Vonicog Alfa (Baxalta)

3.1 引言1926 年，埃里克・冯・维勒布兰德（Erik von Willebrand）描述了芬兰沿海奥兰群岛居民中的一种出血性疾病，现在被称为血管性血友病（VWD）。它被认为是最常见的遗传性出血性疾病，其特征是血管性血友病因子（VWF）在数量和质量上存在缺陷。该疾病患病率高达 1.3%，表现为多种亚型，症状差异很大。VWD 主要分为三大类：1 型、2 型和 3 型。VWF 在止血过程中发挥着双重作用：介导血小板聚集并使其黏附到受伤部位血管壁的内皮下，此外，通过与凝血因子 VIII（FVIII）结合，进一步保护 FVIII 在血浆中不被蛋白水解降解，从而间接促进凝血过程。如今，VWD 的主要治疗方法是 VWF 替代疗法。本章旨在简要回顾人血浆 VWF 作为 VWD 患者治疗药物的历史、目前生产和纯化血浆源性 VWF 产品的最佳实践方法，并对工艺开发的未来方向进行评估。3.2 VWF 的结构、合成与功能3.2.1 基因结构VWD 是由 VWF 基因突变引起的，导致合成的蛋白质结构和（或）功能受损，或出现 VWF 蛋白缺乏的情况。VWF 基因位于 12 号染色体上，长度为 178 千碱基对，包含 52 个外显子。VWF 的信使核糖核酸（mRNA）约含 9 千碱基。22 号染色体上存在一个假基因，包含 VWF 基因的 23 - 34 号外显子，这些外显子对应于真实基因中编码 A1、A2 和 A3 结构域的区域。3.2.2 结构与合成VWF 由内皮细胞和巨核细胞合成，最初是一条由 2813 个氨基酸残基组成的 360kDa 单链多肽，由四种重复结构域组成，从氨基端到羧基端依次为 D1 - D2 - D0 - D3 - A1 - A2 - A3 - D4 - B1 - B2 - B3 - C1 - C2 - CK。这条 VWF 多肽前体随后会进行翻译后修饰，包括切割掉一个 22 个氨基酸残基的信号肽和一个 741 个氨基酸残基的大前肽（95kDa），该前肽对应于D1 - D2 结构域序列，也被称为血管性血友病抗原 II，此外还包括蛋白质糖基化、二聚化和多聚化过程。在内质网中去除信号肽后，羧基端 CK（半胱氨酸结）结构域内（尾对尾）的二硫键形成，导致前体 VWF 二聚体的产生。进一步的加工在高尔基体中进行，通过 D0 - D3 结构域内（头对头）的分子间半胱氨酸键形成，使前体 VWF 二聚体发生多聚化。在高尔基体中的蛋白水解加工将前肽（D1 - D2 结构域）与成熟的 VWF 多聚体分离。VWF 及其前肽可存储在魏尔 - 帕拉德小体（Weibel–Palade bodies）或血小板的 α 颗粒中。VWF 从储存颗粒中以多聚体形式释放，这些多聚体由不同数量的单体组成，富含超大分子形式，能够自发结合血小板糖蛋白 Ib - IX 复合物并使血小板聚集。这些具有促血栓形成作用的超大分子多聚体可被金属蛋白酶 ADAMTS - 13 迅速切割成较小且活性较低的形式。如果 ADAMTS - 13 缺乏，未切割的超大分子多聚体就会在血浆和内皮细胞中积累，导致血小板捕获、聚集，进而引发危及生命的血栓性血小板减少性紫癜（TTP）。VWF 的蛋白水解切割发生在 A2 结构域中 Tyr 842 和 Met 843 之间的肽键处，从 250kDa 的亚基产生两个表观分子量分别为 140kDa 和 176kDa 的片段。这些片段是琼脂糖凝胶电泳上 VWF 主要条带亚基（三重结构）上下出现 “卫星条带” 的原因。新生 VWF 蛋白的初始糖基化和反式高尔基体中的低 pH 环境是人类 VWF 成功聚合的两个重要机制。破坏这两种条件的遗传缺陷都可能导致 VWD 的表型。VWF 是一种大型黏附蛋白，在血液中以一系列多聚体形式循环，其大小从 500kDa 的单体到超过 20,000kDa 的最大蛋白不等。Titani 等人已经确定了其完整的氨基酸残基序列。VWF 单体是由两个 250kDa 亚基组成的同型二聚体。成熟的 VWF 亚基长度为 2050 个氨基酸残基，由 A、B、C、D 四种重复结构域组成，从氨基端到羧基端排列如下：D0 - D3 - A1 - A2 - A3 - D4 - B1 - B2 - B3 - C1 - C2 - C3 - CK，该结构包含与 FVIII、血小板糖蛋白（GPIb）、糖胺聚糖、肝素和胶原蛋白结合的位点。这种多结构域结构对于 VWF 的功能至关重要。半胱氨酸残基在 VWF 中含量最为丰富，在 2050 个总残基中占 169 个，对 VWF 的结构至关重要。所有半胱氨酸残基都参与分子间二硫键的形成以产生多聚体，或参与维持蛋白质亚基折叠所必需的链内二硫键的形成。A3 结构域参与 VWF 与受损血管周围结缔组织中纤维状胶原蛋白的结合。A3 结构域的结构表明，其与胶原蛋白的黏附主要是通过 A3 上的负电荷残基与胶原蛋白上的正电荷残基之间的相互作用实现的。凝血 FVIII 的结合位点位于 D0 / D3 VWF 结构域的氨基端 272 个残基内。VWF A1 结构域包含与非纤维状 V1 型胶原蛋白、肝素和血小板 GPIb 的结合位点。GPIba 与 A1 结构域的结合位点位于氨基酸残基序列 449 至 728 之间。重复的 C 结构域有助于血小板的黏附。A 结构域似乎与补体因子 B 的一段 225 个氨基酸残基的片段同源。VWF 亚基含有 22 条碳水化合物侧链，其中 10 条 O - 连接到丝氨酸或苏氨酸残基上，12 条 N - 连接到天冬酰胺残基上。聚糖约占 VWF 蛋白质量的 20%。3.2.3 VWF 在止血中的作用VWF 在血浆中的正常浓度为 7 - 10mg/mL，它在止血过程中有两个重要功能：介导血小板黏附到受损血管的内皮下，促进血小板血栓形成；通过结合并稳定因子 VIII，促进血液凝固。VWF 与血小板黏附：VWF 存在于血浆、血小板、内皮细胞以及血管壁的内皮下基质中。在生理高剪切率下，VWF 通过与受损血管暴露的结构结合，并桥接相邻血小板，启动血小板的黏附和聚集。对于血小板黏附而言，多聚体结构至关重要，只有最大的多聚体才具有活性。由于每个亚基都包含与胶原蛋白、血小板糖蛋白 GPIb 和 GPIIb / IIIa 的结合位点，VWF 多聚体上重复结合位点与内皮下的黏附蛋白以及血小板表面特定受体的多重相互作用，导致血小板不可逆地黏附到暴露的内皮下。剪切力对 VWF 的构象状态起着关键作用，在高剪切应力区域，VWF 促进血小板黏附和血栓形成的能力与其结构 - 功能密切相关。从魏尔 - 帕拉德小体或血小板 α 颗粒分泌的超大 VWF 多聚体能够在无需胶原蛋白、剪切力或化学刺激的情况下自发与血小板聚集。在健康个体中，这些多聚体会被 ADAMTS - 13 迅速切割成较小的形式，不会在循环中积累。缺乏 ADAMTS - 13 或该酶功能受损会导致危及生命的 TTP 疾病。（图表位置：此处可插入描述 VWF 与血小板黏附过程的示意图，帮助读者理解相关机制）VWF 与凝血 FVIII 的相互作用：VWF / FVIII 复合物的形成涉及两种蛋白质中的特定结构域。FVIII 与 VWF 结合形成紧密的非共价 VWF / FVIII 复合物，这对于 FVIII 在循环中的存活至关重要。凝血酶对 FVIII 轻链和重链的切割导致 FVIII 激活并与 VWF 解离。VWF 不能保护 FVIII 免受凝血酶的激活，但能保护它免受活化因子 X 和活化蛋白 C 的灭活。缺乏 VWF 的患者表现出继发性 FVIII 缺乏，这表明 VWF 对 FVIII 在循环中的存活至关重要。3.3 VWF 蛋白的表征已经开发出标准的实验室检测方法来表征 VWF 蛋白。通过在大孔琼脂糖凝胶上进行十二烷基硫酸钠（SDS）电泳来评估结构蛋白的完整性，以揭示 VWF 多聚体的分布模式和 VWF 多聚体单元的 “三重” 结构模式。然后使用抗 VWF 抗体、免疫染色以及密度测定或放射自显影方法来显示多聚体蛋白结构。通过优化电泳方法的实验条件并使用高分辨率琼脂糖凝胶，可以分析 VWF 多聚体的分布和 “五重 ” 结构模式，从而检测出降解片段。VWF 的活性可以通过几种检测方法进行评估，这些方法反映了该蛋白的生理功能。胶原蛋白结合试验（VWF:CB）用于测量 VWF 与胶原蛋白结合的能力，该试验使用包被胶原蛋白的酶联免疫吸附测定板进行。结合到胶原蛋白上的 VWF 随后使用与抗人 VWF 多克隆抗体偶联的酶（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）进行定量，然后在显色底物上进行酶反应。在瑞斯托菌素（ristocetin）存在的情况下测量 VWF 凝集血小板的能力（VWF:RCo 活性）。检测 VWF 结合 FVIII 的能力（VWF:FVIIIB）可以通过首先将 VWF 结合到固定化的抗 VWF 抗体上，解离任何结合的 FVIII，然后将回收的 VWF 与外源 FVIII 一起孵育，使用偶联的抗 FVIII 抗体对结合的 FVIII 进行定量，并与对照血浆的 VWF 结合能力进行比较。这些实验室检测方法，包括 VWF 抗原的定量方法和 FVIII:C 检测，用于研究和诊断 VWD，并评估纯化的 VWF 制剂。3.4 VWF 缺乏症VWD 是最常见的遗传性出血性疾病，由 VWF 的浓度、结构或功能缺陷引起。其患病率估计在万分之一到 1.3% 之间。随着实验室和分子技术的进步、VWF 基因的发现以及对分子病理结果的理解，人们对 VWD 的类型和亚型有了更深入的认识和分类。VWD 分为三种类型，如表 3.1 所示。3.4.1 VWF 缺乏症的管理VWD 患者容易出现瘀伤、鼻出血、口腔出血，女性患者还会出现月经过多的症状。拔牙后的黏膜出血是最常见的术后出血类型。3 型 VWD 患者有严重的出血倾向，黏膜出血非常频繁，可能会危及生命。此外，由于严重的 FVIII 相关缺陷，还可能发生血肿和关节出血。VWD 的治疗目标是通过纠正原发性止血或凝血缺陷来恢复正常止血。1977 年，去氨加压素（DDAVP），一种合成的血管加压素类似物，成为轻度或中度 1 型 VWD 且 VWF 细胞储存正常患者的首选治疗方法。DDAVP 可诱导 VWF 从细胞内释放，增加血浆 FVIII 和 VWF 的水平。然而，DDAVP 对 3 型 VWD 以及其他严重的 1 型和 2 型 VWD 患者无效。对于这些对 DDAVP 无反应或禁用该药物的患者，需要进行替代治疗。在 20 世纪 50 年代之前，输血和后来的血浆输注是唯一可用的替代治疗方法。然而，输血或血浆输注疗法存在一些缺点，包括输注体积大、蛋白质过载以及传播病毒或其他血源性病原体的风险。VWD 治疗的主要进展总结如图 3.1 所示。（图 3.1 “VWF、血管性血友病及其治疗的时间线”，清晰呈现相关治疗发展历程 ）3.5 VWF 浓缩物的生产20 世纪 50 年代，人类血浆的科恩（Cohn）分级分离工艺的应用，导致了一种富含 FVIII / VWF 的粗血浆组分（组分 1 - 0）的开发，该组分已用于 VWD 患者，并显示出能够纠正出血时间。一个重大突破是使用冷沉淀治疗对 DDAVP 无反应的 VWD 患者，冷沉淀在 20 世纪 80 年代中期之前一直是主要的替代治疗方法。冷沉淀是通过血浆的冷冻和解冻产生的，主要含有 VWF、FVIII、纤维蛋白原和纤连蛋白。重新溶解的冷沉淀减少了输注体积和蛋白质负荷，但仍然存在病毒污染的风险。制造商不断进行的改进稳步提高了 VWD 治疗产品的质量和安全性。引入了纯化步骤以去除不需要的蛋白质，如纤维蛋白原和纤连蛋白。到 20 世纪 80 年代初，VWD 患者的治疗产品在纯度和病毒安全性方面受益于 FVIII 产品的改进。首批含有 VWF 的纯化 FVIII 浓缩物是通过使用聚乙二醇、甘氨酸和肝素等试剂进行选择性沉淀，然后进行酸性 pH 沉淀步骤生产出来的。一种含有 VWF 的冻干 FVIII 浓缩物 Haemate P 于 1981 年在德国首次获得许可，用于治疗 A 型血友病。此后，它被广泛用于 VWD 出血的治疗和预防。该纯化过程包括几个沉淀步骤，并通过在 60°C 下加热 10 小时进行病毒灭活。产品在白蛋白存在的情况下配制，浓度为 8 - 16g/L。在 20 世纪 80 年代后期，基于尺寸排阻、离子交换和对特定配体的亲和作用的新色谱纯化步骤被引入制造过程，从而开发出具有更高比活性的浓缩物。以下将更详细地介绍纯化方法。3.5.1 尺寸排阻色谱法凝胶过滤或尺寸排阻色谱法是纯化 VWF 的有效方法，这得益于该蛋白质的大尺寸，并且该方法最适合作为抛光步骤。Thorell 和 Blomback 在实验室规模使用这项技术，从低纯度组分开始，得到 VWF 的比活性为 104IU/mg 蛋白质。1988 年，法国 Biotransfusion 公司首次在工业规模上使用这项技术生产一种名为 FVIII - HP - SD 的高纯度 FVIII / VWF 复合物。3.5.2 离子交换色谱法离子交换色谱法根据蛋白质各自的电荷进行分离，自 20 世纪 70 年代后期开始使用，有多种合适的分离介质可供选择。利用这项技术，法国在 20 世纪 80年代后期开发出一种专门用于治疗 VWD 的新型高纯度 VWF 浓缩物。开发目标是为 VWD 患者仅提供缺失的蛋白质 VWF。自 1989 年以来，这种浓缩物已在法国的临床实践中常规使用。该 VWF 浓缩物由冷沉淀通过两个连续的弱阴离子交换色谱步骤制备而成，使用的是 Toyopearl DEAE 650（东曹生物科学公司），然后通过明胶琼脂糖亲和色谱法去除纤连蛋白。该产品的特点是 FVIII 含量极低（小于 10%）、比活性高，且多聚体分布与血浆相似。制造过程包括一个溶剂 / 去污剂（S/D）处理步骤用于病毒灭活。通过引入 35nm 孔径过滤器过滤和最终在 80°C 下干热 72 小时的两个互补的去除和灭活步骤，进一步提高了该产品的病毒安全性。纯化的 VWF 在人白蛋白存在的情况下配制，最终浓度为 10g/L，以保护 VWF 免受热变性。这种新一代产品目前以 Wilfactin（也用作 VWF 浓缩物的国际标准）和 Willfact 的名称进行销售。3.5.3 离子交换和凝胶过滤的结合由 Octapharma 公司生产的 VWF / FVIII 浓缩物 Wilate 于 2005 年在德国首次获得许可。其纯化过程主要基于离子交换色谱法，然后进行凝胶过滤步骤。产品的病毒安全性通过溶剂 / 去污剂处理和冻干产品在 100°C 下加热 2 小时的终端干热处理（PermaHeat）来确保。Wilate 的 VWF 多聚体模式与正常血浆接近，但极高分子量多聚体的比例相对较低，VWF:RCo / FVIII:C 的比值约为 1.0。3.5.4 亲和色谱法1987 年，人们描述了 FVIII / VWF 与肝素之间的相互作用。这一特性已被用于在固定化肝素上纯化 FVIII / VWF。1994 年，Grifols 公司推出了一种新的 VWF / FVIII（Alphanate / Fandhi）浓缩物，并已在美国和一些欧洲国家获得许可。Alphanate 由冷沉淀通过分步溶解和在肝素 - 琼脂糖上进一步纯化制备而成。生产过程包括一个溶剂 / 去污剂步骤，最终的冻干产品在 80°C 下进行 72 小时的干热处理，并添加白蛋白作为稳定剂。其 VWF:RCo /FVIII:C 的比值约为 0.53，添加白蛋白前的比活性约为 40IU/mg。除上述产品外，Mazurier 在 2006 年对其他主要用于治疗血管性血友病的血浆源性浓缩物进行了综述，总结于表 3.2。3.6 正在开发的新策略目前正在开发新的纯化技术，以提高 VWF 的纯度和产量。这些技术与第二章中所述的用于改进血浆源性 FVIII 产品的技术类似。百特（Baxter）公司正在开发一种不含血浆和白蛋白的重组 VWF，有望用于治疗 VWD。重组 VWF（rVWF）与重组 FVIII 在中国仓鼠卵巢细胞（CHO 细胞）中共同表达，目前该产品正在进行临床试验。3.7 结论对于特定凝血障碍的有效替代疗法，应旨在仅输注有缺陷的蛋白质，同时避免输入可能导致蛋白质过载和其他潜在副作用的不必要蛋白质。自 1989 年以来，法国一直遵循这一方法，因为市售的高纯度、低 FVIII 含量的 VWF 浓缩物，使医生能够根据患者的具体需求调整 VWF 和 FVIII 的剂量。事实证明，这是治疗 VWD 的一种高度安全有效的方法，它减少了 FVIII 过载，避免了 FVIII水平持续过高，而在某些情况下，FVIII 水平过高与术后静脉血栓栓塞有关。一旦重组 VWF 上市，其使用将延续这一理念。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。