Erlotinib Hydrochloride

文章链接DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-23-1632； 本研究由上海交通大学卢莹教授与大连医科大学附属第二医院血液科共同完成。 一句话说出结论：奥希替尼通过与白血病干/祖细胞表面的CD34蛋白发生共价结合，抑制了Src家族激酶（SFK）及下游STAT3信号通路的活化，从而选择性地诱导CD34高表达的髓系白血病细胞凋亡，为治疗这类难治性白血病提供了新的治疗策略和生物标志物。 作为生命科学领域的专家，我将为您深入剖析这篇发表在《Cancer Research》上的重磅文献。 1. 科学问题如何提出，有什么意义？ 科学问题的提出： 该研究的科学问题源于一系列临床观察和基础研究中的矛盾与未解之谜： 历史观察与临床失败： 早在2007-2008年，就有个案报道第一代EGFR抑制剂（如厄洛替尼）在治疗肺癌的同时，意外地使合并的急性髓系白血病（AML）患者达到完全缓解。体外研究也证实了其对AML细胞的促分化作用。然而，后续的多项临床试验结果却大多是阴性的，效果不佳。 作用机制的悖论： AML细胞本身几乎不表达EGFR，这意味着EGFR抑制剂的抗白血病作用是一种“脱靶效应”（off-target effect）。虽然有研究提示可能与SYK、JAK1等激酶有关，但其精确的脱靶靶点和作用机制仍不明确。 临床转化的关键缺失： 临床试验失败的核心原因在于，研究者们不清楚到底哪一个亚型的AML患者可能从EGFR抑制剂治疗中获益，即缺乏一个有效的生物标志物（biomarker）来筛选优势人群。 新药的未知潜力： 奥希替尼（Osimertinib）是第三代、不可逆的共价EGFR抑制剂，其作用模式与前代可逆抑制剂不同。它是否对AML有效，以及其潜在的脱靶机制是什么，完全是未知的。 研究意义： 解决临床难题： AML是一种致死率高、易复发的恶性血液肿瘤，尤其是化疗耐药和复发的患者，治疗选择极为有限。其复发的根源在于化疗无法清除的白血病干/祖细胞（LSC），而这些细胞通常高表达CD34。如果能找到一种有效清除CD34+ LSC的药物，将对改善AML患者预后、降低复发率具有革命性的意义。 药物重定位（Drug Repurposing）： 奥希替尼是治疗EGFR突变非小细胞肺癌的重磅药物。发现其在白血病中的新用途，是一种典型的“老药新用”，可以大大缩短新药研发周期和成本，快速为白血病患者提供新的治疗选择。 揭示新生物学机制： 本研究旨在阐明奥希替尼在AML中的EGFR非依赖性作用机制。这不仅能解释长久以来关于EGFR抑制剂抗白血病效应的谜团，更重要的是，可能发现新的药物靶点（如本文中的CD34）和信号通路，加深对白血病干细胞生存机制的理解。 2. 逻辑上如何证明科学问题，研究内容是什么？ 研究者采用了一个“从现象到机制，再到临床验证”的严谨逻辑链来证明其核心科学问题。 研究内容与逻辑步骤： 现象观察：奥希替尼选择性杀伤CD34+白血病细胞。 首先验证奥希替尼对来自AML和CML（慢性髓系白血病）患者的原代CD34+细胞具有强效的、剂量依赖性的凋亡诱导作用。 通过对比，证明第一代抑制剂厄洛替尼和另一种共价抑制剂伊布替尼效果远不如奥希替尼，暗示了其独特的作用机制。 关键对比实验：发现奥希替尼对CD34-的白血病细胞几乎没有杀伤效果。在含有CD34+和CD34-细胞的混合样本中，奥希替尼优先清除了CD34+群体。这是整个研究的逻辑起点。 机制探索（一）：寻找直接靶点——CD34。 排除EGFR： 首先确认AML细胞不表达EGFR，排除了其经典靶点。 提出假设： 基于奥希替尼对CD34+细胞的选择性杀伤，大胆假设CD34本身可能就是药物的直接靶点。 直接结合验证： 设计并合成了带生物素（Biotin）标签的奥希替尼探针（biotin-osimertinib）。 通过Pull-down实验，证明该探针可以直接“钓”到纯化的重组CD34蛋白以及细胞裂解液中的内源性CD34蛋白，且这种结合可以被过量的、无标签的奥希替尼竞争掉，证明了结合的特异性。 确定共价结合位点： 利用质谱（MS）技术，分析与奥希替尼孵育后的CD34蛋白，精确鉴定出药物通过迈克尔加成反应，共价结合在了CD34胞外域的半胱氨酸199位（C199）和177位（C177）。 功能性验证： 利用CRISPR-Cas9技术敲除细胞中的CD34，发现细胞对奥希替尼的敏感性显著降低。再将野生型CD34（CD34-WT）或C199/C177突变型CD34（CD34-mut）回补到敲除细胞中，发现只有回补WT-CD34的细胞才恢复了对药物的敏感性。这在遗传学上完美证明了奥希替尼是通过结合CD34的C199/C177位点来发挥作用的。 机制探索（二）：连接“胞外结合”与“胞内凋亡”的信号通路。 寻找信号变化： 药物结合在胞外，如何引起胞内凋亡？研究者利用磷酸化蛋白质组学技术，分析用药前后细胞内酪氨酸磷酸化水平的变化。 发现关键信号分子： 发现奥希替尼处理后，CD34蛋白胞内域的酪氨酸329位（Y329）磷酸化水平显著下降，同时Src家族激酶（SFK，包括Src, Lyn等）的活性被抑制。 建立连接： 通过免疫共沉淀（Co-IP）实验，证明CD34与Src激酶存在物理相互作用。 奥希替尼处理会破坏CD34与Src的结合，且这种破坏依赖于CD34的C199位点。 体外激酶实验证明，Src和Lyn可以直接磷酸化CD34的Y329位点。 确定下游通路： 发现SFK的下游关键效应分子STAT3的磷酸化水平也随之被抑制。使用SFK抑制剂或STAT3抑制剂与奥希替尼联用，表现出协同杀伤效果。 完整通路描绘： 奥希替尼结合CD34胞外域 -> 改变CD34构象 -> 破坏其与胞内Src激酶的结合 -> 导致CD34-Y329磷酸化水平下降，同时SFK/STAT3信号通路被抑制 -> 细胞凋亡。 临床意义和转化验证。 生物标志物确立： 分析TCGA等大型临床数据库，发现CD34高表达是AML不良预后的独立风险因素，并且与特定的基因突变模式（如CEBPA突变）相关。这为筛选优势人群提供了理论依据。 临床前模型验证： 在AML患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型中，证明奥希替尼能有效清除CD34high的白血病细胞，延长小鼠生存期，且对正常的CD34+造血干细胞毒性较小，展示了良好的治疗窗口。 初步临床观察： 对两名常规治疗失败的CD34高表达AML患者进行同情用药，观察到奥希替尼治疗后，患者的外周血白细胞和原始细胞比例迅速下降，证实了其在真实世界中的抗白血病活性。 3. 关键的实验技术有哪些？ 细胞生物学技术： 流式细胞术（FACS）： 用于分选CD34+和CD34-细胞，以及检测细胞凋亡（Annexin V/PI染色）、细胞表面标志物等。 集落形成实验（Colony formation assays）： 评估药物对干/祖细胞增殖和分化潜能的影响。 蛋白质组学与质谱技术（MS）： 这是本研究的核心技术，用于机制发现。 定量磷酸化酪氨酸蛋白质组学： 无偏向性地筛选药物处理后发生磷酸化水平变化的蛋白和位点，是发现信号通路变化的关键。 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）： 用于鉴定Pull-down或IP实验的蛋白，以及鉴定奥希替尼在CD34上的精确共价结合位点。 免疫沉淀-质谱（IP-MS）： 用于鉴定与CD34相互作用的蛋白（发现了Src）。 平行反应监测质谱（PRM-MS）： 一种靶向质谱技术，用于精确定量特定肽段（如CD34-Y329磷酸化肽段）的丰度变化，作为Western Blot的有力补充和验证。 化学与生物化学技术： 化学探针合成： 合成生物素标记的奥希替尼探针，是进行靶点垂钓（Pull-down）的前提。 Pull-down实验： 利用“探针-靶蛋白”的亲和作用，验证药物与CD34的直接结合。 免疫共沉淀（Co-IP）： 验证内源性蛋白之间的相互作用（CD34与Src）。 体外激酶实验（In vitro kinase assay）： 在试管中验证Src/Lyn激酶能否直接磷酸化CD34的特定肽段。 分子生物学与遗传学技术： CRISPR-Cas9基因编辑技术： 用于敲除（Knockout）CD34基因，并通过质粒回补野生型或突变型CD34，是功能验证的“金标准”，有力证明了CD34及其特定位点在药效中的关键作用。 动物模型与临床研究： 患者来源的异种移植（PDX）模型： 将患者的白血病细胞植入免疫缺陷小鼠体内，构建能更好模拟人体肿瘤特征的动物模型，用于评估药物的体内疗效和安全性。 生物信息学分析： 对TCGA、BeatAML等公共数据库进行生存分析和基因表达谱分析，挖掘CD34的临床预后价值。 4. 从文章逻辑性中找到逻辑链接的关键点，并阐明关键点的重要意义。 关键点一：奥希替尼对CD34+细胞的“选择性杀伤”现象。 意义： 这是整个研究的**“逻辑起点”和“驱动力”**。如果奥希替尼对所有白血病细胞都有效，或者对CD34+和CD34-细胞没有差异，研究者就不会将目光锁定在CD34上。正是这种高度的选择性，才催生了“CD34本身可能是靶点”这一极具创新性的假设。它将一个经典的细胞表面标志物，推向了药物直接靶点的前台。 关键点二：证明奥希替尼与CD34的“直接共价结合”。 意义： 这是研究的**“机制核心”**。通过化学探针Pull-down和质谱鉴定结合位点，将药物和CD34直接“绑定”在一起。这一发现颠覆了传统认知，即CD34不仅仅是一个被动标记，而是一个可以被小分子药物直接作用并改变其功能的蛋白。它为“脱靶效应”找到了一个确凿的“靶”，是整个故事中最坚实的证据。 关键点三：揭示“CD34-Src相互作用被药物破坏”的信号转导机制。 意义： 这是连接“胞外事件”与“胞内效应”的**“跨膜信号桥梁”**。它完美地解释了药物结合在细胞膜外的CD34上，为何能引起细胞内部的凋亡信号。通过证明药物结合破坏了CD34与Src激酶的“联盟”，从而关闭了下游的SFK-STAT3促生存通路，使得整个生物学故事链条完整且自洽。 关键点四：将“CD34高表达”确立为疗效预测的“生物标志物”。 意义： 这是从基础研究迈向临床应用的**“转化桥梁”**。通过对临床大数据的分析和PDX模型的验证，研究不仅找到了新靶点，还回答了最初的临床问题：“哪类病人会获益？”。答案就是CD34高表达的患者。这使得奥希替尼治疗白血病从一个模糊的概念，变成了一个具有明确指导原则的精准治疗策略，极大地提升了研究的临床转化价值。 5. 逻辑总结 （1）用简单的逻辑线路总结科学问题： AML化疗易复发（因LSC存在） -> 第一代EGFRi临床试验失败（因靶点和优势人群不明） -> 第三代共价EGFRi（奥希替尼）是否有效？ -> 其作用的精确脱靶靶点和信号通路是什么？ -> 如何利用该机制指导临床用药？ （2）用简单逻辑线路总结实验技术流程: 流式分选CD34+细胞验证药效 -> 化学探针Pull-down发现直接靶点CD34 -> 质谱鉴定共价结合位点C199/C177 -> CRISPR基因编辑验证靶点功能 -> 磷酸化组学筛选信号通路（SFK/STAT3） -> Co-IP和激酶实验验证信号连接 -> PDX模型和临床病例验证体内疗效和临床相关性。 （3）有逻辑性的讲述解决科学问题的经过及背后科学原理： 本研究始于一个长久悬而未决的医学谜题：为什么靶向EGFR的药物会对不表达EGFR的白血病产生作用，但临床应用却屡屡失败？研究团队敏锐地将目光投向了新一代的共价抑制剂奥希替尼，并观察到了一个关键现象：它能高效且选择性地杀死作为白血病复发根源的CD34+白血病干/祖细胞，而对CD34-细胞无效。 这一现象背后的科学原理是什么？他们大胆假设，CD34本身就是奥希替尼的“脱靶”靶点。为了验证这一点，他们采用化学和蛋白质组学手段，首先通过“分子鱼钩”（生物素标记的奥希替尼）成功“钓”到了CD34蛋白，证实了二者的直接结合。接着，利用高精度质谱，他们进一步揭示了结合的本质：奥希替尼像一把带锁的钥匙，通过其活性基团与CD34蛋白胞外域的C199和C177两个半胱氨酸残基形成了不可逆的共价键。最终，通过CRISPR基因编辑这一遗传学“铁证”，他们证明了正是这个结合事件，介导了奥希替尼的杀伤作用。 然而，药物结合在细胞外部，如何触发细胞内部的“自毁程序”？这背后必然有信号的传递。研究团队再次运用蛋白质组学，发现药物结合后，CD34与胞内的Src激酶“分道扬镳”，导致Src激酶及其下游的STAT3促生存信号通路被“关闭”。这揭示了一个精巧的信号转导机制：奥希替尼的外部结合引起CD34构象变化，破坏了其作为“支架”蛋白维持内部促生存信号的能力，最终导致癌细胞凋亡。 最后，研究回归临床。他们发现，CD34高表达本身就是AML患者预后不良的标志。这恰好与他们的发现形成完美闭环：CD34高表达的肿瘤更“毒”，但也恰恰是这类肿瘤，对靶向CD34的奥希替尼最敏感。通过在小鼠模型和两名患者身上的成功应用，他们最终将这一系列基础发现转化为了一个有巨大潜力的、针对特定患者群体的精准治疗新策略。 6. 基于这篇文章能进一步衍生的课题有哪些 药物优化与开发： 能否设计一种新型的、只靶向CD34而不影响EGFR的共价抑制剂？这将能避免在白血病患者中使用时可能出现的EGFR相关副作用（如皮疹、腹泻），实现更精准、更安全的治疗。 探索其他已知的共价激酶抑制剂库，看是否还有其他药物也具备与CD34结合的能力。 深入机制研究： 利用冷冻电镜（Cryo-EM）等结构生物学技术，解析奥希替尼与CD34结合前后的三维结构，从原子层面揭示药物结合如何引起构象变化，并破坏与Src的相互作用。 CD34的Y329位点磷酸化除了与Src/STAT3通路有关，是否还调控其他信号通路或细胞功能？其在正常造血干细胞中的作用是什么？ 奥希替尼对CD34+的正常造血干细胞毒性较低的深层原因是什么？是因为表达量差异，还是正常细胞内有更强的代偿或保护机制？ 临床转化研究： 发起正式临床试验： 基于本文强大的临床前数据和初步人体数据，应设计并开展一项针对复发/难治性、CD34高表达AML/CML患者的I/II期临床试验，以系统评估奥希替尼的疗效和安全性。 联合用药策略： 探索奥希替尼与其他AML标准疗法（如化疗药物、Venetoclax等）或CML疗法（如伊马替尼等TKI）的联合应用，看是否能产生协同增效，甚至根除白血病干细胞，实现“停药”可能。 拓展应用领域： CD34不仅表达在造血干细胞上，还表达在血管内皮祖细胞、某些肿瘤的干细胞上。奥希替尼是否对其他CD34阳性的实体瘤（如某些肉瘤）具有治疗潜力？ 反向思考，奥希替尼对正常CD34+细胞的暂时性抑制作用，是否可以被用于造血干细胞动员，作为一种新型的动员剂辅助干细胞移植？这是一个极具想象力的方向。 探究在自身免疫性疾病等领域，CD34+细胞是否也扮演重要角色，奥希替尼是否能成为一种新的免疫调节剂。

会议推荐 2026第三届中国医药企业项目管理大会 2026第二届中国AI项目管理大会 2026第十五届中国PMO大会 2026第五届中国项目经理大会 本 文 目 录 1、医药研发必备知识体系临床前候选药物(化药)的发现和开发 2、TCR候选药物的发现及其安全性和有效性 3、新药研发(02):先导候选药物的发现及其成药性的多方考量 4、抗体治疗药物发现全流程:从靶点选择到临床候选药物确定 一、医药研发必备知识体系临床前候选药物(化药)的发现和开发 （Fei 生物制药小编） 序 一款新药从实验室到最终上市，主要包括两个阶段：发现(Discovery)和开发(Development)。这是一个极其漫长且耗资巨大的过程。据统计，新药研发平均成本为26亿美金，耗费10年，但其对成功者的资本回馈也无比丰厚。如何提高研发效率，减少研发失败概率是摆在每个药企面前的难题。  药物发现阶段的每150种候选药物中，只有1种进入临床开发，获FDA批准IND申请的候选药物，最终批准上市的平均可能性约为1 / 10。对大型制药公司来说，有更多的动机和资金来支持项目，并推动候选药物走向市场。而对于规模较小的公司，处于临床试验阶段的候选药物，则将大大增加吸引投资者的机会。 药物的发现 药物的发现阶段始于靶点的确定。寻找和确定靶点，是药物研发途径中的第一步，也是最为重要的一步。药物靶点是具有重要生理或者病理功能，能够与药物相结合并产生药理作用的生物分子及其特定的结合位点，包括受体（约占50%）、酶（20%）、离子通道（6%）、核酸（3%）等。通过筛查与特异靶点相互作用的苗头化合物(hits)，并基于该靶点的三维结构，设计出可能的先导化合物(leadcompound)。优化这些先导化合物，使其尽可能像药物一样有效。药物的发现阶段不需要在GLP实验室进行，但需要拥有更多的创新性思维和解决问题的能力。 据IDEA pharma统计，2008-2017年之间，共有846项临床III期试验宣告失败，其中50%是因为招募不到患者。由此可见靶点的选择至关重要，前期对于疾病的调查不足，立项很可能会错误的判断市场份额和前景，甚至导致没有足够的患者支持临床试验。 值得注意的是，针对特定靶点在体外最有效的分子，其在体内可能不是最有效的。许多参数如细胞通透性、血浆稳定性、血浆蛋白结合、血浆清除等都会影响候选药物在体内作用于分子靶点的浓度。因此，在体内最有效的先导化合物被选为临床前候选药物。候选药物的药效越强，剂量就会越低，从而可能会降低脱靶副作用的风险。 新药开发的成本是非常昂贵的，因此，临床前候选药物的确定是药物发现和开发过程中不容忽视的重要环节。根据疾病适应症的不同，药物开发成本和用于IND申请所需的临床前毒理学和药理学研究也有所不同。但通常情况下，一个候选药物需要花费大概150万美金，9-12个月的时间来完成提交IND所需的研究。因此，对多个候选药物进行IND授权研究是不现实的，有必要采取策略来确定一个候选药物。 在确定候选药物时，除了商业因素，还需要对疗效、安全性、药代动力学和毒理学进行评估。此外，候选药物的溶解度，在溶液中的稳定性，合成可行性、固态稳定性和吸湿性，以及知识产权等，也是都是做出最终选择时不可忽略的因素。 药物的开发 药物的开发阶段，包括临床前研究，IND申请，临床试验以及最后提交数据进行NAD申请。相关的临床前研究必须在GLP实验室完成，结果质量需符合IND申请的要求，以确保进入人体试验使用时的安全性。而临床试验则需要对药物的安全性和有效性进行验证。  临床前试验阶段 临床前开发的目标是生成完成IND申请所需的候选药物的数据和文档。IND申请包括三个主要领域的数据和信息: 1) CMC信息 有关用于生产原料药和药品的成分、制造、稳定性、包装和控制的信息。 2) 药理学和毒理学研究 根据临床前数据，评估候选药物是否可能有效，最重要的对人体安全的测试。 3) 临床方案和研究者信息 制定临床试验方案，避免受试者暴露在不必要的风险中, 并提供研究者的临床资质信息。 临床试验阶段 1) 临床I期： 临床I期试验中，一小部分(20-80人)健康志愿者被给予药物，以评估药物的安全性、耐受性、药动学和药效学，有关候选药物疗效的相关指标则很难在一期试验中得到评估。典型的临床I期试验设计是单次递增剂量(SAD)，即单次给药，如果没有观察到不良反应，则给予更高的单次剂量，直到血浆药物水平达到临床前研究估计的安全水平，或发生副作用(最大耐受剂量(MTD))。临床I期试验的两个主要终点是测定为达到合理的血药浓度所需要的药品剂量的信息(药代动力学)和确定最大耐受剂量(MTD)。 2) 临床II期 临床II期试验涉及一个更大的志愿者群体(20-300名患者)，来进一步确保药物的安全性，并评估候选药物的疗效。选定的安全剂量是基于临床I期的MTD，或者是结合临床I期的药代动力学和临床前药代动力学与毒理学研究。此外，为了确保药物的安全性，在项目发现阶段，根据动物和人类细胞或组织研究中确定的疗效，也可用于预测给予患者的选定剂量。 3) 临床III期 临床III期试验涉及多个临床中心和大量患者(300-3000或更多，取决于所研究的疾病/医疗条件)。目的是评估候选药物与疾病适应症的护理治疗标准相比的安全性和有效性。研究的时间长短将根据疾病的症状而有所不同。一项新药申请(NDA)可以根据一项或几项三期研究获得的数据提交给FDA。经FDA批准，该药物可以上市销售。 此外，针对相同适应症，疗效低于已上市药物的新药，FDA不会予以批准；没有任何已上市药物的适应症，对新药疗效的评判标准，则基于对其他可能成功上市药物的疗效评估。据统计，2008-2017年之间，失败的临床III期试验中，18%是因为疗效不足。因此在项目启动前，需要深入的挖掘靶点信息，充分了解国内外在研管线和专利布局，完成对应疾病的国内外治疗现状，融资/交易信息汇总。将与候选药物具有相同靶标和适应症，已上市或有望上市的药物进行比较，保证用于开发的先导化合物，至少与目标药物疗效一致。 结语 综上所述，有许多因素影响临床前候选药物的确定，候选药物的开发途径也多种多样。候选药物适应的疾病领域将极大地影响需要进行的研究，以及药物副作用的可接受程度。考虑到产生临床前数据的巨大成本，应当在药物发现早期，对靶点信息和候选药物进行全面深入的调研，理智的评估风险，以减少研发失败概率。 二、TCR候选药物的发现及其安全性和有效性 （原创 小小富minfu TCRshows） 这里介绍了基于TCR疗法的临床发展相关的独特的复杂性，如HLA限制、TCR发现、效力评估和交叉反应的可能性。 治疗性TCR候选药物的发现 ●图2 TCR治疗候选物的发现。 1 来自TILs 肿瘤通常是由T细胞渗润，T细胞的一部分与各种肿瘤抗原发生反应。这些抗原包括组织分化抗原、癌胚抗原、与转化肿瘤病毒相关的抗原和突变衍生的新抗原。因此，肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)可以作为TCR基因序列的来源，赋予抗肿瘤免疫(图2a)。尽管富含肿瘤反应性T细胞，但仅凭TCR频率通常不足以预测肿瘤的反应性。这是因为大多数TIL是被动的旁观者，对病毒或其他病原体具有特异性。因此，已经开发出识别和分离肿瘤特异性TIL的策略，这些TIL分为三类：表型、功能和转录。 表型marker是结构性表达的膜相关蛋白，使其易于测定，便于大规模分离使用。表型marker的检测是通过使用FACS分选分析或分子条形码抗体，然后通过测序(CITE-seq)对转录本和表位进行细胞索引来完成的。ATPase CD39的表达、组织驻留标志物CD103或PD1、LAG3和TIM3(也称为HAVCR2)识别肿瘤反应性TIL。在CD4+TILs的情况下，具有调节性T细胞表型的细胞可以作为TCR序列的额外来源，该TCR序列赋予对HLA II类限制性肿瘤抗原的反应性。 功能marker可以直接评估TIL的抗原特异性，也可以测量TCR聚集引起的表面marker表达的变化。虽然在技术上比表型marker评估更具挑战性，但功能marker能够以更高的特异性富集肿瘤反应性TIL。对肿瘤抗原具有特异性的TCR可以通过与负载肿瘤相关多肽的HLA多聚体结合来识别。利用FACS分选或磁珠分离，荧光偶联的p/HLA多聚体（如，MBL的tetramer）可促进抗原特异性TIL的分选。然而，这种方法需要大量的起始数量，并且同时筛选多个抗原特异性的能力有限。使用DNA-barcoded p/HLA多聚体结合单细胞测序的CITE-seq，能够以较小的样本量高通量筛选和检索与抗原相关的TCR序列。或者，来自未知特异性的TIL的TCR克隆型的特异性可以使用酵母展示或抗原提呈细胞(APC)展示高度多样化的p/HLA文库去选择。尽管这些方法中的每一种都有实用价值，但实践的局限性限制了一次可以筛查的HLA、表位和多肽长度的总数。肿瘤坏死因子受体超家族的两个成员4-1BB(也称为TNFRSF9和CD137)和OX40(也称为TNFRSF4和CD134)在静息T细胞上不表达，但在抗原刺激后表达上调。与细胞因子的表达不同，4-1BB和OX40的表达依赖于TCR的连接，并且与T细胞分化无关。因此，基于这两个marker的表达的TIL选择可以作为一种功能策略来检索肿瘤反应性TCR，而不需要事先知道它们识别的表位。 最后，单细胞转录组特征可以在体外直接鉴定肿瘤反应性TCR克隆型，而不需要扩增或功能测试。趋化因子CXCL13的表达和多种衰竭相关基因，包括ENTPD1(编码CD39)，PDCD1(编码PD1)，HAVCR2和TIGIT，在肿瘤特异性T细胞中高于旁观者T细胞。相比之下，旁观者T细胞通常表达高水平的记忆相关基因，如IL7R和TCF7。 2 来自患者的循环T细胞 在循环T细胞中可以发现由TIL表达的TCR克隆型，尽管频率明显较低。因此，外周血可以作为肿瘤反应性T细胞的来源(图2a)。在选定的病例中，对肿瘤抗原具有特异性并已进行克隆性扩增的T细胞可使用p/HLA多聚体在体外直接检测到。更常见的是，需要富集稀有TCR克隆型的策略。共抑制分子PD1和T细胞记忆标记CD45RO鉴定含有抗肿瘤T细胞的循环人群。然而，由于肿瘤反应性T细胞只占这些池的小部分，因此需要进行体外T细胞扩增以进行反应性筛选和TCR测序。这可以通过使用单核细胞来源的DC细胞的肿瘤相关多肽脉冲或编码肿瘤抗原的RNA电穿孔的体外刺激(IVS)实现。 如果已知肿瘤抗原的多肽序列和HLA限制性，就可以使用合成的p/HLA复合体直接分离抗原特异的T细胞。p/HLA复合体与荧光染料、Strep-tag II序列或顺磁性人工APC的结合允许稀有T细胞群的富集和扩增。或者，可在体外直接捕获肿瘤反应性T细胞，并使用显示p/HLA多聚体的DNA-barcoded纳米磁珠一步检索其相应的TCR序列。 3 来自健康捐赠者 在肿瘤患者中，相当大比例的HLA提呈的多肽不能激发T细胞反应。这可能是因为无效的启动或因为先前的癌症治疗路线对肿瘤反应性T细胞适应性产生负面影响而发生的。为了克服这些限制，TCR的发现可以使用健康donor的幼稚T细胞来“outsourced”(图2a)。这种方法中，在使用APC进行IVS之前，分离初始T细胞以最大限度地增加TCR谱的多样性。APC可以用多肽脉冲，或用编码肿瘤抗原的mRNA转染以加强更多需要蛋白降解和内源性HLA负载的生理性抗原呈递。或者，可以在没有预先IVS的情况下使用p/HLA多聚体富集和单细胞分选直接分离抗原特异性初始T细胞。筛查多名健康donor增加检测到T细胞反应的可能性，并增加产生的T细胞克隆型的多样性。在TAA抗原中，其中表达由癌细胞和正常组织共享，HLA不匹配的donor可能被用作检索高亲和力TCR序列的策略，这是因为对同种异体HLA起反应的T细胞谱不受胸腺阴性选择的影响。然而，由于从不匹配的donor中提取的TCR可能表现出与通用同种异体HLA的混杂，因此在临床测试之前需要对潜在的off-target反应进行系统筛查。 4 来自HLA转基因小鼠 表达HLA分子并已用人类肿瘤抗原免疫的转基因(Tg)小鼠可用作TCR的来源(图2b)。这种方法有几个优点，首先，它利用小鼠和人类蛋白质序列的差异作为一种策略，以克服胸腺选择对靶向自身抗原的TCR池的负面影响；其次，由于啮齿动物相对容易免疫，因此HLA Tg小鼠是一种产生不同TCR的时间和成本效益高的方法。从免疫的HLA Tg小鼠中提取的T细胞克隆的可变序列已被用作多个临床试验的TCRs的来源。在接受从HLA Tg小鼠获得的TCRs的患者中，靶向抗肿瘤免疫的证据证实了这种方法的治疗潜力。然而，以这种方式来源的TCR的一个主要限制是，受体的小鼠可变序列可以包含免疫原性表位。 5 来自人源化小鼠 为了克服使用具有小鼠可变序列的TCR的局限性，已经产生表达完整的人TCRαβ基因组位点但缺乏小鼠TCR序列的Tg小鼠品系。从概念上讲，这种方法建立在先前的工作基础上，这些工作证明用人免疫球蛋白VH/VL基因座改造的转基因小鼠可以作为完全人抗体序列的来源。将TCR人源化小鼠与HLA Tg小鼠杂交，可以对不同的人类TCR谱系进行采样，这些谱系是受HLA限制的。用肿瘤抗原基因免疫TCR人源化小鼠，使TCR候选动物具有完全的人可变序列(图2b)。在某些情况下，从人源化小鼠克隆的TCRs显示出比人源性TCRs更高的功能亲和力。 TCR的安全性和有效性 ●图3 解决TCR疗法候选药物的安全性和有效性的策略。 1 On-target/off-tumor毒性风险 当肿瘤细胞和正常组织共同表达相同的p/HLA复合物时，预计会出现on-traget/off-tumor毒性。因此，TCR疗法候选药物的毒性风险缓解始于严格评估健康细胞的抗原表达(图3a)。在由体细胞突变和转化肿瘤病毒产生的表位的情况下，off-tumor毒性风险被降至最低，因为正常组织不表达这些蛋白质。对于其他抗原类别，可以使用公开可用的转录组和蛋白质组数据库进行表达的初步评估。RNA-seq具有高敏感性、高特异性和大的动态范围。RNA-seq数据库，例如GTEx，提供了来自多个正常组织的高质量测序结果。人类单细胞RNA表达图谱通过促进稀有细胞种群的识别来补充大量的RNA-seq数据。因为基因和蛋白质表达之间的相关性是不完善的，仅在关键组织中可检测到的RNA转录本不足以断定候选抗原是否代表不安全的靶点。因此，蛋白质水平的表达分析是可取的验证步骤。最后，重要的是要考虑到选定的组织的影响，如睾丸不表达HLA分子，因此不被T细胞直接识别。 2 评估交叉反应 TCR还可以调节由任何单个TCR的退化潜力引起的off-target。TCR的安全性不是由其潜在结合的多肽序列的绝对数量决定的，而是由TCR结合多肽的能力决定的，这些多肽是由off-target的蛋白在HLA中的内源性加工和表达所产生的。只有在执行关键功能的健康组织表达off-target蛋白的情况下，才会导致不可接受的毒性。实验动物和人之间蛋白质序列的差异，加上缺乏HLA的表达，限制了体内毒理学研究在评估on-target和off-target TCR毒性风险方面的有效性。因此，通常需要体外策略来量化候选TCR的退化潜力和安全性。应该进行哪些分析以及在什么情况下评估交叉反应仍然是该领域的一个悬而未决的问题。下面，概述几种用于支持TCR研究新药应用的技术，以及可能有助于降低未来候选药物风险的不断发展的技术。 当TCR表现出与胸腺发育过程中没有遇到的HLA的交叉反应时，就会发生同种异体反应。使用一组表达流行HLA但缺乏靶抗原的HLA不匹配细胞系可以确定TCR是否具有同种异体反应性(图3b)。如果TCR不显示同种异体反应性，应使用其他方法来评估TCR对表达限制性HLA但被其他自身肽结合的靶点的特异性。这可以通过从HLA匹配的健康donor获得的一组正常细胞中筛选候选的TCR来实现。然而，即使是大panels也可能无法包括高度专一化或稀有的细胞类型。提高心脏或肾脏等重要器官细胞亚群的代表性的一种策略是使用诱导多能干细胞或正常组织器官。 一种确定TCR交叉反应潜力的补充技术，称为氨基酸位置扫描，首先确定哪些肽残基与受体形成关键接触(图3c)。这种方法中，同源肽中的每个氨基酸都依次被最小的手性氨基酸丙氨酸取代。在天然残基为丙氨酸的情况下，可以使用另一种紧凑氨基酸，如甘氨酸。TCR的识别基序是由氨基酸取代导致与天然氨基酸相比显著丧失功能(通常＞50%)的多肽位置定义的。氨基酸扫描的临床应用被证明是由于针对MAGE-A3蛋白中的一个表位而导致的亲和力增强的TCR引起的致命性心脏毒性的原因，该多肽来自心脏结构蛋白Titin。位置扫描可以扩展到包括所有20种标准氨基酸，以测量TCR对含有化学相似残基的肽的透过性。一旦确定了TCR的识别基序，这些数据就被用来进行计算机搜索，以确定人类蛋白质组中其他地方是否存在同源基序。 虽然位置扫描提供了哪些肽位置有助于TCR识别的有用信息，但该技术可能会遗漏重要的交叉反应。例如，一些肽序列作为有效的激动剂发挥作用，但与TCR识别的天然肽显示出极小的同源性。这可能是肽内偶联的结果，通过对肽中心核心外残基的修饰促进新的TCR接触的产生。组合多肽文库具有很高的多样性(通常是10^8到＞10^11个变体)，并且包含的多肽中一个氨基酸位置是顺序固定的，而其余的位置被所有20个氨基酸取代。组合多肽文库在识别多肽靶标方面显示出前景，特别是当与生物信息数据库筛选相结合时。或者，酵母展示、噬菌体展示和分子条形码人工APC可以提高交叉反应筛选的速度和灵敏度。在所有发现潜在交叉反应肽的情况下，需要进行额外的研究以确定其生理意义。 3 评估效力 将TCRs用于临床开发的最低限度的效力衡量标准是识别由内源性加工和蛋白质呈递产生的多肽的能力(图3 d-i)。对于HLA I类限制性TCR，理想情况下应该辅之以确定全长蛋白和限制性元件的生理性表达水平是否足以识别。除了细胞因子的分泌，重要的是要比较不同的候选TCR引起肿瘤细胞裂解的能力。公共数据库可以识别共同表达靶抗原和限制性HLA的市售可用的肿瘤细胞系。然而，并不总是有可能确定表达一对感兴趣的p/HLA的已建立的细胞系。克服这一限制的一种解决方案是创建一个代表肿瘤受HLA限制的抗原性图景的“化身”。这可以使用串联迷你基因(TMG)或含有体细胞突变、基因融合、插入/缺失、整合病毒或CGAs的合成长肽来完成。将TMG或合成的长肽脉冲作用于自体APC，可加强患者补充的HLA对抗原的处理和呈递。最近，病人来源的肿瘤类器官被用来对癌细胞表面展示的天然处理的多肽进行采样。相对于已建立的癌细胞系，肿瘤类器官中更接近人类肿瘤的基因组异质性、表型和三维特征。此外，与患者来源的异种移植物不同，可以平行建立正常组织器官，为评估off-target风险提供了一种补充方法，尽管有这些优点，但类器官的生产既耗时又昂贵。从CD4+T细胞中提取的TCR的特征带来了额外的挑战，因为许多实体癌缺乏稳定的HLA II类表达。这一障碍可以通过外源表达II类MHC反式激活因子(CIITA)来克服，CIITA是HLA II类表达的主要转录调节因子。 功能亲和力，即T细胞对逐渐降低的同源多肽浓度作出反应的能力，是比较不同TCR的一种常用且技术简单的方法。一般来说，功能亲和力与肿瘤细胞识别的程度相关。然而，功能亲和力的测量受到多种因素的影响，这些因素与TCR的内在特性无关，包括T细胞分化和活化历史。此外，不同的抗原阈值触发不同的T细胞功能(如细胞因子产生和细胞增殖)。因此，非常需要定量、可重复的和不依赖于T细胞状态的评估TCR效力的替代测定方法。 结合亲和力，单个TCR分子与单个p/HLA复合物相互作用的强度，通常由解离平衡常数Kd表示。在临床前模型和临床试验中，天然产生的TCR的结合亲和力与抗肿瘤疗效相关。在平衡条件下，Kd由解离速率和缔合速率之比(koff/kon)定义。大多数胸腺选择的TCR Kd值在1-200μM范围内；然而，定向进化技术可以产生具有pM结合亲和力的TCR。结合自身抗原的TCR通常具有较高(较弱)生理范围的Kd值，可能是由于胸腺的阴性选择。相比之下，靶向突变衍生新抗原的TCR往往具有较低(较强)的Kd值，其范围与病原体相关受体重叠。Kd值通常使用SPR来测量，其中重组单链可溶性TCR流过含有固定的p/HLA复合物的传感芯片(反之亦然)。结合亲和力与TCR功能反应有不同程度的相关性。然而，这种相关性并不是普遍适用的。在极端情况下，两个TCR可以以接近相等的Kd值结合相同的p/HLA复合物，但显示出不同的信号反应(例如，一个受体可能触发T细胞激活，而另一个不会)。在某些情况下，TCR的三维结合亲和力与其信号传递能力的解偶联被归因于SPR无法解释力依赖性相互作用，例如捕获键的形成。二维方法直接测量活T细胞上TCR的亲和力和/或结合动力学，而不需要重组TCR的表达和纯化。尽管二维亲和力与生物学结果的相关性更密切，但这项技术的通量仍然相对较低，需要专门的仪器。 为了实现更快的通量，基于流式细胞术的方法已经发展起来，既可以推断TCR亲和力，也可以直接测量活T细胞上单体TCR-p/HLA复合物的解离动力学。T细胞依赖CD8共受体激活的程度与TCR的亲和力及其与p/HLA分子的解离半衰期成反比。因此，结合p/HLA多聚体或以共受体非依赖性方式触发抗原特异性效应功能的TCR定性地暗示该受体可能具有相对高的亲和力。基于流式细胞术的定量测量是结构亲和性，即单个膜相关TCR与单体p/HLA分子结合的能力。与功能亲和力不同，结构亲和力测量与T细胞分化状态无关，因此表明T细胞克隆和TCR-T细胞之间高度一致。在方法学上，结构亲和力使用p/HLA多聚体来测量TCR-p/HLA解离速率(koff)，这些多聚体在添加惰性化合物后解离成单体。与koff速率较快的TCR相比，表达koff速率较慢的TCR的T细胞过继细胞转移(ACT)提供了更好的抗肿瘤效果。 参考文献： Chow, A. et al. The ectonucleotidase CD39 identifies tumor-reactive CD8+ T cells predictive of immune checkpoint blockade efficacy in human lung cancer. Immunity 56, 93–106.e6 (2023). Hanada, K. I. et al. A phenotypic signature that identifies neoantigen-reactive T cells in fresh human lung cancers. Cancer Cell 40, 479–493.e6 (2022). Moore, M. J. et al. Humanization of T cell-mediated immunity in mice. Sci. Immunol. 6, eabj4026 (2021). van Amerongen, R. A. et al. Human iPSC-derived preclinical models to identify toxicity of tumor-specific T cells with clinical potential. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 28, 249–261 (2023). Lowery, F. J. et al. Molecular signatures of antitumor neoantigen-reactive T cells from metastatic human cancers. Science 375, 877–884 (2022). Klebanoff, C.A. et al. T cell receptor therapeutics: immunological targeting of the intracellular cancer proteome. Nat Rev Drug Discov (2023). Hos, B. J. et al. 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Commun. 14, 3188 (2023). 三、新药研发(02):先导候选药物的发现及其成药性的多方考量 （原创  屋中人 生物屋） 药物在临床上失败的主要原因有两个：第一是它们不起作用，第二是它们不安全。因此，开发新药最重要的步骤之一是靶点发现和验证。靶标是一个广泛的术语，可以是一系列生物实体，例如蛋白质、基因和RNA。一个好的靶点需要有效、安全、满足临床和商业化需求，最重要的是“可成药(druggable)”。“可成药”靶点可接近推定的药物分子，无论是小分子还是较大的生物制品，并且在结合后引发可在体外和体内可测量的生物反应。 如果确定了感兴趣的靶标，新药研发的后续任务基本就是寻找一个具有临床功效的先导化合物(lead compound)。虽然陈述起来这是一个很简单的工作，但实际上是一个异常复杂和困难重重的过程。 目前，已在化学文摘数据库中注册的化合物数量就超过7000万个，再加上其他可能存在的无穷无尽的化合物，可以成为候选药物的化合物数量是难以统计的，因此从何处开始这一过程非常重要。幸运的是，目前已经报道了一些指南，对如何发现具有生物活性的化合物提供了一些指导和帮助。其中，Lipinski类药5原则指出，大多数具有类药性的化合物仅来源于化学领域中很有限的部分。根据Lipinski类药5原则，具有成药性的化合物一般具有以下5个特点： ·①分子量低于500； ·②LogP值低于5； ·③氢键供体数少于5个； ·④氢键受体数少于10个； ·⑤可旋转键数少于10个。 虽然经验规则缩小了化合物的筛选范围，然而这些限制仍然留下了大范围需要探索和发掘的空间。由于作用于相同靶点的药物在化学结构上具有非常小的结构重叠，使得该问题变得更加复杂。例如，HMG-CoA还原酶抑制剂阿托伐他汀(atorvastatin，Lipitor®)、氟伐他汀(fluvastatin，Lescol®)和瑞舒伐他汀(rosuvastatin，Crestor®)(图1)在结构上存在明显的相似性。它们的结构中都含有4-氟苯环和1,3-二醇羧酸侧链，但其他结构部分各不相同。而洛伐他汀(lovastatin，Mevacor®)同样是HMG-CoA还原酶抑制剂，其结构却是完全不同的，肉眼无法确定该化合物与其他HMG-CoA还原酶抑制剂有任何联系。再如，大家熟知的“伟哥”，即西地那非(sildenafil，Viagra®)，与他达拉非(tadalafil，Cialis®)都是PDE-5抑制剂，但在结构上它们却是完全不同的(图2)。 图1.HMG-CoA 还原酶抑制剂洛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀和瑞舒伐他汀的结构具有一定的相似性，但结构差异很大。 图2. PDE-5抑制剂他达拉非和西地那非虽然在结构差别很大，但却有着共同的大分子靶点。 先导化合物是具有所期望的生物或药理活性，但又存在一些不合适的性质，比如毒性、溶解度或代谢问题等。先导化合物可以有多种来源，其中主要的途径包括： ·天然产物：许多药物先导是从植物、微生物和海洋生物等天然来源中发现的。例如阿司匹林就是从柳树皮中发现的水杨酸进化而来。 ·高通量筛选(HTS)：HTS以自动化的方式针对特定生物靶标，并测试大型化合物库。这些化合物库可能包括合成化合物、现有药物或其它化合物库。 ·虚拟高通量筛选(vHTS)：虚拟筛选使用计算方法来分析化学结构数据库，并预测哪些化合物可能与生物靶标相互作用。 ·DNA编码化合物库(DNA-Encoded Compound Libraries，DEL)：一种将分子生物学与组合化学相结合的策略去高效、简便筛选小分子配体的方法，最早由美国Scripps研究院的Sydney Brenner和Richard Lerner于1992年提出。简单原理是通过linker将基因编码的DNA-tag和小分子连接，然后通过一些生物活性方法的测定来筛选与靶蛋白有结合的配体。 ·基于片段的药物设计(FBLG)：在这种方法中，针对靶点筛选分子的小片段，然后对选中片段进行组装和优化，以产生具有更高亲和力和选择性的先导药物。 ·药物再利用(Drug repurposing)：药物再利用可被视为确定先导药物的“终南捷径”。 ·合理药物设计(Rational drug design)：在此模态中，研究人员利用靶标的结构信息，来设计与靶标特异性结合的化合物，从而创建潜在的先导药物。 ·组合化学：这种方法涉及生成各种化合物的大型库，目的是寻找针对特定目标或疾病的活性分子。 下图是2016-2017年JMC上66个临床候选化合物发现的统计分析图，从图中可以看出高通量筛选(HTS)占29%，在制药行业得到越来越广泛的应用。 现代药物研发中有两种常用的方法，即高通量筛选(high throughput screening，HTS)和虚拟高通量筛选(virtual high throughput screening，vHTS)。这两种方法之间存在一定程度的重叠，运用其中一种方法并不代表排除另一种方法的使用。事实上，两种方法经常串联使用，以提高成功的可能性。 高通量筛选方法通常对包含数百、数千乃至数百万个化合物的大型化合物库进行活性筛选，这些大型化合物库通常包含多种类型的化合物，以便尽可能多地涵盖具有类药性的化学结构，当然也有针对特定生物靶标的化合物库，如基于激酶、磷酸酶的化合物库。 ·高通量筛选分为随机筛选和靶向筛选两种主要方式。随机筛选不依赖于特定的生物学知识，而是广泛测试各种化合物以发现具有潜在活性的分子；而靶向筛选则利用已有的生物学信息，如有蛋白质结构或已知的结合位点，来有针对性地选择可能与之相互作用的化合物。 ·这些化合物一般都是商业在售的(如Maybridge，Enamine，Aldrich等)，此外制药公司内部通常也会收集一些专有的化合物。高通量筛选技术需要复杂的全自动系统，能够操作不同试剂和96 孔、384孔，甚至1496孔微量滴定板，每小时对数千个样品进行试剂分配、数据采集和废料处理，当然还需要自动数据分析系统来处理高通量筛选运行中所获得的大量信息。 ·在评估高通量筛选获得的数据时，必须考虑到一些关键点：首先，最重要的是假阳性和假阴性结果的可能性；同时，在筛选过程中，应特别注意试剂处理操作存在发生错误的可能性(如移液枪枪头堵塞等)；另外，被筛选样品也可能随着时间的推移而发生变质，在化学库中产生“假样品”，即其结构信息不再与最初入库时的结构信息相匹配。 ·为了确保研究是朝着发现先导化合物的正确方向迈进的，通常通过高效液相色谱/质谱(HPLC/MS)等方法测试真正有活性的化合物的纯度，来评估样品的化学完整性。此外，还将对筛选出的化合物开展重复的生物活性筛选来验证高通量筛选的结果。 虚拟高通量筛选(也称为计算机筛选)是一种常用的高通量筛选的替代方法，在这种情况下，分子对接技术和虚拟化合物库(包含数百万种化合物的详细结构信息)与生物靶标的结构数据相结合，用以评估化合物与目标靶点相互作用的强弱。 ·虚拟化合物库通常可以商业购买或免费获得(其中规模最大的是ZINC数据库，http://zinc.docking.org/)，与真实样品一样，制药公司通常也会维护其专属的虚拟化合物库供内部使用。有关生物靶点的结构信息可通过X射线单晶衍射获得，大量蛋白的晶体结构信息可通过结构生物信息学研究协作组织(research collaboratory for structural bioinformatics，RCSB)蛋白数据库(protein data bank，PDB)获得(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)。如果蛋白结构未知，可以根据与这一靶点密切相关的大分子晶体结构数据创建生物靶标的同源模型。随后可以通过将化合物库中的化合物与靶点的假设结合位点进行对接计算，进而排序确定整组化合物的相对等级顺序。接着采用自动化数据分析工具对结果进行预测分析，从化合物数量庞大的化合物库中选择有限数量的候选化合物进行实际的生物活性评价。 ·与高通量筛选非常相似，在评估虚拟筛选结果时必须考虑一些局限性。首先，最重要的是虚拟筛选结果是基于模型系统预测的，而不是基于真实的化合物。因此，结果的准确性取决于模型的准确性。基于X射线晶体结构的计算模型往往比构建的同源模型更可信，但也需要清醒地认识到基于X射线晶体结构的模型并不是完美的。晶体结构可以提供非常详细的结构信息，分辨率可达1.5Å，但根据定义，X射线晶体结构展现的是靶点在固态下的结构。因此，X射线晶体学提供的靶点晶体结构可能与生物靶点发挥活性的真正构象相匹配，但也存在不匹配的可能。在正常生理情况下，生物靶点要么溶解在体液中，要么与生物膜结构相结合，因此，其真实构象很有可能与晶体结构的构象不同。此外，在许多情况下，生物大分子的部分结构必须被改变或去除才能转化为可结晶的形式，从而析出晶体(与配体结合的晶体或未与配体结合的晶体)。鉴于这些局限性，虚拟筛选获得的先导化合物必须经过实际的生物筛选，确定其真实的生物活性，以验证分子对接建模的预测是否准确。 无论采用何种初始筛选方法(HTS或vHTS)，成功的筛选都会获得一个潜在的先导化合物库，需要对这些候选化合物进行筛选以确定其是否有效，确定是否有继续研究的必要，这一过程也称为“先导化合物的发现”(图3)，其本身可能非常复杂，主要取决于潜在先导化合物的数量和本身的性质。例如，对500000个化合物进行筛选，如果化合物库中只有0.1%的化合物具有预期的生物活性，仍然会剩余500个化合物需要后续的筛选研究。理想情况下，这些潜在的先导化合物可能属于为数不多的几种结构类型，可以对每个结构类型开展独立的分析，以确定这一结构类型是否有进一步研究的意义。有限数量的、有限结构类型的潜在先导化合物对后续研究是有利的，同时可以总结出初步的构效关系(structure-activity relationship，SAR)。此外，因为相关合成路线可能已经被报道，故相关类似物的合成也会比较容易。另一方面，化合物库中相关化合物的存在表明它们可能已经被制备并用于其他靶点的研究。这样一来，知识产权的保护也可能存在问题，特别是当这些化合物来源于先前已授权的专利或者已经发表的文献，甚至是早已经商品化的产品时。在这种情况下，专利权和所有权可能会成为严重问题。 一旦发现并确认了最初的先导化合物，并且已经选择了一种结构类型(也可能是多种结构类型)的化合物进行进一步研究，那么化合物的合成、活性测试和数据分析将反复进行，以期提高化合物的药理活性(图3)，这一过程也称为“先导化合物的优化”或“先导物优化”(lead optimization)。在每个先导优化过程的循环中，随着先导化合物分子结构的变化，将获得新的活性数据，用于指导下一代化合物的设计。这种循环将不断总结出最新的构效关系，直到发现适合临床研究的候选药物。 图3.　先导化合物的优化周期开始于通过相关生物活性测试来确定先导化合物的发现。接着对先导化合物进行结构改造，合成新的类似物并进行活性筛选。如果生物活性得到提高，则保留这一结构的改变并重复循环；如果改造使活性下降，则放弃这一改造并重新重复优化。这个优化过程将一直持续到发现适合临床研究的候选化合物为止。 发现一个对靶点有很强作用的先导化合物并不是一个简单的任务，而单纯的高活性并不足以成为一个可供临床开发和商业化的候选药物。每一个候选药物的发现过程都需要新药研发科学家平衡各方面的性质，兼顾多方面的考量(图4)。从先导化合物的发现，到优化，再到最终的临床试验，需要对数百甚至数千个化合物展开一系列的测试。简单来说，不仅需要发现一个能很好作用于靶点的化合物，还需要权衡各方面的性质，来确保成药的可能性。对靶点良好活性的确认只是漫长研发过程的开始，候选化合物还需要经过后续更加严苛的筛选。 图4.　临床候选药物的确定需要权衡靶点活性以外的多方成药性质，通过对成药性的不断优化发现最优的候选药物。 对应于著名的PDCA (Plan-Do-Check-Act，计划-实施-检查-处理)循环，设计-制备-测试-评估(Design–Make–Test–Evaluate)循环是先导药物优化的核心。 ·设计：设计新分子是这个循环的起点。这些新分子可以更好地与靶标结合，而不会产生脱靶效应。 ·制备：合成化学家合成这些新分子，并将它们传递给药理学团队。 ·测试：药理学家对合成的新分子进行测试，以确定它们在筛选中的活性。体外药理学测定(In-vitro pharmacology assays)是评估靶向作用的关键，同时也可以预测可能的脱靶问题。 ·评估：测试的结果作为新的数据源投入评估过程，根据评估结果进入下一个循环周期，进行先导物优化，直到筛选出令人满意的化合物。 每个新药开发项目所采用的具体策略是不同的，但通常都可以用一个筛选级联概括(图5)。筛选级联也称为筛选树，其每个筛选环节都如同一扇大门，从最初活性筛选到体内动物试验，确保不满足条件的化合物尽早被排除在大门之外。 图5.　筛选树是一个发现候选药物的筛选过程，化合物需要经过层层测试才能脱颖而出。 级联的顶部是对化合物靶标活性的筛选，满足一定的阈值便可进入下一步的研究。活性当然是最重要的因素之一，在其他条件相同的情况下，活性越高则给药量越低，从而可以降低副作用发生的可能性。例如，在5nmol/L浓度下就可以很好发挥疗效的化合物的给药剂量肯定要比在5μmol/L才发挥药效的化合物低得多。 当发现一个化合物满足靶点活性的要求后，接下来将进一步研究化合物的靶点选择性和理化性质。生物体进化出了许多高选择性的精密调控系统来实现各种专一的生理功能，但这些系统在结构上往往存在一定的重叠，这可能对一个化合物的生物学性质产生很大的影响。因此，筛选树的下一步生物活性筛选将重点评估化合物对靶点相关生物系统的作用和影响。例如，Kv1.5通道是一种电压门控钾通道，目前是研发房性心律失常药物的靶点，已发现了许多化合物可以高效地阻断该通道。然而，有超过70个其他电压门控钾通道与Kv1.5通道具有不同程度的相似性，而且任何与这些通道相关的作用都可能在动物或人体研究中产生不希望的副作用。以其中的hERG通道为例，Kv1.5通道与hERG通道密切相关，而阻断hERG通道将会增加尖端扭转型室性心动过速和心脏性猝死的风险，因此涉及该领域的任何化合物都需要测试其是否会对hERG通道产生影响，以确保化合物不会在临床试验中出现安全性风险。虽然hERG通道是一个证明药物选择性的重要性的一个极端例子，但应该清楚的是，未能实现靶点选择性将会成为后续药物研发的重大障碍。 类似地，目前有超过500种激酶，任何旨在靶向单一激酶或激酶家族的药物研发都可能产生因作用于其他激酶而带来的风险。为了降低这种风险，在激酶抑制剂开发时会测试化合物对整个激酶谱的作用与影响，以测试是否存在因脱靶而导致的风险。 一般而言，在对目的靶标有效的同时，如果化合物也对其他靶点有很强的作用，那么这类化合物的生物活性是混杂的、不专一的，一般不会再继续推进其后期的研究，因为后期的副作用或不可预测的风险会很大。 然而，靶点专一性要求的严格程度也会随着药物的不同而不同，主要是由脱靶副作用的性质(例如，如果脱靶会导致毛发的过度生长则可能可以接受，倘若会作用于hERG而导致心脏性猝死则绝对不行)、应用患者的数量、用药的时间(一些副作用仅在长期用药时出现)和其他方面的因素决定的。总而言之，靶点的选择性是需要考量的一个主要因素。 然而，活性强、靶点选择性好的化合物并不一定是优秀的候选药物，理化性质也是决定化合物是否适合进一步研究的重要因素。药物在体内的代谢过程主要分为四步，可概括为“ADME”： ·A：Absorption ：吸收——药物从作用部位进入体循环的过程 ·D：Distribution ：分布——药物吸收后通过细胞膜屏障向各组织、器官或者体液进行转运的过程 ·M：Metabolism (Biotransformation)：代谢——药物在体内受酶系统或者肠道菌丛的作用而发生结构转化的过程 ·E ：Excretion：排泄——药物以原型或者代谢产物的形式排出体外的过程 通常在新药开发的早期就会对候选化合物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)进行体外筛选，以确保候选化合物在性质上满足类药性的要求(图6)。例如，为了使药物很好地作用于靶点，它必须能够溶解在体液中并达到起效的浓度，水溶性差的化合物通常难以被开发成药物。对化合物溶解性的要求与化合物本身的药效活性直接相关，如果化合物的活性强，那么对其溶解度的要求就相应降低，因为低浓度的化合物就已经可以发挥预期的治疗效果。溶解度也对药物的吸收有直接的影响，因为化合物必须首先溶解，才能被吸收并通过生物膜到达目标靶点。 图6.　体外ADME 性质可用于评价化合物是否具有“类药”性质。这些类药性主要包括代谢稳定性、血浆稳定性、溶液稳定性、水溶性、生物测定溶解性、P 糖蛋白(P-gp)外排敏感性、CYP450 抑制活性、血脑屏障通透性和渗透性等。 化合物的渗透性(permeability)，即穿透细胞膜的能力也是决定其是否可以成为一个临床候选药物的决定性因素。如果化合物的生物活性很强、选择性高，且水溶性好，但不能通过生物膜，可能会导致化合物无法到达目标靶点，最终不能发挥期望的药效。口服有效的药物必须在胃肠道中被吸收，细胞内靶向的药物还必须透过细胞膜才能到达预期靶点。当然，如果靶点位于细胞外则不会面临这种问题。中枢神经系统(Central nervous system，CNS)候选药物需要透过血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)，问题会更加复杂。此外，外排泵[如P糖蛋白(P-gp)]由于具有外排非内源性物质的功能，也会限制部分化合物的渗透性。化合物能不能穿透细胞膜是新药研发中的重要问题，可能阻碍对该候选化合物的进一步研究。 代谢和化学稳定性同样是需要考量的重要因素。如果一个候选药物满足所有前面提到的标准，但其进入体内会被立即代谢，也会导致不能发挥预期的疗效。候选化合物可允许的相对代谢速率取决于药物的用途，如果是开发新的抗菌药物，则需要化合物的代谢稳定性相对较高，以便其能在足够长的时间内持续杀灭入侵体内的细菌。但如果是开发新的外科手术麻醉剂，代谢稳定性则可能不是一个问题，因为临床希望药物的麻醉作用可以在手术后迅速消退。 在某种意义上，化学稳定性差的化合物作为药物也可能存在问题。为了保证化合物的稳定，可能需要特殊的包装系统，如冷藏储存或将光敏化合物存放在琥珀色瓶子中等。虽然这些问题并非不可克服，但一般而言，首选化学稳定性更好的化合物。 同样重要的是要考虑候选化合物是否会影响正常的代谢过程，是否有可能改变与候选化合物一起联用的药物的代谢。因此为了评估药物- 药物相互作用的风险，需要通过体外筛选方法(肝微粒体)来研究候选化合物是否会抑制肝脏中细胞色素P450(CYP450)代谢酶系，如CYP3A4、CYP2D6和CYP2C9等。即便一个化合物满足前面提及的所有要求，如果存在药物-药物相互作用的风险，仍然不能成为一个成功的候选药物。由于抑制正常代谢过程而撤出市场的特非那丁(Seldane)就是一个典型的例子。 通过各项体外测试并取得良好的结果应该说是候选药物研究的重要进展，但仍不代表一定会取得最终的成功。必须测试化合物的药代动力学(Pharmacokinetics, PK)特性来回答关乎候选药物体内筛选命运的疑问，例如，如果候选化合物采用口服给药方式，有多少比例的药物会进入血液循环(生物利用度)？候选化合物排出和代谢的速率有多快？该化合物是否能够达到所需的起效浓度，以在动物模型中发挥期望的疗效？化合物将在身体内自由分布，还是集中在某些特定的器官或组织中？以上及诸多类似题的答案将对候选化合物是否会在体内动物模型中发挥药效产生极大的影响。无论体外筛选的结果如何，药代动力学性质较差的化合物都不太可能成为最终的药物。 当然，具有合适PK性质的化合物必须在关键动物模型试验中表现出确切的疗效，以证明其可用于临床研究。药效学(Pharmacodynamics, PD)研究的类型主要基于相应的生物学终点(疾病状态)，后面将介绍一些重要动物筛选模型的实例。但应该清楚的是，候选化合物发现的最终目标是找到满足所有上述体外标准的化合物，并在适当的动物模型中被证明功效，而且具有与所需给药方案一致的药代动力学性质。 安全性和副作用是另外需要重点关注的问题，目前有许多体外和体内筛选模型可用于评估化合物可能存在的相关风险。例如，体外hERG筛查、艾姆斯致突变性筛选、犬心血管安全性评估等。安全性研究的性质和范围虽不是本书的重点讨论内容，但始终是药物发现中的重要问题。临床候选药物的潜在副作用在某种程度上取决于预期的用途，例如，考虑到疾病的严重程度，用于治疗如癌症、艾滋病和肌萎缩侧索硬化等致死性疾病的药物的副作用可能会被给予更大的允许空间。另一方面，对于用于治疗慢性疾病或非危及生命病症(如骨关节炎、神经性疼痛等)的药物，必须仔细研究药物的毒副作用。对安全性的关注贯穿于新药发现与开发的各个方面，虽不可能保证进入临床开发的化合物都是安全的，但是在安全筛选中具有“危险信号”的化合物通常不会成为药物。 最后，发现可获得专利保护的化合物也是推动所有药物研发的关键。如前所述，药物发现和开发是一项耗资巨大的工程。通过专利保护实现市场排他性，这将为企业投资新药开发提供必要的经济收益。私营企业、科研机构基本不可能花费巨资将无法专利保护的化合物开发成药物，因为收回成本都希望渺茫，更不用说盈利。 新药研发犹如一个刺激的游戏，是一项艰巨的挑战。从事药物研发的科学家们宛若走在一个个危险的峭壁边缘，小心翼翼地保持着平衡，慢慢前行。平衡药效、选择性、溶解度、稳定性、药代动力学性质、安全性和新颖性的要求对于任何药物的成功研发都是至关重要的，并且如在上述领域中任一个环节跌倒，新药的发现都可能宣告失败。 参考文献 1. 《药物研发基本原理》第2版，〔美〕本杰明·E. 布拉斯，科学出版社 2. Where Do Recent Small Molecule Clinical Development Candidates Come From? Journal of Medicinal Chemistry. 2018, 61(21). 3. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 2011, 162(6):1239-1249. 4. Lead optimization: Delivering molecules fit for preclinical development. Fierce Biotech. 5. 其它信息源于网络搜索 四、抗体治疗药物发现全流程:从靶点选择到临床候选药物确定 （原创 梓树ZiShu 艺药荟） 摘要： 由于许多制药公司的重点从小分子药物大幅转向包含蛋白质和化学治疗剂的更广泛产品组合在抗体治疗药物已进入药物研发的核心阶段。该领域受益于对抗体衍生治疗药物作用机制的深入理解以及开发安全且有针对性的生物治疗药物的复杂技术。本章概述了与抗体治疗药物研发相关的发现过程。讨论详细阐述了靶点选择与验证、筛选准备、先导物识别与优化以及临床候选药物选择。此外，还概述了免疫原性这一基于蛋白质的治疗药物所面临的独特挑战。还包含一个案例研究，以说明巴匹纽单抗(一种人源化抗淀粉样β单克隆抗体，目前正处于治疗阿尔茨海默病的III期临床试验阶段)的发现过程。 【NO.1】引言 抗体治疗药物的整体开发过程可分为五个阶段，即靶点选择与验证、筛选准备、早期候选药物(“命中物”)的产生、高级候选药物(“先导物”)的选择、先导物优化以及临床候选药物选择。图2.1展示了临床候选药物选择之前的药物研发过程概述。与传统小分子药物一样，研发过程通常始于选择经过验证的靶点以及对预期靶点进行治疗性调节的方案。在筛选阶段，开发并测试所有相关试剂和检测方法。然后进行筛选以产生具有理想分子和功能特性的候选抗体，这些特性有可能转化用于预期的治疗适应症。在这个阶段结束时，成功的筛选将导致识别出一个或多个被认为有利于进一步开发的有前景的先导物。接下来，对先导抗体进行优化，以赋予其类似药物的特性，如最佳的靶点结合亲和力、可制造性以及其他生物制药特性。对优化后的候选药物进行广泛而严格的体外和体内评估，以确定它是否适合进一步开发。本章概述了临床前药物研发过程。 【NO.2】治疗性候选药物的发现 2.1 靶点选择 药物发现项目可被视为一种实验方法，用于确定选定的生物靶点是否能够进行治疗性调节。就基于抗体的治疗而言，治疗分子还必须适合大量生产，并能够有效地递送至人类患者，以实现有益的治疗效果。选定的治疗靶点通常被描述为“经过验证的”，这意味着有足够的科学证据证明其与疾病的关联以及治疗潜力。 以下标准可用于定义基于抗体的治疗项目的经过验证的靶点: (1)靶点的生物学或病理功能已明确界定； (2)靶点的病理作用已在相关动物模型中得到验证——例如，已证明小鼠直系同源基因的缺失和/或小鼠蛋白的过表达可模拟人类病理； (3)在模拟人类疾病的动物模型中，已证明基于抗体的靶点干预可实现预期的治疗效果； (4)人类遗传数据已确定靶点与特定人类疾病的明确关联； (5)靶点位于已通过其他手段(如蛋白质、肽或小分子治疗)进行治疗性操纵的分子途径中。 为抗体治疗项目选定的大多数靶点满足上述部分而非全部标准。因此，额外的靶点验证工作通常是基于抗体的治疗项目的关键组成部分。 图2.1 治疗性单克隆抗体发现过程概述，直至临床候选药物的选择。整个过程可分为五个阶段:靶点验证、筛选准备、早期候选药物生成与候选药物选择、候选药物优化与表征以及候选药物选择。五个阶段各自的关键活动列于文本框中 靶点可通过多种方式选定。“文献靶点”是基于已发表数据在人类患者中具有已证实或暗示的疾病关联的分子。其他靶点发现工作可能源于“组学”研究，包括转录谱分析和蛋白质组学实验，这些研究导致发现病理条件下表达模式异常的基因和蛋白质。近年来的全基因组关联研究为新靶点的发现提供了另一个来源(第8章)。 对于基于抗体的治疗项目而言，在选择可行靶点时应考虑几个因素。首先，靶点分子应位于全身给药的治疗性抗体可及的生理位置。因此，靶向部分应存在于细胞表面(细胞表面靶点)、细胞外组织隔室(细胞外靶点)或循环中(可溶性靶点)。此外，靶点应在通过全身循环递送的治疗性抗体可及的病理组织中表达。由于血脑屏障的存在限制了大分子从血液进入大脑通道，大脑靶点对于大蛋白质治疗的调节来说是出了名的困难。尽管正在开发抗体疗法来治疗神经疾病，如阿尔茨海默病(AD)，但药物活性的主要部位是在外周还是中枢神经系统仍存在争议(见2.2.7节讨论)。对于可溶性靶点，其病理浓度应处于可被给药的抗体治疗化学计量结合的水平。抗体治疗的血清峰值浓度可在nM至μM范围内；因此，血清浓度显著超过该水平的可溶性靶点可能无法被治疗性抗体充分结合以实现预期的治疗效果。与此警告相关的是，许多细胞表面受体从细胞膜脱落；脱落的可溶性受体释放到循环中(有时称为“诱饵受体”)，并可能起到汇的作用，从而使结合受体的抗体无法调节靶点的膜形式(见第6章)。 另一个需要考虑的因素是确定细胞表面抗原的抗体介导交联是否会导致受体内化和/或下游信号的激活，这可能是有益的，也可能是有害的。在这种情况下，开发一种细胞模型很重要，在该模型中，感兴趣的靶标在细胞表面表达，并且可以测量下游信号读数，以便检查抗体介导的内吞作用和/或靶向受体交联的生物学效应。此外，患病组织(即肿瘤)与正常组织中靶抗原的差异表达是选择可行靶标的关键考虑因素，因为正常组织中靶标的调节可能会引发安全问题。例如，VEGF系统是正常和疾病相关血管生成的关键介质。抗VEGF抗体如贝伐单抗是一类用于治疗癌症和黄斑变性的抗血管生成药物。理论上，这些抗体也会抑制正常血管生成，并且在患者中通过VEGF调节实际上已经观察到与出血相关的安全风险。虽然很少有经过验证的靶标的项目完全基于安全问题而终止，但评估现有文献以确定关键因素，如组织分布模式和靶标的生理功能，有助于理解潜在的安全问题。例如，对骨骼肌中表达的靶蛋白的理想抑制也可能导致心肌中表达的同一蛋白的意外调节，这可能会对心脏产生有害的毒性作用。尽管这些方法可能有限，但可以使用siRNA介导的基因沉默和组织特异性基因敲除研究等实验方法来评估潜在的安全后果(见第8章)。 2.2 项目规划 "以终为始。"——斯蒂芬·R·科维。这是我的导师在公司内部药物开发课程上给出的关键信息，从那以后一直伴随着我。对于抗体发现项目，最终目标是将候选抗体推进到临床试验阶段。为了实现这一目标，通常在经过5-10年的发现活动后，项目应该从明确的长期和短期目标前进路径开始。 一旦选择了靶标，就应该定义治疗靶向策略。例如，基于抗体的治疗的一种常见分子机制是阻断配体-受体相互作用，对此有三种可设想靶向策略:抗配体抗体、抗受体抗体和受体-Fc融合蛋白。理论上，所有三种基于抗体的治疗方法都应该取得相似的临床结果。然而，实际上，调节相同分子机制的不同治疗实体可能会由于与受体和配体相关的独特生物学特性以及治疗分子本身所具有的独特属性而表现出独特的临床结果。因此，评估各种靶向策略并采用最具战略性和/或可行性的方法向前推进很重要。或者，可以启动两种或更多并行方法，并且所有候选分子随后可以进行排名，以便选择最佳方法。还值得一提的是，抗体治疗的开发并不排除开发调节相同分子靶标的小分子药物的努力。例如，单克隆抗体治疗药物西妥昔单抗与小分子药物吉非替尼和厄洛替尼都靶向EGF受体。如果资源允许，基于抗体的治疗项目可以在有必要时与针对同一靶标的小分子项目并行进行。一般来说，由于基于抗体的治疗所观察到的高度特异性设计良好的抗体与小分子药物相比不太可能引发不良反应，但生产成本要高得多。 所提出的靶向策略和潜在药理学应决定正在研发的治疗性抗体的预期分子特征。这些考虑因素应包括对靶表位及其与细胞信号传导的相关性、结合特异性和亲和力、种间交叉反应性、抗原表达谱、效应器功能募集以及预期临床剂量和给药频率的理解。表位和结合亲和力现在被认为是抗体治疗机制的关键决定因素(第6章和第18章)。例如，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗是两种结合HER2上不同表位的临床单克隆抗体。据信曲妥珠单抗通过阻断HER2和HER3复合物的形成来抑制HER2的非配体依赖性激活，而帕妥珠单抗直接靶向HER2受体的二聚化表位。抗体的效应器功能是指抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。特异性抗体介导的治疗作用，如抗肿瘤活性，严重依赖于IgG的效应器功能来促使免疫细胞杀死癌细胞，而在其他应用中，如靶向免疫细胞上的细胞表面受体，则有必要减弱或消除治疗性抗体的效应器功能(第4章)。几种上市的抗体治疗药物，如依库珠单抗(抗C5抗体)和阿巴西普(CTLA4-Fc)，特意对Fc区域进行了改造，以降低这些分子的效应器功能，从而改善这些产品的安全性。 种间交叉反应性是许多抗体发现项目的一个实际考虑因素，不应与抗体特异性混淆(第10章)。这是候选抗体的一个理想特性，是指抗体与用作体内疗效、药代动力学和药效学(PK/PD)以及安全性评估模型的各种动物物种的直系同源蛋白结合并进行功能相互作用的能力。常用于这些目的的动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔子和食蟹猴(第10章)。对于一些项目，候选抗体极高的结合特异性反而因其缺乏交叉反应性而给项目带来问题。一种常见的做法是有意筛选与人类靶点及其啮齿动物直系同源物(最常见的是小鼠)都能结合并进行功能相互作用的候选抗体(图2.2)。此外，必须评估先导抗体与猴子直系同源物的交叉反应性，以便于在猴子身上进行支持IND的毒性研究(第10章)。 如果无法产生交叉反应性抗体该怎么办？首先，一个简单的生物信息学操作可以帮助评估获得针对选定人类靶点的交叉反应性抗体的可能性。相关直系同源物的氨基酸序列可以很容易地从公共数据库中检索出来并进行比对，以确定序列同源性，这可作为获得交叉反应性抗体可能性的粗略预测指标(一般来说，当抗原的序列同一性大于90%时，抗体与直系同源物发生交叉反应的可能性很高，不过在某些情况下，相关表位序列中的同一性和同源性将是主要决定因素，见第10章)。在缺乏交叉反应性的情况下，已经考虑了几种策略。 图2.2 一个代表性的筛选范例，描绘了从产生抗体命中物到选择先导物的典型筛选过程的实验流程 在治疗性候选药物之前或与之并行产生的替代抗体可用于进行临床前概念验证疗效研究(第10章)。根据定义，替代物是与治疗性候选药物功能等效的抗体，同时特异性结合在预期动物物种中表达的靶点直系同源物。例如，抗细胞因子抗体项目经常遇到人类和小鼠细胞因子直系同源物之间序列同源性较低的情况。在产生先导治疗性候选药物的过程中，可以产生一种抗小鼠细胞因子抗体，以促进在啮齿动物疗效模型中进行概念验证研究。一种越来越流行的方法是产生“人源敲入/敲除”小鼠，即将编码人类靶蛋白的基因插入小鼠基因组中编码小鼠靶点直系同源物的基因座。这些“敲入/敲除”小鼠将只表达人类靶蛋白而不表达内源性小鼠直系同源物。或者，可以产生转基因小鼠，其中人类靶蛋白在内源性小鼠靶蛋白存在的情况下表达。这些基因改造小鼠越来越多地用于评估非交叉反应性候选抗体的疗效、PK和毒性研究。 筛选范式常用于总结筛选策略和工艺流程，从而为基于抗体的治疗方案的实施提供一个框架。筛选范式所涵盖的关键信息包括筛选试验(即一级、二级和三级试验)、体内试验计划(即疗效、药代动力学/药效学、毒性研究)、通过/不通过决策点以及每个流程的预计时间表。图2.2展示了一个通用的筛选范式。 除了候选抗体的总体目标和特定分子特征外，项目计划的其他方面还包括围绕靶蛋白的知识产权主张以及所提议治疗方法的竞争格局、该项目的商业价值以及与调节靶标相关的潜在安全问题。 开发备用治疗候选药物是项目计划的一个重要战略组成部分。如果先导分子在临床前开发或早期临床试验中遇到意外问题，备用分子可以很容易地成为先导候选药物，而不会造成太多时间损失。此外，如果先导分子成功进入市场，备用分子可以成为具有差异化和/或改进治疗特性的第二代药物。备用分子可以与先导分子共同开发，并在临床试验前进行战略性“储备”。 可能需要备用分子的几种情况包括： (1)与同一靶蛋白上不同表位结合的抗体； (2)先导抗体是嵌合或人源化抗体时的全人源抗体； 或(3)靶向同一生物途径中不同蛋白的抗体(例如，在抗体介导的受体-配体相互作用阻断的情况下，靶向配体的抗体可以作为靶向受体的先导抗体的备用分子) 虽然本节没有描述抗体药物发现的一个独特阶段，但项目规划是任何药物发现项目成功执行的关键前奏。应在抗体发现计划开始时制定项目计划，以明确界定科学原理、概述长期目标和实验计划。它应该为各个阶段确定预计时间表，并插入具有明确通过/不通过标准的里程碑决策点。由于药物发现项目在向临床推进的过程中成本越来越高，在失败项目进入后期开发之前及时终止具有显著的成本节约效益。最后，每一条药物发现路径都不是一个简单的过程，而是一个动态的过程，可能因不可预见的问题和挑战而需要灵活性。因此，项目计划会随着发现过程而有机演变，并且必须定期修订和更新。 一旦项目计划得到关键利益相关者的认可，就会组建一个项目团队，该团队至少由一名团队负责人(通常是生物学负责人)和一名抗体工程师或技术专家组成。团队组成会随着项目阶段的不同而变化，并且随着项目在整个开发过程中的推进，所需专业知识的复杂性也会增加(见“临床候选药物的选择”)。 2.3 筛选准备 筛选准备阶段而非筛选阶段，往往是早期发现过程的瓶颈。高质量的试剂和优化的功能测定是成功筛选阶段的关键步骤。一个常见的错误是在试剂和测定方法尚未完全准备好之前就匆忙进入抗体生成过程。在筛选准备过程中试图通过走捷径节省时间，往往会导致下游时间的浪费和资源的损耗。为避免“输入垃圾，输出垃圾”的情况，强烈建议在启动抗体生成(例如小鼠免疫或噬菌体文库筛选)之前，准备好所有试剂并验证测定方法。 试剂包括用于开发筛选试验、抗体生成和筛选的材料，以及靶标验证和机制研究的材料。常见的试剂包括cDNA、表达质粒、细胞系、纯化蛋白、对照和参考抗体，以及用于测试候选抗体物种交叉反应性的靶标直系同源物。许多制药公司通常会将试剂生产外包，以补贴内部药物发现活动。在药物发现过程中应用外包材料之前，验证其质量至关重要。例如，应由内部评估外部供应商纯化的蛋白质的纯度、聚集程度、内毒素的存在、啮齿动物病毒污染和生物活性。 筛选测定通常包括一级、二级和三级测定。一级筛选测定通常测量抗体与目标抗原的结合，以识别“命中”抗体。96孔或384孔高通量形式的酶联免疫吸附测定(ELISA)通常用作一级测定，在此测定中，待筛选的抗体与固定在ELISA板上的目标分子结合。随后用二级试剂检测结合的抗体。该测定易于设置且操作简单。此外，将目标抗原高密度包被在ELISA板上可增加抗体结合的亲和力，并增强对弱结合剂的检测。然而，ELISA形式包括许多洗涤步骤，且不易适应自动化。其他常用的一级结合测定形式包括基于均相溶液的荧光测定或基于细胞的结合测定，如荧光激活细胞分选。与ELISA方法相比，这些测定应允许目标蛋白以其天然构象呈现。图2.3显示了这些测定的示意图。 二级和三级测定旨在测量候选抗体除结合目标抗原外的所需生物活性。应用各种所谓功能测定的顺序是任意的，这通常基于通量和操作的简易性。二级测定可以是高通量筛选形式的基于板的功能测定，而三级测定是具有重要生物学相关性的低通量基于细胞的测定。例如，为了鉴定阻断配体-受体相互作用的抗体，基于板的配体/受体结合ELISA可作为二级测定，而具有信号读出的基于细胞的配体/受体结合测定可作为三级测定。如果可行，使用原代人细胞的功能测定可作为生理相关的细胞系统，并应纳入筛选策略中。 用于筛选靶标特异性结合剂的代表性抗体结合测定。 图2.3 用于筛选抗体的典型结合测定和功能测定的示意图。ECD代表细胞外结构域 筛选测定必须针对高信噪比、板间变异性以及与筛选样品的兼容性进行优化。通常，优化后的测定具有大于3至5倍的信噪比，板间变化最小，并且与代表特定筛选方法的模拟样品兼容。例如，用于筛选杂交瘤命中抗体的基于细胞的功能测定应测试与杂交瘤上清液的兼容性，以排除诸如血清效应或杂交瘤培养基颜色对荧光信号淬灭等变量。值得注意的是，抗体类治疗药物的测定优化标准不如小分子药物严格。抗体类治疗药物的精细结合特异性通常在筛选测定中转化为高测定信号和低假阳性率。 参考抗体或阳性对照抗体是有助于测定验证的有价值工具。此外，参考抗体通常用于体内概念验证研究，以验证靶标或建立疗效模型。 参考抗体可以是功能类似于预期治疗候选物的市售单克隆抗体、与感兴趣的靶蛋白功能相互作用的多克隆抗体，或从公共领域可用序列重建的抗体(例如竞争对手的专利抗体)。阴性对照抗体也很关键，特别是在基于细胞的测定和体内疗效研究中，以确定与IgG分子效应功能相关的任何生物学效应，而与其靶标结合功能无关。相对于参考抗体，阴性对照抗体应是与模型系统中表达的任何蛋白质都不结合的同种型匹配抗体(例如抗绿色荧光蛋白抗体)。 作为筛选准备的一部分，应启动动物模型的开发，在某些情况下这可能需要数年时间。在这种情况下，如果计划的动物模型不能概括人类病理学的范围，则应建立其他补充计划，如体外模型和原代人细胞系统。此外，如“项目规划”中所讨论的，对于预期产生交叉反应性抗体可能性较低的项目，应提前开发用于测试非交叉反应性先导抗体的体内模型。 2.4 早期候选抗体产生和临床候选抗体选择 产生早期抗体候选物(“命中抗体”)最常用的技术是杂交瘤和噬菌体展示平台。目前市场上的许多治疗性抗体都是使用Kohler和Milstein开发的传统杂交瘤技术产生的。目前，在抗体治疗领域，有一个强烈的趋势是开发完全人源抗体，要么使用表达人IgG代替小鼠IgG的人源化小鼠，要么使用噬菌体展示技术筛选天然和合成的人源抗体库。产生人源抗体的技术在第3章中详细描述。 不同的抗体生成技术各有其独特的优缺点。杂交瘤技术是一种经典技术，通常能产生具有所需功能活性的高亲和力啮齿动物抗体。此外，人源化已成为一种标准做法，用于减少候选抗体中的啮齿动物序列成分，并且人源化抗体通常对人类患者使用是安全的。目前已批准的抗体中近50%是经过人源化的，这一事实表明杂交瘤技术可能仍然是获得抗体疗法的主流技术。表达人IgG的转基因小鼠技术对美国食品药品监督管理局(FDA)批准的七种抗体中的六种有贡献，另外两种正在等待批准，这表明该技术的应用正在增加。然而，由于知识产权问题，该技术的获取受限可能会限制其广泛应用。使用噬菌体展示技术筛选人抗体库能够直接产生人抗体，而无需进行人源化。此外，噬菌体展示平台能够快速识别早期命中的抗体，并允许在高度可控的实验条件下，有利于分离针对难处理抗原的抗体，例如在人类和啮齿动物之间具有高度同源性的蛋白质以及有毒免疫原。通过这种方法产生的初始抗体命中可能表现出低亲和力，在这种情况下可能需要进一步进行亲和力成熟。知识产权也限制了该技术的使用。在可行的情况下，可以考虑同时进行免疫和非免疫方法，以生成一组强大的候选抗体。如前所述，通过与先导分子不同的技术平台分离的抗体可以被视为该项目的备用分子。 先导物选择是指在一个严格的、多步骤的筛选过程中对早期命中的抗体进行评估，以选择符合预先确定的标准、能够进入下一阶段药物发现的先导分子的过程。如图２.２所示的筛选模式，通过二级和三级功能测定进行筛选，可以将数百个命中的抗体快速筛选到少数几个分子。然后可以将这些分子小规模(毫克级)纯化成全IgG分子，以便进行更详细的表征，包括确认结合和功能活性以及生化和生物物理分析。常见的分子分析包括测定来自哺乳动物表达系统的表达水平、通过尺寸排阻色谱法进行聚集分析、SDS-PAGE、蛋白质免疫印迹分析、通过Biacore和KinExA分析测定靶蛋白结合亲和力以及粗略的表位作图。淘汰命中的抗体可以基于次优的靶标结合亲和力、缺乏强大的生物学功能或不良的生化和/或生物物理特性。如果没有命中的抗体表现出非常有利的特性，则可以对次优的命中抗体进行分子优化，以改善其生化和生物物理特性。 在完成体外表征后，选择的命中抗体准备好进行足够量(通常为几百毫克到几克)的表达和纯化，用于体内疗效测试。如果需要，可以在疗效研究之前进行初步的药代动力学(PK)研究，以帮助确定给药方案。对于交叉反应性抗体，可以在相关动物模型中将探索性PK/PD和毒性研究与疗效研究结合起来。通常根据已证明的体内疗效来选择先导分子，这通常是该项目继续推进与否的决策点。 2.5 候选药物优化与表征 从初始筛选中选择的先导分子通常需要额外的分子工程来赋予其类药性质，才能成为临床候选药物。常见的先导物优化做法包括啮齿动物抗体的人源化、亲和力成熟和Fc工程。这些工程方法的技术细节在第4章中描述。这里提供这些方法的概述。 人源化已成为一种标准且广泛使用的技术，用于降低最初源自啮齿动物的治疗性抗体的免疫原性。该过程是指用人类IgG序列替换亲本抗体分子中超过90%的啮齿动物IgG序列。除了对啮齿动物抗体进行人源化外，该领域目前还致力于将其他非人类抗体转化为人类治疗药物，并且人源化已应用于源自兔、鸡和骆驼科动物的治疗候选物。 亲和力成熟通常应用于使用展示技术从天然人源文库中筛选出的抗体先导物。这些先导物可能具有相对较低(10-100nM)的靶标结合亲和力，但可通过各种亲和力成熟技术提高，以达到所需的亲和力范围(通常为0.1-10nM)。此外，在某些需要高亲和力抗体的特殊情况下，对于已经表现出低纳摩尔结合亲和力的抗体，还会进一步进行亲和力成熟。例如，可能需要极高亲和力的抗体(即皮摩尔范围)来有效阻断细胞因子与其受体的结合。然而，值得注意的是，高亲和力并不总是与疗效改善相关。与快速内化靶标结合的高亲和力抗体可能会促进抗体从循环中快速清除和消除，导致体内半衰期较短，这是不利的。 IgG1分子的Fc区域是一个功能性分子实体，介导: (1)通过与自然杀伤(NK)细胞上的Fcγ受体(FcγR)结合实现的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)， (2)通过C1q结合实现的补体依赖的细胞毒性(CDC)，以及 (3)通过与新生儿Fc受体(FcRn)结合实现的体内半衰期延长。 已经探索了改变这些活性中的每一种，以在特定应用中调节IgG的功能。例如，探索增强ADCC以增强抗体介导的肿瘤细胞杀伤，这可以通过在接触残基中进行定点突变来增强Fc与FcγR的结合，或去除Fc的岩藻糖基化来实现。此外，已经在Fc/FcRn接触位点进行定点突变，以增加IgG分子的半衰期。在产生优化的先导物后，进行功能和分子表征，以确认其作为治疗候选物的体外和体内活性以及良好的分子特性。 2.6 临床候选药物的选择 优化后的先导分子必须经过一系列严格评估，这些评估构成候选物选择过程；在这个过程结束时，要就该抗体是否符合临床候选物的标准做出关键决定。选择临床候选物是一个里程碑式的决定，标志着利益相关者承诺将治疗性抗体候选物推进到人类患者的临床试验中。 在继续进行之前必须满足的核心标准包括: (1)在细胞和/或动物模型中明确证明抗体候选物的疗效，且该疗效被认为可转化为人类疾病的疗效， (2)已在动物中完成剂量反应研究，以指导早期临床开发中的给药方案， (3)已完成临床前药理学和药代动力学研究，以支持临床给药途径和方案， (4)临床前药理学安全风险被认为较低和/或可接受， (5)证明候选抗体所需的生化和生物物理特性以及临床材料的最佳配方，以及 (6)已对候选分子的可制造性进行了严格评估，并已开发出制备大量临床材料的工艺(见第15章)。 除上述核心标准外，还应满足以下条件: (1)已提交关于候选抗体的专利申请，且任何知识产权问题已得到妥善解决， (2)生物标志物的应用已纳入早期临床计划(第13章)， (3)已进行初步的全球市场研究并获取了竞争定位信息，以及 (4)已确定初步的目标产品概况和早期临床计划。 候选物选择也代表着从早期发现阶段到临床开发阶段的过渡。在这个过渡期间，通常会评估一个或几个候选物以进行优化，以促进工艺开发和可制造性。这通常涉及根据发现过程中获得的数据评估表达或滴度，这些数据可能包括来自瞬时表达或稳定转染到CHO宿主细胞系中的细胞池的数据。在瞬时HEK-293系统中，低于50mg/L的滴度可能在提供用于发现研究的材料方面带来挑战。虽然瞬时系统中的表达滴度与随后的稳定哺乳动物细胞系中的滴度之间似乎没有直接相关性，但低于50mg/L的瞬时表达滴度将是一个潜在问题；在开发过程中可能需要密切监测这些表达水平，以确保在稳定转染的哺乳动物细胞系中实现可接受的表达滴度。 评估抗体候选物在优选制剂或一组制剂中聚集和降解的倾向是早期评估过程的重要组成部分。聚集可能发生在生产的各个阶段，控制最终产品中的聚集水平可能具有挑战性。除了聚集之外，还会在早期评估重要的降解途径，如氧化、脱酰胺、异构化和肽键断裂，通常在多个温度下进行评估(第４章和第15章)。通常，会在更极端的条件下进行加速稳定性研究，以了解特定候选物或一组候选物的主要降解途径。必须认识到，由于不同的降解途径可能以不同的速率加速，因此需要仔细分析这些研究，并且这些研究可能无法代表标准条件下各种杂质的分布甚至特定组成。候选物的早期评估主要旨在识别那些在开发过程中可能面临重大挑战的候选物。如果正在考虑开发多个候选物，则可以基于一组数据进行选择，包括但不限于疗效、耐受性和稳定性。早期制剂研究有助于为选择决策提供信息，如果候选物在早期评估中显示出特别差的稳定性，则可能是候选物选择的重要决定因素。 在此阶段可能会进行额外的体外和离体安全性评估，例如筛选候选抗体激活免疫细胞的能力。自2006年TG1412(Parexel International)一期试验以来，该检测方法已被制药行业广泛采用，在该试验中一种人源化的“超级激动剂”抗CD28抗体在六名健康志愿者中引发了一种被称为“细胞因子风暴”的全身性炎症反应。潜在的病理机制与TG1412交联T细胞上的CD28有关，触发不受控制的细胞因子释放并导致危及生命的结果。 开发生物标志物以促进靶向患者群体的选择和在临床试验中测量确定的药理学终点，应与先导优化过程并行进行。生物标志物开发是药物开发过程的一个组成部分，也是临床试验不可或缺的一部分。验证一个生物标志物通常需要数月至数年的时间，并且需要深入了解与治疗方案相关的生物学、病理学和治疗机制。因此，必须为这项活动分配大量资源和足够的时间。第13章和第14章讨论了生物标志物的重要性及其在抗体治疗开发计划中的贡献。 候选物选择是最重要的发现里程碑，标志着发现活动的结束和实验药物临床测试阶段的开始。在收集了关于先导分子的综合数据包并由包括发现科学、制造、药物安全、药物代谢、监管、法律、商业以及临床等各个学科的一组专家进行评估之后，才会到达这个决策点。值得注意的是，推进或终止候选分子的决定很少基于单一因素，而是在对候选分子的集体属性进行仔细和详尽的风险效益计算之后做出的。 end 本公众号声明： 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