，筛选了两个能够与经典 RNA G-四链体（RNA G-quadruplexes，RG4s）结构结合的 G4s 稳定剂拓扑替康（topotecan，TPT，17）和小檗胺（berbamine，BBM，18），利用微量热涌动实验，证实了 TPT 和 BBM 能够与宿主因子mRNA 的 RG4 结构稳定结合。研究团队在新型冠状病毒肺炎易感细胞 H1299 中外源性表达了 ACE2、AXL、FURIN、TMPRSS2 等多种宿主因子，发现TPT 和 BBM 显著抑制宿主因子蛋白表达；突变的RG4 结构形成关键位点能显著促进相应宿主因子蛋白表达，并导致 TPT 和 BBM 的抑制作用失效。此外，用 TPT、BBM 处理 SARS-CoV-2 易感细胞 H1299、Vero-E6 均显著下调内源性 ACE2、AXL、FURIN、TMPRSS2 等蛋白的表达。上述研究证实 TPT 和BBM 能够通过稳定 RG4 结构，抑制关键宿主因子表达，具有潜在的抵抗 SARS-CoV-2 感染的作用。研究团队利用 SARS-CoV-2 假病毒系统分别在细胞和动物水平检测了 TPT、BBM 对 SARS-CoV-2 感染的调控作用。他们发现，TPT 和 BBM 显著抑制 SARSCoV-2原始株、突变株 P.1 和突变株 B.1.617.2 感染宿主细胞，并在低浓度时表现出比 PDS（RG4 经典稳定剂）更高的病毒感染抑制效率。 2 结语与展望近年来病毒基因组学的研究发现许多 G4s 或PQS 出现在病毒基因组的调节区，对调节病毒生命周期发挥关键作用。通过利用小分子 G4s 配体靶向病毒 G4s 或宿主 G4s 实现对病毒感染的抗性，被证明是一种新的抗病毒策略。开发抗病毒 G4s 结合剂的最艰巨的任务是赋予它们区分病毒和细胞 G4s 的能力。如上所述，目前的 G4s 配体具有共同的化学特征，它们通过与 G4s 的堆积作用识别 G4s，这种识别方法无法提升对不同 G4s 的选择性，使配体的成药性较差，也成为它们进入临床试验的障碍。基于病毒 G4s 的高分辨率结构设计新的分子可以提高选择性，由于 G4s 主要在环和沟槽区域不同，这些G4s 局部结构的表征将为设计更具选择性的配体提供基础。G4s 配体最终发挥抗病毒作用往往归因于病毒-宿主相互作用的多种机制，在具体的试验中需要在分子水平上更深层次地表征 G4s 介导的病毒机制，而这些详细机制的阐明也会有利于开发基于G4s 的抗病毒药物。以 G4s 为基础的靶向策略的另一个突出的优点是可以同时影响复制和潜伏的病毒，这种特点在针对感染的人类宿主的 HHV、 HPV 和HIV-1 等病毒中具有明显优势。总而言之，关于病毒中 G4s 的所有数据都表明，G4s 配体是控制病毒感染的一种新的方法，以 G4s 为靶标的小分子配体研究会为抗病毒药物的开发提供新的视角。参考文献： [1] Varshney D, Spiegel J, Zyner K, et al. 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DOI: 10.1371/journal.ppat.1011131. 谢恬谢恬，医学博士、二级教授、博士生导师。中国医学科学院学部委员，国务院特殊津贴专家、国家岐黄学者、浙江省特级专家，药学国家一流本科专业负责人，国家重点学科“治未病与健康管理”学科带头人。杭州师范大学药学院院长、中西医整合肿瘤学研究院院长、浙江省榄香烯类抗癌药物研究重点实验室主任、浙江省中药资源开发与利用工程研究中心主任。兼任中国抗癌协会中西医整合控瘤新药研究专委会主任委员、世界中医药联合会肿瘤分会副会长、中国中西医结合学会常务理事及中药学专委会副主任委员。谢恬教授以第一完成人获国家科技进步二等奖 2 项、中国发明专利金奖 2 项、教育部高校优秀科研成果一等奖 3 项，还获浙江省教学成果二等奖、吴阶平医药创新奖、何梁何利科学技术创新奖、中国药学发展奖创新药物突出成就奖、杭州市科技创新特别贡献奖等。谢恬教授获授权中国、欧美发明专利 50 余项；创新提出中西医结合“分子配伍”理论研发新药及治疗癌症，成功研发榄香烯脂质体（榄香烯乳状注射液、榄香烯口服乳）等新药。主持国家自然科学基金重点项目、国家重大新药创制重大专项、国家中药现代化重点项目等科研项目20多项。在PNAS，Sci Transl Med，Nat Commun，Chem Soc Rev，Angew Chem，Adv Mater，Matter，ACS Nano等著名期刊发表学术论文160余篇；出版Elemene Antitumor Drugs 等专著、教材和译著 20 部。叶向阳博士，研究员。浙江省高层次人才。从事免疫抗肿瘤、靶向抗肿瘤、心血管疾病、代谢综合症、纤维化病等多个领域的创新药研发近 20 年，在药物设计上有丰富的经验，并在药物化学、天然产物全合成、有机合成领域等领域取得一定的成绩。创新药物发明专利授权和发明申请 40 余项；发表 SCI 论文 70 余篇，其中以第一作者或通讯作者在药物化学及有机化学Top期刊如 J Am Chem Soc，J Med Chem，Eur J Med Chem，J Org Chem，Biochem Pharm 等发表多篇论文。现任美国化学会及美国三洲华人化学会委会员。担任多个国际期刊审稿人。 end 本公众号声明： 1、如您转载本公众号原创内容必须注明出处。 2、本公众号转载的内容是出于传递更多信息之目的，若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请作者或发布单位与我们联系，我们将及时进行修改或删除处理。 3、本公众号文中部分图片来源于网络，版权归原作者所有，如果侵犯到您的权益，请联系我们删除。 4、本公众号发布的所有内容，并不意味着本公众号赞同其观点或证实其描述。其原创性以及文中陈述文字和内容未经本公众号证实，对本文全部或者部分内容的真实性、完整性、及时性我们不作任何保证或承诺，请浏览者仅作参考，并请自行核实。

核酸药物

2026-01-14

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元素化学生物学研究的挑战与发展机遇

本文总结了国家自然科学基金委员会专项项目(科技活动项目) “元素化学生物学”研讨会的学术交流和研讨成果, 凝练了该领域国际前沿研究亟需解决的关键科学问题和重点发展方向, 提出了加强学科发展布局的资助建议.1引言据统计, 有29种元素参与生物演化过程, 76种元素参与疾病诊断与治疗, 这些元素在生物生长、生命健康中起着关键且不可替代的作用. 随着物质科学、生物技术的革命性突破, 元素化学生物学作为化学生物学的一个学科方向, 广泛涉及化学、生物、医学、材料、信息、工程等学科. 该学科方向聚焦元素特征鲜明的生物分子离子、生物过程、调控工具、临床诊疗试剂、组学与成像技术等研究[1~4], 致力于利用经典学科与现代技术的互补性来同步研究生命元素、诊疗元素及其生物系统的结构和功能在时空尺度上的多样性, 着重考察元素介导的生物系统稳态变化, 绘制化学生物学元素周期表(图1), 并应用于生物医药、疾病诊疗、生命健康、环境治理、高端制造等领域.图 1 生命元素与诊疗元素的化学周期表(红色字体表示放疗元素)元素化学生物学的发展可追溯到1962年, 沃森(Watson)、克里克(Crick)和威尔金斯(Wilkins)因发现DNA双螺旋结构而获得诺贝尔生理学或医学奖, 该发现揭示了含磷(P)骨架构成的磷酸二酯键在遗传信息存储与传递中的核心作用[5]. 1992年, 克雷布斯(Krebs)和费希尔(Fischer)因发现蛋白质可逆磷酸化调控机制而获得诺贝尔生理学或医学奖, 证实磷酸基团是作为信号传导“分子开关”的关键功能[6]. 磷酸化修饰通过改变蛋白质构象与活性, 构建了细胞内复杂的信号网络, 凸显了磷元素在动态生物调控中的不可替代性. 1998年, 诺贝尔生理学或医学奖授予了罗伯特·弗奇戈特、路易斯·伊格纳罗和弗里德·默拉德，以表彰他们发现了一氧化氮(NO)作为心血管系统信使分子的作用机制. 此后, 基于他们的工作, 研究人员进一步研究揭示了铁(Fe)、铜(Cu)等金属元素在气体信号传导中的核心地位. 例如, Fe2+与NO结合调控血红蛋白的氧运输, Cu2+参与NO合成酶的催化过程, 展现了金属元素对生物信号转导的精准调控[7,8]. 2002年, 诺贝尔化学奖授予了在生物大分子质谱和核磁共振研究做出杰出贡献的三位科学家(约翰·芬恩、田中耕一、库尔特·伍斯里奇). 这些基于元素解析的技术为蛋白质、核酸等生物分子的精确三维互作提供了关键工具, 从原子水平阐明了元素参与的生物识别与催化机制[9]. 2003年, 诺贝尔生理学或医学奖授予了保罗·劳特布尔和彼得·曼斯菲尔德，以表彰他们在核磁共振成像(MRI)技术领域的突破性成就, 该技术利用氢(1H)与顺磁性金属(如钆(Gd)、锰(Mn)、铁(Fe))的物理特性实现了活体元素分布可视化与动态监测, 推动了元素化学生物学从体外研究向活体实时动态分析, 为元素相关疾病(如铁过载、铜代谢紊乱)的诊疗提供了全新策略[10].近年来, 元素化学生物学研究新方法和新技术的开发, 推动了生命元素化学生物学及调控工具、元素诊疗化学生物学及临床应用等研究的快速发展, 研究成果揭示了生命体系中元素的精确调控机制, 人工设计的元素化学工具又推动了医学和生物技术发展, 对生物起源与进化、人类健康与疾病等领域的研究具有深远意义. 由国家自然科学基金委员会化学科学部主办的“元素化学生物学研讨会”于2024年9月在中山大学召开. 本次研讨会围绕“生命元素稳态与调控、具有元素特征的探针分子、金属蛋白(酶)化学生物学、元素药物化学生物学、放射元素化学生物学、元素化学生物学研究新方法和新技术”6个专题展开. 本次研讨会汇聚了国内分别来自化学、生物学、药学与医学等领域的主流和特色研究团队, 充分体现了化学生物学作为一门高度融合交叉学科的特点. 一批创新性的工作和发展方向在研讨会中涌现, 展示了我国在元素化学生物学领域的最新进展, 充分讨论了国际研究前沿和热点, 现总结如下.2国内外元素化学生物学研究进展2.1 生命元素化学生物学及分子调控工具2.1.1 生命元素生命元素可分为主族金属元素、主族非金属元素和过渡金属元素. 主族金属元素如钾[11]、钠[12]、钙[13]和镁[14]主要以离子形式介导神经传导、细胞通讯、生物大分子稳定等生物过程.钠Na+: 近年来的研究表明, 主族金属离子介导细胞间通讯调控免疫细胞功能. 例如, 肿瘤实质中的钠离子浓度明显高于癌旁组织, 引起的离子通讯在肿瘤发展中具有关键作用. Zielinski等[15]发现, 在高Na+状态下, 肿瘤微环境中的Na+内流增加导致胞内Na+浓度升高, 增强Na+/K+-ATP (腺嘌呤核苷三磷酸)酶活性, 使细胞膜维持超极化状态. 这一变化促进了T细胞受体(TCR)激活过程中的钙离子内流, 启动了活化T细胞核内因子(NFAT)的产生, 激活了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路, 进而引发了代谢重编程, 提高了T细胞的代谢适应性和杀伤性. Lugli等[16]也报道了高盐饮食会导致氯化钠在肿瘤中特异性蓄积, 通过NaCl补充剂可以诱导CD8+T细胞活化及效应记忆T细胞分化, 维持干细胞样可塑性的基因网络, 与PD-1阻断剂具有相似的免疫通讯效果.钾K+: 钾离子是一种在胞内而非胞外高浓度存在的离子, 然而, Restifo等[17]研究发现, 当肿瘤坏死后会释放K+到胞外空间中, 改变了内外离子梯度, 使T细胞的葡萄糖代谢水平和必需氨基酸含量大幅下降, 从而抑制了T细胞的合成代谢. 但同时也激活了自噬相关通路, 引起代谢重编程, 激活了多个干细胞样能力相关的基因位点, 使T细胞具有更强的持久力、移植存活率、自我更新能力以及多能性. 另外, K+稳定核酸G-四链体二级结构, 并与Na+一起协同调控构型转变, 在基因转录与表达、DNA复制、RNA翻译、端粒酶活性维持、基因组稳定性以及表观遗传修饰等方面发挥重要的调控作用[18].镁Mg2+: 血清镁含量也是免疫系统抵御病原体和肿瘤细胞的重要因素. T细胞只有在镁浓度充足的环境中, 才能通过离子信号传递清除异常或受感染的细胞, 保障免疫系统的正常运转. Hess等[19]发现, Mg2+能促进白细胞功能相关抗原1 (LAF-1)的构象变化, 从而调控LFA-1与其配体ICAMs之间的结合亲和力, 诱导免疫突触形成. 此外, Mg2+还能利用整合素淋巴细胞功能相关分子1-细胞间黏附分子(LFA-1-ICAMs)的结合形成顺式和同型细胞间的相互作用, 增强分子由外向内的信号传递, 参与T细胞活化过程以及白细胞的迁移与外渗. 另外, Mg2+通过中和磷酸骨架的负电荷, 稳定RNA的折叠构象(如tRNA的“L”形结构)[20].钙Ca2+: 胞质中的Ca2+不仅是一种重要的矿质元素, 可以参与调节细胞的结构和代谢, 并且还作为第二信使在细胞信号转导中起着核心作用. 钙调蛋白(calmodulin)通过结合Ca2+调控神经元信号传导、肌肉收缩等过程. 张宏等[21]发现自噬诱导条件下引起的内质网表面的钙瞬变是决定自噬体在内质网上形成的关键信号. 内质网表面的钙瞬变引起参与自噬起始的200 kD的焦点黏附激酶家族相互作用蛋白(FIP200)复合物发生液-液分离, 所形成的FIP200凝聚体进而与内质网膜蛋白VAPs和ATLs结合定位于内质网, 成为自噬体起始位点.生命必需的过渡金属元素, 如铁(Fe)、锌(Zn)、铜(Cu)、锰(Mn)、镍(Ni), 以特定化学形式嵌入生物分子中, 形成金属蛋白(酶). 生物体内近一半的蛋白酶需要金属元素来发挥功能, 这些第一过渡金属元素通过其独特的配位动力学活性和可变氧化还原态特性发挥对生物大分子的瞬息动态调控作用.铁Fe2+/Fe3+: 铁在红细胞功能和许多生理过程所需的必需蛋白质和酶中起着至关重要的作用[22], 如组织中氧的运输、线粒体呼吸过程中的电子传递反应、DNA的合成和修复、异种生物的新陈代谢. 当铁元素在细胞和组织中过量存在时, 会破坏氧化还原平衡, 催化活性氧(ROS)的传播, 从而导致氧化应激[23,24]. 2012年, Stockwell实验室[25]提出了“铁死亡”这一基于内源性铁稳态失衡导致的新型细胞程序性死亡方式. 铁死亡由铁依赖性的脂质过氧化作用驱动, 受到包括氧化还原稳态、线粒体活性和脂质、氨基酸、糖的代谢、铁代谢等多种代谢途径的调控, 这种死亡方式与多种器官损伤与退行性疾病息息相关.铜Cu+/Cu2+: 铜是动物和人类必需的微量金属元素, 通过调节各种重要的生物过程, 包括线粒体氧化磷酸化、结缔组织交联和抗氧化防御, 能促进器官正常功能和新陈代谢过程, 如血红蛋白合成、神经递质、铁氧化、细胞呼吸、抗氧化防御肽酰胺化, 以及色素和结缔组织的形成[26]. 2022年, Golub等[27]报道了一种由线粒体铜过载引起的细胞死亡新形式——“铜死亡”. 铜死亡的主要过程依赖于细胞内铜离子的积累, 铜离子直接结合三羧酸循环(TCA)循环中的脂酰化成分, 导致这些蛋白聚集、失调, 阻断了TCA循环, 引发了蛋白质毒性应激, 并诱导细胞死亡. 其中, 铁氧还蛋白1 (FDX1)是铜死亡的关键调控因子, 也是蛋白质脂酰化的上游调节因子. FDX1和脂酰化蛋白的丰度与多种人类肿瘤的发生高度相关, 这为具有此类代谢特征的癌细胞提供了潜在的治疗手段. 铜死亡和铜增生策略已成为近年来人们针对癌症治疗的研究热点.锌Zn2+: 锌作为重要的微量元素, 是很多酶的辅助因子, 可以稳定蛋白质结构, 提高催化活性, 参与细胞呼吸、DNA复制和修复、转录和翻译等过程[28], 与细胞分裂、凋亡、衰老、增殖和抗氧化防御机制密切相关. 毛宗万、夏炜等[29]发现精氨酸激酶伴侣蛋白McsA的锌指结构作为细胞内重金属传感器, 通过感受细胞内锌离子浓度而发生构象变化, 进而通过结合精氨酸激酶McsB改变底物的亲和力, 显著增强磷酸化效率并加速信号周转. 说明Zn2+可通过锌指结构调控蛋白精氨酸磷酸化修饰程度, 从而维持细胞内蛋白质稳态平衡. 此外, Zn2+还作为信号分子参与细胞信号通路调控, 并通过金属介导的传递机制增强免疫细胞功能[30]. 郭子建等[31]发现肿瘤细胞内存在Zn2+过载现象, 这会引发线粒体呼吸链电子的异常泄露, 并促进还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化, 从而导致ROS积累, 促使干扰素和炎症因子释放至胞外. 过量Zn2+也会诱导肿瘤发生免疫原性焦亡, 促进了抗肿瘤免疫信号的传递.锰Mn2+: 锰具有提高免疫力、维持神经、改善造血系统、维持心脏和肌肉功能、预防心脑血管疾病等作用与功效. Mn2+浓度变化也与病理状态密切相关. 例如, 病毒感染细胞后会导致线粒体、高尔基体等贮锰亚细胞器中Mn2+释放到胞质, 使胞质Mn2+浓度升高至正常生理下的60倍左右. 2018年, 蒋争凡等[32,33]发现Mn2+不仅能促进第二信使环磷酸鸟苷(cGAMP)合成, 也能增强干扰素基因刺激蛋白(STING)与cGAMP的结合能力, 从而超活化dsDNA感受器cGAS-STING信号. 通过外源添加Mn2+改变细胞内外离子梯度可激活cGAS-STING通路, 促进肿瘤抗原呈递, 增强细胞毒性T细胞和自然杀伤(NK)细胞的活性, 同时促进记忆性T细胞的存活与增殖, 强化机体对肿瘤细胞的免疫监视和清除能力[34].在蛋白质翻译后修饰中, 磷酸化修饰是磷在生物化学中的重要体现, 调控蛋白质功能和细胞内信号转导. 近年来, 研究人员也发现一些主族非金属元素同样以特定化学形式嵌入生物大分子中, 形成硫代核酸、硒核酸、硒蛋白等.磷P: 磷是生命体系中极为重要的元素, 广泛存在于DNA、RNA、ATP和磷脂等关键生物分子中. 人体中磷含量约为0.9%, 其中80%~90%存在于骨骼和牙齿中, 其余磷元素在细胞信号传导、基因表达调控和代谢过程中发挥关键作用. 例如, 淀粉样蛋白的异常磷酸化会影响其聚集状态和构象变化, 导致病理蛋白聚集的多态性与异质性, 进而推动神经退行性疾病的进展. 李艳梅和刘聪等[35]合作研究发现, α-突触核蛋白中Y39位点的磷酸化形成了包含“口袋”状的纤维聚集结构, 并可导致S129位点磷酸化水平的提高,影响其病理活性; S129位点磷酸化显著增强了α-突触核蛋白预成纤维与细胞膜上淋巴细胞活化基因3受体的结合, 进而影响其在细胞间的传播过程[36]. 磷酸化修饰的异常与多种疾病密切相关, 其精准调控对疾病治疗具有重要意义.硫S: 金属硫蛋白是一种广泛存在于微生物和人类等各种机体中的蛋白质, 因其富含半胱氨酸残基的结构特性, 使其能够通过与锌、铜和镉等重金属结合实现金属调控. 近期发现DNA骨架上非桥连氧原子可以被硫原子取代, 导致磷硫酰化修饰, 参与基因表达调控、细胞内氧化还原稳态维持等生理过程. 陈实等[37]发现含磷硫酰化修饰的DNA通过优先抑制DNA损伤F-H蛋白(DndFGH)复合物的ATP水解酶活性, 阻碍DNA易位, 再抑制核酸酶活性, 从而实现对DndFGH复合物介导限制系统的精准调控; 最新研究还发现了一种以ATP为底物的微生物磷硫酰化系统(TdpABC). 该系统通过腺苷化激活DNA戊糖-磷酸骨架, 并在活性硫亲核攻击下生成磷硫酰化修饰, 同时释放AMP. 这项研究揭示了硫原子掺入DNA骨架的化学生物学机制, 以及相关防御系统如何识别硫原子以抵抗噬菌体侵染, 有效避免宿主自身免疫[38].硒Se: 硒是人体必需的微量元素, 硒蛋白也在维持正常生理功能(包括代谢调节、信号传递以及免疫应答等)方面起着重要的作用. 倪嘉缵、宋国丽团队[39]发现一种内质网硒蛋白K在神经元中高表达, 参与氧化平衡维持、缓解内质网应激与Ca2+调节等过程, 还会通过抑制毫钙蛋白酶/半胱天冬酶-12 (m-calpain/caspase-12)级联反应抑制神经元凋亡, 在神经细胞保护中起到了重要作用. 徐辉碧、吴钰周团队[40]发现多种内质网硒蛋白(硒蛋白F、硒蛋白T、硒蛋白K等)在糖脂代谢稳态及免疫应答中发挥重要作用, 通过调控氧化还原稳态、内质网稳态及免疫细胞功能从而干预糖脂代谢紊乱疾病(心血管疾病、糖尿病、脂肪肝等)的发展,并设计了硒蛋白GPX4 (铁死亡关键调控因子)特异性荧光探针[41].其他生命必需元素在维持机体结构和生理功能方面同样不可或缺. 常量元素中, 碳、氢、氧、氮是构成蛋白质、脂肪、碳水化合物和核酸的基本成分, 也是生命存在的基础; 氯离子则主要调节体液渗透压, 维持电解质和酸碱平衡. 在微量元素中,钴是维生素B12的重要组成, 参与DNA和血红蛋白合成(砷也参与反应)、氨基酸代谢及甲基转移反应; 铬是胰岛素的辅因子, 也是胃蛋白酶的组成之一, 主要调节血糖代谢、维持血糖水平, 并与核酸、脂质和氨基酸的合成利用密切相关; 碘是甲状腺激素的组成成分, 参与生长发育和代谢调控; 钒、锡、镍是人体有益元素, 其中钒有助于降低胆固醇和血糖, 锡参与蛋白质合成, 镍是多种酶的必需成分, 参与氢氧化酶催化, 并促进铁吸收和氨基酸合成; 氟是骨骼、牙齿和细胞壁形成所必需的结构成分; 硅对骨骼和软骨形成初期至关重要, 同时维持皮肤和结缔组织的强度、弹性及血管壁通透性; 钼是多种酶的辅助因子, 参与氮代谢和能量代谢; 溴则以有机溴化物形式存在于人体组织和血液中.2.1.2 调控工具生物转运系统: 对于离子型生命元素, 各种生物体都有自身的转运系统, 这些天然的调控工具, 成为化学生物学中的重要调控对象. 例如, 在生物膜上广泛存在离子通道和转运蛋白, 能够感知膜内外的离子浓度来控制开关, 实现特定离子定向流入/排出的效果. 例如, Skaar等[28]报道的锌金属伴侣蛋白(ZNG1), 能够将锌“按需”输送到其他蛋白质中, 为锌稳态的研究提供了重要参考. 王晓东、郑三多等[42]发现锌离子转运蛋白ZnT1亦可以直接介导铜离子的转运, 并参与铜死亡调节. 通过冷冻电子显微镜结构解析揭示了Zn2+和Cu2+在共享ZnT1中主要的结合位点, 说明了Zn2+会通过竞争Cu2+与ZnT1的结合来抑制铜转运和铜死亡. Zhang等[43]揭示了核因子E2相关因子2 (NRF2)可利用含HECT和RLD结构域的E3泛素连接酶2 (HERC2)、囊泡相关膜蛋白8 (VAMP8)和核受体辅激活因子4 (NCOA4)控制铁蛋白的合成/降解和维持铁的平衡, 提出通过抑制NRF2和诱导铁死亡的组合疗法作为有效的癌症治疗策略.小分子调控工具: 除了天然生物大分子调控以外, 人们也开发了一些针对性的人工小分子调控工具, 通过人为干预细胞多重稳态以达到治疗目的, 包括蛋白酶抑制剂、金属螯合剂、阴离子转运载体等. 2015年, 蒋华良、何川、陈靖等[44]发现了铜伴侣蛋白的小分子抑制剂. 该抑制剂可同时靶向两种铜伴侣蛋白(Atox1和CCS), 选择性调控铜离子转运, 从而选择性地抑制肿瘤细胞增殖. 曲晓刚等[45]报道的手性金属螺旋对映异构体[Ni2L3]4+-P能选择性稳定端粒G-四链体DNA并抑制端粒酶活性, 通过诱导端粒DNA损伤及其3′端降解, 促进乳腺癌干细胞和癌细胞衰老和凋亡. 饶江宏等[46]报道了一种能靶向螯合线粒体铜的纳米体系, 该体系通过剥夺癌细胞线粒体铜使呼吸供能模式从氧化磷酸化转变为糖酵解, 并降低能量产生抑制癌症生长. 施剑林等[47]将一种金属离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)负载到神经降压素(NT)修饰的Zn-Al层状双氢氧化物(LDH)中. 该体系能够在膀胱肿瘤部位有效富集, 其释放的EDTA分子通过EDTA-Ca2+螯合作用从细胞间钙依赖性连接蛋白中剥夺了Ca2+, 导致肿瘤分解. 毛宗万、谭彩萍等[48]设计了偶联临床铁螯合剂地拉罗司的线粒体靶向配合物. 该配合物特异性地将细胞铁富集于线粒体, 干扰线粒体代谢, 同时提高DNA、RNA和组蛋白的甲基化水平, 最终改变RNA聚合酶II的活性以及基因表达图谱.H+浓度调控对维持正常生理稳态也至关重要. Makoto Nakanishi[49]发现谷氨酸代谢酶1 (GLS1)抑制剂可以通过pH调节选择性清除体内的衰老细胞, 这一过程与H+浓度梯度密切相关. 由于衰老细胞中溶酶体膜受损, 其内部H+会泄露到胞质, 导致胞内pH下降. 这种酸性环境促使GLS1基因编码的肾型谷氨酰胺酶表达量上调, 进而增强谷氨酰胺的分解代谢, 产生的氨能够中和胞内的低pH, 因此提高了衰老细胞的存活率. 另外, 金属配合物通过碱性阴离子转运实现对肿瘤细胞的清除. 例如, 溶酶体定位的环金属铱将肿瘤胞质中的HCO3−转运至溶酶体的同时外排Cl−,降低溶酶体H+浓度并诱导其碱化, 从而使自噬流发生阻滞, 促进肿瘤凋亡, 这被认为是规避肿瘤耐药性的策略之一[50]. 此外, 张俊龙等[51]报道了一种靶向位于内质网膜的蛋白质二硫键异构酶的镓配合物. 该配合物可作为有效的阴离子转运蛋白, 影响pH梯度并改变膜通透性, 导致线粒体功能障碍和铁从电子转移链(ETC)中释放. 通过阻止抗氧化谷胱甘肽(GSH)系统的修复, 加强脱铁作用. 当和膳食多不饱和脂肪酸联合治疗时, 可增强脱铁症期间的脂质过氧化, 在体外和体内都显示出协同作用.2.2 诊疗元素与药物化学生物学2.2.1 诊疗元素化学药物在治疗领域发挥举足轻重的作用. 通过人工设计含特定元素的化学分子, 可以实现对生物功能的调控, 并在疾病诊断与治疗中具有重要应用. 如图2所示, Peter Sadler总结了临床使用的元素药物与诊断试剂. 事实上, 药物通常由多种元素组合而成. Njardarson[52]对美国食品和药物管理局(FDA)批准的药物中元素的多样性进行了分析, 结果表明, 除碳, 氢, 氧和氮元素外, 硫是药物中最常用的元素, 随后是氯、氟、磷、溴、碘、铁、铂和钙等(图3). 虽然仅有1.6%的药物含有过渡金属元素, 但以顺铂为代表的过渡金属药物在抗癌方面发挥着不可替代的作用. 它们属于配位化学反应动力学惰性, 与多齿配体结合通常具有稳定的化学结构.图 2 临床使用的化学元素药物和诊断试剂图 3 美国FDA批准上市的化学药物元素组成(C、H、O、N除外)[52]铂Pt(II)/Pt(IV): 郭子建率先提出金属免疫, 并与王晓勇[53]将青蒿琥酯与奥沙利铂(OP)偶联, 设计了一种以多种肿瘤细胞过表达的髓系细胞触发受体2 (TREM2)为靶点、具有重塑肿瘤微环境和增强T细胞抗肿瘤活性功效的Pt(IV)化学免疫治疗剂. 针对四价铂前药, 郭子建与刘志博[54]利用放射线的特点, 发展出放疗在肿瘤中特异性激活Pt(IV)化疗前药的精准化疗技术. 随后, 该团队[55]阐明了医用β核素驱动前药释放的可行性, 并通过[177Lu]激活Pt(IV)前药实现转移瘤联合治疗, 为靶向放射性核素疗法与化疗的协同提供了全新模式. 朱光宇[56]系统性地开展了四价铂前药研究. 设计合成了一种新型近红外光激活的Pt(IV)光氧化剂. 该Pt(IV)光氧化剂能够在近红外光照射下, 以不依赖氧气的方式氧化多种肿瘤相关的生物分子. 与传统临床铂药物相比, 该Pt(IV)光氧化剂的暗毒性极低,一旦受到近红外光的激活, 其抗肿瘤活性会显著提高, 并能够克服肿瘤细胞对铂类药物的耐药性. 近年来, 核酸G-四链体已发展成为有前景的癌症治疗靶点, 为DNA反应性药物提供了靶向选择. 然而, 由于G-四链体结构在体内具有高度动态性和微环境依赖性, 如何控制G-四链体配体的可及性是一个重大挑战. 毛宗万等[57,58]开展了以G-四链体靶向调控的抗肿瘤Pt(II)配合物研究, 通过增加微核形成和DNA损伤来发挥全基因组效应, 影响肿瘤通路、胞质DNA感受通路和免疫应答等信号通路, 从而诱导免疫原性细胞死亡(ICD). 之后该团队还通过G-四链体和高尔基体双靶向卡宾Pt(II)配合物触发高尔基体应激和细胞核DNA损伤, 激活细胞自噬与凋亡串扰并导致自噬梗阻, 实现细胞及活体肿瘤的高效抑制[59]. 最近, 又构建了多种实现肿瘤特异性激活的“双锁”Pt(IV)前药, 触发协同的铁死亡和细胞凋亡[60,61].铱Ir(III): 除铂类化合物外, 基于其他过渡金属如Ru、Ir、Re、Au元素药物的设计及其化学生物学研究也取得突出进展. 其中, 环金属铱配合物的高量子产率的荧光特性及高抗癌活性使其成为潜在的诊疗药物. Peter Sadler、巢晖、Gilles Gasser等[62]报道了一例具有高氧化态的Ir(III)光催化剂, 可以通过光催化氧化1,4-二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH, 活细胞中的重要辅酶)产生NAD*自由基, 并进一步引发NADH耗竭、细胞内氧化还原失衡和肿瘤ICD. 之前, 毛宗万研究团队[63,64]还筛选出咔啉生物碱铱配合物作为肿瘤特异性靶向和高pH响应的光动力诊疗剂, 诱导Caspase和ROS依赖的细胞凋亡, 通过双光子磷光成像追踪到溶酶体自噬过程中自噬小体融合的精细过程. 铁死亡是近年来发现的一种程序性细胞死亡, 铁死亡诱导剂作为新的抗肿瘤药物具有巨大潜力. 毛宗万等[65,66]报道了一个定位溶酶体的二茂铁Ir(III)配合物, 在溶酶体的酸性环境下, 能有效催化Fenton反应, 诱导脂质过氧化, 通过铁过载导致铁死亡. 近期又开发了纳摩尔级光毒性的Ir(III)-三苯胺光敏剂, 光照后发生光驱动细胞内迁移, 造成KEAP1蛋白、DNA等生物大分子的级联损伤, 从而同时引发内源性铁应激的细胞焦亡和铁死亡串扰, 并进一步触发免疫原性细胞死亡. 最近,梁宏等[67]报道了一种利用氧基皂啡生物碱修饰的Ir(III)配合物, 其通过靶向溶酶体组织蛋白酶D, 激活LKB1-AMPK-ULK1信号通路, 诱导自噬依赖性ICD, 可以在体内外展现出显著的抗肿瘤效果.钌Ru(II): 相分离过程异常与多种重大疾病的发生和发展相关联, 对相分离过程的调控与示踪将有助于人们更好地理解这些疾病的发生机制, 同时也可为它们的治疗提供新策略. 最近, 一种双三苯基膦钌配合物被报道, 该研究不仅通过调节染色质可及性来改变基因的表达模式, 还通过磷光成像和磷光寿命成像技术, 在活细胞中可以观察到DNA的相分离行为[68]. 针对精确传递和原位催化在催化医学中的挑战性, 毛宗万[69]报道了抗体-芳基钌杂合体, 其催化吉西他滨前药不仅能诱导DNA损伤, 还能有效阻断癌细胞中的Her2信号通路. 巢晖等[70]报道的高正电荷的Ru(II)配合物, 通过高效诱导肿瘤细胞DNA缩聚, 阻碍DNA解旋酶、聚合酶、RNA聚合酶II和转录因子等核酶的识别和结合, 全面抑制DNA的复制、转录和修复, 在顺铂耐药的A549/DDP细胞中表现出显著毒性, 展现出克服耐药性的潜力. 另外, 钌(Ru)基光敏剂(如TLD-1433)也常用于光动力治疗,通过光激活产生ROS杀伤癌细胞[71].铼Re(I): 一种理想的肿瘤治疗方法不仅要破坏原发肿瘤, 还要提高肿瘤微环境的免疫原性, 以达到令人满意的抗肿瘤免疫效果. 毛宗万研究团队[72]设计了一个焦亡诱导配合物. 该配合物不仅能在缺氧下高效进行I型和II型光动力治疗, 还能激发gasdermin D介导的细胞焦亡, 可在体内完全激活T细胞依赖的适应性免疫反应, 最终在破坏原发肿瘤的同时消除远端肿瘤. 罗锦荣[73]设计了一例四嗪修饰的光功能性Re(I)抗肿瘤配合物, 通过生物正交裂解反应促使四嗪基团与Re(I)聚吡啶配合物的分离, 并释放出毒性Re(I)氨甲基吡啶配合物, 引发溶酶体功能障碍并诱导ICD的发生.金Au(I)/Au(III): 张静和唐本忠[74]报道了一例氮杂环卡宾-Au(I)配合物, 可有效抑制硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、高效生成ROS和促进细胞氧化还原应激诱导的ICD的协同作用. 同样, 邹滔滔[75]基于该TrxR靶点,设计并合成了一类Au(III)烷基光活化前药. 该前药在光照条件下通过β-氢消除机制发生金-碳键断裂, 释放Au(III)氢化物并进一步与在Au(III)烷基配合物的催化作用下被过量的巯基化合物还原为Au(I), 实现可控的TrxR抑制性和抗肿瘤活性.锌Zn: 过量Zn2+会诱导肿瘤发生免疫原性焦亡, 促进抗肿瘤免疫信号的传递, 因此也是肿瘤治疗的重要切入口. 凌代舜等[76]构建了一种Zn2+掺杂的层状双金属氢氧化物, 能持续中和肿瘤区域的过量H+实现Zn2+靶向释放, 破坏溶酶体阻断自噬, 诱导线粒体损伤,激活ICD. 聂广军等[77]开发了锌基纳米分子机器, 主动跨越血管内皮屏障高效富集于肾肿瘤, 并在酸性微环境中解离出Zn2+, 诱导金属硫蛋白-1X表达上调的同时释放炎性细胞因子, 进一步实现化疗药物的减毒增效. 毛宗万团队[78,79]以Pt(IV)前药为分子工具, 通过抑制或干预以锌为金属中心的碳酸酐酶或超氧化物歧化酶, 有效破坏了肿瘤细胞内锌离子稳态, 调控了肿瘤微环境, 最终导致细胞凋亡或焦亡.锰Mn: 锰基材料结合传统或新型治疗方式, 为肿瘤治疗提供了新策略. 它不仅保留了金属小分子或纳米颗粒的抗肿瘤功能, Mn的加入还通过协同作用增强了治疗效果. 彭汉勇团队[80]开发了一种温控合成策略, 用于制备多功能DNA模板化碳酸锰纳米颗粒. 该纳米颗粒具有pH响应特性, 能在肿瘤微酸环境(pH 5.5)下快速大量释放Mn2+, 一方面放大MRI信号实现肿瘤成像, 另一方面通过脱氧核酶(DNAzyme)介导的早期生长反应蛋白1 (EGR-1)基因沉默, 结合Mn2+催化的Fenton反应产生·OH实现协同的化学动力治疗. 张振中团队[81]利用锰的天然免疫激活作用, 构建了一种基于pH敏感型无定形介孔磷酸锰(APMP)的纳米给药系统. 该系统负载拓扑异构酶Ⅱ抑制剂阿霉素(DOX), 可靶向肿瘤细胞, 释放低剂量DOX并诱导DNA泄露至胞质, 同时显著提高胞内Mn2+水平, 协同增强cGAS-STING通路, 激活天然和适应性免疫应答. 张俊龙等[82]也开发了一种模拟天然锰过氧化氢酶核心结构的双核锰配合物. 该配合物通过清除H2O2诱导的ROS累积, 减轻脂质过氧化, 在治疗角膜碱烧伤损伤方面展现出良好的疗效和安全性.铁Fe: 周子健等[83]设计了基于Fe(III)-croconaine (克酮酸菁)复合物的纳米颗粒(Cro-Fe@BSA)用于联合光热疗法. 肿瘤细胞内的酸性环境和高浓度GSH触发了Fe3+的解离和还原, 同时恢复croconaine光热转换能力, 通过激光照射产生的热量提高Fenton反应, 增强铁死亡. 而铁死亡抑制热休克蛋白表达, 阻断了肿瘤细胞对热损伤的自我保护机制, 从而提升光热疗效. 刘世勇等[84]设计了一种自溶性两亲聚二茂铁纳米药物, 用于协同增强肿瘤化学动力学治疗. 在酸性条件下纳米颗粒解聚释放氮杂醌甲基衍生物(AQM)和氨基二茂铁(AFc), 能够消耗GSH和促进ROS爆发, 有效抑制肿瘤, 同时体内实验表明该纳米颗粒具有显著的肿瘤靶向和滞留能力, 为增强化学动力学疗法在精准医疗中的应用提供了新策略. 施剑林等[85]设计了一种铁浓度增强的Fe/Al层状双氢氧化物(Fe/Al-LDH)纳米药物, 用于协同铁死亡与免疫治疗, 有效逆转肿瘤免疫抑制微环境. 该纳米药物能够响应酸性环境释放铁离子, 诱导铁死亡, 同时释放钙网蛋白(CRT)和高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)等损伤相关的分子模式 (DAMPs)促进DC成熟, 通过NF-κB通路诱导巨噬细胞极化为抗肿瘤M1表型, 增强免疫治疗效果.铜Cu: 张先正等[86]将铜基外壳通过Cu2+与3,3′-二硫代双(丙酰肼)自组装包覆在过氧化钙纳米粒子上,并通过表面修饰实现肿瘤靶向和负载溴结构域蛋白4 (BRD4)抑制剂JQ-1, 降低IFN-γ诱导的PD-L1的表达, 利用铜死亡介导的免疫治疗纳米反应器增强抗肿瘤免疫. 苏畅团队[87]构建了一种锚定于中空碳纳米球上的铜基单原子纳米酶, 以Cu-N3O结构为活性中心通过双催化路径同步将H2O2和O2转化为·O2−与·OH, 展现出优异的类过氧化物酶和类氧化酶活性, 且兼具显著的光热转换性能, 表现出优越的肿瘤杀伤能力. 余靓等[88]基于结肠癌微环境中H2S过表达的特点, 利用羟基磷酸铜纳米颗粒能与H2S反应转化为硫化铜的特性, 使单分散的羟基磷酸铜纳米颗粒通过原位硫化作用转变为超小的硫化铜纳米颗粒, 通过提高铜基纳米颗粒的内吞和抑制铜离子的外排实现肿瘤细胞内铜稳态的失衡, 进一步诱发细胞焦亡和铜死亡. 赵春顺课题组[89]提出了一种金属配合物前药的设计策略, 使低毒性的金属配合物前药DPBD-Cu响应肿瘤微环境中高水平的过氧化氢发生断键后释放出游离二硫代氨基甲酸(DTC), DTC竞争性螯合DPBD-Cu分子内的Cu2+原位形成了具有生物活性的Cu(DTC)2, 再通过前配体、病理特征响应的化学敏感键、可携带金属离子的基团等, 实现了在特定条件下原位合成金属配合物并激活治疗作用的目的. 谷战军等[90]合作开发了一种含铜的夹心型多金属氧酸盐作为可控铜死亡纳米胶囊, 在暴露于电离辐射时释放铜离子导致以铁-硫簇蛋白丢失和脂酰化蛋白聚集为特征的铜死亡, 同时辐射诱导的铜死亡能够克服肿瘤的获得性辐射抗性, 并激活了强大的远隔效应, 可以在优化放疗的局部抗肿瘤效应的同时激活系统性抗肿瘤免疫.硫S/硒Se: 从图3可以看出, 硫是除碳、氢、氧、氮之外在药物中出现最多的元素, 且含硫药物的比例呈现持续增长趋势. 根据2020~2024年FDA新批准药物的最新统计数据, 近五年间新批准的含硫药物比例从2020年的11%已上升到2024年的20%[91].而作为与硫同族的硒元素, 近年来也因其在癌症、中风和糖尿病等疾病的治疗方面展现出潜力而引起广泛关注. 陈填烽[92]设计的硒纳米颗粒(LNT-Se)能够迅速激活硒蛋白, 上调谷胱甘肽过氧化物酶1 (GPx1)使巨噬细胞重新极化, 从而抑制破骨细胞生成和病理性骨质流失. 该团队[93]还开发了一种基于硒纳米的口服水凝胶微珠, 其可通过介导硒蛋白的原位合成, 显著抑制促炎细胞因子的分泌, 同时重新分布免疫细胞, 从而有效缓解结肠炎相关症状. 此外, 该方法还能调节肠道菌群组成,维持肠道微生态平衡, 为硒蛋白疗法提供了重要的拓展方向. 黄震等[94]利用人工合成的硒修饰脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) (dNTPαSe)代替天然dNTP作为聚合反应的底物, 通过降低聚合速度增加聚合酶识别的准确性, 从而有效抑制包括引物-引物错配延伸、模板-模板错配延伸、引物-模板错配延伸和聚合酶头合成在内的多种非特异性扩增.磷P/砷As/铋Bi: P是人体必需的元素之一. 在医学领域, 含磷药物如阿兹夫定在治疗新型冠状病毒感染(COVID-19)等方面发挥了重要作用. 在医学材料领域, 含磷材料的多电荷影响和蛋白冠特性可用于调控蛋白凝聚状态和靶向特定细胞器. 在农业领域, 传统含磷农药的环境问题促使新型高效磷肥和低毒农药的研发, 如双甲胺草磷、氯酰草膦. 此外, 磷不仅是核酸和细胞膜的重要组成部分, 还在维持细胞正常生理功能及构建骨骼中发挥着不可替代的作用. 赵劲[95]创新性地以氧化黑磷纳米片为研究对象, 发现氧化黑磷展现出了良好的骨代谢调节潜力, 有望作为经典抗骨吸收药物双膦酸盐(BiP)的升级替代, 成为治疗骨质疏松等骨代谢性疾病的高效纳米材料. 砷(As)元素对克服白血病里的急性早幼粒细胞白血病具有重要作用, 临床统计数据表明三氧化二砷对急性早幼粒细胞白血病治愈率达到了90%[96]. 赵劲等[97]构建了一种可诱导铁死亡的砷-铱纳米平台(AsIr@PDA), 通过在砷纳米片表面负载铱配合物(IrFN)以诱导铁死亡, 并包裹聚多巴胺(PDA)提升其稳定性、光热性能和光响应性药物释放效率. 更重要的是, 该平台结合了砷的免疫调节特性, 显著增强了诱导细胞免疫原性死亡的能力, 从而激活抗肿瘤免疫反应, 在胰腺癌模型中表现出优异的清除效果. 另外, 基于Bi元素制备的铋剂, 如枸橼酸铋钾、胶体果胶铋和次水杨酸铋, 广泛用于治疗消化性溃疡、根除幽门螺杆菌(Hp)、预防和治疗腹泻[98]. 孙红哲等[99,100]发现金属铋类药物可有效地治疗由新型冠状病毒、耐药性细菌感染所引发的疾病.碳C: 近年来兴起的不依赖氧气的碳自由基治疗[101]可针对性地提高乏氧肿瘤的治疗效果. 步文博等[102]利用碳自由基(R·)灭活NF-κB用于根治性封顶治疗, R·介导亲电自由基加成到DNA中双键, 同时通过自由基链反应封盖NF-κB中的巯基残基, 从而产生显著的NF-κB失活效果和肿瘤转移抑制作用. 这种机制在生物大分子可控修饰和根治性介导癌症治疗中有很大潜力. 巢晖和张喜庭等[103]合作报道了一例线粒体靶向的蒽醌铱(III)配合物用于乏氧肿瘤光动力治疗, 在乏氧条件下, 具有蒽醌基团的配合物Ir4可被还原成具有二羟基蒽结构的Ir4-red, 并在双光子(730nm)激发下产生碳自由基, 损伤线粒体最终诱导肿瘤细胞凋亡, 克服了乏氧环境对抗肿瘤光敏剂的限制. 刘习强等[104]设计了一种靶向纳米颗粒P2@IR1061-RGD NPs, 用于NIR II窗口下的光热治疗/光动力治疗(PTT/PDT)联合治疗.其中, 含偶氮聚合物(P2)封装NIR II光热染料IR1061, 在1064nm光照射下产生的光热效应可以破坏P2的偶氮键高效生成碳自由基, 从而诱导癌细胞凋亡和坏死, 克服了传统PDT在缺氧肿瘤中的局限.阴彩霞等[105]开发了一种新型光活化探针BI, 光激发(405~660nm)可触发生成高效碳自由基(BI·)和超氧阴离子(·O2−), BI·偶联形成二聚体BI-BI, 后者在·O2−作用下形成扩展共轭体系Cy-BI, 具有超高光热转换率. 作为强大的自由基源, BI具有克服临床缺氧障碍的潜力, 实现了显著的肿瘤协同治疗效果.硼B: 富含硼-10的氨基酸硼药, 在二元肿瘤硼中子俘获疗法(BNCT)中得到广泛重视[106]. 硼杂环药物在治疗隐孢子虫腹泻病也具有临床治疗潜力, 在寄生虫磷酸二酯酶抑制剂SLU-2815中引入苯并口恶硼吡咯生成了SLU-10906, 显著提高了其对隐孢子虫磷酸二酯酶的亲和力和选择性, 表明硼基团的酯环结构能增强抗寄生虫活性[107]. 此外, BNCT近年来也受到了大量关注. 赵利等[108]设计并合成了聚甘油包覆富集六方氮化硼纳米颗粒(h-10BN-PG)用于小鼠结肠癌模型治疗. 得益于超小粒径和“隐身”表面修饰, 该纳米载体在肿瘤中高效积累, 单次静脉注射纳米颗粒结合一次中子束照射即可显著缩小移植瘤体积. 该疗法不仅通过直接破坏肿瘤细胞DNA发挥作用, 还诱导了肿瘤内明显的炎症性免疫反应, 增强了持续抑瘤效果. 刘志博等[109]构建了一种含有免疫佐剂的硼胶囊(基于含硼共价有机框架材料), 通过中子照射触发胶囊破裂并同步释放佐剂, 以激发强烈的抗肿瘤免疫应答. 研究发现, BNCT过程中产生的高能粒子在硼胶囊中产生大量结构缺陷, 加速了药物的释放. 在小鼠肿瘤模型中, 联合使用BNCT和上述佐剂控释策略几乎完全消除了原位和远处移植瘤, 显示出显著的全身抗肿瘤疗效; 随后, 该团队采用选择性氟化α-硼氨基化合物的方法合成了含双硼结构的氟硼苯丙氨酸(BBPA), 并标记18F用于光诱导电子转移(PET)成像和BNCT治疗. 研究表明, 在多种肿瘤模型中, [18F]BBPA-PET成像具有极高的对比度, 其肿瘤摄取随BNCT剂量保持稳定, 可准确预测肿瘤内硼含量. 由于双硼结构的引入, BBPA在肿瘤组织和肿瘤细胞中的硼含量显著高于传统BPA, 从而可用更低剂量的药物实现理想的治疗效果[110].氟F: 全氟化碳(PFC)是优越的载氧剂, 合成血液能够替代为血液循环系统提供临时支持, 为身体组织提供应急供氧[111]. 胡一桥与吴锦慧等[112]设计了一种PFC纳米颗粒, 其不仅可通过PDT效应破坏肿瘤血管,从而提高药物在肿瘤部位的渗透性; 还可作为“吸氧海绵”, 将进入肿瘤组织的氧气进行富集并逐步消耗, 从而为依赖乏氧条件激活的药物提供有利环境. 姜鹏团队[113]通过人血清白蛋白修饰的全氟三丁胺纳米乳构建“液-液”界面体系, 利用超声振荡过程中空化气泡的生成与破裂, 实现H2O和PFC间的高频接触与分离. 在此过程中, H2O分子中的氧原子失去电子, 生成·OH, 而PFC分子则得到电子形成带负电的PFC*, 同时水中溶解的O2在超声辅助下从带负电的PFC*获得电子, 产生·O2−. 因此, 在超声条件下该PFC纳米乳可以产生多种自由基且不受氧气浓度限制, 从而触发肿瘤细胞ICD, 促进DC成熟和巨噬细胞极化, 激活T细胞介导的抗肿瘤免疫反应来消融肿瘤. 此外, [18F]-氟代脱氧葡萄糖(FDG)是由放射性同位素18F取代葡萄糖2位的羟基所构成, 利用PET技术, 18F-FDG在肿瘤学临床医学影像和肿瘤扩散方面有着大量的应用, 被誉为癌症诊断的“世纪分子”.氢H/氧O: 氢气治疗[114]在抗肿瘤、抗炎、细胞保护、神经保护、抗氧化具有一定的疗效, 但目前仍然需要进一步的科学研究明确其安全性. 单线态氧和氧自由基在肿瘤光动力治疗领域已获得广泛使用[115].放射性元素: 放射治疗(放疗)与手术治疗、药物治疗一起构成了肿瘤治疗的三大最主要手段, 超过50%的癌症病例需要放疗, 电离辐射通过辐解组织中的水产生自由基(如羟基自由基和水合电子), 这些自由基继而损伤肿瘤细胞的DNA等关键分子, 从而产生杀伤效应. 放疗具有组织穿透性高且散射小的特点, 因此响应放疗的前药释放策略能够为缓解化疗药物毒副作用提供支持. 镥(177Lu)标记前列腺特异性膜抗原(PSMA) (如Lu-PSMA-617)靶向前列腺癌, 通过β辐射杀死肿瘤细胞[116]; 锶(89Sr)和钐(153Sm)用于骨转移癌的镇痛治疗. 钆(Gd)和碘(I)等可用于医学诊断与成像, 钆(Gd)基造影剂(如Gd-DTPA)增强MRI成像对比度, 用于肿瘤和血管病变检测. 刘志博等[117]报道了一种基于PET化学的放疗去保护策略, 该研究筛选出N-烷基-4-吡啶鎓作为理想的脱笼保护基团, 并将其应用在一种抗体偶联药物(ADC)中, 并证明放疗结合ADC药物的策略效果明显优于单独的放疗方法. 该团队[118]进一步利用157Gd (n, γ)反应产生的俄歇电子、X射线、γ射线和内转换电子激发激发金属有机框架(MOFs)材料, 在肿瘤内原位产生·OH和1O2等ROS, 杀伤肿瘤细胞并激活全身肿瘤免疫. 庞小溪等[119]开发了一种专门用于MRI引导Gd-NCT的新型治疗性生物钆剂157Gd-DOTA-PSMA, 利用PSMA引导钆纳米细胞治疗(Gd-NCT)靶向治疗前列腺癌的可行性, 同时可以利用PET/CT和MRI等手段动态监控药物输送, 且利用中子辐照作用有效地诱导DNA损伤和凋亡. Chen团队[120]将纳米技术衍生的钆双胺隐藏的磁性纳米颗粒Gd-FPFNP与脐带间充质干细胞结合开发了一种干细胞-纳米颗粒系统(SNS), 主动靶向星形胶质瘤进行Gd-NCT, 不仅可以通过磁引导其定位, 还可以有效减少钆双胺的降解和解离, 显著提高T/B和T/N比率和生物安全性. 碘(I)标记分子(如125I-甲状腺素)用于放射性示踪和甲状腺功能评估. 锕系元素普遍具有放射性的特点. 王殳凹[121]从锕系元素配位化学角度出发, 设计了一系列高效促排剂, 在核应急及辐射防护领域展现出良好的应用潜力. 陈小元等[122]报道了一例结合了化疗药物喜树碱与放射性核素(177Lu/68Ga/64Cu)的自组装纳米诊疗体系, 利用Evans蓝与血液白蛋白结合的特性, 实现了肿瘤靶向富集、智能释药与实时成像.2.2.2 诊断试剂除了治疗用途外, 元素在医学诊断和成像中同样发挥着关键作用. 人工设计的诊断分子常通过引入特定元素来赋予独特的化学或光物理性质, 从而在生物医学研究中发挥关键作用. 主族元素构建的放射性探针可实现高灵敏度生物示踪. 例如,68Ga标记的DOTA-3-酪氨酰基-奥曲肽(DOTATATE)和PSMA-11分别用于神经内分泌肿瘤与前列腺癌的PET成像; 18F标记化合物可突破生物背景干扰实时追踪人体菌群代谢; 而超极化129Xe气体灌注技术能以皮摩尔级灵敏度增强肺部MRI信号, 精准监测肺功能病变[123]. 过渡金属探针则可通过配体设计精确调控其功能. 例如, 铁基大环配合物Fe(TOB)经疏水性优化显著延长血清蛋白结合时间达3倍, 为MRI动态监测创造时间窗口[124]. 钌(II)配合物兼具磷光与单线态氧生成能力, 其四嗪修饰衍生物通过生物正交反应实现癌细胞选择性成像与治疗[125]. 而含腈基多吡啶配合物[Ru(phen)2(11,12-dCN-dppz)]2+可特异性探测G-四链体DNA微环境[126]. 线粒体靶向的锇(II)配合物[Os(TAP)22tpphz]4+更能在近红外激发下穿透核膜实现DNA超分辨成像[127]. 稀土元素配合物在生物成像和检测中也具有重要应用前景. 铕(Ⅲ)配合物如[Eu(pcta-PEPA2)]可用于肿瘤术中光学成像, 而铕掺杂碳点(Eu-CDs)可高选择性检测生物样品中的谷胱甘肽含量[128,129]. 铽(III)配合物凭借ms级发光寿命优势, 结合时间门控技术有效消除背景荧光, 其中聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子构建的敏化发射福斯特共振能量转移(cFRET)探针实现三种DNA靶标同步检测[130]. 基于大环结构铽配合物构建的CoraFluors探针则通过时间分辨FRET (TR-FRET)定量活细胞内蛋白质-配体相互作用[131]. 李富友等[132]发现, NaYbF4纳米粒子具有与激发波长一致的发射峰. 进一步研究显示, 其他单一稀土中心纳米材料(如铒(Er)、铥(Tm)、钕(Nd))也普遍存在这种“零Stokes位移”特性, 因此有效减少了能量传递和弛豫过程中的损耗, 提升了发光效率, 并具有微秒级的发光寿命. 基于此, 发展出一种时间域荧光成像方法, 广泛应用于多通道生物活体成像、荧光加密与解码及高灵敏度肿瘤被动靶向成像等领域.表1总结了2.1和2.2节中提到的各种代表性元素在化学生物学中的主要功能.表 1 元素在化学生物学中的主要功能2.3 元素化学生物学研究新方法和新技术元素化学生物学研究的新方法和新技术包括金属多维组学、超分辨成像技术、质谱成像、原位示踪、现代顺磁共振技术、多维生物核磁共振技术、大数据分析、纳米递送、靶向蛋白质降解技术、基因编辑技术等. 这些技术为元素化学生物学的研究提供了强大的工具, 推动了从原子到生物系统的全链条研究, 为精准医学和环境科学等领域带来了新的突破.多维组学技术: 金属多维组学整合了金属离子的化学形态、空间分布、氧化还原状态及其与生物大分子(如DNA、蛋白质)的功能关联, 形成多维度的动态分析框架. 该技术结合同步辐射技术(如X射线荧光成像、XANES)、质谱、计算化学等手段, 不仅能定量定位金属药物的亚细胞分布, 还能揭示光激活过程中金属物种的化学转化路径及靶点作用模式. 孙红哲[133]近年来通过整合多种组学技术, 实现了对金属药物分子机制的深入研究, 通过固定化金属离子亲和层析/差异凝胶电泳技术(IMAC/2D-GE)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)等联用技术, 系统分析了金属铋药物在幽门螺杆菌内的结合蛋白, 揭示了金属铋在生物体内的分子靶点及其作用机制, 同时, 通过整合金属蛋白质组学、代谢组学及转录组学技术, 发现了金属镓药物的抗菌机制. Sadler等[134]聚焦于光活化金属药物的创新设计及机制研究, 提出了“激发态金属组学”框架, 通过红移吸收波长的多核金属簇Os-Ru异金属配合物、缺氧响应型铂(IV)前药及光开关配体二噻吩乙烯实现了时空精准治疗. 王初等[135]开发了一种名为METAL-TPP的化学蛋白质组学方法, 结合热稳定性定量蛋白质组学分析技术(TPP)鉴定金属结合蛋白, 为研究金属结合蛋白质组学提供了新的实验技术.伊成器[136]开发了一种名为“cisplatin-seq”的测序技术, 结合顺铂-DNA交联产物阻碍DNA合成的特性, 实现了对顺铂结合位点的碱基分辨率检测, 成功绘制了人肿瘤细胞中顺铂-DNA交联在全基因组范围内的分布图谱, 为系统解析顺铂的作用机制和靶点选择提供了重要工具. Dorrestein[137]开发了一种基于两步电喷雾电离质谱的代谢组学策略, 通过柱后pH调节与金属注入结合规则化的离子识别分子网络, 实现了复杂样品中金属结合化合物的高效识别, 具有广泛的金属通用性, 有望成为解析生物体系中金属结合分子的通用平台. 叶明亮[138]开发了一种以肽段为核心的蛋白局部稳定性分析技术(PELSA), 可用于系统鉴定多种类型配体(包括药物、抗体、磷酸化肽、金属离子和代谢物)与蛋白的结合区域, 并测定局部结合亲和力, 为研究蛋白-配体相互作用提供了高分辨率、定量化的策略. 此外, 过渡金属配合物因其独特的光催化活性, 在多组学研究技术的构建中展现出重要潜力. 陈鹏[139]基于金属铱光催化的生物正交反应原理, 构建了线粒体蛋白质组学技术(CAT-Prox), 在难以操作的细胞中实现了高特异的线粒体蛋白质组学的时空分析.超分辨成像技术: 超分辨成像技术突破传统光学显微镜的分辨率极限, 能够在纳米尺寸上观察生物分子和细胞结构. 该技术通过创新的光学、化学和计算方法, 克服了衍射极限的限制, 使得分辨率可以达到几十纳米甚至更高. 超分辨成像技术可以用于研究细胞器的超微结构(如线粒体、内质网、细胞骨架), 研究突触结构和神经递质的分布等. Sunbul等[140]将荧光点亮适配体和蛋白质结合适配体进行结合, 实现了对蛋白质的高分辨率成像. Vicidomini等[141]提出了一种结合单光子探测器阵列和时间标记数据采集模块的显微镜平台, 能够同时进行荧光寿命成像、荧光相关光谱和双色荧光交叉相关光谱等多种测量, 从而在多个时空尺度上研究生物分子的动态行为, 未来, 这种技术有望在神经退行性疾病和其他生物分子凝聚体的研究中发挥重要作用. 郭子建[142]开发了一种基于超分辨成像的细胞器识别与锌离子动态监测新策略(Zn-STIMO), 通过单探针染色结合细胞器形态特征, 实现对多细胞器中Zn2+水平的同时追踪, 有望推动亚细胞器锌生物学研究的深入发展. 此外, 过渡金属配合物凭借其独特的光物理特性, 如磷光发射、大Stokes位移和优异的光稳定性, 在生物成像领域表现出显著优势. 任咏华等[143]报道的一种具有大Stokes位移的双核铂配合物, 适用于超分辨成像, 可以实现在活细胞内跨亚细胞器追踪. 周翔[144]构建了G-四链体结合的铱配合物, 结合双光子磷光寿命成像实现了细胞中G-四链体检测.质谱成像: 质谱成像是一种结合质谱分析技术与空间分辨能力的分子成像技术, 可在生物组织切片或材料表面直接检测分子(如脂质、代谢物、蛋白质、药物分子等)的化学组成及其空间分布信息. Gao等[145]提出了一种凝胶辅助质谱成像技术, 突破了传统质谱成像的空间分辨率限制, 实现了亚微米级别的单细胞分子分析. de Miranda等[146]将质谱成像技术与成像质谱流式细胞术相结合, 用于单细胞水平的代谢物分析和细胞表型鉴定, 揭示了组织内细胞的代谢异质性及其与特定细胞群体(如癌细胞或免疫细胞)的关联. 在研究金属候选药物的细胞摄取与分布时, 二次离子质谱成像(SIMS)可以通过特征生物碎片, 如磷脂碎片和DNA脱氧核糖碎片指示亚细胞器的位置, 进而确定金属药物的定位. 汪福意[147,148]利用飞行时间二次离子质谱(ToF-SIMS)成像技术, 在单细胞水平上研究了铂类化合物的亚细胞器分布及其与生物靶分子的相互作用, 原位观察到高迁移率族蛋白HMGB1与顺铂损伤DNA的特异性结合, 并发现顺铂损伤DNA会阻断转录因子Smad3与DNA结合, 从而抑制转录活性. Siuzdak等[149]揭示了纳米二次离子质谱成像技术(NanoSIMS)在亚细胞水平上进行代谢物定量成像的潜力, 特别是在代谢通量分析、亚细胞区室化研究和治疗性纳米颗粒的亚细胞定位方面[150]. Gianneschi[151]通过结合NanoSIMS与超分辨荧光显微成像技术, 系统评估了酶响应型Pt(II)纳米颗粒在肿瘤组织中的分布特性. 该研究实现了对195Pt标记的铂药与15N标记的骨架载体在组织水平上的高分辨率共定位成像, 不仅量化了药物释放效率, 还进一步验证了铂药与细胞核DNA结合的递送路径. 2021年, Keppler[152]通过NanoSIMS结合双稳定同位素标记实现了奥沙利铂在结肠癌细胞中的亚细胞器示踪. 利用该技术揭示了铂类药物在核仁中的特异性富集现象, 这一过程引发核糖体生物合成应激, 进一步导致核仁结构的瓦解. 研究表明,核仁是铂类药物作用的关键靶点, 其应激状态与结直肠癌治疗效果具有高度相关性, 该发现也为克服铂类药物耐药性提供了新的干预策略. 同年, Massi[153]开发了铂标记萘二甲酰亚胺探针, 利用NanoSIMS检测195Pt次级离子分布, 在亚细胞器水平验证了探针在细菌内的完整保留与特异性富集, 其定位结果与超分辨荧光显微镜显示的脂质囊泡分布高度吻合, 实现了活细菌脂质囊泡的多模态成像.原位示踪技术: 原位示踪技术通过同位素标记、荧光探针或化学传感器, 结合显微成像或质谱成像, 实现分子(如代谢物、金属离子、药物)的时空动态解析. Roland Nilsson等[154]通过13C示踪与多因素认证(MFA)技术, 在离体人类肝脏中实现了多途径代谢通量的高分辨率解析, 揭示了人类特有的代谢特征(如BCAA直接代谢、肌酸合成), 为代谢疾病机制研究和药物开发提供了更贴近生理的模型. Alexandrov等[155]开发了一种名为13C-SpaceM的空间单细胞同位素示踪技术, 用于研究癌症中脂肪酸代谢的异质性.现代顺磁共振技术: 现代顺磁共振技术通过检测未配对电子的自旋特性解析顺磁性物质的精细结构与动态行为, 结合高频脉冲与电子-核双共振技术, 将分辨率提升至原子级, 并能追踪ns级动态过程. 该技术常用于解析金属酶机制等. Han等[156]通过超高磁场(240GHz)结合钆自旋标记, 突破传统氮氧自由基标记的限制, 实现了室温溶液态下蛋白质AsLOV2构象动态的实时、高灵敏度监测. 顺磁性化学探针在电子顺磁共振和核磁共振光谱中的应用已有四十多年的历史, Ubbink等[157]对现有的顺磁化学探针进行了总结. 陶丽芝等[158]利用顺磁共振技术揭示古菌膜脂(GMGTs)生物合成途径Gms酶的催化机制, 证实Gms含有的三个FeS簇对电子传递和构建C(sp3)–C(sp3)键至关重要, 指出GMGT具有指示海洋缺氧历史变化的地球科学应用潜力.多维生物核磁共振与成像: 多维生物核磁共振技术通过结合高场NMR仪器、同位素标记和先进的NMR实验技术, 常用于研究生物大分子在高浓度或拥挤条件下的结构和动态行为. 近年来, 研究者使用2D NOESY[159]、TROSY[160]等解决了许多问题, 但大部分都是非拥挤条件下的. 例如, Frydman等[161]使用一种新型的NMR技术L-PROSY显著增强了NOESY和TOCSY谱图的交叉峰信号, 从而能够在更高的温度下(不拥挤剂且接近生理条件)研究糖类分子的结构. Kreutz等[160]通过引入[2-19F,2-13C]标记的腺苷来增强TROSY谱图的信号, 解决了大分子RNA在溶液中的结构解析问题. 而Blackledge等[162]用PEG模拟拥挤环境, 使用15N-1H HSQC, 研究了麻疹病毒核蛋白的内在无序区域NTAIL在液-液相分离条件下的动态行为. 刘买利等[163~165]在利用核磁共振研究复杂生物体系中分子相互作用方面取得了突出贡献, 发展细胞及活体NMR/MRI方法, 利用动态核极化(13C、15N、31P、89Y)增强磁共振检测生物标志物, 揭示生物标志物与肿瘤细胞的密切相互作用, 从而促进疾病的诊断和治疗. 刘文婷等[166~169]利用核酸核磁共振技术解析多例Pt(II)配合物与G-四链体的复合物结构, 提出了配合物动力学控制G-四链体识别新策略, 阐明配合物诱导G-四链体杂化聚集、结构变化等多点动态结合新模式, 为活细胞探测设计提供了结构基础.先进计算技术和算法: 大数据分析指通过先进的计算技术和算法, 对大规模、复杂的数据集进行处理、分析和解释, 以提取有价值的信息和洞察, 在化学生物学领域中, 常用于基因组学、代谢组和蛋白质组学数据分析等. 例如, Lumbers等[170]利用两样本孟德尔随机化分析, 结合大规模人群生物样本库的蛋白质组学和基因组学数据, 识别了与心力衰竭及其亚型相关的44种潜在治疗靶点, 解决了心力衰竭治疗靶点发现的问题. Steindler等[171]对350个放线菌基因组进行比较基因组学分析, 结合系统发育树构建、功能注释和差异表达分析等方法, 揭示了海绵共生微生物与自由生活微生物之间的遗传差异. Coskun等[172]使用三维空间代谢组学分析框架, 结合ToF-SIMS技术, 对扁桃体组织中的代谢物进行高分辨率的三维空间分布分析, 揭示了免疫细胞在淋巴组织中的代谢异质性, 并为研究健康和疾病状态下的免疫细胞提供了新的工具. 分子动力学模拟可用于阐明环状肽的溶液结构等[173].靶向蛋白质降解技术: 靶向蛋白质降解技术是一种新型的治疗策略, 旨在通过选择性降解疾病相关的蛋白质来治疗疾病. 该技术在癌症、神经退行性疾病、炎症性疾病和感染性疾病等领域具有广泛的应用前景. Melo等[174]开发了一种抗体介导的靶向蛋白质降解技术PROTACs, 利用细胞表面的E3泛素连接酶来诱导跨膜蛋白的泛素化和降解, 从而克服了小分子降解剂在口服生物利用度和渗透性方面的局限性. Pt(IV)前药作为新一代铂剂, 通过轴向配体修饰, 可精准调控其脂溶性、代谢稳定性、氧化还原行为等, 与靶向蛋白降解技术相结合也成为一种治疗策略. 2025年, 鄢明和张学景[175]在顺铂(IV)轴向位置偶联了靶向PARP蛋白的PROTAC降解剂, 能够同时诱导DNA损伤并降解损伤修复蛋白PARP-1, 这种协同作用显著提升了其抗癌活性, 也为克服铂类耐药性提供了新策略. 朱光宇[176]也在奥沙利铂(IV)轴向位置偶联了靶向BRD4蛋白的PROTAC降解剂(AVR771), 与传统BRD4铂基抑制剂及卡铂相比, 不仅抗肿瘤效力增加了三个数量级, 也通过改变铂药的药代动力学特性在活体模型中表现出更强的治疗适应性. 同年, Ciulli[177]创新性地在一种具有独特结构与功能特性的金属有机分子二茂铁中引入了PROTACs. 利用围绕中心Fe2+自由旋转的环戊二烯基作为分子铰链, 增强PROTACs的动态构象变化, 在非极性环境中产生更多的折叠状态. 这种构象变化提高了PROTACs的细胞渗透性及代谢稳定性, 降低了其对药物外排机制的依赖性, 表现出更稳健的靶标降解特性. 这项研究也证明金属元素具有协同与促进PROTACs的治疗潜力.基因编辑技术: 基因编辑技术是一类能够对生物体的基因进行精准修改的技术. Mattson等[178]利用CRISPR-Cas9技术、碱基编辑、先导编辑、CRISPR-Cas13d技术等基因编辑技术, 通过修正或敲除突变的亨廷顿基因, 减少了突变蛋白的积累, 从而改善亨廷顿病的神经病理症状和运动功能. 曲晓刚等[179]通过联合CRISPR技术和G-四链体结合蛋白/配体开发了可选择性靶向特定基因组G-四链体结构的新策略, 调控G-四链体介导的细胞增殖、分化与衰老. Ferreira等[180]开发了一种基于NIR光激活的纳米颗粒递送系统, 其能够在大脑中实现空间控制的CRISPR-Cas9基因编辑. 王晓东[42]通过全基因组CRISPR-Cas9筛选, 发现ZnT1是调控Cu2+诱导铜死亡的关键基因, 揭示ZnT1作为Zn2+/Cu2+双功能转运蛋白, 在铜离子稳态与铜死亡调控中发挥核心作用, 并为靶向ZnT1治疗铜过载相关疾病(如威尔逊病)提供了新思路. 此外, CRISPR系统对金属离子依赖的催化机制为其活性调控提供了重要切入点. Li等[181]通过解析酸热溶纤维素来源Cas9与靶DNA结合过程中的5个冷冻电镜结构(2.2~2.9Å分辨率), 揭示其依赖Mg2+和Mn2+等金属离子协同调控两个核酸酶结构域的构象变化, 实现双链DNA的精准切割, 并且进一步通过配位残基改造可调控Cas9对不同金属离子的选择性, 从而影响其编辑活性与特异性.近年来, 元素化学生物学的新方法和新技术在多个领域展现了巨大的应用潜力. 如表2所示, 这些技术不仅推动了基础研究的深入, 还为精准医学、药物开发和环境科学等领域带来了新的突破. 随着技术的不断进步, 未来在化学生物学中的应用前景将更加广阔.表 2 元素化学生物学研究中的新方法和新技术及相应用途3元素化学生物学研究的发展趋势3.1 金属介导细胞间通讯和免疫信号传递金属离子(如钠、钾、钙、锌、铁、铜)不仅是细胞的基础元素, 更是细胞间信号传递中不可或缺的精密信使. 它们具有独特的化学性质, 依赖于细胞内外浓度梯度的变化, 通过直接结合蛋白、调节酶活性、改变膜电位或引发氧化应激等方式, 精确调控细胞命运. 这种由金属离子介导的生物信号不仅存在于同型细胞间, 也构成了多细胞免疫的基础. 金属离子通过影响供体-受体结合强度、参与免疫检查点信号通路、诱导细胞因子风暴等机制, 促使免疫细胞发生代谢重编程, 构建起免疫信号传导的核心网络. 对金属离子进行精准调控并追踪其动态过程, 既是当前研究的重要挑战, 也对该领域的发展具有深远意义. 通过多组学整合分析, 解析金属离子在免疫通讯中的动态网络与分子逻辑, 不仅为阐明自身免疫病、慢性炎症和肿瘤免疫逃逸的机制提供新视角, 也为开发靶向金属信号轴、重塑免疫微环境的创新治疗策略奠定了基础.3.2 金属原位调控翻译后蛋白质修饰蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs)是动态调控蛋白质功能、信号转导及细胞命运的核心机制. 研究发现金属离子(如Zn2+、Cu+/2+、Fe2+/3+、Ca2+)在部分PTMs过程中发挥着至关重要的作用: 金属离子可作为修饰酶活性中心直接催化翻译后修饰过程, 也可通过稳定修饰酶的关键结构域间接调控其活性, 或诱导蛋白质构象变化从而掩蔽或暴露特定的修饰位点[182]. 这些多样化的调控机制共同影响甲基化、磷酸化、乙酰化、泛素化等关键蛋白质PTMs在细胞内的空间分布与动态平衡. 然而, 当前研究主要依赖基于结构解析的体外实验体系, 如何在活细胞内实现对金属离子调控PTMs动态变化的实时监测与精准干预, 仍然是亟待突破的重大挑战. 为应对这一挑战, 亟需发展超高分辨蛋白原位金属成像探针、化学光遗传学工具以及时空分辨修饰蛋白质组学等前沿技术. 阐明生理、病理条件下金属离子-PTMs互作网络的动态变化规律与调控机制, 将为深入解析相关疾病的发生机制, 并针对“金属调控PTMs过程”开发靶向干预新策略, 提供理论基础和技术方法.3.3 金属及配体协同参与基因调控主族金属离子、过渡金属配合物以及配体通过动态稳定核酸二级结构、选择性基因干预、靶向表观遗传修饰和智能响应调控, 多层次多机制调节基因表达, 影响细胞的生理和病理过程. 目前, 金属及配体介导的基因调控正逐渐从静态结合走向动态响应, 从单一靶点迈向多尺度网络. 未来, 随着AI辅助设计、基因编辑和金属组学技术的发展, 可以通过开发金属离子响应型探针监测细胞内核酸动态构象变化, 设计选择性金属-有机杂化分子调控染色质高级结构及多基因协同网络, 利用“时空精准”与“动态激活”的过渡金属配合物提升诊疗效果, 联合基因编辑方法精准干预基因组表达并实现表观基因组的精准重编程, 进一步向动态可视化、智能化和诊疗一体化方向发展, 系统解析金属及配体在细胞生长、增殖、分化、代谢、衰老和死亡过程中的复杂基因调控机制.3.4 金属离子及配合物介导新型细胞死亡金属元素凭借其独特的理化性质和生物活性, 在调控细胞命运和治疗重大疾病中发挥着关键作用[183]. 研究表明, 金属离子及其配合物可通过多种机制干扰细胞内稳态: 一方面, 它们可调节有氧糖酵解与氧化磷酸化过程, 破坏肿瘤细胞的能量代谢平衡; 另一方面, 通过中断GSH/ROS/NADH等介导的氧化还原通路, 诱导细胞发生氧化应激. 此外, 金属离子还可通过结合、隔离或重排关键金属元素(如铁、铜、锌), 影响蛋白质折叠与功能,进而打破细胞的蛋白稳态与信号转导网络. 近年来, 以铁死亡、铜死亡等为代表的金属依赖性细胞死亡方式受到广泛关注, 金属在调控细胞死亡及免疫应答中的作用不断被深入挖掘. 例如, 锰离子可通过激活cGAS-STING通路增强先天免疫反应. 因此, 金属离子及其配合物不仅是细胞毒性杀伤的工具, 更是精准调控细胞命运与免疫响应的战略分子, 在元素化学生物学中占据着核心地位, 并为新型金属药物设计与肿瘤免疫治疗提供了广阔空间.3.5 新靶标驱动元素药物发展以新靶标驱动的元素药物研发呈现多维度创新趋势, 蛋白质降解剂和抗体药物偶联物(ADC)是元素药物发展聚焦的两大方向. 蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)通过异双功能分子诱导E3泛素连接酶接近目标蛋白, 且开始探索金属元素介导的降解体系, 如铂(IV)轴向修饰PROTAC和二茂铁铰链PROTAC. 分子胶通过诱导蛋白质新偶联拓展靶标空间, 近期研究结合金属离子(如锌、镁)形成多配位复合体, 为攻克传统小分子难以结合的蛋白界面提供新思路. ADC则通过单抗精确识别并递送细胞毒载荷, 新一代ADC开始采用金属核素放射性同位素(64Cu、111In)及MOF载体, 实现可控载药释放及诊疗一体化. 新靶标驱动的元素药物发展正迈向“精准靶向-功能诱导-多模集成”新范式, 金属元素在结构修饰、功能转化及跨界递送中展现独特调控价值, 正重塑分子设计与机制干预边界.3.6 放射性核素的诊疗化学生物学放射性核素因其独特的核物理性质, 在医学诊断和治疗中扮演着越来越重要的角色. 现阶段, 放射性核素在放射性标记与生物分子成像、诊疗一体化、新型放射性探针开发等方面已发挥重要作用, 而它们在研究药物作用机制、理解疾病发生机理和新技术开发领域的作用在近年也受到更多关注. 例如, 利用放射性示踪剂监测药物在体内的分布和代谢过程来评估药代动力学、毒副作用和疗效等, 以用于新药、新疗法的研发与探索. 而放射性核素在化学生物学领域的潜力依然有待深入挖掘, 未来发展基于放射性元素的病原标志物靶向型辐射成像、单细胞辐射组学和基因编辑等技术将为疾病诊疗、生物分子动态解析、细胞功能调控和新型工具的开发等领域助力赋能. 随着人工智能技术的飞速进步, 利用深度学习和人工智能技术将进一步推动放射性核素诊疗的过程简化和诊断准确性及效率提升.3.7 生物医学的元素调控工具研究元素化学生物学的发展为深入理解多种人类重大疾病(如神经退行性疾病、癌症)的分子病理机制提供了重要的理论基础. 目前已报道多种具有元素选择性的高时空分辨探针及可逆金属螯合剂等元素调控工具, 实现了活细胞内元素-蛋白质相互作用的动态监测和靶向干预. 未来, 合理开发以下方面的元素调控工具将对生物医学领域起到更大推动作用: (1) 进一步发展具有亚细胞器定位能力、超高灵敏度及可逆响应的探针以解析细胞内元素-蛋白互作的动态过程; (2) 创制对外界/微环境信号响应的分子开关等工具实现对蛋白质稳态通路的精准时空调控; (3) 深入阐明铜/锌等金属稳态失衡在神经退行等疾病中的具体分子病理机制; (4) 探索靶向细胞内元素代谢相关生物大分子靶标的新策略; (5) 整合金属组学、蛋白质组学等多组学技术, 系统解析元素浓度动态变化与细胞蛋白质稳态之间的全局性调控网络.3.8 现代AI、组学、成像等方法技术开发现代元素化学生物学的研究正在深度融合多组学、人工智能与高分辨成像技术, 推动其向系统化、动态化与精准化方向演进. 多组学方法整合了基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和金属组学等多维数据, 为系统解析化学药物, 特别是金属药物及元素标记分子的作用机制提供了有力支撑. 通过从静态图谱到动态网络的转变, 多组学不仅提升了信号通路解析的深度, 也推动了从终点结果向过程机制的过渡. 元素在生命体系中的分布及动态变化呈现高度的时间和空间特异性. 高时空分辨的原位检测技术为解析元素参与生理与病理过程中的分子机制提供了关键手段, 成为构建元素功能网络、揭示生命过程本质规律的重要工具, 也为精准医学的发展奠定了基础. 此外, 人工智能的引入进一步赋能数据整合与机制建模. 借助AI模型, 可实现对药物靶点与毒性的预测、药物结构的优化, 并通过多组学手段验证其作用通路与代谢过程. AI与多组学的协同, 正推动元素药物研究从分子层面迈向系统层次, 为解析复杂细胞信号网络提供关键支撑. 因此, 集成AI、多组学与高分辨成像的技术体系, 正成为元素化学生物学研究的重要驱动力, 加速实现高分辨率、动态化、智能化的研究目标, 为新型元素药物的发现与精准应用提供战略支撑.总之, 以上技术方法的发展与突破(图4), 不仅为元素化学生物学研究提供了关键支撑, 也为疾病机制研究和药物开发奠定了重要基础, 更将深化我们对元素在生命过程中作用的理解.图 4 元素化学生物学的发展趋势(金属元素部分)4元素化学生物学研究面临的挑战元素化学生物学作为化学与生命科学的桥梁, 不仅深化了人们对生命元素功能的理解, 还为疾病诊疗、生物技术及生命健康提供了创新策略. 尽管元素化学生物学在基础研究和临床应用方面取得了重要进展, 但该领域仍面临诸多关键挑战.(1)解析复杂生物体系中元素的动态互作网络. 元素在生物体系中的复杂动态行为, 具有时空异质性、跨尺度调控、氧化还原敏感性等特点, 传统分析方法难以实时捕捉其精确变化, 需要发展超分辨成像(如X射线荧光纳米断层扫描)与活细胞动态追踪技术, 结合人工智能深度学习模型(如AlphaFold)预测元素-生物分子相互作用网络.(2)设计更精准的元素基生物调控工具. 元素基工具具有精准性与安全性问题, 许多元素基分子具有靶向性不足、代谢不可控性、免疫原性风险等, 需要开发智能响应型载体(如pH/酶激活的Pt药物前体), 并利用生物偶联技术(如抗体-放射性核素偶联物)提高靶向性, 同时建立更严格的元素毒理学评估体系.(3)发展高时空分辨的元素原位检测技术. 目前研究技术方法存在局限性, 如灵敏度与分辨率的平衡、活体分析缺乏特异性探针且深层组织成像受限于信号穿透性等, 需要开发新型生物相容性探针, 发展多模态联用技术.(4)跨学科协作与数据整合的挑战. 需整合化学、生物学、物理学和计算科学, 开发智能化分析平台.元素毒性、代谢调控复杂性及跨尺度研究方法的整合仍是重大挑战. 随着多学科交叉的深入, 元素化学生物学有望在合成生物学、精准医学和生物能源等领域开辟新的研究方向.5拟解决的关键问题化学元素在生命体系和机体健康中起着关键、不可替代的作用, 是各种生物系统的重要组成部分, 目前关于生命中的元素问题还需深入探索. 通过创造性地发展化学生物学技术与方法, 从分子精度, 甚至是原子及化学键层面上, 对生命体系中的元素角色进行精准的识别、阐释、修饰和调控, 可以帮助我们从不同于经典学科的视角理解生命本质, 推进生命科学、生物医药与医疗健康等前沿领域的加速发展.(1)如何绘制生命体系内源元素分子功能的化学生物学图谱? 需揭示内源元素在生命过程调控中的分子机制, 提出可化学干预的分子靶标, 为面向内源元素的生理和病理调节确定新型发展路径.(2)如何高效探测和调节生命体系各类元素的分子行为? 通过发展特异性化学生物学工具揭示关键元素在表观遗传、细胞免疫、神经传导等重要生命过程中的作用机制, 并构建可化学干预的分子手段, 为基于元素的功能调节提供化学生物学解决方案.(3)如何利用外源性元素构建具有鲜明特色的面向疾病诊疗的分子探针和潜在药物分子? 需揭示主族元素、过渡金属元素和稀土元素各自在构建外源性分子工具中所体现出的化学生物学独特性, 为基于元素特征的分子工具明晰未来发展前景.6对元素化学生物学的发展建议开展元素化学生物学研究, 对深入融合化学、生物学、医学、药学、材料学、影像学等学科意义重大. 这不仅能促使各学科相互启迪、协同进步, 还为元素化学生物学自身开辟全新的发展路径. 在此背景下, 凝聚国内相关研究队伍迫在眉睫. 从化学元素的视角切入, 着重探究生命体系中内源和外源元素的化学生物学特性, 全方位揭示各类元素在生物过程中的分子调控机制, 并积极探寻其在疾病诊疗等各方面的应用场景, 为我国化学生物学领域腾飞增添强劲动力. 基于此, 对该领域发展提出以下建议.(1)强化金属元素在细胞关键活动中的研究. 聚焦多细胞通讯以及新型细胞死亡进程中, 主族和过渡金属元素的时空分布规律、动态修饰过程、代谢行为的生物学效应, 实现对其精准调控. 明确这些金属元素在亚细胞水平的分布特征、价态变化及形态特点, 深度剖析它们在参与生物催化、生物矿化、蛋白质修饰与稳态调控、细胞免疫调节等过程中的作用机制和分子路径. 同时, 大力发展分子探针工具, 为该领域研究提供更为精准、高效的技术支撑.(2)深化特征元素对核酸与蛋白质修饰调控研究. 解析细胞微环境中内源金属离子对核酸二级结构(如G-四链体、i-motif等)的调控机制, 以及蛋白翻译后修饰的影响及生物学效应. 积极开发针对内源动态核酸结构、蛋白翻译后修饰变化响应的元素类检测与调控工具, 构建金属修饰与非编码RNA、蛋白修饰酶之间的互作网络图谱. 设计并合成靶向特异核酸结构、蛋白翻译后修饰过程的元素类化学干预分子, 为精准调控生物分子过程、治疗相关疾病奠定坚实基础.(3)大力推进新靶标导向的元素药物研究与诊疗应用. 借助元素所具备的独特氧化态、立体结构、协同模式热力学动力学调控能力以及多靶向等特性, 紧密围绕临床实际需求, 开展元素类药物的设计开发工作, 包括: 抗体偶联等新(多)靶点驱动的新一代铂类药物及其他元素类药物设计, 构建靶向分子库并实现模块化合成, 探索放射性元素在诊疗领域的应用潜力, 引入人工智能技术进行高通量筛选, 以及完善评价模型构建等环节. 通过全链条的研究推进, 加速元素类药物从实验室到临床应用的转化进程, 为疾病治疗提供更多创新手段.(4)持续加大元素化学生物学研究新方法和新技术开发力度. 积极开拓元素多维组学、超分辨成像技术、质谱成像、原位示踪、现代顺磁共振技术、(近似)细胞环境的多维核磁结构解析技术、大数据分析、纳米递送等前沿技术. 这些新方法和新技术的涌现, 将极大提升科研工作者对元素化学生物学现象的观测精度与研究深度, 打破传统研究手段的局限, 为解决该领域的关键科学问题提供全新视角与有力工具, 推动元素化学生物学研究向更高水平迈进.通过上述策略, 有望构建出特色鲜明、内容丰富的化学生物学元素周期表, 助力新理论、新方法、新工具、新技术等方面实现持续突破, 切实攻克生命健康等领域的关键难题, 稳固我国在元素化学生物学国际前沿领域的优势地位, 为人类健康事业贡献中国智慧与力量.【参考文献】[1] Galy B, Conrad M, Muckenthaler M. 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诊断试剂临床研究

2026-01-06

·学术前沿研究

Gut：羧基富勒烯衍生物QF70靶向PLIN2降解治疗MASLD

一、引言脂滴是高度动态且具有代谢活性的细胞器，是脂质代谢的核心枢纽。肝细胞中脂滴的过度积累是代谢相关脂肪性肝病（MASLD）公认的细胞特征，该病是全球最常见的慢性肝病，影响着超过 30% 的成年人。除了导致细胞内脂质沉积和单纯性脂肪变性外，脂滴生物合成和降解功能异常还可通过阻碍脂解和自噬、诱导内质网应激、压迫血窦内皮细胞引发缺氧介导的星状细胞活化，直接促进从早期单纯性肝脂肪变性向晚期代谢相关脂肪性肝炎进展。此外，非肝细胞中脂滴的增加在加重肝外代谢疾病（包括心血管疾病、胰岛素抵抗、2 型糖尿病、肥胖和恶性肿瘤易感性）中也发挥重要作用。因此，靶向脂滴已成为治疗 MASLD 及其他相关代谢疾病的一种有前景的策略。脂滴在不同代谢状态下具有高度多样的功能。其核心包含中性脂质，周围包裹着单层磷脂膜，膜上修饰有多种多功能膜相关蛋白，这些蛋白调控膜转运、脂质代谢和脂滴稳定性。在这些表面蛋白中，围脂滴蛋白（perilipins）因其在脂滴积累和稳定性中的关键作用而备受关注。围脂滴蛋白2（PLIN2）是围脂滴蛋白家族成员，主要在肝细胞和脂肪细胞中表达，对脂滴大小具有关键影响，且与 MASLD 的易感性、严重程度、胰岛素抵抗及肥胖密切相关。PLIN2 缺陷小鼠的 MASLD 病理特征显著改善。在脂滴形成和增大过程中，PLIN2 的表面表达同步增加，导致脂肪甘油三酯脂酶（ATGL）难以进入脂滴核心。由于 ATGL 是催化甘油三酯（TG）水解生成二酰甘油（DAG）和脂肪酸的首个限速酶，脂滴表面 PLIN2 的过量沉积会导致脂解受损和脂肪变性进展。这些发现表明，PLIN2 是 MASLD 治疗的潜在靶点。然而，目前尚未开发出通过靶向 PLIN2 治疗 MASLD 的药理学方法。目前，针对 MASLD 的治疗研发主要基于饮食干预、小分子药物和减重手术。作为精准医疗领域快速发展的方向，基于纳米颗粒的疗法凭借其吸引人的 “位点特异性” 靶向性、良好的生物相容性、改善的药代动力学特征以及可设计的细胞定向药物递送和释放能力，为药物研发提供了新机遇。迄今为止，已开发出多种类型的纳米结构作为治疗剂，主要包括脂质纳米系统、碳纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、金属纳米材料、无机纳米颗粒等。此前的研究报道了脂质体、纳米乳剂、聚合物纳米颗粒和纳米凝胶在抗 MASLD 策略中的临床前应用，但主要作为药物载体。值得注意的是，近期研究强调了纳米颗粒作为直接抗 MASLD 药物的应用前景，其中碳纳米颗粒和金属纳米材料受到了重点关注。Denise 等人报道，氧化铈纳米颗粒可定位于肝脏，抑制脂肪变性、炎症和肝损伤，但相关分子机制尚不明确。此外，高羟基化富勒烯C₆₀(OH)₄₄和角鲨烷溶解的富勒烯 C₆₀具有阻断炎症相关脂肪细胞脂质积累的潜力。然而，尚未对纳米颗粒对肝脏代谢疾病的功能影响进行系统评估，其调控脂滴形成的确切分子机制仍需进一步阐明。本研究筛选了八种常用纳米材料对 PLIN2 调控的脂滴稳定性的影响，发现C₇₀富勒烯是最具抗MASLD活性的材料。此外，制备了一种表面修饰四个丙二酸基团的C₇₀富勒烯衍生物，命名为QF70，并证实其作为治疗MASLD的新型候选药物的疗效，其作用机制涉及 PLIN2 的溶酶体降解。二、研究结果 1.富勒烯衍生物是PLIN2介导的脂滴形成的强效抑制剂为鉴定可作为脂滴积累相关 MASLD 进展治疗候选物的有效纳米材料，我们首先测试了八种常用于疾病干预的纳米颗粒，包括纳米氧化铈（nano-CeO₂）、纳米氧化锌（nano-ZnO）、氧化石墨烯（graphene oxide）、金纳米颗粒（gold nanoparticles）、银纳米颗粒（silver nanoparticles）、纳米四氧化三铁（nano-Fe₃O₄）、纳米金刚石（nanodiamonds）和富勒醇（fullerol）。纳米颗粒的纳入标准包括：市售可得、生物相容性良好、粒径在 20-50nm 之间，且已有报道具有代谢紊乱保护作用。我们系统比较了它们在 Huh7 细胞中的细胞毒性，以及下调 PLIN2 表达、抑制脂滴形成和细胞炎症的能力。除纳米氧化锌外，通过 CCK8 测定（图 1B）和流式细胞术（图 1C）检测，所有被检测的纳米材料均显示出可忽略的细胞毒性。随后，通过用棕榈酸（0.5mM PA）和油酸（1mM OA）处理细胞，构建了体外脂滴形成模型，该模型也会像MASLD中那样诱导PLIN2蛋白上调。值得注意的是，如图1D所示，富勒醇对脂滴中PLIN2表达的下调作用最为显著。此外，富勒醇还能有效抑制细胞内脂质沉积（图1E、F），并抑制TNFα和IL6的产生（图1G、H），而其他纳米颗粒的作用则不太显著或不稳定。这些发现表明，富勒醇有望成为一种可促进MASLD中PLIN2下调的纳米颗粒。图1 纳米颗粒的筛选。(A) 纳米药物筛选策略示意图；(B) 纳米颗粒孵育 24 小时后的 CCK8 测定结果；(C) 流式细胞术分析纳米颗粒的凋亡诱导作用；(D) 纳米颗粒处理后，Huh7 细胞中脂滴 PLIN2 表达的蛋白质印迹分析及定量；(E) 尼罗红染色检测不同纳米颗粒处理 12 小时后细胞内脂滴（比例尺：25μm）；(F) 脂滴定量分析；(G) 纳米颗粒处理后 Huh7 细胞中 IL6 启动子的荧光素酶测定；(H) 纳米颗粒处理后 Huh7 细胞中 TNFα 启动子的荧光素酶测定。注：BSA（牛血清白蛋白）、FITC（荧光素异硫氰酸酯）、GO（氧化石墨烯）、HOM（细胞匀浆）、LD（脂滴）、MASLD（代谢相关脂肪性肝病）、OA（油酸）、PA（棕榈酸）、PLIN2（围脂滴蛋白 2）。 2.羧基富勒烯衍生物QF70作为抗MASLD候选物的制备富勒醇作为富勒烯衍生物的典型代表，因其修饰方法简便且生物活性多样而被广泛应用。考虑到表面官能团可能进一步影响抗 MASLD 能力，我们在第二轮筛选中比较了富勒醇与其他七种常用富勒烯衍生物的活性。本研究筛选了 C₆₀和 C₇₀核心两类富勒烯，每类均带有八种不同的表面取代基（图 2A、B）。已有报道表明，这些表面修饰均具有调节富勒烯衍生物药理活性的潜力。分子动力学模拟显示，基于随时间变化的均方根偏差（RMSD）值，所有这些衍生物对膜结构均无可预测的重大影响，表明其对细胞膜完整性的潜在损伤有限（图 2C、D）。乳酸脱氢酶（LDH）检测也支持这一结论（图 2E）。值得注意的是，初步表型筛选表明，羧基修饰的富勒烯是抑制 PLIN2 蛋白上调、肝细胞脂滴积累和细胞炎症的最有效衍生物（图 2F-H）。鉴于表面覆盖基团的数量可能影响富勒烯的理化性质和治疗效果，进一步检测了带有2-5个丙二酸基团的羧基富勒烯的抗MASLD功能（图2I-M）。重要的是，带有四个丙二酸基团的羧基富勒烯（命名为QF70）是保护肝细胞免受脂毒性损伤的最有效衍生物。此外，评估了两种不同类型人肝细胞的毒性和表型数据。QF70未显示出明显的毒性作用，并显著抑制了这些细胞中 PLIN2 的表达和脂滴积累。通过微生物致突变性艾姆氏试验、体外哺乳动物染色体畸变试验以及体内单剂量毒性试验等多种方法对 QF70 的安全性进行了评估，在这些试验中均未观察到与 QF70 相关的任何毒性副作用。图2 富勒烯衍生物的筛选。(A) 富勒烯衍生物筛选策略示意图；(B) 富勒烯衍生物 F1'-F8' 的示意图（对应 F1-F8 的简化结构）；(C) 不同富勒烯衍生物 F1'-F8' 穿过脂质膜的代表性模拟图像；(D) 不同富勒烯衍生物在脂质膜中的均方根偏差（RMSD）；(E) Huh7 细胞对 C₆₀/C₇₀衍生物的 LDH 测定；(F) PA/OA 刺激后，不同 C₆₀/C₇₀衍生物处理的 Huh7 细胞中脂滴 PLIN2 表达的蛋白质印迹分析及定量；(G) 不同 C₆₀/C₇₀衍生物处理后 Huh7 细胞中脂滴的尼罗红染色（比例尺：25μm）；(H) 不同 C₆₀/C₇₀衍生物处理后，Huh7 细胞中脂滴定量与 IL6/TNF 启动子荧光素酶测定的综合分析；(I) 不同 C₇₀- 羧基富勒烯处理后肝细胞中脂滴 PLIN2 表达的蛋白质印迹分析及定量；(J) 不同 C₇₀- 羧基富勒烯处理后肝细胞中脂滴的尼罗红染色；(K) 脂滴定量分析；(L) 不同 C₇₀- 羧基富勒烯处理后 Huh7 细胞中 IL6 启动子的荧光素酶测定；(M) 不同 C₇₀- 羧基富勒烯处理后 Huh7 细胞中 TNF 启动子的荧光素酶测定。注：LDH（乳酸脱氢酶）、MD（分子动力学）、OA（油酸）、PA（棕榈酸）、PLIN2（围脂滴蛋白 2）、RMSD（均方根偏差）。 3. QF70主要分布于肝脏和脂肪组织使用Gd-DTPA偶联的QF70作为MRI探针，进一步监测了QF70在体内的生物分布（图 3A）。给小鼠口服 0.4mmol/kg 剂量的 Gd-DTPA-QF70 后进行 MRI 成像。此外，在给予 Gd-DTPA-QF70 后不同时间点收集组织，通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定确认 QF70 的组织生物分布。如图 3B、C 所示，QF70 从血液中快速清除，但在肝脏和白色脂肪组织中显著富集。MRI 检测验证了 QF70 在肝脏和脂肪组织中的富集（图 3D）。通过FITC标记 QF70，在直接荧光成像下确认了QF70特异性分布于肝脏和白色脂肪组织（图 3E、F）。此外，使用富勒烯抗体进行了额外的组织病理学和免疫荧光分析，进一步证实了 QF70 在肝脏和白色脂肪组织中的大量富集。一致地，肝脏组织样本的电子显微镜检查清楚地显示了 QF70 纳米颗粒在肝脏中的富集。关于富勒烯的代谢特征，富勒烯衍生物在体内具有较高的稳定性，代谢产物极少。其主要通过肝脏和肾脏代谢消除，经粪便和尿液排泄，24 小时内可从血液中完全清除。少数研究表明，富勒烯可能会被肠道微生物群和其他微生物部分降解，可能产生呋喃或吡喃类结构类似物，但迄今为止尚未检测到有毒副产物。图3 QF70 的生物分布。(A) Gd-DTPA-QF70 的合成与应用示意图；(B) 口服给药后不同时间点血浆中 QF70 的浓度；(C) QF70 在不同器官中的生物分布（n=3）；(D) 给予 Gd-DTPA-QF70 后 C57BL/6 小鼠的 T1 加权 MRI 图像；(E) QF70-FITC 的合成与应用示意图；(F) 给予 QF70-FITC 后分离器官的荧光成像。注：AUC（曲线下面积）、DCC（1,3 - 二环己基碳二亚胺）、DTPA（二乙烯三胺五乙酸）、FITC（荧光素异硫氰酸酯）、GdCl（氯化钆）、HATU（2-（7 - 氮杂苯并三唑 - 1 - 基）-N,N,N',N'- 四甲基脲六氟磷酸盐）、ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）、NHS（N - 羟基琥珀酰亚胺）、QF70（四丙二酸基取代 C₇₀富勒烯）。 4.QF70定位于溶酶体，抑制肝细胞和脂肪细胞中脂滴形成鉴于给药后肝脏是 QF70 的主要作用部位，通过将 FITC 标记的 QF70 与枯否细胞（CD68）、肝细胞（KRT18）和肝星状细胞（结蛋白）的相应标志物共同孵育，然后进行共聚焦显微镜成像，探究了 QF70 积累的具体肝细胞类型（图 4A）。研究发现 QF70 特异性内化到肝细胞中，而不是枯否细胞或肝星状细胞（图 4B）。此外，收集实验结束时经 QF70 处理的小鼠肝脏，使用富勒烯抗体进行免疫荧光分析，评估 QF70 与组织内不同细胞类型的共定位。如图 4C 所示，QF70 主要与肝实质细胞共定位。与上述结果一致，QF70 显著抑制了原代肝细胞中 PA/OA 诱导的脂滴形成、TG 沉积和炎症激活（图 4D、E）。自由扩散和内吞作用是富勒烯衍生物摄取的两种主要途径（图 4F）。通过分子动力学模拟，QF70 无法通过自由扩散进入肝细胞（图 4G）。使用内吞途径抑制剂（包括抑制网格蛋白囊泡形成的氯丙嗪、结合甾醇并破坏小窝形成的制霉菌素以及抑制脂质筏介导的内吞作用的甲基-β-环糊精），进一步研究了内吞途径是否以及如何介导 QF70 内化到肝细胞中。值得注意的是，只有氯丙嗪或高渗条件孵育能有效且特异性地阻断QF70的内化，表明QF70主要通过网格蛋白介导的内吞途径内化到肝细胞中（图 4H）。随后，通过在孵育后不同时间点进行细胞分级分离，确定了 QF70 摄取后的亚细胞定位。QF70 在肝细胞中的亚细胞分布主要集中在溶酶体中（图 4I），荧光显微镜（图 4J）和电子显微镜（图 4K）进一步证实了这一点，表明溶酶体是 QF70 的主要靶细胞器。考虑到内体在纳米药物细胞内转运中的重要作用，在 QF70 与肝细胞共孵育 3 小时后，检测了 QF70 与内体标志物 EEA1 的共定位。如图 4L 所示，QF70 与 EEA1 之间存在显著的共定位，表明 QF70 可被内体捕获。由于内体捕获是纳米药物实际应用中的一个重大挑战，QF70 能否从内体逃逸并避免直接转运至溶酶体，对于其进入细胞质并发挥后续药理作用至关重要。为了研究 QF70 是否能从内体逃逸，于是检测了添加巴佛洛霉素A 对 QF70 与溶酶体共定位的影响（图 4M）。巴佛洛霉素 A 是一种特异性抑制内体向溶酶体转运的化合物。如果 QF70 无法从内体逃逸或避免被内体捕获，那么阻断内体向溶酶体的转运将完全消除 QF70与溶酶体的共定位。结果表明，巴佛洛霉素A处理未能完全阻断QF70与溶酶体的共定位，这表明QF70可以从内体逃逸和/或通过内体非依赖途径部分进入溶酶体（图 4M、N）。图4 QF70 作用于肝细胞的表型。(A) 3T3-L1 细胞处理示意图；(B) 不同时间点 3T3-L1 细胞摄取 QF70-FITC 的代表性共聚焦显微镜图像（比例尺：15μm）；(C) 氯丙嗪、制霉菌素和 MβCD 对 3T3-L1 细胞摄取 QF70-FITC 的影响（比例尺：15μm）；(D) 3T3-L1 细胞中 QF70-FITC 与溶酶体示踪剂红的荧光共定位（比例尺：15μm）；(E) 3T3-L1 细胞中 QF70 的电子显微镜图像（比例尺：500nm）；(F) QF70 处理后 3T3-L1 细胞中脂滴的尼罗红染色（比例尺：15μm）；(G) QF70 处理后 3T3-L1 细胞中 IL-6、CCL-2、Cebpα、PdgfRα、Acox-1、Lcad 和 Pparα 的 qPCR 分析。CCL-2：C-C 趋化因子配体 2；Cebpα：CCAAT 增强子结合蛋白 α；Acox-1：酰基辅酶 A 氧化酶 1；Lcad：长链酰基辅酶 A 脱氢酶；PdgfRα：血小板衍生生长因子受体 α；Pparα：过氧化物酶体增殖物激活受体 α；QF70：四丙二酸基取代 C₇₀富勒烯。由于全身给药后 QF70 也会被白色脂肪组织摄取，于是研究了 QF70 处理的脂肪细胞中是否存在类似的内化机制（图 5A）。结果表明，QF70也通过网格蛋白依赖性内吞途径内化到脂肪细胞中，且主要亚细胞定位在溶酶体中（图5B-E）。更重要的是，QF70能显著抑制分化的3T3-L1脂肪细胞中的脂质积累（图5F）和炎症反应（图5G）。图5 QF70 作用于3T3-L1细胞的表型。(A) 3T3-L1 细胞处理示意图；(B) 不同时间点 3T3-L1 细胞摄取 QF70-FITC 的代表性共聚焦显微镜图像（比例尺：15μm）；(C) 氯丙嗪、制霉菌素和 MβCD 对 3T3-L1 细胞摄取 QF70-FITC 的影响（比例尺：15μm）；(D) 3T3-L1 细胞中 QF70-FITC 与溶酶体示踪剂红的荧光共定位（比例尺：15μm）；(E) 3T3-L1 细胞中 QF70 的电子显微镜图像（比例尺：500nm）；(F) QF70 处理后 3T3-L1 细胞中脂滴的尼罗红染色（比例尺：15μm）；(G) QF70 处理后 3T3-L1 细胞中 IL-6、CCL-2、Cebpα、PdgfRα、Acox-1、Lcad 和 Pparα 的 qPCR 分析。注：CCL-2（C-C 趋化因子配体 2）、Cebpα（CCAAT 增强子结合蛋白 α）、Acox-1（酰基辅酶 A 氧化酶 1）、Lcad（长链酰基辅酶 A 脱氢酶）、PdgfRα（血小板衍生生长因子受体 α）、Pparα（过氧化物酶体增殖物激活受体 α）、QF70（四丙二酸基取代 C₇₀富勒烯）。 5. QF70直接结合PLIN2并促进其溶酶体降解随后用生物素标记QF70，通过pull-down实验结合MS分析获得了与QF70相互作用的蛋白质。鉴定出三种与MASLD相关的蛋白质，即PLIN2、MTCH2和HMGCL，作为与QF70相互作用的潜在候选物（图 6A）。通过等温滴定量热法（ITC）检测 QF70 与这三种候选物的直接相互作用，结果表明 QF70 与 PLIN2 存在强直接结合，而与HMGCL或MTCH2无结合（图 6B）。此外，免疫沉淀相互作用研究（图 6C）和荧光共定位实验（图 6D）进一步证实了 QF70 与 PLIN2 的结合。事实上，QF70 处理显著降低了 PA/OA 处理后培养肝细胞中 PLIN2 的蛋白质水平（图 6E）。值得注意的是，与溶酶体降解特异性抑制剂氯喹共同孵育后，QF70 对 PLIN2 表达的抑制能力大幅逆转（图 6F），表明QF70 通过促进 PLIN2 的溶酶体依赖性降解来降低其蛋白质水平。与这些观察结果一致，与载体对照组相比，QF70 处理后肝细胞中 PLIN2 在溶酶体中的积累增加，这可通过 PLIN2 与溶酶体相关膜蛋白 2（LAMP2）的荧光共定位增强来证明（图 6G）。此外，还评估了在肝细胞和脂肪细胞中 PLIN2 敲除（KO）后，QF70 对脂滴形成和炎症反应的作用。QF70 能有效抑制野生型细胞中的脂滴积累。PLIN2 的基因敲除导致脂滴减少更为显著，突显了其在脂滴积累中的关键调控作用。在 PLIN2-KO 背景下，后续 QF70 处理未产生任何额外的表型效应。此外，PLIN2 敲除后，QF70 无法对 TNFα、CXCL-8 和 SCD1 等标志物产生额外的下调作用。更重要的是，用 QF70 处理 PLIN2-KO 小鼠 12 周，并系统分析了 QF70 对 PLIN2-KO 小鼠是否有额外作用。值得注意的是，尽管 PLIN2-KO 不能完全阻断 MASLD 进展，但 QF70 给药并未对肝脂肪变性、炎症或肝纤维化产生额外的保护作用。这些数据清楚地表明，QF70 通过 PLIN2 依赖性途径保护免受 MASLD 的影响。然后，进一步探究了 QF70 与 PLIN2 的相互作用发生在何处。具体而言，将 QF70 与肝细胞共孵育 24 小时，并对 QF70、PLIN2 和 LAMP2 进行三色共定位分析。如图 6H 所示，紫光表示 QF70 与 PLIN2 在细胞质中不与 LAMP2 共定位（蓝色箭头），而白光表示 QF70 与 PLIN2 和 LAMP2 在溶酶体中共同定位（白色箭头）。这些数据清楚地表明，QF70 可以在细胞质中与 PLIN2 结合，而不仅仅局限于溶酶体中。为了揭示该机制更多的分子细节，进行了分子对接模拟，鉴定出 PLIN2 中可能与 QF70 相互作用的八个氨基酸残基（图 6I）。重要的是，QF70 中的四个丙二酸基团是富勒烯与 PLIN2 结合所必需的。其中两个丙二酸直接与 PLIN2 残基形成氢键，另外两个丙二酸则有助于维持氢键形成所需的适当空间位阻。PLIN2 上推定结合位点的突变（PLIN2-mut）显著减弱了 QF70 与 PLIN2 的相互作用（图 6J）。更重要的是，QF70 无法促进 PLIN2-mut 的蛋白质降解，因此不能阻断 Huh7 细胞和脂肪细胞中 PLIN2-mut 诱导的脂质积累和炎症（图 6K-O）。这些数据强烈表明，在 Huh7 细胞和脂肪细胞中，QF70 对脂质积累和炎症的保护作用主要归因于其与 PLIN2 的直接相互作用，并诱导其溶酶体定位和降解（图 6P）。图6 QF70通过溶酶体途径促进PLIN2降解。(A) 体外pull-down和质谱（MS）分析示意图；(B) ITC 测定 QF70 与 PLIN2、MTCH2 和 HMGCL 的结合亲和力；(C) QF70 与 PLIN2 的免疫沉淀（IP）亲和力验证；(D) 肝细胞中 QF70-FITC 与 PLIN2 的免疫荧光共定位（比例尺：15μm）；(E) QF70 处理后肝细胞中 PLIN2 表达的蛋白质印迹分析及定量；(F) QF70 处理后，从原代肝细胞（PHCs）分离的溶酶体中 PLIN2 表达的蛋白质印迹分析及定量；(G) 肝细胞中 PLIN2 与 LAMP2 的免疫荧光共定位（比例尺：15μm）；(H) 肝细胞中 PLIN2、QF70-FITC 和 LAMP2 的免疫荧光共定位（比例尺：15μm）；(I) QF70 与 PLIN2 的对接图像；(J) ITC 测定 QF70 与 PLIN2-mut 的结合亲和力；(K) Huh7-PLIN2 敲除细胞转染 PLIN2-WT 或 PLIN2-mut 后，脂滴的尼罗红染色（比例尺：15μm）；(L) Huh7-PLIN2 敲除细胞转染 PLIN2-WT 或 PLIN2-mut 并经 QF70 处理后，Flag-PLIN2 表达的蛋白质印迹分析及定量；(M) Huh7-PLIN2 敲除细胞转染 PLIN2-WT 或 PLIN2-mut 并经 QF70 处理后，脂滴的尼罗红染色（比例尺：15μm）；(N) Huh7-PLIN2 敲除细胞转染 PLIN2-WT 或 PLIN2-mut 并经 QF70 处理后，炎症和脂质代谢的基因集变异分析（GSVA）评分；(O) Huh7-PLIN2 敲除细胞转染 PLIN2-WT 或 PLIN2-mut 并经 QF70 处理后，富集信号通路的热图；(P) QF70 的分子机制示意图。CQ：氯喹；ITC：等温滴定量热法；HMGCL：3 - 羟基 - 3 - 甲基戊二酰辅酶 A 裂解酶；KO：敲除；MS：质谱；MTCH2：线粒体载体同源物 2；OA：油酸；PA：棕榈酸；PLIN2：围脂滴蛋白 2；QF70：四丙二酸基取代 C₇₀富勒烯；WT：野生型。 6. QF70在小鼠中有效抑制MASLD进展和代谢紊乱，且安全性良好随后在高脂高胆固醇（HFHC）饮食诱导的小鼠 MASLD 模型中检测了 QF70 的抗 MASLD 作用。根据先前的研究和预实验确定了小鼠中 QF70 的治疗剂量。简而言之，小鼠喂食 HFHC 饮食 16 周，并在 HFHC 处理 4 周后开始口服给予 QF70 或载体，持续 12 周（图 7A）。QF70 处理有效抑制了肝脏重量、体重和白色脂肪组织重量的增加（图 7B）。值得注意的是，给予 QF70 并未显著影响小鼠的饮食消耗。这表明小鼠体重和肝脏重量的变化并非由饮食差异引起。组织学染色显示，与载体组相比，QF70 给药还显著改善了脂质积累、炎症、纤维化以及脂肪细胞增大（图 7C-E）。此外，QF70 处理的动物血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平低于对照组动物（图 7F）。QF70 给药后，肝脏和白色脂肪中 PLIN2 的蛋白质水平也显著降低（图 7G），而 QF70 对正常小鼠肝脏中 PLIN2 的表达无显著影响。通过 RNA-seq 进行的转录组分析显示，QF70 处理显著且持续地下调了 HFHC 饮食诱导的肝脏（图 7H、I）和白色脂肪（图 7J）中与脂质代谢、炎症和纤维化相关的致病通路和基因的激活。重要的是，长期给予 QF70 后，未观察到主要组织的功能或结构参数有任何显著损伤（图 7K-M），这表明其具有良好的长期耐受性和安全性。图7 HFHC 喂养小鼠暴露于 QF70 后的表型。(A) 体内 HFHC 喂养小鼠经 QF70 处理的示意图（100mg/kg，灌胃）；(B) 正常饮食（NC）或 HFHC 喂养小鼠在实验终点的体重、肝脏重量和白色脂肪组织（WAT）重量（每组 n=8 只小鼠）；(C) 肝脏 H&E、油红 O（ORO）、苦味酸天狼星红（PSR）和 CD11b 染色的代表性组织学图像，以及附睾白色脂肪组织（EpiWAT）H&E 染色的代表性组织学图像（每组 n=6 只小鼠）；(D) 基于 H&E 的 NAS 评分以及 (C) 中 ORO、PSR 和 CD11b 的定量分析（每组 n=6 只小鼠）；(E) EpiWAT 的脂肪细胞面积（每组 n=6 只小鼠）；(F) 每组小鼠的血清 ALT、AST、TC 和 TG 水平（每组 n=8 只小鼠）；(G) 肝脏和 WAT 中 PLIN2 表达的蛋白质印迹分析及定量；(H) 与炎症、脂质代谢和纤维化相关的 KEGG 通路富集分析；(I) QF70 处理下调的肝脏中与炎症、脂质代谢和纤维化相关的基因表达热图（每组 n=4 只小鼠）；(J) QF70 处理下调的 WAT 中与脂质代谢相关的基因表达热图（每组 n=3 只小鼠）；(K) HFHC - 载体组和 HFHC-QF70 组的器官指数（每组 n=5 只小鼠）；(L) 每组小鼠的血清肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶 MB（CK-MB）、尿酸（BUA）、肌酐（CREA）和尿素（UREA）水平（每组 n=8 只小鼠）；(M) 不同器官的代表性 H&E 组织学图像（每组 n=4 只小鼠）。ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶；BUA：尿酸；CK：肌酸激酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶 MB；CREA：肌酐；HFHC：高脂高胆固醇；PLIN2：围脂滴蛋白 2；PSR：苦味酸天狼星红；QF70：四丙二酸基取代 C₇₀富勒烯；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；UREA：尿素；WAT：白色脂肪组织。为了进一步确定 QF70 对 MASLD 相关代谢紊乱的影响，在高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠模型和 ob/ob 小鼠模型中评估了 QF70 的表型和分子影响。一致地，QF70 处理在降低体重、改善肝功能和组织学特征、缓解肥胖相关表型以及抑制代谢紊乱相关分子通路方面发挥了显著的保护作用（图 8A-M）。值得注意的是，基于葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验检测，ob/ob 小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗得到了显著改善（图 8N、O）。图 8 HFD 喂养或ob/ob肥胖小鼠暴露于QF70后的表型。(A) NC 或 HFD 喂养小鼠在实验终点的体重、肝脏重量和 WAT 重量（每组 n=8 只小鼠）；(B) HFD 喂养小鼠肝脏 H&E、ORO 染色的代表性组织学图像，以及 EpiWAT H&E 染色的代表性组织学图像（每组 n=6 只小鼠）；(C) (B) 中 ORO 的定量分析和 EpiWAT 的脂肪细胞面积（每组 n=6 只小鼠）；(D) HFD 喂养小鼠每组的血清 ALT、AST、TC 和 TG 水平（每组 n=8 只小鼠）；(E) HFD 喂养小鼠肝脏和 WAT 中 PLIN2 表达的蛋白质印迹分析及定量；(F) ob/ob 肥胖小鼠在实验终点的体重、肝脏重量和 WAT 重量（每组 n=8 只小鼠）；(G) ob/ob 肥胖小鼠肝脏 H&E、ORO 染色的代表性组织学图像，以及 EpiWAT H&E 染色的代表性组织学图像（每组 n=8 只小鼠）；(H) (G) 中 ORO 的定量分析（n=8）和 EpiWAT 的脂肪细胞面积（每组 n=6 只小鼠）；(I) ob/ob 肥胖小鼠的血清 ALT、AST、TC 和 TG 水平（每组 n=8 只小鼠）；(J) ob/ob 肥胖小鼠肝脏和 WAT 中PLIN2 表达的蛋白质印迹分析及定量；(K) ob/ob 肥胖小鼠 8 个样本的聚类分析（每组 n=4 只小鼠）；(L) ob/ob 肥胖小鼠肝脏中与炎症和脂质代谢相关的 KEGG 通路富集分析；(M) QF70 处理下调的 ob/ob 肥胖小鼠肝脏中与脂质代谢相关的基因表达热图（每组 n=4 只小鼠）；(N) 葡萄糖耐量试验（GTT）及 GTT 曲线下面积（AUC）；(O) 胰岛素耐量试验（ITT）及 ITT 曲线下面积（AUC）。ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶；AUC：曲线下面积；GTT：葡萄糖耐量试验；HFD：高脂饮食；ITT：胰岛素耐量试验；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；WAT：白色脂肪组织。 7. QF70有效阻断食蟹猴MASLD进展为了进一步验证 QF70 治疗 MASLD 和代谢紊乱的转化潜力，在食蟹猴非人灵长类动物 MASLD 模型中评估了 QF70 的药理活性。将 8 只自发出现 MASLD 特征的猴子随机分为 QF70 组和安慰剂组，每组 4 只，并通过 HFHC 饮食进一步加重 MASLD 严重程度，持续 16 周（图 9A）。在 HFHC 喂养前，QF70 组和载体组的生理参数、血常规检测指标和肝脏组织学特征具有可比性（图 9B、C、E）。在 HFHC 喂养 4 周后，每天口服给予猴子 17.5mg/kg 剂量的 QF70，持续 12 周。值得注意的是，MRI 显示 QF70 显著抑制了肝脏中脂质积累的含量（图 9B），同时血清 ALT 和 AST 水平显著降低，肝脏 TG 和 TC 含量也降低（图 9C、D）。组织学和免疫荧光染色显示，与载体对照组相比，QF70 处理的动物肝脂肪变性、炎症细胞浸润和纤维化显著减轻（图 9E、F）。此外，肝脏和脂肪组织中 PLIN2 蛋白质水平显著降低（图 9G）。尽管 QF70 处理 12 周后体重无显著差异（这可能归因于给药时间相对较短），但与对照组相比，QF70 组猴子的肝脏和白色脂肪组织中与脂质代谢紊乱和炎症反应相关的基因显著下调（图 9I、J）。脂质组学分析显示，QF70 处理还显著改善了血浆脂质谱，其中二酰甘油（DAG）、甘油三酯（TG）、磷脂酰胆碱、神经酰胺和磷脂酰乙醇胺水平显著降低（图 9K）。总之，这些发现清楚地验证了 QF70 在临床治疗 MASLD 和相关代谢疾病中的潜力。图 9 食蟹猴暴露于QF70后的表型。(A) 体内 HFHC 喂养食蟹猴经 QF70 处理的示意图（17.5mg/kg，灌胃）；(B) 0 周、4 周和 16 周肝脏的代表性 T1-MRI 图像；(C) 0 周和 16 周每组猴子的血清 ALT、AST 水平（每组 n=4 只猴子）；(D) 16 周时肝脏的 TG 和 TC 含量（每组 n=4 只猴子）；(E) 肝脏 H&E、ORO、PSR 和 CD11b 染色的代表性组织学图像（每组 n=4 只猴子）；(F) (E) 中 ORO、PSR 和 CD11b 的定量分析（每组 n=4 只猴子）；(G) HFHC 喂养猴子肝脏和 WAT 中 PLIN2 表达的蛋白质印迹分析；(H) HFHC 喂养猴子肝脏和 WAT 中 PLIN2 表达的定量分析；(I) QF70 处理下调的肝脏中与炎症、脂质代谢和纤维化相关的基因表达热图（每组 n=3 只猴子）；(J) QF70 处理下调的 WAT 中与脂质代谢相关的基因表达热图（每组 n=3 只猴子）；(K) QF70 处理组与载体处理组猴子血清脂质谱的脂质组学热图。ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶；HFHC：高脂高胆固醇；MRI：磁共振成像；PLIN2：围脂滴蛋白 2；QF70：四丙二酸基取代 C₇₀富勒烯；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；WAT：白色脂肪组织。三、讨论 MASLD 已成为导致肝脏死亡和肝外并发症的主要原因之一。目前，临床实践中可用的药物仅有两种，干预措施仍然相当有限。利用纳米材料的多重生物活性和良好的生物相容性，于是制备了羧基富勒烯 QF70 作为一种强效的 PLIN2 - 脂滴调节剂，它能有效阻断啮齿类动物和非人灵长类动物模型中 MASLD 的进展和代谢紊乱。机制研究表明，QF70 在肝细胞和脂肪细胞中特异性结合 PLIN2，并促进其溶酶体积累和降解。这些发现为纳米医学领域中富勒烯衍生物用于脂滴相关蛋白的靶向降解以及肝脏和代谢疾病的治疗提供了概念验证和纳米药物候选物。脂滴在肝脏代谢紊乱中具有双重作用。一方面，在脂滴形成的早期阶段，过量的脂质可以被包裹起来，以防止过量脂肪酸积累引起的脂毒性。另一方面，脂滴数量和大小的持续增加会诱导严重的细胞内质网应激和凋亡，从而加速炎症反应和瘢痕形成。脂滴的稳态是一个动态平衡过程。脂滴的形成可以通过内部脂质合成或外部脂质摄取实现，起源于内质网双层脂质核心，周围环绕着单层磷脂，随后在脂滴表面的I类和II类蛋白质的控制下进行出芽过程。关于脂滴降解，存在两种途径，即脂解和自噬介导的“脂自噬”。脂解是由细胞质中的ATGL与脂滴表面结合引起的，ATGL在脂滴表面催化储存的甘油三酯（TAG）分解为甘油和脂肪酸。值得注意的是，脂滴表面蛋白PLIN2密切参与脂滴的形成和降解。具体而言，PLIN2的过表达可以促进TAG储存和脂滴形成，但通过包裹脂滴膜并减少ATGL进入核心，阻碍TAG降解。此外，PLIN2还参与脂滴的融合和分裂，影响脂滴的形成和分解。尽管PLIN2在调节脂滴中具有重要作用，但其晶体结构仍然未知，目前尚无报道直接靶向PLIN2的小分子或抑制剂。本研究首次提供证据支持 QF70 特异性靶向 PLIN2，调控其溶酶体降解并抑制脂滴形成。QF70 在 PLIN2 降解和脂滴形成方面的显著效果突显了纳米材料在缓解肝脏和代谢疾病中的应用。抑制脂滴形成的治疗策略包括使用脂肪酸合成抑制剂和胰岛素增敏剂来减少脂肪酸酰化，而减少外部脂质摄入的相应治疗策略包括调节肠道微生物群、饮食营养和日常生活方式。目前，大多数针对MASLD的药物研发工作集中在开发潜在分子靶点的拮抗剂或激动剂。然而，超过70%的人类蛋白质组难以与小分子抑制剂结合。纳米医学凭借其独特的理化性质以及在多样性、灵活性、智能性和药物递送能力及细胞类型特异性靶向性方面的显著优势，已成为治疗多种疾病的有前景的策略。迄今为止，已有超过100种纳米药物获批上市，主要用于癌症治疗（53%）和感染性疾病（14%）。然而，纳米药物的研发仍面临若干挑战，纳米颗粒在代谢疾病中的应用还远未充分开发。迄今为止，仅有两种药物（聚乙二醇干扰素α-2a和聚乙二醇干扰素α-2b）被开发用于治疗肝脏相关疾病。纳米颗粒用于肝病治疗的主要挑战之一是，由于肝脏中枯否细胞和非驻留免疫细胞固有的免疫清除能力，其对实质细胞的特异性靶向性通常受损。纳米材料向不同细胞类型的靶向递送取决于其大小、表面电荷和溶解度。小尺寸和阳离子纳米颗粒具有更强的肝细胞递送倾向，而较大的纳米颗粒更倾向于被枯否细胞清除。在本研究中，QF70纳米颗粒在水溶液中可聚集至约10nm，在转运至生物环境中时可能解聚为近1nm的单体。这种尺寸范围可避免枯否细胞的吸收。此外，QF70对在代谢组织和细胞中高表达的PLIN2的亲和力增强了其与肝实质细胞和脂肪细胞的相容性。本研究还深入探讨了富勒烯衍生物的构效关系和分子机制。由于富勒烯衍生物的组成复杂且取代基多样，其生物活性具有多样性和不确定性。值得注意的是，尽管 C₆₀和 C₇₀具有相似的结构，但它们在某些生物活性方面表现出显著差异。从分子结构来看，C₆₀是高度对称的球体，而 C₇₀是椭球体。这种结构差异导致表面修饰基团的空间分布不同，影响其亲疏水性。因此，这些差异导致了生物活性的显著不同。本研究系统比较了碳笼大小、修饰基团和添加数量对富勒烯衍生物作用的影响，最终优化出四丙二酸基取代 C₇₀富勒烯作为最具潜力的候选物。关于分子机制，先前的研究通常将富勒烯的益处归因于其抗氧化应激能力。已对富勒烯的抗炎活性进行了广泛研究。然而，其潜在机制仍不明确，主要局限于传统的自由基清除和抗氧化作用。此外，虽然抑制炎症可能对 MASLD 有益，但仅调节炎症并不一定能保证疗效。先前的临床药物研究结果不佳。先前的研究表明，脂毒性在 MASLD 的进展中起着关键作用。此外，新获批的 MASLD 药物雷西替罗姆（Rezdiffra）与脂质代谢紊乱的调控相关。因此，基于脂质稳态调控开发 MASLD 药物似乎是一种有效的策略。本研究首次揭示，QF70 直接靶向 PLIN2 并增强其溶酶体定位和降解。这些发现极大地拓展了纳米颗粒的益处，不仅限于预防氧化应激，还为通过直接靶向蛋白质降解开发新型纳米药物提供了新途径。此外，尽管已有报道纳米颗粒可通过靶向溶酶体发挥治疗作用，但先前的研究主要聚焦于恢复溶酶体的酸性环境以实现治疗效果，而没有靶向特定的蛋白质或靶点。例如，Zeng 等人报道的纳米材料由含氟聚酯组成，能够转运氢离子。当这些材料到达溶酶体时，它们可以释放 H⁺离子并降低溶酶体 pH 值，以恢复降解功能。与这些方法不同，本研究报道 QF70 通过其表面羧基直接结合 PLIN2，促进其随后转运至溶酶体进行降解，从而发挥治疗作用。治疗方法的差异为具有不同病理机制的疾病提供了更全面的治疗选择。据报道，富勒烯衍生物在体内具有较高的稳定性，代谢产物极少。它们主要通过肝脏和肾脏代谢消除，经粪便和尿液排泄，24 小时内可从血液中完全清除。因此，我们推测其抗 MASLD 功能和分子机制主要得益于 QF70 原型。总之，本研究鉴定出一种羧基富勒烯 QF70，它能克服传统纳米药物的递送障碍，在病变部位有效富集。值得注意的是，QF70 具有可控的结构和作用于脂滴膜蛋白 PLIN2 的特异性药理机制。QF70-PLIN2 - 脂滴轴的关键作用为设计用于脂滴紊乱相关代谢疾病的新型纳米材料提供了新的思路。四、研究局限性 1. 本研究已系统证明，QF70 给药通过诱导小鼠 PLIN2 降解显著阻止了 MASLD 的进展，这可能有利于过量甘油三酯的分解。然而，停药后 QF70 是否会继续抑制脂滴积累和炎症反应仍有待研究。考虑到 MASLD 是一种对代谢应激产生的进行性疾病，理论上需要持续给药以获得稳定的治疗效果，除非能完全消除代谢应激。 2. 由于纳米颗粒种类繁多且性质各异，难以在大量不同的纳米颗粒之间比较某一特征。纳米材料的生物活性与其大小、形状和表面修饰密切相关。因此，使用具有不同参数的纳米材料可能会产生不同的筛选结果。 3. 尽管本研究的发现清楚地支持 PLIN2 作为 QF70 的直接药理靶点，但目前我们不能排除其他蛋白质可能与 QF70 结合并有助于其抗 MASLD 作用的可能性，因为纳米颗粒可能具有多个功能靶点。 4. 尽管对 PLIN2 与富勒醇之间的相互作用进行了对接模拟，但未获得阳性结果。关于富勒醇的抗 MASLD 益处，可能归因于其他未明确的机制，例如抗氧化功能、抗炎作用或对 PLIN2 降解的其他间接调控能力。然而，这些机制超出了本研究的范围，因此未进行深入探讨。五、文章逻辑梳理 1. 靶向递送优势：QF70在体内主要分布在肝脏和白色脂肪组织中，且能特异性被肝细胞摄取，而非Kupffer细胞或肝星状细胞。这种特异性分布使其能够精准作用于MASLD的关键病变部位。 2. 细胞摄取机制：QF70通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞，并主要定位于溶酶体。重要的是，QF70能够从内体中逃逸，避免被直接运送到溶酶体降解，这为其发挥药理作用创造了条件。 3. 分子机制创新：通过蛋白质组学筛选，研究团队发现QF70直接与PLIN2蛋白结合，并促进其溶酶体降解。分子对接模拟显示，QF70的四个丙二酸基团与PLIN2的八个氨基酸残基发生相互作用，其中两个直接形成氢键。4. 细胞模型验证：在Huh7细胞和原代肝细胞中，QF70显著抑制PA/OA诱导的脂滴积累和炎症反应。在PLIN2敲除的细胞中，QF70不再产生额外的保护效应，证实其作用依赖于PLIN2。 5. 小鼠模型效果：在高脂高胆固醇饮食诱导的MASLD小鼠模型中，口服QF70（100mg/kg）治疗12周显著改善肝脏脂肪变性、炎症和纤维化，降低血清ALT、AST、TG和TC水平。类似的效果也在高脂饮食诱导的肥胖小鼠和ob/ob小鼠中得到验证。 6. 非人灵长类模型：在食蟹猴MASLD模型中，QF70（17.5mg/kg）治疗16周后，MRI显示肝脏脂质积累显著减少，肝功能指标改善，肝脏组织学显示脂肪变性、炎症和纤维化明显减轻。参考文献： Zou T, Wan J, Liao R, Bai L, Li X, Cheng X, Zhou J, Tang Q, Zhang Y, Zhao C, Qu W, Yang J, Zhang X, Tian T, Yao X, Cai Z, Tian S, Jiang J, Hu Y, Yang H, Zhang E, Chen Y, Yu B, Cai J, Xu H, Wang C, Zhang XJ, She ZG, Li H. Discovery of a carboxyl fullerene derivative as a new lipid droplet regulator inhibiting MASLD. Gut. 2025:gutjnl-2025-336268. doi: 10.1136/gutjnl-2025-336268

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KEGG	Wiki	ATC	Drug Bank
D01707	钆喷酸葡胺	V08CA01	DB00789

研发状态

批准上市

10 条最早获批的记录,

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适应症	国家/地区	公司	日期
造影剂	美国	Bayer HealthCare Pharmaceuticals, Inc.	1988-06-02

未上市

10 条进展最快的记录,

后查看更多信息

适应症	最高研发状态	国家/地区	公司	日期
心血管畸形	临床3期	-	Bayer AG	2003-12-01
病理性缩窄	临床3期	-	Bayer AG	2003-12-01
肾动脉狭窄	临床3期	-	Bayer AG	2003-12-01
血管动脉疾病	临床3期	-	Bayer AG	2003-12-01
外周血管疾病	临床3期	-	Bayer AG	2003-03-01
脑转移瘤	临床3期	日本	Bayer AG	2003-02-01
心肌梗塞	临床2期	美国	Bayer AG	2006-03-01
心肌梗塞	临床2期	阿根廷	Bayer AG	2006-03-01
外周动脉疾病	临床2期	日本	Bayer AG	2004-07-01
原发性免疫缺陷疾病	临床2期	美国	Asis Co., Ltd.	-

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临床结果

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研究	分期	人群特征	评价人数	分组	结果	评价	发布日期


NCT02057874 (CTgov)	N/A	肝细胞癌 \| 不可切除的肝细胞癌	2	3 Tesla Magnetic Resonance Imaging+Magnevist	築遞遞襯願觸獵餘願夢(糧襯獵製艱衊網選鬱觸) = 選繭鏇艱鹽醖顧廠顧顧鏇構鑰糧廠醖壓鹽鏇範 (鏇糧鏇鏇廠網夢襯鬱積, 窪淵餘鹽顧齋鬱鬱艱鏇 ~ 築範製遞壓網蓋夢鹽壓) 更多	-	2018-07-11
NCT00537056 (CTgov)	N/A	肾细胞癌	17	FDG PET CT+F-18 Fluoro-deoxi-glucose+Sunitinib+Gadolinium-DTPA	餘蓋齋繭鹽製壓鑰艱鑰(夢齋衊選願齋獵簾範鹽) = 獵襯鏇鹹顧鬱餘窪鬱選鑰淵衊襯製淵糧積構壓 (鹽鑰夢憲襯遞窪鹹壓餘, 5.7) 更多	-	2017-06-14
NCT02080312 (CTgov)	N/A	梅尼埃病	6	Magnevist	襯選製壓網製網醖遞醖 = 膚鹽淵壓願蓋膚艱鏇構艱觸糧積鏇製繭鏇壓憲 (襯廠艱襯選願壓顧範衊, 構淵鹹廠顧觸遞顧簾築 ~ 壓簾繭蓋簾醖鑰鏇憲窪) 更多	-	2016-02-12
NCT01260636 (Supra-Aortic VALUE, Pubmed \| AJNR Am J Neuroradiol)	临床3期	-	46	Single-dose gadobenate dimeglumine	網齋衊窪淵齋選鬱餘積(憲鑰遞網膚顧遞鏇蓋淵) = 憲鏇獵憲鏇夢壓網選鹹選鬱選網糧醖觸醖襯鹹 (遞糧選憲餘構網築齋鏇 ) 更多	积极	2013-04-01
	临床3期	-	46	Double-dose gadopentetate dimeglumine	網齋衊窪淵齋選鬱餘積(憲鑰遞網膚顧遞鏇蓋淵) = 簾齋網製廠鏇膚餘繭網選鬱選網糧醖觸醖襯鹹 (遞糧選憲餘構網築齋鏇 ) 更多	积极	2013-04-01