克服KRAS-G12C耐药的变构TEAD抑制剂设计

2023-07-31

临床结果

Hippo 信号通路控制着包括细胞增殖、存活和分化在内的多种细胞功能，而 Hippo通路的信号异常也涉及多种病理，包括癌症，免疫等。研究表明，Yes相关蛋白（YAP, Yes-associated protein）和基于PDZ结合基序的转录共激活子（TAZ, Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 是 Hippo 通路下游的转录共激活因子，正常情况下，YAP/TAZ会在细胞质内被磷酸化并最终被降解。相关基因的过表达、扩增或其上游的神经纤维瘤蛋白 2 (NF2，Neurofibromine 2)的缺失均会激活YAP/TAZ，去磷酸化的YAP/TAZ则会易位至细胞核内，并与转录增强相关结构域家族（TEAD1-4, Transcriptional enhanced associate domain1-4）结合，进而驱动细胞的增殖与存活。同时，YAP/TAZ的激活与肿瘤靶向治疗耐药性的产生也有关——在Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）驱动的癌症小鼠模型中，YAP的激活可以补偿KRAS抑制。因此，YAP/TAZ与TEAD间的蛋白-蛋白相互作用（PPI, Protein-protein interaction）是潜在的重要靶点。随着TEAD上脂质口袋的发现，一些 TEAD小分子抑制剂得到了开发。但这些早期发现的TEAD小分子抑制剂并不能有效抑制YAP/TAZ与TEAD间的相互作用，其活性和抗增殖能力有限。近日，美国基因泰克和罗氏公司研究团队合作，发现了能够与TEAD脂质口袋结合，并且通过变构调节抑制YAP/TAZ与TEAD间的相互作用的强效泛TEAD小分子抑制剂GNE-7883，该抑制剂的抗增殖活性及体内抗肿瘤活性已得到证实，并且其有望能够克服KRAS-G12C的原发性耐药和获得性耐药。首先，研究团队使用TEAD3-YAP时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET，Time-resolved fluorescence resonance energy transfer）分析方法对>200万种化合物进行了高通量筛选，鉴定出了以化合物1（TEAD3–YAP IC50 = 1.4 μM）为代表的活性分子，在后续的研究中，化合物1表现出了对TEAD1-4的选择性趋势；此外，化合物1在脂质置换实验中也表现出了对TEAD1-4相同的选择趋势。结合以上实验结果，可以推测化合物1能够通过与TEAD蛋白上的脂质口袋产生相互作用，通过变构机制影响YAP/TAZ和所有人类TEAD亚型的相互作用。随后，研究团队试图通过引入一些亲脂性基团来增强化合物与TEAD脂质口袋之间的范德华作用力来获得活性更优的化合物。将化合物1的三氟甲基替换成亲脂性的环己基，将乙酯替换成2-氰基环戊酰胺后衍生出的化合物2表现出了与TEAD脂质口袋更强的结合能力，TEAD与YAP和TAZ的PPI抑制作用也有明显的提高；同时，化合物2对YAP 扩增的 OVCAR-8细胞及NF2缺失的HCC1576细胞中表现出了抗增殖作用，而在对照VMRC-LCD细胞中未表现出抗增殖效果。通过分析化合物1、化合物2与TEAD2的共晶结构，研究团队发现化合物1与TEAD2的K357、Q410、S345及C380之间存在氢键作用；而化合物2并未与Q410和S345之间形成相互作用，而是在水分子的介导下与Y333, E359, S331及 S377间形成了氢键相互作用。鉴于在所有TEAD亚型中，S345均能够与配体产生关键的保守氢键，为提高化合物的泛TEAD抑制活性，研究团队又在化合物2的母核上引入了极性的吡嗪基团，使得化合物能够与S345形成关键氢键，并对酰胺片段进行了替换以平衡化合物的整体极性。结果表明，化合物3的泛TEAD活性有了明显的提高。在化合物3的吡嗪片段上继续引入甲基，得到了衍生物GNE-7883，该小分子除了能够与S345（TEAD2）形成氢键作用外，还与S377，L374及 V329之间通过水分子介导形成了氢键网络。根据GNE-7883与TEAD2的共晶结构，可发现该小分子与TEAD2的结合并未明显改变TEAD2的PPI界面，而是与结合位点2邻近的脂质口袋有相互作用。随后，研究团队借助核磁共振氟谱（19F-NMR, 19F-Nuclear magnetic resonance spectroscopy）和生化探针（TEAD2的结合肽S2和S3）进行均相时间分辨荧光（HTRF, Homogeneous time-resolved fluorescence）实验。实验结果表明，在未加入GNE-7883时， S2和S3能够正常与TEAD2相结合，游离的S2与S3信号大大减弱；而GNE-7883的加入，使得游离的S2信号增强，而游离的S3信号未受影响，以上实验结果验证了此类小分子是通过改变结合位点2的空间构象来阻断YAP/TAZ与TEAD2间的相互作用。并且，研究团队发现此类小分子化合物并不会改变YAP/TAZ在细胞核或细胞质中的定位。通过对染色质转座酶可及性测序（ATAC-seq, Assays for transposase-accessible chromatin using sequencing），研究团队发现用GNE-7883处理OVCAR-8细胞 48小时可导致OVCAR-8细胞中染色质的特异性重构，有效降低TEAD位点染色质可及性。为了考察GNE-7883的体外活性，研究团队开展了相关实验，发现GNE-7883在OVCAR-8细胞和多种NF2缺失的肿瘤细胞系模型中可抑制细胞增殖。为了探究GNE-7883的体内药效，研究团队对 NCI-H226 异种移植模型进行了为期 4 天的治疗（100 或 250 mg/kg，每天一次）。肿瘤组织分析表明，在使用 GNE-7883 的情况下，YAP/TAZ 靶点得分呈剂量依赖性下降，化合物的血药浓度也呈剂量依赖性上升，化合物药代动力学和药效学效应之间存在良好的相关性。接下来，研究团队在两种常用的 YAP/TAZ 依赖性异种移植模型中进行了药效研究，结果表明GNE-7883 能够阻滞肿瘤的生长或导致肿瘤消退，并且，实验过程中没有观察到与治疗相关的体重下降。之前的报道指出，YAP/TAZ和Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物/丝裂原活化蛋白激酶（KRAS/MAPK）通路下游的转录程序已被证明在多个水平上相互交织，并且，研究团队发现KRAS-G12C抑制剂索托拉西布（Sotorasib）KRAS-G12C抑制剂索托拉西布（Sotorasib）耐药性细胞NCI-H358-R中出现了明显的YAP向细胞核的严重易位，进一步证实了 YAP/TAZ 的激活是Sotorasib的耐药机制之一。由此，研究团队开展了进一步的实验以考察GNE-7883能否通过抑制YAP/TAZ的激活有效克服肿瘤对Sotorasib的抗性。实验结果表明，Sotorasib和GNE-7883的联合使用能够在体外模型及体内模型中发挥抗肿瘤药效。除非小细胞肺癌（NSCLC，Non-small cell lung cancer）外，KRAS-G12C 突变也见于多种实体瘤。与 NSCLC 相比，伴有 KRAS-G12C 突变的结直肠癌（CRC, Colorectal cancer）KRAS-G12C 突变的结直肠癌（CRC, Colorectal cancer）对Sotorasib和其他 KRAS-G12C 抑制剂的反应性要低得多，CRC 似乎在本质上对 KRAS-G12C 抑制剂更具抵抗力。为了评估泛 GNE-7883是否能增强 KRAS-G12C 抑制剂在这种更难治疗的适应症中的药效，研究团队还使用同剂量的GNE-7883在结直肠 SW837 异种移植模型上做了验证。实验结果表明，与单用Sotorasib的实验组相比较，GNE-7883和Sotorasib的联合用药能够更好地抑制肿瘤的生长。除非小细胞肺癌（NSCLC，Non-small cell lung cancer）外，KRAS-G12C 突变也见于多种实体瘤。与 NSCLC 相比，伴有 KRAS-G12C 突变的结直肠癌（CRC, Colorectal cancer）KRAS-G12C 突变的结直肠癌（CRC, Colorectal cancer）对Sotorasib和其他 KRAS-G12C 抑制剂的反应性要低得多，CRC 似乎在本质上对 KRAS-G12C 抑制剂更具抵抗力。为了评估泛 GNE-7883是否能增强 KRAS-G12C 抑制剂在这种更难治疗的适应症中的药效，研究团队还使用同剂量的GNE-7883在结直肠 SW837 异种移植模型上做了验证。实验结果表明，与单用Sotorasib的实验组相比较，GNE-7883和Sotorasib的联合用药能够更好地抑制肿瘤的生长。综上，研究团队在此篇文章中介绍了一种强效的泛TEAD抑制剂GNE-7883，尽管其药物代谢特性还有待改善，但该小分子能够在与TEAD上的脂质口袋结合的同时致使其发生构象变化，进而阻断YAP/TAZ与TEAD之间相互作用，具有在精准肿瘤学研究和治疗肿瘤耐药方面的应用前景。参考文献Hagenbeek, T.J., Zbieg, J.R., Hafner, M. et al. An allosteric pan-TEAD inhibitor blocks oncogenic YAP/TAZ signaling and overcomes KRAS G12C inhibitor resistance. Nat Cancer 4, 812–828 (2023). https://doi.org/10.1038/s43018-023-00577-0