mRNA-2752

摘要:过去20年中，疫苗显著改善了慢性疾病的检测和管理。根据世界卫生组织（WHO）的数据，预计到2020年，癌症将成为全球主要的死亡原因，造成近1000万人死亡，约占每六例死亡中的一例。因此，人们越来越关注癌症疫苗（CV）的开发，将其作为一种预防手段而不仅仅是治疗方法。由于在管理、稳定性和设计方面的进步，使用蛋白质和肽作为疫苗传递载体引起了持续的兴趣。本综述关注该领域的最新进展，并探讨基于蛋白质和肽的疫苗治疗各种类型癌症的潜力。 1.引言 尽管经过数十年的科学研究和临床研究，以及对有前景的新治疗方法的临床试验，癌症仍然是导致发病率和死亡率的主要原因。不受控制的细胞分裂是癌症的特征，这些细胞侵入其他组织导致肿瘤肿块的形成、血管生成和转移（癌症在全身的扩散）。血管生成是从已有血管形成新血管的过程，对正常生长和发育至关重要，但它在良性肿瘤向恶性肿瘤的转变中也起着重要作用。化疗是治疗癌症的主要方法之一，涉及向癌细胞施用细胞毒性物质。 尽管近年来取得了重大进展，但大多数癌症治疗仍然涉及手术或相对不变的化疗、放疗和激素疗法。例如，传统的化学预防剂（如DNA烷化剂）针对活跃增殖的息肉可能也会损害健康生长的细胞，并且可能无法完全消除静止或不增殖的癌细胞。现代药物的开发也与药物抗性的出现有关，这可能是由于影响药物与其靶标的相互作用的药物转运蛋白或解毒酶的缺陷引起的。癌症中的药物抗性也可能是由于DNA修复过程和程序性细胞死亡途径的缺陷导致的。即使在成功的初始治疗后，患者仍然面临癌症复发的风险。小分子药物的开发推动了寻找新的癌症治疗方法的努力，但意外的副作用促使人们探索替代策略。 2.疫苗免疫学的关键概念 疫苗利用人体发展对微生物的防御机制的能力。免疫系统能够迅速识别并消除以前遇到过的病原体细菌。疫苗包含被破坏或灭活的病原体，它们触发的免疫反应与人体对细菌的自然反应非常相似。由于疫苗中的病原体被杀死或灭活，它们不会引起疾病，这使得接种疫苗成为建立免疫力的低风险方法。 疫苗和良好的卫生习惯是预防传染病传播的最有效方法。如果不加以控制，一些传染病已被证明是致命的。 2.1.免疫系统 免疫系统能够区分自身分子和结构以及非自身分子和结构。通过识别和消除它们，这种技能旨在保护有机体免受疾病传播的影响。免疫系统由两个主要部分组成：先天（天生）免疫系统和适应性（特定）免疫系统。 2.1.1.先天免疫系统 先天免疫系统对入侵病原体提供快速反应。当细胞和分子识别出病原体的特定分子结构时，就会触发先天免疫系统。先天免疫系统的作用是防止或限制这些病原体的复制和传播。炎症是先天免疫系统对脊椎动物感染的最早反应之一。受感染和受伤的细胞产生特定化学物质，如组胺和前列腺素，这些物质引发炎症。这种反应增加了对疼痛的敏感性，扩张了局部血管，并吸引称为中性粒细胞的白细胞，它们可以将病原体作为最初的防御吞噬。中性粒细胞可以释放趋化因子和细胞因子，吸引其他免疫细胞，如巨噬细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）。巨噬细胞存在于组织中，既能吞噬也能杀死感染。NK细胞使用一种称为凋亡的过程来识别和破坏受感染的细胞和一些癌细胞。凋亡的特征是DNA和蛋白质的分解以及细胞的解体。 先天免疫系统以多种方式对疾病早期阶段的病原体做出反应，但它不提供持久的免疫力。当病毒能够绕过这一最初的防线时，无脊椎动物的先天免疫系统激活适应性免疫系统。 2.1.2.适应性免疫系统 适应性免疫系统具有增强病原体识别、定制针对病原体实际结构的特定反应，并记住该反应以备将来再次遇到相同或密切相关的病原体时的显著能力。适应性免疫系统激活骨髓和胸腺，分别产生B细胞和T细胞，以产生体液免疫和细胞免疫。通常，T细胞攻击被病原体感染的体细胞或发展成癌症的细胞，而B细胞产生直接对抗病原体的抗体（Abs）。在对抗原（被识别为非自身的分子）的反应中，B细胞在被激活时产生Abs。抗原可以包括细菌毒素（B.T）、癌性结构或细菌本身。产生的Abs特定于该特定抗原。Abs的主要作用是中和（使无效）入侵者以防止其繁殖，或标记它们以供消除（由其他免疫细胞执行）。与B细胞类似，T细胞具有抗原特异性表面受体。T细胞可以专门化于各种角色，如吸引和激活巨噬细胞，刺激B细胞产生Abs，或直接消除感染细胞（细胞毒性T细胞，也称为杀手细胞）。即使在感染被清除后，这种增强的反应也通过免疫记忆得以维持。每当病毒再次进入体内时，免疫系统能够更快速地响应。这种能力由记忆细胞维持，它们保留了以前遇到的病原体的某些特征，并在再次识别病原体时能够触发强烈的反应。 2.1.3.肿瘤免疫学 有大量证据表明，免疫系统经常在肿瘤变得可见之前就消除它们，这个过程被称为免疫监视。对肿瘤的免疫反应非常复杂，尚未完全理解，并且受到各种因素的影响，特别是肿瘤的类型。有效的肿瘤控制需要细胞毒性T细胞和NK细胞的参与。另一个重要特征是肿瘤细胞的高凋亡率。凋亡细胞可以释放蛋白质片段，激活NK细胞和其他细胞，如果合成率高并且有比巨噬细胞能吞噬的更多的凋亡细胞，就会诱导干扰素的产生。干扰素通过增强抗肿瘤T细胞识别肿瘤细胞的能力，在免疫监视中发挥作用。肿瘤细胞能够产生肿瘤相关抗原（TAAs），这些蛋白质在肿瘤细胞表面比正常细胞更丰富。作为响应，免疫系统利用T细胞在识别这些抗原为外来物后消除肿瘤细胞。 3.疫苗的免疫学要求 3.1.被识别后选择最佳抗原 疫苗旨在阻止由病原体感染导致的疾病指标。大多数情况下，这是通过最小化疾病的影响而不是完全预防它来实现的。因此，在选择合适的抗原作为疫苗基础时，了解疾病的病原学和自然免疫控制是非常有帮助的。疫苗中包含的来自病原体的复杂材料可以变化。我们对基础免疫学和选择技术的改进理解，导致了比以往任何时候都更彻底的疫苗表征，激发了更逻辑的疫苗创造方法。 3.2.诱导先天免疫反应 如前所述，一系列因素和刺激可以激活免疫系统。因此，在开发疫苗时，特别是在使用高纯度或精炼的抗原时，重要的是要考虑不仅仅是“外来”抗原的存在以引发免疫反应。一些灭活全病毒和高纯度成分抗原配方可能缺乏某些分子特征和防御触发因素，这些因素对于先天免疫系统的功能是必要的。这些抗原可能没有预期的那么免疫原性，但它们的设计是为了减少过度的炎症反应。在这种情况下，使用佐剂可以通过模拟它们来替代缺失的先天触发因素，恢复保护反应需求与其可耐受性之间的适当平衡。 3.3.有益的CD4 T细胞诱导 CD4 T细胞的激活主要由早期炎症反应的性质决定。因此，疫苗中使用的佐剂可以影响CD4 T细胞的激活和随后的发展，这反过来又影响适应性免疫系统反应的幅度和性质。 3.4.效应细胞选择与靶向 必须意识到，并非所有针对特定病原体或抗原的免疫反应都能最佳地激发保护；一些感染已经进化出逃避或操纵免疫反应的策略。尽管抗体滴度常被认为是免疫保护的充分指标，但它们实际上可能并非获得最佳保护的手段。可能不存在免疫相关性和保护力，或者我们对它们的理解还不够充分。现代疫苗开发中，临床试验仍被用来了解临床效果，如果可能的话，了解受保护者的免疫学特征。 4.传统疫苗与基于蛋白质和肽的疫苗的比较 传统疫苗与基于蛋白质和肽的疫苗的比较在表7.1中进行了解释。 5.基于蛋白质和肽的疫苗的考虑因素 蛋白质、单克隆抗体（mAbs）和肽作为“生物制剂”方法的一部分用于癌症治疗。与肽不同，单克隆抗体和大型蛋白质配体在某些浓度下可能对骨髓和肝脏有毒，这可能由于它们非选择性地进入网状内皮系统而导致这些器官受损。此外，它们的大尺寸使得它们难以被输送到肿瘤中。因此，这些生物分子主要用于血液恶性肿瘤，并且它们被输送到肿瘤黏膜表面的动脉靶标。另一方面，肽提供了几个优势，包括它们的小尺寸、合成和修改的便捷性、穿透肿瘤的能力以及高生物相容性。化学修饰，如D-氨基酸的引入或环化，可以防止肽被蛋白酶降解。 在临床前和临床环境中，有许多肽候选物正在开发中。自2000年以来，肽在临床试验中最常被研究用于癌症症状（18%）和代谢疾病症状（17%）。肽可以以多种方式用于治疗癌症，包括作为药物（如血管生成抑制剂）、激素和疫苗。它们也可以作为靶向肿瘤和输送放射性物质和细胞毒素药物（靶向化疗和放疗）的代理。由于肽能够结合不同的受体并参与多种代谢途径，它们可以作为癌症研究中的诊断工具和生物标志物。过去十年中，癌症疫苗的概念已经发展，临床研究集中在基于特定抗原的疫苗输送上，以增强抗癌免疫。 这种方法涉及使用从潜在肿瘤组织或特殊抗原的蛋白质序列中衍生的肽制成的疫苗。肿瘤相关抗原（TAAs）由肿瘤细胞产生，并且可以被宿主的免疫系统，特别是T细胞识别。这些TAAs可以静脉注射给癌症患者，目的是触发广泛的免疫反应，可能导致各种器官组织中的癌细胞被消除。主动免疫疗法，通常称为疫苗接种，涉及在宿主中诱导有效的、肿瘤特异性的免疫反应，这最终可能导致肿瘤的退化。肿瘤细胞产生的任何具有突变结构的蛋白质或肽都可以作为肿瘤抗原。相关基因的突变导致这种异常蛋白质的产生。许多临床试验已经调查了TAA肽疫苗接种或主动免疫在转移性癌症个体中的治疗潜力。 细胞毒性T细胞（CTL，CD8+ T细胞或杀手T细胞）表位是最常见的TAAs。通常，肽抗原长度为8到10个氨基酸，具有2-3个主要锚定残基，这些残基与MHC I类分子结合，以及2-3个与T细胞受体（TCR）连接的残基。由于它们专注于由MHC I类分子产生的肽，CTLs是对抗肿瘤细胞的有效免疫系统效应器。T细胞上的T细胞抗原受体（TCR）可以识别位于MHC分子表位口袋中的小肽。MHC的两个亚型是I类和II类，I类分子存在于所有有核细胞上，II类分子发现在特定的抗原呈递细胞上。MHC分子也被称为人类白细胞抗原。 如前所述，MHC II类分子在能够吞噬抗原或将它们与表面抗体结合的抗原呈递细胞（APCs）上表达。CD4+ T细胞可以识别与这些分子相关的抗原。 癌胚抗原（CEA）（乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌和非小细胞肺癌（NSCLCs）），HER-2/neu免疫优势肽（肺癌、乳腺癌或卵巢癌），前列腺特异性膜抗原（PSMA）（黑色素瘤）和Mucin-1是几个已经经历了I期、II期和III期研究的突出肽疫苗。GV-1001，一种由端粒酶逆转录酶的催化组分制成的替代疫苗，目前正在研究中。它是一种注射形式的广泛MHC II类肽。GV-1001目前正在用于II期临床试验，以治疗胰腺癌、NSCLC和肝癌。 6.所有疫苗面临的挑战 所有旨在为癌症、致病微生物或自身免疫介质的遭遇而激活免疫系统的免疫接种都存在一些问题。 6.1.选择合适的抗原 历史上有效的疫苗接种通常使用活体、减毒的有机体。这些疫苗虽然在群体层面上取得了成功，但存在中等但显著的激活风险，可能会导致疾病或其他不利的副作用。早期的癌症疫苗（CVs）是使用经过辐射治疗或其他形式灭活的完整肿瘤细胞开发的，因为当时没有可用的肿瘤抗原。这种疫苗接种方法在小鼠模型中导致了肿瘤排斥，并引发了针对肿瘤的特异性免疫反应。这些早期疫苗要么没有使用经过多次体内或体外传代并累积了许多突变的肿瘤组织系，要么使用了。整个肿瘤细胞注射带来了与基于整个病毒的疫苗相似的重大健康风险，引发了关于重新激活和疾病进展的担忧。主要关注的是潜在的自身免疫发展。未成熟的树突状细胞（DCs）处理死亡细胞和组织中的自身抗原，没有强烈的激活信号，如病原体提供的信号，免疫系统不会对这些抗原作出反应。为了产生强大的免疫力，肿瘤细胞疫苗需要激活DCs的化学物质。然而，在完整肿瘤细胞的情况下，预计激活的DCs不仅会启动免疫，还会呈现肿瘤特异性抗原和其他抗原（自身抗原），这些抗原通常受到外周耐受性的影响。使用动物模型和临床试验的研究积累了疫苗接种后发生自身免疫反应的证据，证实了这一情况的现实性。 免疫疗法与其他疗法相比的主要优势在于其提供的特异性。然而，当使用整个癌细胞或复杂的肿瘤衍生物混合物时，这种优势可能会受到损害。免疫系统有能力识别肿瘤表达的表位并靶向肿瘤细胞，同时保留健康的细胞。在过去二十年中，为了开发能够从这种特异性中受益的肿瘤抗原，已经做出了巨大的努力。已经鉴定出许多肿瘤抗原，并且临床前调查表明，基于这些抗原的癌症疫苗可以促进长期记忆和肿瘤特异性免疫，而不诱发自身免疫疾病。实际上，广泛的研究表明，包含来自MAGE3、HER2/NEU17、粘液1或其他MAGE基因家族成员、mammaglobin或CEA的表位的疫苗是免疫原性的，而不会引起自身免疫疾病。尽管有确立的肿瘤抗原可用，但癌症疫苗领域的最新发展再次集中在使用整个肿瘤细胞或整个细胞裂解物作为抗原。这些复杂的混合物可能更具免疫原性，并能引发比小鼠化学致癌肿瘤中发现的单独抗原更强的抗肿瘤免疫反应，因为它们可能包含对每个肿瘤都独特的特定肿瘤抗原。对转基因常见肿瘤抗原的小鼠进行的研究表明，这些抗原可以引发同样强大的抗癌反应，并导致肿瘤排斥。 对目前临床成功率的不满是一个令人关注的问题，可能会阻碍基于公认的抗原的癌症疫苗的使用。在低估基于定义的肿瘤抗原疫苗的潜力并回归可能导致自身免疫的未定义肿瘤混合物之前，至关重要的是要记住，基于抗原的疫苗在动物模型中已经显示出成功，主要是在肿瘤预防方面。目前，这些疫苗仅被测试用于严重疾病，通常是在传统疗法失败的情况下。因此，它们尚未有机会在人类中复制同样的成功水平。 6.2.刺激适当类型的免疫反应 系统性免疫旨在监测被称为转移性癌症的系统状况。然而，许多原发性肿瘤起源于粘膜，粘膜免疫系统首先在这里遇到它们。越来越多的注意力被放在可以有效地增强粘膜和系统免疫的疫苗的抗原、佐剂和递送系统上。粘膜免疫系统已经进化到在对病毒的快速反应、对食物或其他环境抗原的不敏感性以及非致病性细菌菌群之间保持健康的平衡。粘膜疫苗必须仔细维持这种调节平衡，同时也增强保护性反应。 目前有一个问题，即免疫反应是否能有效治疗器官恶性肿瘤，如肺、肝或脑组织。使用现有动物模型进行的大多数研究，特别是那些源自皮下（SC）部位的可移植肿瘤的研究，并没有为这个问题提供新的知识。治疗性癌症疫苗预计将加强已经存在、活跃但不成熟免疫反应，而不是引发全新的免疫反应。这进一步证明了考虑是否应该进行特定疫苗接种以促进粘膜免疫而不是系统免疫的合理性。当针对具有粘膜起源的肿瘤时，如膀胱癌、结肠癌（CC）、宫颈癌、头颈鳞状细胞癌（SCCHN）、肺腺癌或宫颈癌，粘膜免疫途径可能在增强反应方面更有效。癌症疫苗的未来开发将需要更深入地理解粘膜免疫。 6.3.长期记忆的诱发 部分疫苗具有刺激免疫记忆的能力，这是一种至关重要的防御机制，而其他疫苗则没有。理解免疫记忆是什么以及其发展和维持所需的条件，最近已成为研究的焦点。缺乏能够区分记忆T细胞和其他T细胞的明显标志物一直是该领域的一个主要障碍。然而，最近在使用趋化因子受体方面的进展已成功地允许区分记忆细胞和其他功能性T细胞亚群。此外，开始有报道称存在类似粘液的糖蛋白等指标。这些标志物将有助于确定肿瘤抗原、佐剂和注射途径如何影响它们引发的免疫反应，不仅在复杂性和强度方面，而且在它们触发的记忆反应类型方面。普遍共识认为，强烈的初次免疫反应对于产生大量记忆细胞是必要的。然而，关于抗原在这一过程中的重要性存在持续的争论，记忆T细胞的寿命受哪些因素影响仍然不清晰。这些问题对于治疗性癌症疫苗尤其相关。基于特定抗原的疫苗预计在这些抗原存在的情况下增强免疫力，因为癌症患者的免疫系统长时间暴露于肿瘤抗原。在接种疫苗之前，患者已经具有肿瘤特异性T细胞，但目前尚不清楚这些细胞是效应细胞还是效应和记忆细胞的组合。根据一些研究，记忆细胞对癌症是独特的，并且可以在癌症中识别。然而，尚不确定癌症患者中有多少T细胞是肿瘤特异性的，以及疫苗如何影响它们，因为区分效应细胞和记忆细胞以及肿瘤抗原的持续性存在挑战。目前还不清楚在癌症等疾病条件下是否能够恢复长期记忆。正在慢性病毒疾病背景下开发一些标准，对癌症来说较少，特别是对TH细胞激活和先天免疫的需求。最近的研究指出，T细胞记忆的发展是分阶段进行的。它始于在抗原存在时发展为效应细胞的初始细胞，然后在抗原受限时发展为效应记忆细胞，最后在抗原完全消除时发展为中心记忆细胞。即使作为一种预防措施，也假定癌症免疫接种将在健康的年轻人中实现这一点。然而，在慢性抗原的背景下，尚不清楚治疗性疫苗如何触发整个分化过程。 6.4.癌症疫苗的额外困难 6.4.1.免疫系统老化 胸腺停止产生初始T细胞已经过去很长时间，癌症疫苗目前正在对65至80岁的老年癌症患者进行测试。因此，为了使效应细胞群体能够对疫苗做出反应，患者T细胞库中至少有一个或多个记忆T细胞必须能够识别疫苗抗原。“最佳匹配”T细胞本应在早年从多样化的初始克隆池中被选中，但可能或可能不会出现在对疫苗反应的T细胞中。动物模型表明，年轻小鼠与老年小鼠相比展现出更强的初次反应，这是经验上的真实情况。随着个体年龄的增长，他们产生初始反应并将其转化为记忆的能力受损。这归因于衰老引起的免疫系统功能的改变。利用小鼠模型的临床前研究和癌症疫苗的临床试验目前显示出显著差异。大多数研究不使用老年小鼠，而那些使用老年小鼠的研究报告称，在诱导有效的抗肿瘤免疫反应方面存在挑战，以及由于T细胞亚群模式的转变，癌症易感性随年龄增长而增加。鉴于这些疫苗将主要在老年患者中进行管理，因此至关重要的是要更加重视设计能够至少部分解决与年龄相关关切的癌症治疗性疫苗。例如，已经证明激活共刺激分子4-1BB（CD137）可以增强老年小鼠的T细胞反应。可能的是，失活有害调节因子如细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA4）或激活尚未测试的其他共刺激分子将具有类似的效果。此外，虽然大量佐剂在年轻小鼠中可能有益，但少量佐剂可能增强老年人的免疫反应。在老年大鼠中，CpGDNA似乎在增强细胞和体液免疫方面更有效。与衰老相关的免疫功能下降表明，与成人相比，患有癌症的儿童可能对治疗性癌症疫苗更敏感。然而，此类实验很少进行。与老年患者的临床研究相比，针对3至17岁患有复发性神经母细胞瘤、肉瘤和肾脏恶性肿瘤的儿童的基于DC的疫苗试验的结果不幸并不十分乐观。这表明免疫抑制标准疗法和/或先前的治疗对即使是年轻患者的免疫系统也产生负面影响。这意味着有效的疫苗接种方法将需要在疾病早期阶段进行疫苗接种，并且在没有免疫抑制常规药物的情况下进行。 6.4.2.免疫逃逸和肿瘤诱导的免疫抑制 当发现肿瘤时，免疫系统和肿瘤之间已经发生了多次相互作用。如果肿瘤发展缓慢且没有显著破坏附近健康组织，免疫系统可能无法识别肿瘤。在这段时间里，肿瘤细胞经历了额外的突变，其中一些突变促进了增殖和侵袭。除了伤口愈合和凝血等防御机制外，由于树突状细胞（DCs）已被激活，当肿瘤扩大并开始破坏组织时，适应性免疫系统得到通知。这些细胞将肿瘤和组织碎片“运送”到引流的淋巴结，T细胞可能在那里暴露它。癌症患者中独特的针对肿瘤的细胞和体液反应表明，免疫系统已经识别了肿瘤。当肿瘤细胞停止表达特定的肿瘤抗原或MHC分子时，免疫系统已尝试消除肿瘤。然而，持续的肿瘤生长表明，免疫系统可能最终无法识别肿瘤。“癌症免疫编辑”一词指的是这种修改肿瘤但不完全根除它的免疫监视过程。肿瘤可以以多种方式影响免疫系统，并且已经发现许多免疫效应途径存在功能缺陷。癌症患者经历了树突状细胞发育和活性的抑制。T细胞的激活和功能也明显异常，这最初在携带肿瘤的小鼠中观察到，后来在患有各种肿瘤类型的人类中发现。这些效应可能由肿瘤细胞产生的细胞因子介导，如转化生长因子（TGF）、白细胞介素10（IL-10）和其他细胞因子，以及其他较少知名的可溶性化学物质或细胞表面分子。此外，先天免疫的不适当激活可能会阻碍适应性抗肿瘤免疫。研究表明，肿瘤诱导的巨噬细胞和多形核细胞的激活导致癌症患者的氧化应激，导致T细胞功能显著降低。此外，已观察到激活NKT细胞，这些细胞可以产生高水平的IL-13，可能会抑制对癌症的免疫反应。为了促进治疗干预，正在努力在分子水平上更好地理解这些免疫抑制途径。有令人鼓舞的报告称，在有限的情况下，免疫接种已经能够部分逆转这些问题。需要进一步的研究来理解调节性T细胞（TRegs）在癌症免疫中的作用。CD4+ CD25+ T细胞的一个亚群已经显示出抑制自身免疫的能力，这表明这些淋巴细胞在肿瘤进展期间自身抗原呈现增加时可能成为非常强大的免疫细胞。有限的动物研究表明，去除这些细胞可能会带来一些好处。在尝试使用治疗性癌症疫苗调节患者的免疫系统之前，至关重要的是要彻底了解患者的免疫系统。由于许多免疫抑制过程在各种肿瘤类型中是共享的，因此可能更有效的做法是开发一个治疗计划，包括在治疗性疫苗接种之前解除免疫抑制。 7.蛋白质和肽疫苗的佐剂和配方 无论是由完整的细胞、某些蛋白质还是肽组成，所有癌症疫苗都必须含有佐剂。目前，只有两种佐剂，即角鲨烯-油水乳液（MF59）和基于铝的盐类（明矾），被授权用于临床试验。然而，已经研究并证明了许多其他增强疫苗免疫原性的化合物在动物模型和人类中都是有效的。随着它们被识别为分子，许多新型佐剂的佐剂效应背后的机制得到了更好的理解。佐剂可以激活T细胞、NK细胞和其他先天系统细胞以释放细胞因子，以促进抗原特异性T细胞的存活。白细胞介素-2（IL-2）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-12、IL-4和其他几种细胞因子已被用作癌症疫苗中的佐剂。此外，细菌产品长期以来一直被用作有效的佐剂。来自沙门氏菌的单磷脂A（MPL）和来自革兰氏阴性细菌的脂多糖（LPS）是两个最著名的例子。最近，发现细菌DNA由于存在未甲基化的CpG二核苷酸而具有显著的免疫刺激性活性。这些和其他细菌化学物质被DCs、巨噬细胞可能还有NK细胞和其他先天系统细胞产生的各种独特受体识别。因此，这些细胞发育、激活并开始产生促炎细胞因子。这些受体中的许多属于Toll样受体（TLR）家族，可以识别入侵的病原体，并存在于某些细胞内或细胞表面。由于它们激活细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的卓越能力，细菌化合物引起了肿瘤免疫学家的关注。 不同抗原处理途径控制着抗原肽如何由MHC类I分子呈现给CD8+ T细胞（内源性途径）或由MHC类II分子呈现给CD4+ T细胞（外源性途径）的发现，促进了一类能够将抗原传递到期望的处理途径（外源性途径）的佐剂的发展。含有除核酸外所有抗原类型的疫苗主要通过外源性途径将抗原传递给抗原呈递细胞（APCs），这促进了抗体的产生和CD4+ T细胞的激活。在细胞质中的抗原被运输到内质网（ER）并附着到MHC类I分子之前，必须首先被蛋白酶体分解。像聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球、类病毒颗粒（VLPs）和免疫刺激性复合物（ISCOMs）这样的佐剂，它们是由胆固醇和Quil A组成的胶束，是能够有效传递抗原到细胞质的小颗粒。为了成功地将抗原传递给APCs，并通过MHC类I和类II分子呈现，疫苗配方中的佐剂必须是颗粒状的。热休克蛋白（HSPs）也可能是这些佐剂之一。抗原成功地被传递到MHC类I途径，激活APCs 。 7.1.微贮库递送系统 微贮库（微粒）载体常常可以作为可溶性聚合物载体的一个可行的替代品。脂质体、胶束、聚合物微粒和细胞幽灵是这类系统的一些例子。与“直接”分子共轭相比，使用这些载体的结果是在活性成分与载体的比例上显著更高。此外，由于在注射给药期间，药物分子与其周围环境被载体壁完全隔离，它们提供了更高水平的保护，以防止酶解降解和其他有害化学物质的侵害。这些载体的另一个优点是，单个载体可以运输多种药物。然而，应该注意的是，并非所有微粒都能通过肾脏过滤排出，因为它们的大小。微贮库载体的主要缺点是它们倾向于被RES细胞吸收，特别是在肝脏和脾脏。 7.2.胶束和脂质体 脂质体是被最广泛研究和最适合的颗粒状药物载体，用于包裹肽和蛋白质。脂质体由同心的球形磷脂双层构成，包围着一个水性空间，形成囊泡。这些颗粒具有最小的毒性或抗原反应，并且完全生物相容和生物不活跃。肽和蛋白质可以被包裹在脂质体的水性腔室中。脂质体的制备方法多种多样，只需要进行不损害肽或蛋白质完整性的调整。传统的脂质体被RES细胞迅速清除，类似于其他微粒递送技术。为了延长脂质体的循环寿命，人们已经做出了努力，允许开发可以向除了RES之外的目标递送药物的脂质体。这是通过将灵活的亲水性聚合物与修饰的表面结合，通常是PEG，到长循环脂质体上实现的。这阻止了血浆蛋白附着在脂质体表面，从而阻碍了RES的识别和吸收。类似于大分子，脂质体可以由于EPR效应而在各种来源的肿瘤中积累。修改长循环脂质体以递送基于肽和蛋白质的药物到肿瘤是一个简单的过程。然而，使用不同的小尺寸递送方法，如添加药物的胶束或肽和蛋白质与聚合物的共轭，可能被证明更有效。在各种药理学胶束中，由两亲性PEG-磷脂共轭制成的聚合物胶束特别有趣，因为它们的耐用性。与脂质体不同，这些微小颗粒缺乏内部水性空间。通过在这些颗粒的表面化学附着疏水“锚”，可以将药物物质如肽或蛋白质并入胶束。 8.世卫组织推荐的合成肽疫苗生产和质量控制的指令是什么？ 为了确保人类使用的肽疫苗的安全性和有效性一致性，本指南作为其开发、生产和控制的基础。这些指南包括： • 起始材料的控制，包括有关合成感兴趣肽的背景数据； • 生产过程的控制； • 最终产品的控制。 8.1.生产控制指南 8.1.1.肽合成和表征 肽合成过程应该被充分描述，包括任何过程中的控制。描述应该包括使用的原材料的来源和具体信息、采用的方法、偶联和脱保护条件、进入合成下一步骤的要求，以及任何集成的组（如糖基或脂质）。如果合成是在溶液中进行的，应提供流程图和中间肽的细节。应该提供证据支持以下内容： • 正确的氨基酸以所需顺序添加，并且进行了适当数量和种类的修改（如脂质或糖基部分的并入），从而使得主肽序列具有预期的结构。 • 检测和表征了肽单体的主要以及在可能的情况下次要杂质。 • 在连续几批中，肽保持一致的质量水平。 8.1.2.共轭物 共轭产品应满足以下要求： • 需要建立共轭证明； • 应以减少副作用（例如载体交联）为目标； • 重要的是要收集证据证明共轭不会改变抗原序列； • 残留试剂和副产品水平应保持在最低限度。 8.1.3.载体 载体可能与肽共轭或整合到其中。由于对载体的免疫反应可能超过对肽的反应，在选择载体时应小心。最好避免可能引发自身免疫以及那些可能在目标人群中引起预先存在的超敏反应的载体。 8.1.4.聚合、环化或载体合成肽 应特别注意以下几点： • 产品从一批到另一批的相对分子质量分布保持一致。 • 当适当时，各种肽的相对比例保持一致。 • 借助合适的补充分析程序，清楚地识别产品的性质。 • 借助合适的补充分析程序，清楚地识别产品的性质。 8.1.5.防腐剂 如果添加了防腐剂，应确定防腐剂的含量，并证明所使用的量不会对个别疫苗组分产生有害影响，也不会在人类中引起任何意外的不良反应。不应在单剂量制剂中添加防腐剂。 8.2.配方最终产品的指南 8.2.1 与佐剂的相互作用 重要的是要明确各种疫苗组分如何与佐剂相互作用，并证明这种相互作用在不同批次之间是一致的。例如，聚合物制剂中不同种类与佐剂的结合程度可能受到分子质量、疏水性或pH等因素的影响。因此，配方过程可能会无意中导致制剂的分级。 8.2.2.稳定性研究 充分的稳定性研究是疫苗开发的关键组成部分。这些结果用于确定产品在理想储存条件下的最大货架寿命。为了验证产品直到有效期内的免疫原性和无毒性，应对声称有效的每个组分进行实时稳定性测试。加速稳定性研究可以提供产品稳定的初步证据，但它们不能取代用于许可目的的实时测试。 8.2.3.效力 疫苗的功能活性或其在人类中的作用方式不一定反映在效力测定中。在适当的情况下，应包括适当的疫苗效力测试。效力测定的主要目标是使用部分依赖于生物活性的技术来证明批次间的一致性。因此，考虑适当的体外或体内免疫原性或抗原性测定是很重要的。在这样的测定中，应对照参考材料进行比较，并且结果应经过统计验证。由于疫苗的作用机制可能存在差异，这些测定的具体内容必须逐个案例确定。 9.癌症的抗原性和免疫原性 肿瘤引发能够停止其生长的免疫反应的能力被称为肿瘤免疫原性。然而，关于这一复杂过程的功能还有很多需要了解的地方。免疫系统可能阻止癌症扩散的概念最初由Paul Ehrlich在1909年提出。Burnet后来提出了一个理论来解释这一点，建议肿瘤释放新抗原，触发能够根除新癌症的免疫反应。Lewis Thomas采取了一种进化的观点，假设生物体拥有高度发达的防御机制，类似于移植排斥过程，阻止癌症的发展。癌症免疫监视和免疫编辑的概念受到了这些假设的启发。免疫系统区分自身抗原（正常组织表达的抗原）和非自身抗原，以消除逃避免疫识别的恶性肿瘤。最初，人们认为这种机制可以解释肿瘤的免疫原性。然而，尽管有大量相反的证据，但宿主免疫系统未能消除产生非自身抗原的癌症的出现，无法用提出的方法来解释。此外，它也无法解释肠道微生物产生的大量外来抗原与宿主和谐共存的情况。 Pradeu & Carosella认为免疫原性取决于癌细胞呈现与免疫受体通常接触的不同的独特抗原表位，而不是抗原是否被识别为非自身，他们试图解释这些差异。他们描述了表位表达如何“突然”改变。然而，Pradeu & Carosella令人信服地表明，仅凭免疫原性不足以解释因表位呈现变化引起的免疫耐受。根据新抗原与其他经常暴露的抗原一起呈现的方式，它可以导致免疫或耐受。当新抗原以小剂量和逐渐变化的方式引入时，会发生免疫耐受。因此，免疫原性要求肿瘤细胞表达足够水平的肿瘤细胞专有的抗原，而不是从肿瘤形成的正常细胞。此外，肿瘤细胞必须成功地传递抗原，以导致免疫激活，而不是免疫耐受。最近的实验和观察为这一结论提供了一些证据支持。 抗原性，或称免疫原反应性，指的是病毒与特定抗体分子结合的能力。包膜病毒并非通过衣壳蛋白的抗原位点或B细胞表位来具有抗原性，这些位点被抗体结合位点所识别。蛋白质表位的连续性或不连续性由构成多肽链的氨基酸的接近程度决定。大多数表位的免疫原反应性依赖于蛋白质的天然构象，因为它们由肽链折叠带来的表面残基聚集在一起。病毒衣壳的四聚体结构，也称为新类型表位，是由病毒衣壳形成的。新类型表位的发展涉及衣壳蛋白的亚单位间相互作用，这些相互作用引起衣壳蛋白的构象变化，以及相邻亚单位残基的排列，从而形成特定的表位。 宿主对生物材料的反应受到免疫系统的抗原性和免疫原性的影晌，它们具有不同的功能。一种物质附着或与身体最终细胞介导反应的副产品（如B细胞或TCRs）相互作用的能力称为抗原性。这些抗原具有称为抗原决定簇或表位的结构组分，它们与B细胞受体（也称为抗体或免疫球蛋白）结合。当一个主要组织相容性复合体（MHC）分子与蛋白质抗原的线性氨基酸序列（表位）结合时，TCRs能够识别它们。当一个“免疫原”通过激活先天免疫系统然后是适应性（获得性）免疫系统来引发免疫反应时，身体对外国抗原变得更加敏感。生物材料，特别是来自自然的同种异体或异种材料，可以作为免疫原。所有抗原性材料也是免疫原性的，而反之则不然。因此，有些分子本身是抗原性的但不是免疫原性的。这些分子被称为“半抗原”，如金属离子。它们在术后金属超敏反应中扮演着至关重要的角色。因此，免疫原性和抗原性都影响宿主免疫系统对自然和人造生物材料的反应。 10.目前发展 10.1.基于细胞的癌症疫苗 目前正在进行的临床试验中，GVAX与CRS-207、PD-1或urelumab（NCT03190265，NCT02451982）联合使用。成功治疗癌症的方法包括阻断免疫检查点以及癌症疫苗。当PD-1/CTLA-4被加入GVAX疫苗时，CD8+/Treg比率和IFN-+ TNF-+ CD8+肿瘤浸润细胞的数量显著增加。此外，还加入了一种基因改造，有可能将恶性细胞转变为类似于癌症干细胞（CSCs）的细胞，被纳入到全面癌症细胞疫苗中。已经证明，AGI-101H，一种模仿黑色素瘤干细胞的基因改造疫苗，在治疗黑色素瘤患者方面取得了成功。AGI-101H在两项针对黑色素瘤患者的II期研究中显示出了有希望的结果，导致生存率增加。 10.2.基于病毒的癌症疫苗 在临床前和临床试验中，免疫刺激腺病毒基础疫苗或TAAs已被用来展示显著激活抗肿瘤免疫。基于病毒载体表达HER2的VRP-HER2疫苗，在临床前和临床测试中显示出了有希望的结果。hHER2+乳腺癌小鼠模型在接受VRP-HER2疫苗后肿瘤生长得到改善。VRP-HER2在乳腺癌临床试验中也显示出了疗效。患者的HER2特异性免疫反应与他们的无进展间隔长度密切相关。探索了VRP-HER2和抗PD-1疗法的组合以增强总体疗效，展示了这一想法的可行性。此外，试验（NCT03632941）仍在进行中。在非肌层浸润性膀胱癌的治疗中，nadocagene firadenovec，一种非复制型腺病毒载体疫苗，显示出了有希望的结果。根据一项临床试验的结果，该药物在治疗BCG耐药非肌层浸润性膀胱癌方面的疗效，53.4%的患者在初次剂量的Nadofaragene firadenovec后实现了完全反应。此外，需要考虑BT-001，一种有可能表达抗CTLA4抗体和GM-CSF的溶瘤病毒疫苗。之前进行了一项临床试验（NCT04725331）以评估其疗效。在II期研究中，溶瘤病毒疫苗T-VEC被施用。患有IIIB-IVM1a期疾病的患者表现出32%/18%的目标/完全反应率，与普通人群中的28%/14%（112名参与者）相比。 10.3.基于肽的癌症疫苗 多肽IMU-131和白喉毒素通过HER2的细胞外域的B细胞表位连接。IMU-131已被证明在发表的I期临床研究中产生HER2特异性抗体和细胞反应。NeuVax，另一种针对HER2的肽疫苗，是已经进入III期临床试验的CVs之一。最近来自III期临床研究的发现表明，单独的NeuVax对乳腺癌没有明显影响。此外，两项II期临床试验（NCT02297898和NCT01570038）目前正在研究NeuVax和Trastuzumab联合治疗HER2阳性乳腺癌的效果。Boston Biomedical开发了一种名为DSP-788的新型癌症多肽疫苗。DSP-7888（WT1）中的肽激活了针对Wilm肿瘤基因1的辅助T细胞和CTLs。由于WT1在各种血液学和实体恶性肿瘤中表达，DSP-7888很可能会针对表达WT1的癌细胞。在复发或晚期恶性肿瘤患者中，DSP-7888显示出良好的耐受性和没有剂量限制效应。三项I/II期试验评估了DSP-7888作为单药治疗的安全性和有效性，但尚未报告临床结果（NCT02436252，NCT02750891，NCT02498665）。此外，DSP-7888正在一项II期临床研究中被评估用于急性白血病患者（NCT04747002），以及在一项III期临床试验中与Bevacizumab联合用于复发性胶质母细胞瘤患者（NCT03149003）。SurVaxM是另一种针对胶质母细胞瘤的有效肽疫苗，显著延长了这种状况下患者的生存时间。在II期临床试验中，SurVaxM正在被评估与Pembrolizumab联合治疗胶质母细胞瘤（NCT04013672）。 10.4.DNA疫苗 宫颈癌一直是DNA疫苗研究的重点。目前，两项III期临床试验（NCT03185013，NCT03721978）正在进行中，以评估针对HPV的DNA疫苗VGX-3100的安全性和有效性。INOVIO公司发布了VGX-3100针对宫颈癌前病变（NCT03185013）的首个III期研究的积极发现。VGX-3100，连同COVID-19疫苗“ZycoV-D”，有潜力成为第一个可供销售的DNA药物。另一种针对宫颈癌的DNA疫苗GX-188E结合了多个表位，专门针对并激活DCs。在GX-188E针对宫颈癌的II期试验中，52名患者中有67%在36周治疗后显示病变减少。GX-188E联合治疗的临床试验显示出光明的前景。 10.5.mRNA疫苗 TriMix mRNA在各种临床试验中显示出良好的免疫原性和耐受性。两项最近发表的II期临床试验表明，TriMix和TAA mRNA疫苗在III期或IV期黑色素瘤患者中诱导强烈的CD8+ T细胞反应，导致显著的肿瘤反应率。mRNA-2752是另一种免疫刺激mRNA疫苗的例子。mRNA-2752，由Moderna开发用于淋巴瘤治疗的脂质纳米颗粒（LNP），包含人类OX40L、IL-23和IL-36 mRNA。目前正在临床试验中进行评估（NCT03739931）。几种编码TAA的mRNA疫苗组合也在各种临床试验中用于转移性黑色素瘤的治疗。例如，mRNA疫苗BNT111包括四种TAAs（NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE）。BNT111展示了非突变常见肿瘤抗原靶标的广泛应用，并已成功治疗接受CPI的黑色素瘤患者。新抗原编码的mRNA疫苗是最广泛使用的个性化疫苗形式。定制的mRNA CVs在临床试验中被证明是安全且耐受性良好的。BioNTech和Moderna开发的个性化疫苗的临床试验显示出有希望的抗肿瘤益处。例如，Moderna开发了mRNA-4157，一种包含多达34个新抗原编码的个性化疫苗。在无法切除的实体瘤患者中，mRNA-4157单独或与Pembrolizumab联合使用，显示出强大的抗肿瘤效果。mRNA-4157的临床试验目前处于II期。利用mRNA定制平台，BioNTech创建了BNT122新抗原CV。BNT122编码多达20个患者特异性新抗原。在之前的Ia/Ib期试验中，BNT122被单独或与抗PD-L1抗体Atezolizumab联合用于实体瘤患者（NCT03289962）。实验研究表明，BNT122诱导了特定的临床反应和针对新抗原的T细胞反应。BNT122目前正在进行II期临床试验，用于治疗结直肠癌（CRC）（NCT04486378）。 11.结论 疫苗开发过程困难且复杂。与传统免疫接种相比，蛋白质和肽疫苗提供了许多好处。与由灭活毒素、死亡或减毒微生物以及重组成分组成的传统疫苗相比，这种方法安全且经济。由于它们的简单性和易于合成，蛋白质和肽疫苗可以以相对较低的成本生产。此外，肽疫苗不包含对宿主具有高反应原性的不必要的脂多糖、脂质和毒素成分。此外，肽疫苗可以结合来自多个抗原的表位，创建一个包含T细胞和B细胞的单一抗原配方。肽提供了许多好处，但单独给药时，它们通常不是很免疫原性的。为了解决这个问题，需要下一代佐剂。肽疫苗的未来递送技术可能集中在配方中佐剂的组合、提高抗原摄取的技术、促进先天免疫的创新佐剂，以及产生特定适应性免疫反应的佐剂。然而，人们对佐剂的安全性仍有重大关注。佐剂和粒子肽疫苗递送方法的使用存在安全问题，这些问题可以解决，可能允许肽疫苗技术推进到下一代亚单位疫苗。随着医学进入一个新时代，疾病管理策略正在基因和蛋白质数据层面上设计，这些数据构成了所有生物学的基础。在这种情况下，蛋白质治疗越来越重要。在仔细选择最佳抗原和抗原递送系统以及应用适当的联合治疗的情况下，治疗性癌症疫苗（CVs）的开发具有很大的希望。这种选择应该基于已经发生的免疫编辑知识和每个癌症患者特有的免疫抑制机制。肽疫苗，由于其已知的结构、低成本、易于生产和操纵，以及由于其合成性质而缺乏批次间差异，提供了一个有利的替代方案。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:信使RNA（mRNA）癌症疫苗的研发已经通过应用个性化的癌症抗原、mRNA的结构优化，以及开发替代的RNA基表达载体和高效的靶向递送载体，逐渐克服了众多挑战。目前，编码肿瘤相关抗原（TAAs）、肿瘤特异性抗原（TSAs）或免疫调节剂的各种癌症疫苗正在进行临床试验。在本文中，我们总结了mRNA的优化以及RNA基表达载体在癌症疫苗中的出现。我们首先回顾了最先进的靶向脂质纳米颗粒（LNPs）的进步和应用，然后介绍了mRNA癌症疫苗的主要分类和临床应用。总的来说，mRNA疫苗正在成为癌症免疫治疗的中心焦点，提供解决癌症治疗中多个挑战的潜力，无论是作为单一疗法还是与当前癌症治疗的组合使用。 1.介绍 肿瘤学领域最近通过引入基于mRNA的肿瘤疫苗取得了重大进展，标志着癌症免疫治疗的新时代。这些疫苗利用mRNA的多功能性来激发针对癌症的强烈免疫反应，通过编码肿瘤抗原来实现。这种方法促使免疫系统识别并消除表达这些抗原的癌细胞。mRNA疫苗的一个关键优势是其卓越的安全特性。与基于DNA的治疗方法不同，mRNA疫苗不会整合到宿主基因组中，从而消除了插入突变的风险。此外，mRNA同时编码多个抗原的能力提高了疫苗的效力，并为个性化疫苗的开发铺平了道路。mRNA表达的短暂性质确保了抗原刺激是暂时的，有效地降低了慢性炎症或自身免疫反应的可能性。此外，mRNA疫苗的快速设计和合成能力使人们能够迅速应对不断演变的肿瘤学挑战，包括根据个体患者的特定肿瘤特征定制疫苗，标志着向个性化癌症治疗迈出了重要一步。尽管mRNA癌症疫苗显示出相当的前景，但其更广泛的应用受到几个挑战的阻碍。这些挑战包括mRNA固有的不稳定性、需要高效和有针对性的递送系统以及肿瘤细胞可能的免疫耐受和逃避。这些挑战是当前研究工作的重点。因此，优化mRNA序列以实现最大的蛋白质表达、确保mRNA稳定性以及增强递送方法以实现最佳的细胞摄取和抗原呈递是正在进行研究的关键领域。针对2019冠状病毒病（COVID-19）的mRNA疫苗的成功开发通过全面优化mRNA结构克服了技术瓶颈。这一成就是通过对mRNA的每个方面进行重新设计和增强，从而提高其稳定性和表达效率而实现的。此外，多种mRNA递送系统的进步促进了mRNA分子的高效和靶向递送。mRNA癌症疫苗也从所有这些进展中受益，随着临床试验的进展，mRNA癌症疫苗正在成为抗击癌症的有希望的工具。本综述深入探讨了mRNA疫苗在肿瘤学领域的开发和应用。我们全面总结了mRNA癌症疫苗的开发历史，突出了抗原表达载体的结构优化以增强mRNA稳定性和翻译效率。此外，我们还讨论了其他基于RNA的抗原表达载体在癌症疫苗开发中的应用和未来前景。我们介绍了用于mRNA疫苗的LNP递送系统，强调了靶向策略。我们还阐明了各种类型的mRNA癌症疫苗及其目前的发展状态。预计mRNA疫苗将克服癌症治疗中的各种挑战，并成为癌症免疫治疗的主要方式。 2.mRNA癌症疫苗作为一种创新治疗方法的概念 随着两种COVID-19疫苗的应用，mRNA疫苗的流行度显著上升，标志着它们的发展和公众认可的一个关键时刻。然而，mRNA疫苗的研究和开发早在COVID-19大流行之前就已经开始了。这一旅程始于体外合成mRNA及其在体内表达的成功（表1）。在20世纪90年代初，人们开始努力开发用于预防肿瘤的mRNA疫苗。Martinon F.等人的一项里程碑式研究表明，使用包裹在脂质体中的mRNA编码流感病毒核蛋白（NP），在小鼠中诱导产生抗流感细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），展示了首次使用mRNA刺激体内抗原特异性免疫反应。Boczkowski等人通过将编码肿瘤抗原的mRNA转染到树突细胞中，进一步推动了这项研究，导致在体外和体内产生CTLs。这项研究在展示mRNA诱导抗肿瘤免疫反应的潜力方面具有关键意义。然而，早期的mRNA分子由于不稳定性和低表达效率而面临限制。未修饰的mRNA最初因其高免疫原性而闻名，通过toll样受体（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9）激活先天免疫反应。随后将修饰的核苷（如m5C、m6A、m5U、s2U和伪尿嘧啶）纳入mRNA配方中显著降低了它们的免疫原性，完全用伪尿嘧啶替代尿嘧啶提高了mRNA的稳定性和翻译效率。做出这些突破性发现的科学家Katalin Karikó博士和Drew Weissman博士因其关于核苷碱基修饰的发现，使COVID-19有效的mRNA疫苗的开发成为可能，被授予2023年诺贝尔生理学或医学奖。 表1. mRNA疫苗开发中的最新里程碑事件 对siRNA的脂质体传递的研究为LNP系统的进展提供了宝贵的见解。自那以后，LNPs已被验证为体内mRNA传递的有效载体，在各种预防性和治疗性疫苗策略中。COVID-19大流行凸显了mRNA技术的巨大潜力，为mRNA基础癌症疫苗的开发提供了宝贵的见解。此外，个性化新抗原疫苗的出现为患有各种恶性肿瘤的患者带来了实质性的临床益处。mRNA-4157与pembrolizumab联合进入黑色素瘤患者的III期临床试验，代表了个性化mRNA癌症疫苗领域的一个重大里程碑。当前对mRNA癌症疫苗的研究主要集中在消除mRNA的免疫原性和不稳定性、开发高效和有针对性的mRNA递送系统，以及推进个性化mRNA癌症疫苗的开发。本文的后续部分将对这些关键方面进行更全面的探讨。 3.用于抗原表达的RNA基载体 3.1.体外转录mRNA的设计策略 体外转录（IVT）mRNA的结构，反映真核mRNA，包括5'帽、编码蛋白质的开放阅读框（ORF）、5'和3'非翻译区（UTRs）以及3'聚（A）尾。每个mRNA片段的结构复杂性显著影响翻译效率、属性和免疫原性，使优化对mRNA技术的效力至关重要。对于IVT mRNA，5'帽结构（m7GpppN）对稳定性和翻译效率至关重要。形成帽的两种主要方法是天花病毒capping酶（VCE）介导的capping和共转录capping。VCE capping提供特异性，但成本更高，复杂性更大，而共转录capping更简单但效果较差。最近的进步包括使用VCE在5'端引入GTP类似物，创建修饰的mRNA。此外，将T7 RNA聚合酶与VCE整合简化了帽修饰mRNA合成，减少了对昂贵类似物的需求。持续的帽类似物优化显著提高了mRNA稳定性和转录，增强了其研究和应用潜力（表2）。此外，最近的一项研究表明，随着年龄的增长，mRNA帽中的cap1向cap2转变，减少了RIG-I受体激活并增加了mRNA稳定性。纳入cap2可能减少免疫原性并延长mRNA寿命。 表2. 不同代的 mRNA 帽类似物 mRNA的5'非翻译区（UTR），对基因表达调控至关重要，可以优化以提高翻译效率。例如，调整AUG密码子位置或纳入非结构化序列可以提高翻译效率。较短的5' UTR，大约17个核苷酸，也有助于减少变异性和翻译问题。与5' UTR类似，3' UTR也包含几个调控元件，在调节mRNA稳定性、亚细胞定位和翻译效率方面也起着关键作用。关键策略包括避免miRNA结合位点，消除腺嘌呤/尿嘧啶富集元件，并最小化其长度。尽管设计最佳UTRs存在挑战，但自然UTRs，如BNT162b2 COVID-19疫苗中使用的人类α-珠蛋白mRNA的5' UTR，通常因其证明的基因表达效率而更受青睐。然而，UTRs对不同类型的细胞影响不同，需要针对特定目标细胞进行定制优化。高通量筛选（HTS）技术和遗传算法的快速发展，有助于从细胞或病毒基因组中识别出潜在的优化序列，这些序列来自5' UTR和3' UTR的多样化库。 mRNA中编码序列（CDS）的优化对于有效的基因表达至关重要。常见的策略包括将宿主细胞中罕见的密码子替换为更普遍的同义密码子。2005年，Karikó等人通过纳入前文提到的修饰核苷，解决了mRNA高免疫原性和低蛋白表达的挑战。此外，GC含量和mRNA二级结构等因素显著影响mRNA翻译。然而，尽管这些优化策略有效，但在充分发挥mRNA序列潜力以达到最佳性能方面仍有局限性。在精准医学领域，开发mRNA设计算法是一个有前景的方法，以克服这些挑战。这些算法专注于识别具有稳定二级结构、增强翻译效率和优化密码子的mRNA序列，预计将大大促进基于mRNA的技术发展。我们在这里列出了一些，以及它们的特点和优缺点（表3）。 表3. mRNA设计算法。 聚腺苷酸尾，以长重复的聚腺苷酸序列为特征，在防御mRNA免受酶解乙酰化和降解方面发挥着关键作用，从而增强其稳定性和翻译效率。在聚腺苷酸序列之间加入短序列或硫代磷酸已被证明可以进一步提高稳定性。例如，BNT162b2的聚腺苷酸尾序列包括30A + 10GCAUAUGACU + 70A的结构。此外，最近的一项研究表明，含有20%胞嘧啶的聚腺苷酸尾可以保护mRNA免受去乙酰化酶活性的影响，并显著提高mRNA的翻译效率和半衰期。 mRNA结构的优化策略可以协同使用，以增强蛋白质生产。mRNA疫苗的进步强调了需要一个普遍标准化的mRNA设计和筛选协议。全面的筛选和精确定制的针对特定目标的序列有望在未来的mRNA设计中实现多样化的增强。这种方法使个性化适应特定细胞类型和独特的微环境，从而最大化每个mRNA转录本的蛋白质合成效率。 3.2.其他基于RNA的抗原表达载体 mRNA目前的不稳定性在其作为治疗剂的应用中提出了重大限制，促使最近的研究专注于探索替代的RNA载体。除了线性mRNA，其他几种类型的RNA载体迅速发展（图1）。其中一种有前景的载体是自我复制的RNA（saRNA），它来源于病毒并携带RNA聚合酶序列。这种saRNA表现出自我复制和翻译能力，使其能够以最小的量引发可检测的保护性免疫反应。这一特性表明saRNA可以有效地应用于癌症疫苗。几项探索这种潜力的临床前研究已经在进行中。例如，一项比较研究表明，针对人乳头瘤病毒（HPV）的saRNA与未修饰和修饰的非复制mRNA相比，显示出更强的抗肿瘤效果。然而，目前尚不清楚RNA聚合酶在体内是否会引发免疫反应。 图1. 在 mRNA 癌症疫苗中使用的不同类型的 RNA 表达载体 此外，saRNA的较大尺寸可能为现有递送系统带来新的挑战。解决这个问题的一个潜在策略是将编码RNA聚合酶的序列与目标蛋白的序列在空间上分离。 环状RNA（circRNA），由于其共价环状结构，由于其对RNase的抗性，提供了比mRNA更高的稳定性。这一特性为RNA疫苗提供了独特的优势。Qu等人开发的circRNA疫苗平台已显示出对多种COVID-19变体的保护效果，为基于circRNA的癌症疫苗的开发提供了宝贵的见解。研究表明，编码抗原或细胞因子的circRNA分子在抑制肿瘤方面比mRNA疫苗更有效。此外，Amaya等人强调了circRNA作为佐剂在增强抗肿瘤效果中的作用。然而，这些效果背后的确切机制尚未完全理解。在最近的一项研究中，Huang等人表明，肿瘤特异性circRNA circFAM53B通过表达特定肽段启动抗肿瘤免疫，强调了circRNA在免疫疗法中的潜力。 尽管取得了这些进展，circRNA合成仍然存在挑战，包括次优的环化效率和酶等试剂的高成本。尽管如此，circRNA作为一种有前景的基于RNA的治疗剂和疫苗类别，具有重要的未来潜力。 最近的一项进展涉及将短双链RNA（dsRNA）与单链mRNA杂交，形成树状、梳状结构，既作为抗原表达载体，又作为免疫佐剂。这种方法允许通过操纵dsRNA的长度、序列和数量，精确控制mRNA疫苗中的免疫刺激强度。这种梳状RNA设计适用于正在开发的多种mRNA疫苗，预计将显著提高其效力和安全性。 mRNA疗法的一个关键组成部分是递送系统。常见的递送系统包括精蛋白、脂质复合体（LPX）、脂多聚复合体（LPP）、病毒样颗粒（VLPs）、树突细胞和脂质纳米颗粒（LNPs）。由于LNP技术在当前应用中最先进的地位，本综述主要关注LNP技术的应用。 LNPs通常由阳离子或可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质组成。阳离子或可电离脂质在酸性条件下带正电荷，通过静电相互作用与带负电荷的mRNA结合。在内体中，这些脂质质子化，有助于mRNA逃逸以进行细胞质中的抗原表达。胆固醇提高LNP稳定性，帮助内吞作用和内体逃逸，而磷脂促进mRNA封装和稳定性，聚乙二醇化防止体内蛋白-LNP相互作用。 最初为递送siRNA而开发的LNP技术已经适应于mRNA封装和递送。虽然提供了高效的mRNA包装和生物相容性，但大多数LNPs在给药后在肝脏中积累，可能导致肝毒性。当前LNP-mRNA癌症疫苗的重点是针对选择性mRNA递送到特定器官或细胞的靶向策略。 LNP靶向的最新进展包括被动或主动方法到肿瘤。有效的抗肿瘤免疫取决于将编码抗原的mRNA递送到抗原呈递细胞（APCs），设计用于靶向免疫细胞的LNP预计将增强抗肿瘤反应并最小化全身副作用。作为被动靶向方法，靠近淋巴结的皮下注射在多项研究中证明是有效的。然而，皮下给药的LNPs也可以在肝脏和脾脏等器官中积累，可能影响疫苗的效力和安全性。 LNP脂质结构的修饰是另一种靶向策略，因为LNPs自然地在体内与血浆蛋白相互作用，形成“蛋白冠”，改变它们与细胞和器官的相互作用。临床前研究表明，这些修饰可以显著影响mRNA递送和LNP靶向。例如，脂质113-O12B特别靶向淋巴结，并被大量树突细胞和巨噬细胞摄取，诱导强大的免疫反应，并且当与抗PD1抗体结合时，实现了40%的完全肿瘤缓解率。然而，体内筛选有局限性，包括动物使用的伦理问题和体外筛选无法准确预测体内递送效率。 调节LNPs的内部和/或外部电荷对于靶向至关重要。为组织特异性mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑开发的SORT纳米颗粒与血清蛋白相互作用，这些血清蛋白结合到目标器官细胞上的受体，允许选择性器官靶向。然而，依赖于内源性患者蛋白进行靶向可能导致脱靶效应和个体间变异。 LNPs的被动靶向因其简单性和广泛适用性而受欢迎，但缺乏特异性。主动靶向虽然更具体和高效，但涉及更高的成本和潜在的免疫原性风险。因此，靶向LNPs在mRNA递送中代表了一个有前景的途径，未来的研究需要优化被动和主动策略，以提高LNP在mRNA和药物递送中的性能和安全性。 4.mRNA癌症疫苗的分类 4.1.编码病毒抗原的mRNA基础癌症疫苗 针对病毒抗原的mRNA基础癌症疫苗的开发是一个新兴领域。这些疫苗特别适用于与病毒相关的恶性肿瘤，如人乳头瘤病毒（HPV）、乙型肝炎（HBV）、Epstein-Barr（EBV）和HIV，它们与宫颈癌、肝癌和鼻咽癌等有关。传统的针对这些病毒的疫苗主要是预防性的。然而，基于mRNA的疫苗提供了一种治疗性方法，通过刺激身体的免疫系统识别和攻击表达这些病毒抗原的细胞。例如，最近的一项研究表明，一种信使RNA-HPV治疗性疫苗（mHTV）在小鼠和非人灵长类动物中显示出强大的免疫原性和抗肿瘤效果，使mHTV成为HPV有希望的治疗性和预防性疫苗。 mRNA疫苗平台的灵活性在个性化医学中特别有价值。根据个体患者的病毒抗原档案定制疫苗可以解决病毒癌基因不断演变带来的挑战，提供更有效的治疗方法。HIV以其快速变异和多样性而闻名，在疫苗开发中提出了重大挑战。基于mRNA的HIV疫苗在小鼠和灵长类动物中诱导了体液和细胞免疫反应，恒河猴在接受初免和加强疫苗后SHIV暴露减少了79%。最近针对HIV的mRNA疫苗eOD-GT8 60mer的I期临床试验显示良好的安全性，并在97%的参与者（35/36）中诱导了广泛的中和抗体（bnAbs），证明了mRNA疫苗在HIV预防中的潜力。此外，mRNA疫苗为慢性病毒感染如HBV提供了一种新方法。目前正在进行针对乙型肝炎病毒相关肝细胞癌（HCC）的治疗性mRNA疫苗（NCT05738447）的临床试验。 EBV与多种癌症有关，包括鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤和胃癌。EBV的复杂性质及其与宿主免疫系统的相互作用为疫苗开发带来了重大挑战。特别是，EBV在宿主细胞内的潜伏使免疫系统难以检测和根除。迄今为止，尚未有针对EBV感染的疫苗获批，针对EBV的mRNA疫苗的开发仍处于临床前阶段，尽管它们显示出了有希望的潜力。 尽管mRNA疫苗有潜力预防与癌症相关的病毒感染，但针对癌症相关病毒的疫苗主要仍处于临床前阶段。这是由于病毒突变、免疫逃逸和长期感染引起的免疫耐受等挑战。未来的研究需要集中克服这些障碍，开发更有效的针对这些病毒的mRNA疫苗。 4.2.编码肿瘤抗原的mRNA疫苗 4.2.1.肿瘤相关抗原（TAAs） TAAs是一类在肿瘤中比正常组织表达水平显著更高的抗原。这种过度表达使它们成为癌症疫苗的主要靶点。这些疫苗可以根据个体TAAs定制，与传统疗法如化疗或放疗相比，提供增强的效力和减少的副作用。这种个性化方法标志着肿瘤学的重大进步，呈现出更有针对性的、针对特定患者的治疗策略。一些已知的TAAs列在表4中。 表4. 不同癌症类型研究充分的肿瘤相关抗原(TAA)列表。 尽管TAAs有潜力，但针对TAAs的mRNA疫苗也有局限性。作为非突变自身抗原，TAAs可能导致临床免疫治疗中T细胞反应差和免疫耐受。此外，TAA在正常细胞中的表达可能导致附带损伤。这些疫苗在TAAs表达水平低或发生突变的癌症中也可能效果较差。克服这些局限性的策略包括将癌症抗原与免疫刺激性分子共递送，增强肿瘤微环境中的免疫激活，并将疫苗与传统治疗如化疗或放疗结合使用。BNT111针对四种常见的TAAs（NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶、TPTE），在超过90%的皮肤黑色素瘤患者中，BNT111诱导了对这些抗原的新的和增强的免疫反应（I期临床试验，NCT02410733）。正在进行的II期试验（BNT111-01，NCT04526899）将BNT111与Cemiplimab（由Regeneron Inc.制造的抗PD1抗体）结合使用，用于对抗PD-1疗法无反应的晚期不可切除III期或IV期黑色素瘤患者。 在编码TAAs的mRNA疫苗中，应优先考虑仅在肿瘤细胞中表达的TAAs，最小化在正常细胞中的表达。全面研究TAAs在肿瘤和正常组织中的表达模式对于确定更安全、更有效的靶点至关重要。 4.2.2.肿瘤特异性抗原（TSAs） 肿瘤特异性抗原（TSAs）是与正常细胞相比，在癌细胞中独特表达或显著过度表达的蛋白质或肽片段。这些抗原来源于各种致癌过程，包括突变、异常基因表达和翻译后修饰。新抗原通过主要组织相容性复合体（MHC）分子呈现在癌细胞表面。这些新抗原在正常组织中不存在，使它们成为免疫治疗策略的理想靶点。它们对个体肿瘤的独特性避免了与靶向共享肿瘤抗原时常伴随的耐受性和自身免疫问题。2014年，Tran等人成功地使用针对ERBB2IP特异性的CD4+细胞治疗了一名胆管癌患者，实现了完全肿瘤消退，展示了TSAs在诱导抗肿瘤反应中的潜力。他们还在10名胃肠道肿瘤患者中的9名中发现了基因突变，这表明肿瘤异质性的广泛存在，即使在同一肿瘤类型中，不同患者之间的TSAs也各不相同。开发个性化的mRNA疫苗涉及通过先进的测序和生物信息学方法识别和选择新抗原。下一代测序（NGS）、高通量筛选和机器学习算法通过识别个体肿瘤基因外显子中的突变和异常转录/翻译事件，促进了TSA预测。 个性化mRNA新抗原疫苗的临床潜力得到了其诱导强大和特异性免疫反应的能力的支持。早期临床试验已经显示出有希望的结果，有证据表明疫苗诱导的T细胞反应和潜在的临床益处（表5）。Ugur Sahin等人确定了13名黑色素瘤患者最有可能引发免疫反应的突变，并开发了编码多达10种新抗原的mRNA。临床试验表明，在13名患者中，有8名在接种疫苗后一年内没有复发，剩下的5名中有2名经历了肿瘤缩小，其中1名在接受PD-1抗体治疗时实现了完全缓解。mRNA-4157和BNT122是正在进行临床试验的两种典型的个性化mRNA疫苗。mRNA-4157编码34种针对个体患者肿瘤DNA中独特突变的抗原，正在进行黑色素瘤、非小细胞肺癌和其他实体瘤的临床试验。测试mRNA-4157与帕博利珠单抗（默克公司制造的抗PD1）联合用于头颈鳞状细胞癌患者的临床试验显示，总响应率为50%，疾病控制率为90%。两项IIb期临床试验结合mRNA-4157和帕博利珠单抗用于高危黑色素瘤患者，分别降低了44%和49%的复发或死亡风险，表明治疗时间更长时效益更明显。mRNA-4157和帕博利珠单抗的联合疗法已进入III期临床试验（NCT05933577），标志着它是第一个达到这一阶段的mRNA癌症疫苗。 表5. 已发布结果的代表性 mRNA 疫苗临床试验 个性化的mRNA疫苗为目前免疫疗法抵抗的癌症提供了有希望的治疗方法，如胰腺导管腺癌（PDAC），它对免疫检查点抑制剂（ICIs）表现出抵抗性。胰腺癌中新抗原的丰富使基于新抗原的mRNA疫苗成为一种可行的治疗策略。BNT122利用mRNA在PDAC患者中表达20种新抗原。当与化疗和免疫检查点疗法结合使用时，BNT122显示出在减缓PDAC患者复发方面的潜力，随后将进行一项随访的全球随机试验（IMCODE 003，BNT122）。 TSA mRNA疫苗代表了一种高度个性化的方法，为每个人的肿瘤抗原量身定制每种疫苗。结合免疫检查点抑制剂，这些疫苗为长期以来对医学科学具有挑战性的疾病治疗提供了新的途径。 4.3.编码免疫调节因子的mRNA 肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特征包括T细胞浸润有限或存在大量免疫抑制细胞，这有助于对抗目前的治疗方法。细胞因子对调节免疫细胞间的细胞间通信至关重要，能够有效地转导免疫信号，并协调针对目标抗原的强大免疫反应。通过mRNA传递细胞因子、共刺激配体或其他免疫调节因子可以有效重塑TME并增强肿瘤对各种免疫疗法的敏感性。 创新方法包括使用纳米粒子将编码肿瘤抑制因子p53的mRNA传递到肝癌细胞，并结合抗PD-1单克隆抗体。这一策略已显示出在调节TME和实现抗肿瘤效果方面的有效性。此外，以前的研究利用编码caTLR4和共刺激配体CD70和CD40L的mRNA来刺激APCs中的免疫反应。随后在T细胞功能上的增强已被证明可以有效对抗肿瘤，并抑制小鼠早期可切除乳腺癌的病变。mRNA-2752是一种编码三种免疫调节因子的mRNA疫苗，目前正在进行I期和II期临床试验，以评估其安全性和耐受性，无论是作为单独治疗还是与固定剂量的durvalumab（由AstraZeneca Inc.制造的抗PDL1抗体）联合用于晚期恶性肿瘤患者。 5.结论和未来展望 COVID-19疫苗的成功部署显著加快了mRNA技术在肿瘤学中的进展。利用创新的RNA基载体和靶向策略，正在开发新的mRNA疫苗平台以针对广泛的肿瘤抗原。值得注意的是，个性化mRNA疫苗在癌症治疗中取得了显著的突破。这些疫苗在临床试验中显示出增强的潜力，特别是与传统治疗，包括ICI和传统治疗方法结合使用时。 尽管发展全面，mRNA癌症疫苗仍面临多重挑战。进一步的研究对于完善这些疫苗的开发和应用至关重要。疫苗设计、递送技术和快速识别肿瘤新抗原的持续改进是关键，使mRNA疫苗成为个性化癌症治疗中的有希望的工具。