【Nature子刊】第二代强效BCL-2/BCL-xL降解剂的开发和晶体结构

2024-04-05

蛋白降解靶向嵌合体临床结果临床1期

近日，由美国德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心生物化学与结构生物学系和格里希儿童癌症研究所的研究团队在Nature Communications期刊发表了题为“Development and crystal structures of a potent second-generation dual degrader of BCL-2 and BCL-xL”的文章。该研究基于前期工作开发了针对BCL-2和BCL-xL的第二代双降解剂，并解析了相关的分子机制。BCL-2蛋白家族的成员是细胞凋亡的关键调节因子，包括抗凋亡（BCL-2、BCL-xL、MCL-1等）和促凋亡（BAD、BIM、PUMA、BAK、BAX等）蛋白。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的相对丰度控制着细胞命运并维持体内平衡。在肿瘤发生过程中，癌细胞通过过表达抗凋亡蛋白来逃避细胞凋亡，从而帮助肿瘤发生、进展和耐药性的发展。因此，作为癌症治疗的策略，人们一直关注开发针对BCL2蛋白家族的小分子抑制剂和降解剂。2021年该团队在Nature Communications发表了针对BCL-xL和BCL-2的双降解剂753b，但该PROTAC涉及的特异性分子机制仍然未知。在这项研究中，作者确定了753b介导BCL-xL/BCL-2靶向降解的分子基础，并解析了VHL/753b/BCL-xL和VHL/753b/BCL-2三元配合物的晶体结构。而且作者发现这两种三元复合物表现出明显不同的结构，在VHL/753b连接子/靶标界面上展现不同的相互作用网络。更进一步，作者基于结构开发出了降解BCL-xL/BCL-2更强效力的降解子WH244，并解析了VHL/WH244/BCL-2的晶体结构和阐明了其提高有效性的潜在机制。首先，为最大限度地提高获得衍射质量晶体的概率，作者优化了一种获得纯三元配合物的生化复溶策略，将蛋白质和753b混合物使用凝胶过滤柱进一步纯化，对均相三元配合峰进行汇集、浓缩和结晶试验。经过大量优化，获得了VCB/753b/BCL-2（以下简称BCL-2753b）和VCB/753b/BCL-xL（以下简称BCL-xL753b）的三元配合物结构。最终的BCL-2753b和BCLxL753b结构在2.56 Å和2.94 Å分辨率下分离，R/Rfree值分别为0.20/0.25和0.20/0.24（图1）。图1其次，作者通过晶体结构发现了753b连接BCL-2和VHL的重要氨基酸残基，并通过生化测定发现将重要的氨基酸位点突变会破坏三元复合物，导致BCL-2完全缺乏多泛素链形成。但令人惊讶的是，BCL-xL753b中的BCL-xL与BCL-2753b中的BCL-2相比具有截然不同的结晶构像。来自BCL-xL753b和BCL-2753b结构的VHL亚基的叠加表明，由于PROTAC的路径改变，BCL-xL和BCL-2相对于彼此旋转近180°，并伴有~14 Å的平移。与BCL-2753b复合物不同，BCL-xL不与VHL配体相互作用（图2）。图2接着，基于BCL-xL/2与753b的两个三元复合结构，作者用更刚性的1,4-二甲基哌嗪取代了753b的柔性烷基链，进一步开发了新的PROTAC，WH244，而刚性连接子将保持复合物的整体三级排列结构，以有效地降解BCL-xL和BCL-2。通过一系列实验评估，与753b相比，WH244表现出更高的效力。此外，WH244介导的BCL-xL和BCL-2的蛋白水解具有时间依赖性，而且确认BCL-xL/BCL-2的蛋白水解是通过蛋白酶体UPS介导的。作者还评估了WH244的抗肿瘤功效，在Jurkat细胞中WH244表现出优于753b、DT2216和ABT263的效力（图3）。图3为了评估WH244和753b诱导的BCL-xL和BCL-2的降解效率，作者还通过CRISPR Cas9技术生成了内源性HiBiT敲入BCL-xL和HiBiT敲入BCL-2的HeLa细胞。进一步在编辑的细胞中进行了时间过程测定，确认WH244诱导的BCL-xL和BCL-2降解速度快于753b。为进一步评估753b和WH244对BCL-xL/BCL-2蛋白的细胞选择性，作者进行了多重串联质谱（TMT）标记质谱蛋白质组学实验和不同的蛋白质组学分析技术（即数据独立采集（DIA）蛋白质组学方法）来表征BCL-xL和BCL-2双PROTAC的靶向和脱靶效应，发现753b和WH244都显示出降解BCL-xL和BCL-2的能力，其中WH244在降解这两种蛋白质方面表现出卓越的功效。作者最后通过AlphaLISA和NanoBRET进行了体外三元复合物形成测定，观察到与753b相比，BCL-xL和BCL-2都与WH244形成了更紧密的复合物（图4）。图4最后为深入研究WH244的分子机理，作者尝试了共结晶WH244介导的三元配合物，并获得了VCB/WH244/BCL-2（以下简称BCL2WH244）的复合物衍射晶体。将BCL-2WH244结构细化为2.98 Å分辨率，R/Rfree值为0.23/0.29。作者还采用多泛素链形成测定法发现了BCL2的重要氨基酸残基位点（图5）。而且作者还分析了BCL-2WH244三元复合物与BCL-xL753b和BCL-2753b的差异，发现BCL-2在BCL2WH244中的取向相对于BCL-2753b结构中的取向完全改变，而是与BCL-xL753b结构中的BCL-xL相似。总的来说，作者认为WH244的功效增强可归因于极性1,4-二甲基哌嗪接头的整合和在BCLxL/BCL-2配体中使用桥接吗啉，这种整合导致了更稳健的二元复合物，因此BCL2WH244的三元复合物也明显更强。图5本文作者：BC声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓