全反式维甲酸佐剂mRNA疫苗，特异性激活肠黏膜抗肿瘤免疫应答！

2024-04-03

信使RNA临床1期疫苗临床结果免疫疗法

结直肠癌是全世界第三大癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。结直肠癌的主要治疗方法是手术切除、放化疗和靶向治疗，然而临床治疗手段效果有限，复发率仍然很高。mRNA肿瘤疫苗通常通过肌肉注射或静脉注射给药，激活引流淋巴结中的抗原呈递细胞，例如树突状细胞（DC），并触发抗原特异性细胞毒性T细胞的产生。然而，结直肠癌发生在粘膜表面（0期），并逐渐生长到内壁（I期）和肠壁（II期）。由于在解剖学上的功能距离和区室化，mRNA疫苗激活的DC和T细胞在治疗结直肠癌上的疗效有限。尽管口服或直肠免疫已被提议作为在肠道中引发粘膜免疫反应的首选策略，然而渗透效果不佳以及胃肠道环境中抗原和载体系统的不稳定性仍然是需要克服的挑战性障碍。因此，开发以系统给药的方式有效激活肠道粘膜表面抗肿瘤免疫反应的mRNA疫苗对于提高治疗结直肠癌的疗效至关重要。3月25日，中国科学院化学研究所吕雪光课题组联合北京大学药学院苗蕾课题组在Advanced Science上发表了题为：“All-Trans-Retinoic Acid-Adjuvanted mRNA Vaccine Induces Mucosal Anti-Tumor Immune Responses for Treating Colorectal Cancer”的研究论文。本研究在脂质、胆固醇和mRNA的自组装过程中直接掺入全反式维甲酸（维A酸）ATRA，成功制备了具有不同ATRA含量的LNP（ATRA-LNP）。这类ATRA-LNP有效激活了引流淋巴结中的树突状细胞，引发了强烈的全身性T细胞反应，并有效增加了抗原特异性细胞毒性T细胞在原位结直肠肿瘤中的浸润。增强的黏膜抗肿瘤免疫反应大大改善了小鼠对原位结直肠肿瘤模型的肿瘤抑制。全反式维甲酸（ATRA）是一种天然存在的维生素A（视黄醇）衍生物，在淋巴细胞运输和粘膜免疫中起着至关重要的作用。ATRA通过诱导趋化因子受体9型（CCR9）和α4β7整合素的表达，分别与肠上皮细胞表达的趋化因子配体25（CCL25）和肠道相关淋巴组织中表达的粘膜地址细胞粘附分子-1（MAdCAM-1）结合，使活化的T细胞具有肠道趋向性。研究表明，共递送蛋白质抗原和ATRA可引起全身和粘膜免疫反应。单独施用高剂量ATRA（~300μg）时，观察到抗原特异性肠道IgA反应。ATRA-LNP的制备表征本研究采用了Moderna使用的SM-102，DSPC，DMG-PEG2000和胆固醇配方和比例，mRNA可电离脂质的氮磷比（N/P）为5.67。将ATRA溶解在脂质乙醇相中，通过微流控装置与荧光素酶mRNA（mLuc）混合。动态光散射测量表明，具有不同ATRA含量的LNP均成功制备，其流体动力学直径和多分散指数（PDI）与不含ATRA的LNP几乎相同（图1b,c）。ATRA-LNP表现出球形形态，如低温电子显微镜（Cryo-EM）图像所示（图1e）。ATRA的掺入不影响LNPs的mRNA包封效率，通过高效液相色谱法测定，ATRA在LNP中的包封效率约为76%。ATRA-LNP的表面电荷比SM102-LNP更负，并且随着ATRA量的增加而降低（图1d）。ATRA-LNP在4和37℃下保持其胶体稳定性至少50天（图1f，g）。图1. ATRA-LNP的制备和表征ATRA-LNP的递送效率为了研究ATRA是否影响体外LNP的mRNA递送，将裸mRNA和SM102-LNP作为对照，测量各组与DC2.4细胞共孵育后荧光素酶的表达。其中，裸mRNA组无法检测到荧光素酶表达信号，SM102-LNP表现出非常高的mRNA递送效率，而ATRA-LNP的转染效率是SM102-LNP的约2.5倍。基于这一结果，研究继续探究了ATRA对不同LNP的DC细胞转染改善作用。在包括使用ALC-0315、cKK-E12、L-319和MC-3的LNP组中，均观察到mRNA转染效率的提高，证明ATRA可作为提高体外LNP-mRNA递送效率的一般策略。图2. ATRA对不同LNP配方转染效率的提高作用在雌性C57BL/6小鼠的体内实验中，均观察到SM102-LNP和ATRA-LNP组在注射位点有较强的mRNA表达，肝脏中的mRNA表达较低。IVIS图像定量显示，在所有测试时间点，ATRA-LNP的mRNA表达都高于SM102-LNP（图2d），ATRA-LNP的平均曲线下面积（AUC）比SM102-LNP高约42%（图2e），表明ATRA-LNP在体内也改善了LNP的mRNA表达。ATRA的递送改善机制LNP-mRNA递送效率很大程度上取决于其细胞摄取和内体逃逸效率，因此，研究采用了荧光素酰胺（FAM）标记的寡核苷酸（FAM-A20）作为细胞摄取的评估标志物。与SM102-LNP相比，ATRA-LNP的细胞摄取约为1.7倍（图2f）。此外，研究还采用了荧光染料标记的脂质NBD-PE和N-Rhod-PE构建了内体评估模型。如图2h所示，与SM102-LNP相比，ATRA-LNP表现出更高的融合能力。总的来说，这些结果表明，将ATRA掺入LNP中改善了其细胞摄取和内体逃逸，从而增强了mRNA的表达。这一发现可能对开发更有效的LNP-mRNA疗法具有重要意义。ATRA的靶向机制和免疫功能性增强T细胞肠道归巢受体的表达在T细胞活化过程中，ATRA的存在被证明能诱导CCR9和α4β7的表达，从而使T细胞具有肠道趋向性。与PBS组相比，ATRA-LNP和裸ATRA均显著增加了CD8和CD4 T细胞上CCR9和α4β7的表达。与裸ATRA处理相比，ATRA-LNP处理增加了约59%的CD3CD8CCR9、14%的CD3CD8α4β7和71%的CD3CD8α4β7CCR9 T细胞群，表明ATRA-LNP在诱导CD8 T细胞的肠道归巢受体方面具有更高的疗效，ATRA-LNP较裸ATRA具有更好的水溶性。图3. ATRA-LNP诱导T细胞肠道归巢受体表达激活体内全身和黏膜免疫反应通过肌肉注射给雌性C57BL/6小鼠接种每剂含有10μg mOVA的SM102-LNP或ATRA-LNP，并在一天后分离流淋巴结以评估DC的激活。ATRA-LNP显示出与SM102-LNP相似的DC活化功效，表明ATRA对DC活化没有贡献。在首次接种疫苗后第22天分离脾细胞，并分析抗原特异性细胞毒性T细胞群。ATRA-LNP处理组脾细胞中OVA四聚体CD8CD3 T细胞的数量分别是SM102-LNP和PBS处理组的约1.6倍和16倍，表明ATRA-LNP更有效地激活了系统性T细胞反应。此外，研究还分离了肠道的固有层，并检验了抗原特异性CD8 T细胞群。与SM102-LNP相比，ATRA-LNP显著增加了OVA四聚体CD8CD3 T细胞的数量，这表明ATRA-LNP激活的T细胞具有肠道归巢性。接下来，研究团队使用小鼠皮下MC38-OVA模型评估了ATRA-LNP或SM102-LNP封装mOVA的治疗效果。SM102-LNP对原位MC38-OVA肿瘤几乎没有治疗效果，但极大地抑制了皮下MC38-OVA肿瘤的生长，延长了动物存活率，表明LNP-mRNA癌症疫苗对治疗皮下肿瘤有效，但对治疗原位结直肠肿瘤的疗效有限。与SM102-LNP相比，ATRA-LNP显示出相似的治疗效果。与PBS治疗相比，空白ATRA-LNP（无mOVA）治疗显示出相当的肿瘤生长和生存率，表明ATRA本身并不直接抑制肿瘤生长。因此，相较于传统LNP，ATRA-LNP的意义在于更好诱导T细胞的肠道归巢效应，并以此增强肠道抗肿瘤免疫反应。此外，流式细胞术分析显示，ATRA-LNP增强了肿瘤和肠系膜淋巴结中的CD8和CD4 T细胞浸润，诱导了先天性炎症生态位，有可能引发适应性免疫。ATRA-LNP还增加了M1与M2型巨噬细胞的比率，表明其减缓了肿瘤微环境的免疫抑制性。总结本研究中，将ATRA掺入LNP不仅增强了其mRNA递送效率和脾脏中的全身T细胞反应，而且使活化的T细胞具有肠道趋向性，显著增加了细胞毒性T细胞对原位结直肠肿瘤的浸润，从而增强了治疗效果。这些结果表明，ATRA可以用作mRNA疫苗的佐剂，以增强肠道中的粘膜免疫反应。此外，由于ATRA的掺入并不改变LNP-mRNA的制备过程，也有利于生产放大。参考资料[1]Li W, Li Y, Li J, Meng J, Jiang Z, Yang C, Wen Y, Liu S, Cheng X, Mi S, Zhao Y, Miao L, Lu X. All-Trans-Retinoic Acid-Adjuvanted mRNA Vaccine Induces Mucosal Anti-Tumor Immune Responses for Treating Colorectal Cancer. Adv Sci (Weinh). 2024 Mar 25:e2309770. doi: 10.1002/advs.202309770.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。