Foretinib

肝细胞癌是最常见的实体瘤之一。很大一部分肝细胞癌患者被诊断为晚期，只能接受系统治疗。我们见证了系统治疗从单一药物靶向治疗(sorafenib和lenvatinib)到检查点抑制剂+靶向治疗(atezolizumab+bevacizumab)的演变。尽管取得了显著的进展，但只有一小部分患者可以获得持久的临床益处，因此仍然存在巨大的治疗机会和挑战。在过去的几年里，新兴的系统疗法，包括新的分子靶向单一疗法(例如，donafenib)、新的肿瘤免疫单一疗法(例如，durvalumab)和新的联合疗法(例如，durvalumab+tremelimumab)，在临床试验中显示了优异的效果。此外，许多新的治疗方法也被提出和开发，如序贯联合靶向治疗和下一代细胞疗法，这些方法也有可能改善晚期肝癌患者的治疗效果。本文我们就晚期肝癌治疗的演变过程以及未来方向做一个简要介绍。当前的治疗格局在过去，化疗药物是晚期肝癌系统治疗的主要药物，疗效有限，不良反应显著。2007年FDA批准了多靶点酪氨酸激酶抑制剂(TKI) sorafenib，第一个被证明对晚期肝癌患者有效的靶向药物，十多年来一直是晚期肝癌治疗的标准药物，其极大地改变了肝癌患者的治疗模式（图1）。然而其治疗效果远不令人满意。与安慰剂相比，sorafenib仅提高了2.8个月的生存优势。图1. 治疗晚期肝癌的系统疗法Atezolizumab (抗PDL1单抗)与bevacizumab (抗VEGF单抗)的联合治疗是肝癌治疗领域的一个新的里程碑。在IMbrave150试验中，与sorafenib相比，在不能切除的肝癌患者中，这种组合提供了29.8%的ORR和5.8个月的生存益处。与sorafenib相比，在过去十年中，这是第一个在统计上显著提高总体存活率的疗法。此外，这也是首次将免疫检查点抑制剂(ICB)用于肝癌的一线疗法。新组合提供的优异治疗效果使其成为用于晚期肝癌患者的最佳治疗选择，除了那些有禁忌症的患者，如自身免疫性疾病、肝移植病史或高危出血事件，这些占晚期肝癌的20%。一线治疗的范式转变突显了重新考虑二线治疗前景的必要性。目前批准的二线疗法，包括regorafenib、cabozantinib、ramucirumab、pembrolizumab以及nivolumab和ipilimumab的组合，仅在以前接受过sorafenib治疗的患者中评估有效，但在atezolizumab–bevacizumab联合治疗失败后，目前还没有一种药物被证明有效。Nivolumab(抗PD1单抗)和ipilimumab(抗CTLA4单抗)是一线治疗失败后第一个被批准用于晚期肝癌患者的双重免疫治疗联合方案。CheckMate试验的一个子队列结果所示，Nivolumab和ipilimumab组合在以前使用sorafenib治疗的患者中产生了优异的约30%的ORR。与ICB单一疗法相比，Nivolumab和ipilimumab的联合使用似乎与更高的应答率有关。然而，这种优异的治疗反应是否能转化为总体存活率的改善仍有待确定。对于接受一线ICB治疗的患者，其他ICB作为二线治疗的有效性仍不清楚。新兴的靶向单一疗法靶向治疗旨在抑制对肿瘤生长和维持至关重要的分子通路，是目前晚期肝癌的主要治疗方法。新出现的针对肝细胞癌的靶向治疗可分为两类：作用机制与以前类似的新的多激酶抑制剂，以及具有更特定靶点的小分子药物。Donafenib是一种类似于sorafenib的多激酶抑制剂。本质上，它是sorafenib的一种改良形式，具有改善的药代动力学曲线(包括延长的半衰期和减少的清除量)。在中国进行的涉及668名晚期肝癌患者的ZGDH3 III期试验中，Donafenib与单用sorafenib相比，总体存活率有统计学意义的改善。在随机对照试验中，除了Donafenib，到目前为止还没有其他一线单一疗法显示出明显优于sorafenib。Apatinib是另一种多激酶抑制剂，对VEGFR2具有高选择性。在中国进行的AHELP III期试验中，包括400名经过系统化疗或靶向治疗的中晚期肝癌患者。结果显示，与安慰剂相比，Apatinib在这些患者的总存活率方面有显著优势(表1)。表1. III期临床试验阳性结果的晚期肝癌治疗药物除多激酶抑制剂外，其他靶点更明确的药物，包括选择性MET和FGFR4抑制剂、TGF-β抑制剂和PI3K-AKT-mTOR抑制剂，在临床试验中也显示出治疗肝癌的潜力（表2）。表2. 单一靶向疗法的肝癌治疗药物临床进展MET是一种肝细胞生长因子(HGF)的酪氨酸激酶受体，在~50%的肝癌中表达异常。HGF-MET通路的激活与肝癌的发生发展密切相关。在肝癌中测试了六种MET抑制剂，包括四种非选择性抑制剂(tivantinib, cabozantinib, foretinib 和 golvatinib)和两种选择性抑制剂(tepotinib 和capmatinib)。对于高表达MET的肝癌，选择性抑制剂更有可能在减少靶外毒性的同时有效地抑制MET活性，这使得它们成为当前临床研究的重点。成纤维细胞生长因子家族包括至少5个FGFR(FGFR1至FGFR5)和22个同源配体。在这些受体中，FGFR4是在人类肝脏中主要表达的受体，因此被认为是治疗肝癌的潜在靶点。其内源性配体FGF19与FGFR4结合后可激活下游通路促进细胞增殖。Fisogatinib是一种选择性的FGFR4抑制剂。在I期研究中，98名晚期肝癌患者被分为FGF19+组和FGF19-组，并接受Fisogatinib治疗。有趣的是，FGF19+组和FGF19-组的ORR分别为17%和0%。这项研究表明，FGF19可以作为使用FGFR4抑制剂的潜在预测生物标志物。TGF-β通路在肿瘤的发生发展过程中具有双重作用。虽然它最初可以抑制增殖，但在癌变的后期可以作为肿瘤促进剂发挥作用，促进细胞侵袭和转移。在一项涉及149名患者的研究中，研究了TGF-βR1抑制剂galunisertib作为肝癌二线治疗的初步疗效。在galunisertib治疗后，血清甲胎蛋白水平高和低的患者的中位总生存期分别为7.3月和16.8个月。这为甲胎蛋白用作TGF-β抑制的生物标志物提供了机制基础。PI3K-AKT-mTOR通路是肝癌发生发展过程中的另一个重要信号通路。据报道，该通路在~50%的肝癌细胞中异常激活。到目前为止，几种mTOR抑制剂，如everolimus 和temsirolimus，已经被提出作为治疗肝癌的单一疗法，但在临床试验中失败了。一些新的mTOR抑制剂在PI3K-AKT-mTOR通路具有更广泛的抑制作用，包括双重mTORC1-mTORC2抑制剂和PI3K-mTOR抑制剂(例如，onatasertib)，目前正处于晚期肝癌的早期临床试验。新兴的肿瘤免疫单一疗法肝脏含有许多免疫细胞，如Kupffer细胞(驻肝巨噬细胞)、树突状细胞和淋巴细胞。为了应对外来分子，肝脏通常通过表达和分泌抑制分子来维持抗炎环境，包括IDO1、PDL1和TGF-β。同样，肝细胞癌也呈现炎症但抑制的免疫环境，使肝细胞癌患者成为免疫治疗的理想对象。在临床试验中，许多肿瘤免疫药物被评估为治疗肝癌的单一疗法(表3)。这些药物可分为两类：针对已成功靶点(如PD1/PDL1或CTLA4)的新型ICB药物和针对其他免疫调节分子的新型药物。表3. 单一肿瘤免疫疗法的肝癌治疗药物临床进展针对PD1/PDL1或CTLA4的抑制剂仍然是肝癌免疫治疗临床试验的主流。除了nivolumab和pembrolizumab之外，其他被评估为单一疗法治疗肝癌的药物还包括两种PD1抑制剂(camrelizumab和tislelizumab)和三种PDL1抑制剂(avelumab、duvalumab和atezolizumab)。尽管与nivolumab和pembrolizumab针对相同的靶点，但camrelizumab和tislelizumab有一些不同的特征。例如，与nivolumab和pembrolizumab不同，camrelizumab有不同的结合表位，tislelizumab具有避免ADCP的独特能力。I/II期研究的结果表明，在二线试验中，它们的临床疗效与nivolumab和pembrolizumab大致相似。与sorafenib相比，Tislelizumab目前正在接受RATIONALE-301 III期临床试验的评估，作为一线疗法，试验结果将很快公布(NCT03412773)。Durvalumab是一种抗PDL1单抗，已在II期研究中被证明在二线设置的晚期肝癌中具有临床活性和耐受性。它在一线环境中的有效性已经在HIMALAYA III期试验中进行了评估，与sorafenib的相比，总体存活率方面达到了非劣效的目标。而且接受Durvalumab治疗的患者的3级或4级治疗相关不良事件(TRAE)也比sorafenib治疗的患者少(12.9%比36.9%)。总而言之，这些试验的结果表明，单一免疫疗法可能也是肝癌患者的一种有前途的一线治疗选择，特别是对于那些需要更安全方案的患者。除了PD1-PDL1或CTLA4抑制外，针对其他免疫抑制分子的抑制剂(如TIM3、LAG3、TIGIT和IDO1以及针对共刺激分子的激动剂(如CD40、OX40也已取得显著进展。其中一些药物已经进入了临床开发，一些初步结果已经公布。新兴的联合疗法广泛的临床证据表明，单一疗法与耐药性的产生有关，只能提供有限的临床益处。相比之下，联合疗法可以克服耐药性，更有可能在临床上有效。目前，肝癌的联合治疗选择很少，这表明该领域存在相当大的机会和挑战(图2)。图2. 肝癌治疗的联合疗法分子靶向药物的组合分子靶向药物的组合可以通过靶向细胞内的多个关键成分来实现协同效应。尽管这种联合疗法在概念上优于单一疗法，但到目前为止还没有取得实质性的临床成功。一些新的组合，如lenvatinib加EGFR抑制剂gefitinib，在早期临床试验中取得了有希望的结果。通过阻断EGFR-PAK2-ERK5信号的反馈激活，Lenvatinib和Gefitinib的组合导致了大约三分之一的EGFR+肝癌患者有治疗反应。因此，使用EGFR过表达作为生物标记物可能使更多的晚期肝细胞癌患者从这种治疗中受益。目前，临床研究中用于治疗肝细胞癌的分子靶向药物组合数量有限。与基于ICB的联合治疗相比，靶向联合治疗往往具有更高的毒性和更低的持久有效可能性。尽管如此，联合靶向治疗仍然在肝癌的治疗中具有不可替代的作用，因为有某些禁忌症的患者，如自身免疫性疾病和器官移植病史，不适合ICB治疗。肿瘤免疫药物的组合免疫肿瘤学药物的作用机制差异很大，为开发免疫治疗组合提供了机会。目前，PD1-PDL1抑制剂+CTLA4抑制剂是目前研究最多的肝细胞癌免疫肿瘤学组合。抑制PD1-PDL1可以增强效应T细胞的抗肿瘤活性，而抑制CTLA4可以增加肿瘤内CD4+和CD8+T细胞的丰度。如果肿瘤组织中不存在效应性T细胞，则仅抑制PD1-PDL1不能诱导有效的抗肿瘤反应，因此，可能需要同时抑制CTLA4以确保抗肿瘤活性。根据这一理念，在包括782名晚期肝癌患者在内的III期HIMALAYA试验中，duvalumab和temlimumab的组合作为一线治疗显示出显著的疗效，显著提高了总生存率。许多肿瘤免疫药物可以针对其他免疫调节分子，如TIM3、LAG3、TIGIT、IDO1和CD40。它们通过对PD1-PDL1或CTLA4抑制的不同机制调节免疫反应，因此，可以产生协同和互补的作用来治疗肿瘤。2022年3月，LAG3抑制剂relatlimab和nivolumab的组合被FDA批准用于治疗黑色素瘤，这是肿瘤免疫药物发展的一个重要里程碑。这一成功揭示了超越PD1-PDL1或CTLA4抑制的组合的巨大潜力。几种这样的新组合，包括nivolumab加relatlimab(NCT04567615)，目前进行临床研究中用于治疗肝癌。ICB与VEGF–VEGFR抗体的联合应用血管生成是癌症的一个标志，已被广泛证明与癌症的进展和转移有关。由血管内皮生长因子驱动的异常肿瘤血管生成可导致免疫抑制因子TME的形成。使用抗VEGFA单抗(例如bevacizumab)或抗VEGFR单抗(例如Ramucirumab)选择性地抑制这一过程可以通过多种机制重塑微环境，包括促进树突状细胞的成熟，改变M1：M2巨噬细胞比值，减少Treg的聚集，增加细胞毒性T细胞的丰度，从而减弱其免疫抑制作用。除了批准的atezolizumab–bevacizumab组合外，还有其他具有类似作用机制的组合用于治疗晚期肝癌。在III期Orient-32试验中，在一线设置的571名晚期肝癌患者中评估了sintilimab(抗PD1)和bevacizumab生物类似物IBI305的联合疗效。与单独接受sorafenib的患者相比，接受这种联合方案的患者在总体存活率和无进展存活率方面都有统计上的显著益处。ICB和多激酶抑制剂的联合应用目前，四种多激酶抑制剂被批准用于治疗肝癌，所有这些药物都可以通过抑制VEGFRs发挥抗血管生成作用。因此，它们的免疫调节功能类似于抗血管内皮生长因子抗体。由于多激酶抑制剂可以靶向其他分子，如PDGFR、FGFRs、KIT和MET，它们对肿瘤免疫也有额外的作用，不依赖于血管内皮生长因子抑制。此外，与抗血管生成药物相比，多激酶抑制剂被认为具有相对更强的肿瘤杀伤和肿瘤坏死活性。因此，它们可能会诱导释放更多的肿瘤抗原，从而增强肿瘤的免疫原性。所有四种多激酶抑制剂都已就其与ICB的协同潜力进行了评估，其中研究最多的是lenvatinib。在Ib期Keynote-524研究中，104例未接受系统治疗的晚期肝癌患者中，联合应用lenvatinib和pembrolizumab的ORR为36.0%，是Keynote-224研究中单用pembrolizumab治疗的两倍。在这些优异效果的基础上，比较这种组合与sorafenib在未接受系统治疗的患者中的III期LEAP-002试验已经启动。未得到满足的需求和未来方向寻找用于患者选择的生物标志物目前的系统治疗在晚期肝癌患者中表现出高度异质性的疗效，因此，识别用于预测和患者选择的生物标记物已成为迫切需要。对sorafenib的反应，PI3K-AKT-mTOR通路的突变状态被确定为基因组生物标志物；具有相关突变的患者往往具有较低的ORR和较短的OS和PFS。此外， ACSL4的表达和VEGFA扩增也被证明对sorafenib的应答有预测能力。对于Lenvatinib，几个血清生物标志物，包括VEGF、 ANG2、FGF21以及FGFR4，在临床研究中显示出潜在的预测能力。此外，对二线TKIs regorafenib和cabozantinib的研究也产生了一些有前景的生物标志物，包括几个血清microRNAs(如MIR30A和MIR122)和血清AFP。对于ICB治疗，候选生物标记物可分为四类：免疫组织化学标志物生物标记物、基因组生物标记物、转录生物标记物和其他。先前研究的肝细胞癌免疫组织化学标志物包括PD1、PDL1、CD3、CD4、CD8、CD68、CD163和FOXP3。总的来说，PD1、PDL1、CD3和CD8被发现具有一定的预测能力，而其他的与ICB相关的生存益处无关。肿瘤突变负荷(TMB)是研究最多的基因组生物标志物，在多种肿瘤(如黑色素瘤、非小细胞肺癌和膀胱癌)中显示出预测能力。然而，一项研究声称，TMB仅在CD8+T细胞丰度与新抗原呈正相关的肿瘤中有效，而肝癌不是其中之一。Wnt-β-Catenin途径的突变是另一个潜在的基因组生物标志物。携带CTNNB1突变的肝癌通常与免疫排斥表型有关，其特征是低免疫渗透和降低细胞溶解活性。这类肿瘤更有可能对ICB治疗无效。此外，涉及转录生物标记物和其他生物标记物的研究，如循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA，也揭示了一些潜在的预测肝癌免疫治疗反应的候选生物标记物。靶向“无法下药”的驱动因素目前，肝细胞癌中的主要突变驱动因素，包括端粒酶逆转录酶启动子(TERTp)、CTNNB1(编码β-catenin)和TP53，仍然是“无法下药”的。TERTp基因是肝细胞癌中最常见的突变基因，在约60%的肝细胞癌中发现，并已被报道与渐进性肝癌的发生密切相关。TERT编码端粒酶的一个催化蛋白亚基，在端粒维持中起着至关重要的作用。没有端粒维持机制的细胞逐渐遭受端粒磨损，最终触发复制性衰老或凋亡。端粒的维持使细胞能够克服复制性死亡，从而为其治疗开发提供了可能。在一项肝癌的临床前研究中，在人肝癌细胞系和异种移植小鼠模型中，用反义寡核苷酸沉默TERT的表达导致了肿瘤细胞的增殖停滞和死亡，这为抑制TERT在肝癌中的治疗潜力提供了初步证据。近50%的肝癌由于CTNNB1、AXIN1或APC基因突变而表现出Wnt-β-Catenin信号通路的激活。针对Wnt-β-Catenin信号的上游分子(例如AXIN和LRP)的药物，如salinomycin和NVP-TNKS656，已经开发出来，并在包括肝癌在内的多种肿瘤类型的临床前模型中进行了测试，并显示出疗效。然而，当Wnt-β-Catenin信号通路在下游被激活时，这些药物可能无效。另一个在肝细胞癌中经常改变的基因是TP53，该基因编码肿瘤抑制基因P53。与TERT启动子或CTNNB1的突变不同，TP53的突变通常会导致基因功能丧失。因此，靶向TP53突变的肝癌是具有挑战性的， 2021年发表的一项研究表明，通过重新激活突变的p53蛋白来治疗TP53突变的肿瘤是可能的。在小鼠NSCLC异种移植模型中，三氧化二砷(ATO)治疗能够显著抑制TP53突变肿瘤的生长，这意味着ATO可能成为治疗TP53突变肿瘤患者的一种潜在疗法。除了重新激活P53外，还有其他治疗策略来对抗这种突变，例如将野生型P53重新引入癌细胞，靶向其调控因子，例如MDM2。探索基于靶向治疗的新策略在过去的几年里，出现了许多针对肝癌治疗的创新的靶向治疗策略。一个典型的例子是序贯联合治疗，其中治疗药物是按顺序给药的，第一个药物可以诱导癌细胞的弱点，使癌细胞更容易受到第二个药物的影响(图3)。与同时给药的传统组合相比，顺序组合可以导致较低的组合毒性，但仍保持协同抗肿瘤效果。这一概念的一个成功应用是“one-two punch”疗法，已证明在治疗肝癌方面是可行的。图3. 序贯联合治疗示意图代偿信号通路的激活是药物耐药的重要原因。例如，KRAS突变的肺癌和结肠癌细胞可能通过MYC依赖的转录上调ERBB3而对MEK抑制剂产生耐药性；抑制ERBB3能够逆转MEK抑制剂的耐药性并提高疗效。在BRAF突变的结肠癌细胞中，EGFR的反馈激活导致了对BRAF抑制剂的耐药性。因此，BRAF和EGFR抑制剂的组合代表了一种治疗BRAF突变结肠癌的新方法。在肝细胞癌中，旁路通路激活也被报道诱导对Lenvatinib的耐药。Lenvatinib抑制FGFR可能导致EGFR-PAK2-ERK5通路的反馈激活，这反过来又导致对Lenvatinib治疗的耐药性。这一发现为联合应用Lenvatinib和EGFR抑制剂治疗高EGFR肝细胞癌患者提供了机制基础。另一种避免通路重新激活的潜在策略是针对同一信号通路的多个组件。一项研究表明，作用于EGFR信号通路的三到四种药物的组合，在EGFR突变的异种移植模型中都能够产生持久的治疗反应，证明了这一策略的可行性和有效性。拓展现有的免疫治疗方法除了ICI之外的其他免疫疗法对肝细胞癌的治疗潜力也受到广泛研究。过继细胞疗法(ACT)是目前最具代表性的非ICB免疫疗法，它能够通过输注患者自身或健康捐赠者的免疫细胞来增强抗肿瘤免疫反应。以前使用ACT治疗肝癌的尝试包括输注淋巴因子激活的杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞。目前， CAR-T细胞治疗和TCR- T细胞治疗已成为肝癌ACT疗法的热点。多种CAR T细胞疗法(靶向GPC3、CD147或NKG2DL)和TCRT细胞疗法(靶向AFP或乙肝病毒抗原)正在进行临床试验，用于治疗肝癌，并取得了一些优异的初步结果。治疗性疫苗的使用是一种吸引人的策略，旨在诱导或增强针对肿瘤抗原的特异性免疫反应。这些疫苗包括多肽疫苗、树突状细胞疫苗和溶瘤病毒。基于明确定义的肿瘤相关抗原，如AFP、GPC3和多药耐药相关蛋白3(MRP3)，已被开发成针对肝癌的多肽疫苗。基于树突状细胞的疫苗可以通过使用特定的抗原(包括多肽、蛋白质、核酸和裂解物)在体外诱导树突状细胞的激活和成熟来产生。溶瘤病毒是一种工程病毒，可以选择性地溶解肿瘤细胞。溶瘤病毒介导的溶瘤不仅导致肿瘤消退，而且通过释放可溶的肿瘤抗原来增强抗肿瘤免疫反应。尽管治疗性疫苗并不是新的，其中一些已经作为单一治疗在肝癌中试验了几年，但它们与新的ICB疗法的结合已经产生了早期的有希望的结果，因此值得进一步研究。BsAb代表了一种新兴的免疫疗法，它具有介导传统单特异性抗体无法实现的独特生物效应的能力。BsAbs可作为T细胞重定向分子(如EpCAM-CD3 BsAbs)、肿瘤靶向免疫调节剂(如肿瘤抗-CD40 BsAbs)或双重免疫调节剂(如PD1-CTLA4 BsAbs)，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。BsAb有很多优势。例如，在基于表达人PD1和CTLA4的新型转基因小鼠模型的临床前测试中，与针对PD1和CTLA4的传统单抗组合相比，PD1-CTLA4 BsAb MEDI5752表现出更高的有效性，同时限制了毒性。为肝癌开发的BsAbs，如GPC3-CD3和PD1-CTLA4 BsAbs，在临床前和临床研究中也已显示出优异的早期结果。小编小结肝癌的治疗手段正在以惊人的速度前进。标准疗法已经从单一的药物TKIs发展到ICB和靶向药物治疗的组合，从而显著改善了患者的生存益处。目前，一些治疗晚期肝癌的新疗法正在进行临床研究，这些疗法可分为三大类，包括分子靶向单一疗法、肿瘤免疫单一疗法和联合疗法。其中一些药物，如donafenib, apatinib, durvalumab以及durvalumab 和tremelimumab的组合，在III期临床试验中取得了优异的结果，为晚期肝癌患者提供了更多潜在的治疗选择。此外，临床前研究还提出了一些新的治疗方法，包括靶向治疗(例如，序贯联合治疗)和免疫治疗(例如，下一代ACT)，这有可能进一步改善未来肝癌的治疗效果。参考文献Evolving therapeutic landscape of advanced hepatocellular carcinoma.Immunotherapies for hepatocellular carcinoma.Molecular therapies and precision medicine for hepatocellular carcinoma.

导读近年来，靶向药物在抗癌药物的发展中立下了汗马功劳，在现有的抗癌靶向药物中，许多针对癌症的靶向疗法是抑制驱动肿瘤生长的蛋白质活性的小分子或单克隆抗体，然而，长期使用之后，肿瘤细胞通常会“聪明地”通过靶蛋白的过表达或者突变来获得对这些药物的抗性，从而使其能够摆脱药物的抑制作用。在最新的研究中，研究者将目标瞄准了细胞内的“清洁工”，也就是我们体内的泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS），并希望通过该系统的参与来应对靶蛋白过表达或者突变带来的药物抗性。图1 PROTACs双功能分子的发展时间轴2022年8月2日，清华大学饶燏教授团队在Chemical Society Reviews期刊上发表了题为“Chemistries of bifunctional PROTAC degraders”的重磅文章。值得注意的是2015年起，饶燏教授课题组开始致力于探究细胞内靶向蛋白质降解技术（PROTACs），以及将PROTAC技术转化为临床相关的抗肿瘤活性分子，取得了一系列重要研究进展。本综述通过分析PROTACs开发的众多代表性示例，强调了这一蓬勃发展领域的重要进展以及传统的经验主义开发PROTACs的局限性。综述作者从药物设计的角度总结和分析了PROTACs结构优化的一般原则和策略，并提出了促进PROTACs发展蓝图。https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/CS/D2CS00220E01E3连接酶配体的设计与优化1.1 第一代多肽的PROTAC的设计2008 年，Rodriguez课题组使用VHL识别的HIF1α的七个氨基酸序列(ALAPYIP) 代替IkBa磷酸肽，合成了新一代靶向ERa(4)和AR(5)的PROTAC。这些PROTAC可以诱导特异性降解低微摩尔范围内的ERa或AR，无需显微注射。与磷酸肽PROTACs相比，发现能招募VHL E3泛素连接酶与短肽的PROTACs化合物，使该技术的发展取得了突破。然而，由于其肽特性，肽PROTACs的细胞通透性较差，这限制了PROTAC技术用于开发实用疗法。图2 基于多肽的PROTAC的设计与优化1.2小分子PROTACs的设计从2001年到2011年，虽然PROTACs的概念提出了十年，但这项技术发展缓慢。基于小分子的E3泛素连接酶配体的发现导致PROTACs 技术的快速发展。目前，已鉴定出 600 多种人类基因组编码的 E3 泛素连接酶，但缺乏高亲和力和特异性的 E3 泛素蛋白连接酶小分子配体限制了 PROTAC 技术的更广泛应用。迄今为止，几种类型的 E3 配体已用于 PROTAC 的设计和开发。小鼠双微体基因2蛋白 (MDM2)、细胞凋亡蛋白抑制剂 (cIAP)、希佩尔林道蛋白(VHL) 和 CRBN (cereblon) 已成功用于小分子 PROTAC，特别是基于CRBN的 ARV-110 和 ARV-471 已用于临床研究。图3 E3连接酶配体发现时间表 红点表示适当的linker连接位点综述作者还根据降解目标对使用的E3连接酶进行了分析。通过分析，作者发现不同蛋白质对E3连接酶的耐受性存在一定差异。有些蛋白质对 E3 连接酶的耐受性更高，因此可以使用多种 E3 连接酶（CRBN、VHL、MDM2、cIAP 等）来设计 PROTAC，例如 BRD4、BTK、HDAC 等。耐受 E3 连接酶，只有特定的 E3 连接酶（CRBN 或 VHL）可用于设计 PROTAC，如 Aurora A、FKBP12 等。造成这些差异的原因主要有以下几点：首先，可能是不同类型的E3连接酶在不同细胞中的表达水平不同，导致降解活性的效率不同。其次，可能是不同的靶蛋白具有一定的E3连接酶选择性，导致E3连接酶诱导的蛋白质泛素化和降解效率不同。最后，可能是基于不同E3连接酶的PROTACs的数量和种类不够，导致基于某一种E3连接酶设计的降解剂不能诱导相关蛋白的降解。基于以上分析结果，我们发现在后续的PROTACs设计中，我们可以总结和借鉴以下经验：首先，最好选择 CRBN 或 VHL 连接酶作为 E3 配体，因为这两种 E3 连接酶的作用域最高。其次，当基于已知 E3 连接酶配体设计的 PROTAC 不能诱导新靶蛋白降解时，可以使用新的 E3 连接酶配体来设计 PROTAC，但这种策略需要大量的实验验证。图4 目前常用的 E3 连接酶类型、它们的比例以及可被基于 VHL 和 CRBN 的 PROTAC 降解的代表性靶标02PROTACs的连接基团设计策略PROTACs的整体降解效率不仅取决于靶蛋白配体的亲和力和E3配体的类型，还取决于通过合适的连接基团连接的POI配体和E3配体的有效组合。大量数据表明，连接基团长度和组成对于三元复合物的形成、降解活性和靶标选择性很重要。包括长度、组成、刚性和附着位点等。但是，连接基团的设计和优化还没有普遍适用的设计策略。通常，使用短且结构简单的烷基链或 PEG链作为起点，通过迭代试错调整连接基团的相关特性。2.1选择合适的E3连接酶配体结合位点Maniaci课题组基于VHL与VH298结合的共晶结构，设计了用于VHL自诱导降解的Homo-PROTACs。可以很容易地观察到VH298有两个溶剂暴露位点，这两个位点上的连接子并不影响VH298与VHL的结合方式。因此，他们合成了三种不同的附着点组合的PROTACs，发现最高效的PROTAC CM11与VH032的左乙酰基对称连接。然而，从其他位置连接的PROTACs，如化合物37和38，显示出无效降解，这突出了适当的附着位点对降解活性的重要性。Crews报告的另一个例子是通过改变连接子长度和连接位点实现p38的异型选择性降解他们开发了基于foretinib和VHL配体的p38a-和p38dselective PROTACs。SJFa在较低的纳米摩尔浓度下能有效降解p38a，但p38b、p38g和p38d的降解活性较差。SJFd有效降解p38d，而p38a、p38b和p38g未降解。图5基于VHL的PROTAC的合理设计2.2 选择合适的靶蛋白配体结合位点PROTACs选择的用于降解不同靶蛋白的小分子配体种类繁多。因此，连接这些小分子配体的连接位点也有多种策略。选择接头进入位点的原则是从配体结合口袋边缘或溶剂区进入接头，而不改变或微弱改变小分子与其受体的结合亲和力。与 POI 结合的众多小分子的晶体结构数据为我们选择合适的接头附着位点提供了理论基础。通常，从配体的活性原子中提取接头，例如羧基、氨基等。 图6基于POI配体的PROTACs的合理设计2.3 PROTACs分子自组装目前对于新的 PROTACs 连接基团没有普遍接受的设计规则，可以确保为任何给定的目标蛋白质生成有效的降解剂，并且通常需要一定程度的经验试验和错误。PROTACs 连接基团最常见的基序结构是 PEG 和不同长度的烷基链。由于其高效和快速，点击化学通常用于 PROTACs 分子的合成。因此，三唑结构的接头也是连接 POI 和 E3 连接酶配体的一种选择。药物化学家尝试仅使用刚性接头，包括炔烃和饱和杂环，如哌嗪和哌啶，并在PROTACs的开发中取得了成功。表1已发表PROTACs中常见的连接基团根据 POI 配体和 E3 配体的结构特性，预组装的接头基序可以在任一端通过正交条件或去保护序列有效地官能化。首先，可以将POI配体和接头基序组装，得到带有接头基序的中间体，可以直接进行下一步或带有保护基。然后修饰的中间体与 E3 泛素连接酶配体连接形成PROTAC 分子。反过来，我们也可以将连接体与 E3 配体连接，然后与 POI 配体连接以获得 PROTAC 分子。另一种常见的策略是将 POI 配体和 E3 配体分别连接到一个接头基序上，然后通过简单的化学反应（如酰胺缩合、点击化学等）将这两部分组装起来形成PROTAC分子。图7 PROTAC组装和代表性PROTAC概述03典型PROTAC的设计3.1亚型选择性PROTAC的设计基于选择性抑制剂的亚型选择性PROTAC的设计。图8亚型选择性PROTACs的合理设计基于通用型抑制剂的亚型选择性PROTAC设计。图9亚型选择性PROTACs的合理设计3.2设计降解蛋白质复合物的PROTACs近年来，已经开发了一系列新的EED 靶向和 EZH2 靶向 PROTAC，以消除 PRC2 复合物的功能。2019 年，Bloeche课题组通过将有效的 EED 抑制剂 MAK683 与 VHL 配体结合，开发了一种 EED 降解剂 86与 EED 结合并促进与 VHL 形成三元复合物，并诱导EED 快速有效的降解。图10靶向EED的PROTAC分子可降解PRC2蛋白复合物3.3‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍不同抑制剂以降解相同POI的PROTAC2016 年，基于 I 型 BCR-ABL 抑制剂（达沙替尼和波舒替尼），Crews 课题组首先尝试开发用于降解 BCR-ABL 的 BCR-ABL PROTAC。为了设计 BCRABL PROTAC，作者将波舒替尼和达沙替尼与VHL 和 CRBN E3 泛素连接酶配体结合。优化的连接基团可以诱导 BCR-ABL 靶标和 VHL E3 连接酶之间的良好相互作用，从而导致 BCR-ABL 的降解。图11代表性 BCR-ABL 抑制剂 (A) 和PROTAC (B) 的化学结构3.4设计降解不可成药靶标的PROTACs基于SI-109的结构,王少萌课题组使用来那度胺和泊马度胺作为E3连接酶配体与SI-109连接，得到23种不同的STAT3降解剂，它们除了E3连接酶配体外，在连接基团和靶蛋白配体上也有所不同。连接基团包括不同长度的炔链和烷基链。通过STAT3降解活性测试，发现降解剂SD-36对STAT3的降解活性最好，在MOLM-16细胞和SU-DHL-1细胞中STAT3的降解活性DC50分别为60 nM和28 nM。图12 针对 STAT3 的合理设计和代表性 PROTACs04设计突变蛋白PROTACs4.1降解野生型和突变型蛋白质的PROTAC设计2018 年，饶燏课题组首次开发了一系列新的PROTACs 用于耐依鲁替尼的 BTK 降解。依鲁替尼和泊马度胺连接的降解剂 P13I 表现出最强的降解活性，可以有效降解野生型（DC50 =9.2 nM）和依鲁替尼-Mino 细胞中的抗 C481S BTK (DC50 = 30 nM)。进一步优化 P13I，将 P13I 的 E3 连接酶配体替换为来那度胺，得到新的降解剂 L18I。它不仅可以有效降解野生型 BTK，还可以有效降解多种临床相关的 BTK 突变体（C481S/T/ A/G/W) 在浓度低于 50 nM 的 HeLa 细胞中。降解剂L18I在体外能有效抑制表达C481S-BTK的DLBCL和MCL细胞的增殖，而依鲁替尼对增殖的抑制效果较差。图13 BTK PROTACs的合理设计4.2选择性降解突变蛋白的PROTAC设计2020年，王佳亮研究团队报道了由 E3 连接酶配体沙利度胺和 BRAF 激酶抑制剂vemurafenib 产生的 BRAF 降解剂。最有效的降解剂选择性诱导 BRAFV600E 的降解，而不是野生型 BRAF，尽管它们对两种蛋白质的亲和力相似。图14 BRAFV600E选择性降解PROTAC的设计05不可逆共价和可逆共价PROTAC的设计5.1不可逆共价PROTACs的设计与POI配体共价结合图15 靶向KRASG12C的不可逆共价PROTAC与 E3 连接酶共价结合图16 不可逆共价 BTK PROTAC5.2可逆共价PROTACs的设计依鲁替尼与 BTK 具有高共价和非共价结合活性。它是非共价类似物，不能形成共价复合物，对 BTK也有很高的亲和力。基于依鲁替尼结构开发的可逆共价抑制剂也实现了良好的结合亲和力。迄今为止，已开发出多种非共价BTK降解剂，证明了PROTAC技术实现BTK高效降解的可行性。基于这些结果，London 课题组报道了非共价的139、基于丙烯酰胺的 140 和基于氰基丙烯酰胺的141 PROTAC，它们都表现出明显的 BTK降解，DC50 小于 10 nM，Dmax 大于 85%。图17 可逆共价PROTAC的设计06双机制降解器的设计一系列针对 RTK 激酶降解的 PROTAC 已被报道以分子胶做为例子。2018 年，Winter 课题组基于混杂激酶抑制剂舒尼替尼合成了一系列基于 CRBN 的 PROTAC。出乎意料的是，这两个系列均未能诱导其共有靶标的降解，而单个分子（如 MI-389）在急性白血病细胞系中显示出明显的抗增殖作用。一些数据表明 MI-389 的细胞毒性取决于 CRBN E3 连接酶复合物，并由靶蛋白降解而不是残余激酶抑制活性触发。图18同时具有PROTAC和分子胶作用机制（GSPT1）化合物的开发优化过程07改善PROTACs药代动力学特性的结构设计与 AR 一样，ER 也与疾病密切相关，尤其是乳腺癌。雌激素调节细胞生长、增殖、发育和分化等多种生理过程。ER是核受体（NR）蛋白超家族的重要成员，是一种配体激活的转录因子，包括α和β亚型。ERα 在正常乳腺上皮中的表达率较低，但在乳腺肿瘤中高表达。ERα基因敲除小鼠实验表明，ERα在乳腺发育中具有促进乳腺肿瘤形成的作用。因此，使用PROTAC开发ERα降解剂的技术已成为治疗乳腺癌的新方法。图19 Erα PROTACs的设计和优化08基于晶体结构和计算化学的PROTACs设计8.1以三元配合物的晶体结构为指导的理性PROTACs设计基于受体-配体晶体结构的药物设计一直是小分子药物发现和优化的重要理论基础。与小分子不同，PROTACs诱导靶蛋白配体和E3连接酶配体之间形成三元复合物，这种三元复合物的相互作用可以通过连接基团来调节。图20基于三元配合物晶体结构的选择性BRD4 PROTACs的合理设计8.2计算化学指导下的理性PROTACs设计虽然PROTACs是研究和医疗的优越生物技术，但PROTACs复杂的机制在开发过程中带来了更多的困难。“POI-PROTAC-E3连接酶”三元复合物模型是PROTACs开发的最重要指导方案之一。三元复合物结构为POI、PROTACs分子和E3连接酶之间提供了促进结构活性的合理作用模式关系分析，大大加快了分子优化过程，清楚地说明了降解选择性的来源。由于复合体庞大、灵活且不稳定，构建三元复合体需要严格的条件，极其耗时和困难。真正的共晶结构远远落后于要求。因此，开发用于三元复数建模的计算方法迫在眉睫。人工智能可以进一步利用现有高质量但分散的实验结果，推动理解蛋白-蛋白相互作用的内在机制，促进PROTAC的发展。图21 基于计算化学的PROTACs的开发过程09条件控制PROTAC的设计尽管已经报道了许多 PROTAC，但这些PROTACs可以快速高效地诱导蛋白质降解，在生物学研究和疾病治疗中都发挥着重要作用，其缺点主要表现在人工可控性差、时空选择性差等，导致无法人工控制释放药物和存在明显的副作用。目前策略主要分为三类。第一类是光控PROTACs，这是目前最成功的方法。第二类是利用叶笼策略来控制和实现蛋白质降解。第三类是在其他条件下人工释放PROTACs，如缺氧激活PROTACs。最近的一篇综述详细介绍了PROTACs的组成和不同的产生策略。图22不同条件控制的PROTAC分子总结和展望自2001年第一个概念验证PROTAC被报道以来，PROTACs技术进入了实际应用阶段。PROTACs分子设计的最大挑战是潜在降解剂候选物的发现过程仍然是经验性的。这个过程在很大程度上依赖于合成和药物化学方面的大量努力，这既费时又昂贵。PROTACs化合物设计的一般流程大致如下，通过筛选确定合适的目标蛋白配体；分析配体与靶蛋白的结合方式；在不影响配体与靶蛋白结合的情况下选择合适的连接基团结合位点；然后与E3连接酶配体结合形成PROTACs化合物。与传统的小分子抑制剂不同，PROTACs的优化很难让人概括系统的构效关系。对于一个新的靶点，通常研究人员只能尝试寻找活性PROTACs化合物，这增加了研究的工作量和难度。开发具有预测功能的新型计算工具将促进PROTAC发展。总之，PROTAC为跨越当前生物研究中药物发现和工具开发的障碍提供了一种新的有前途且强大的方法。另一方面，需要更多的努力来深入了解PROTACs在临床上的疗效和安全性。更多适合开发PROTAC的目标结合剂和E3连接酶仍有待探索。更重要的是，在现有的研究基础上，逐步总结规律，以利于PROTAC分子的分子设计和优化。参考文献：Han XR, Chen L, Wei Y, Yu W, Chen Y, Zhang C, Jiao B, Shi T, Sun L, Zhang C, Xu Y, Lee MR, Luo Y, Plewe MB, Wang J. Discovery of Selective Small Molecule Degraders of BRAF-V600E. J Med Chem. 2020 Apr 23;63(8):4069-4080. doi: 10.1021/acs.jmedchem.9b02083. Epub 2020 Apr 10. PMID: 32223235.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。