Mcl-1

前言 粘蛋白（MUC）家族是一组高度糖基化的大分子，在哺乳动物上皮细胞中大量表达。粘蛋白有助于粘液屏障的形成，因此对感染具有保护作用。有趣的是，一些MUC蛋白在癌细胞中异常表达，并参与肿瘤的发生和发展，包括细胞生长、增殖、凋亡抑制、化疗耐药、代谢重编程和免疫逃避。 由于其独特的生物学和结构特征，MUC蛋白被认为是某些癌症的重要生物标志物，以及非常具有前景的治疗靶点。 粘蛋白的结构和分类 粘蛋白分为两类：分泌粘蛋白和跨膜粘蛋白。分泌性粘蛋白包括凝胶形成粘蛋白和非凝胶形成粘蛋白，包括MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC9（OVGP1）和MUC19。跨膜粘蛋白还包括一个跨膜结构域和一个细胞内结构域，包括MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC12、MUC13、MUC14（内皮粘蛋白）、MUC15、MUC16、MUC17、MUC20、MUC21和MUC22。 跨膜粘蛋白是单次跨膜的I型膜蛋白，其N端胞外区域包括串联重复序列（TR）结构域、SEA（海胆精子蛋白-肠激酶-聚集蛋白）结构域和/或EGF（表皮生长因子）样结构域。TR结构域包含数量可变的重复氨基酸序列，富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸（S/T/P）。这些S/T/P残基是O-连接N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）加成的位点，以启动进一步的N-连接糖基化链反应。TR结构域由于其高度糖基化的结构而成为这些分子的物理和化学特征的基础，例如润滑或免疫保护。 SEA结构域有一个高度保守的裂解位点，位于细胞膜外侧附近。跨膜粘蛋白的蛋白水解裂解将它们分成一个N端亚单位（包含TR结构域）和C端亚单位（包含跨膜和细胞质结构域）。这两个亚单位可以形成一个非共价且稳定的复合物。EGF样结构域与一些生长因子序列同源，并与ErbB受体等生长因子受体相互作用。 MUC1是第一个被识别的粘蛋白，也称为EMA（肿瘤相关上皮膜抗原）或CD227，是一种大的糖基化蛋白质，根据糖基化状态，其预期分子量在120到500 kDa之间。MUC1中的可变数量串联重复序列（VNTR）域由20个氨基酸（PAPGSTAPPAHGVTSAPDTR）的20–125个重复序列组成。MUC1还包含110个氨基酸长度的SEA、短跨膜区和74个氨基酸的胞内区。其胞内结构域具有几个短的（4~9个氨基酸）蛋白质结合基序，促进其与GSK3β（糖原合成酶激酶3β）、β-连环蛋白、GRB2（生长因子受体结合蛋白2）、SRC和ESR1（雌激素受体1）的相互作用。此外，它还拥有一个p53结合区，这是一个相对较长的37个氨基酸序列。 MUC16（CA125）是最大的跨膜粘蛋白，由于已知MUC16在卵巢癌细胞表面过表达并分裂/脱落到血液中，因此它是卵巢癌的一种公认的血清生物标记物。MUC16包含约14000个氨基酸，分子量在1.5到5 MDa之间。MUC16包含三个主要结构域：N端结构域（MUC16-N）、串联重复结构域（MUC16-TR）和C端结构域（MUC16-C）。其N-末端结构域在一个约12000个氨基酸长的富含苏氨酸区域内包含多个富含丝氨酸的区域，该区域仅为O-糖基化。TR结构域包含156个氨基酸的12~60个重复序列，具有散布的SEA结构域，其中包含O-连接和N-连接的糖基化位点。MUC16的C端结构域包括一个胞外结构域、短跨膜区和一个32个氨基酸的胞内结构域。 跨膜粘蛋白在肿瘤发生中的作用 肿瘤发生是一个复杂的过程，涉及细胞内外的各种事件，许多报道表明，跨膜粘蛋白可能在肿瘤发生和进展中发挥多种作用。 促进癌细胞增殖 癌细胞的基本特征之一是由异常生长信号通路维持的无限增殖潜能。致癌突变或受体酪氨酸激酶（RTK）的过度表达赋予生长因子信号的组成性激活。MUC1的细胞质结构域具有多个蛋白质结合基序和磷酸化位点，已知RTK与MUC1直接相互作用可以产生致癌信号。 ErbB是一个RTK家族，MUC1与所有ErbB家族受体相互作用，相互传递致癌信号。此外，MUC1还与成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）结合，FGFR3是肿瘤发生中的另一个关键RTK。在FGF1配体刺激下，FGFR3与MUC1相互作用并磷酸化MUC1细胞质结构域的YEKV基序。 抗凋亡作用 癌症的另一个重要标志是抗凋亡细胞死亡。癌细胞通过各种机制逃避应激诱导的凋亡，MUC1具有促进这种生存的保护作用。首先，MUC1通过DNA复制机制或抗癌药物的作用减弱DNA损伤引起的遗传毒性应激。MUC1通过与p53调节域和p53反应元件的直接关联来调节p53依赖性基因转录。另一方面，MUC1通过转录多药耐药（MDR）基因直接利用药物外排系统，据报道，该基因可保护肺癌和胰腺癌细胞免受化疗的影响。 MUC1可以减弱线粒体凋亡因子，如细胞色素c或Bcl-xL，保护癌细胞免受阿糖胞苷、吉西他滨和顺铂等抗癌基因毒素的侵害。此外，MUC1还通过清除氧化应激为癌细胞提供生存优势，MUC1去磷酸化并激活FOXO3a，FOXO3a激活诱导其核定位和随后的ROS清除基因转录激活。 MUC16也被认为在癌细胞中起着抗凋亡的作用。MUC16 c端结构域的异位表达诱导卵巢癌细胞对顺铂产生耐药性，该作用是通过抑制p53介导的。尽管其结合蛋白和耐药表型的确切分子机制尚不清楚，但MUC16的胞内结构域被认为具有与MUC1相当的信号作用。 能量代谢重编程 各种癌症组织中粘蛋白表达的改变被认为是能量代谢重编程的调节因素。一项早期研究中证明MUC1可以增加胰腺癌患者的糖代谢水平。在原位胰腺癌小鼠模型中，MUC1过表达也与葡萄糖摄取增加以及HIF-1α、GLUT1和LDHA蛋白表达相关。 脂质代谢的改变也与癌症的进展有关。一项研究提出了一个包含38个基因的子集，命名为MLMS（MUC1诱导的脂质代谢信号），由与MUC1转化的3Y1细胞中脂质代谢相关的差异表达基因组成。在tamoxifen治疗的乳腺癌患者中，MLMS过度表达与不良预后相关，表明脂质代谢改变可能导致tamoxifen耐药。 EMT与转移 最近，一系列研究支持了粘蛋白在乳腺癌和胰腺癌EMT中的作用。对MUC1过表达细胞和敲除小鼠模型的分析表明，胰腺癌中MUC1强烈影响EMT过程。例如，当MUC1胞内结构域中的所有酪氨酸残基被苯丙氨酸取代时，EMT被阻断。该MUC1突变体不能与β-连环蛋白结合，因此无法转移到细胞核以促进EMT基因的转录。 MUC16也是胰腺癌中EMT的介质，其敲除导致癌细胞在体外迁移减少，在体内转移减少。事实上，最近描述的MUC16和FAK之间的相互作用被认为是胰腺癌转移的一种机制。 逃避免疫监视 由于在正常上皮细胞中表达的粘蛋白在抵抗细菌感染的粘膜免疫中具有重要作用，癌症相关粘蛋白被认为可以调节肿瘤免疫。粘蛋白参与多种策略以逃避宿主免疫，包括（1）阻断免疫细胞和癌细胞之间的相互作用，（2）通过共刺激或共抑制分子调节免疫细胞信号，以及（3）调节促炎细胞因子的产生。由于其胞外区域的巨大糖基化结构，粘蛋白对细胞间的相互作用具有抑制作用。 TCGA样本的免疫细胞浸润分析表明粘蛋白mRNA表达与肿瘤细胞毒性淋巴细胞浸润之间存在强烈的负相关。此外，癌细胞表面过度表达的MUC1和MUC4为癌细胞和细胞毒性淋巴细胞之间的结合提供了空间障碍，导致癌细胞裂解减少。癌细胞上的糖基化MUC1直接与免疫细胞（包括巨噬细胞）上表达的选择素或siglec家族蛋白结合，并抑制其功能。此外，MUC1通过与T细胞上的细胞间粘附分子1（ICAM-1）结合并抑制其功能而发挥免疫检查点分子的作用。 MUC靶向的肿瘤治疗 许多研究表明，粘蛋白是癌症治疗的有希望的靶点。由于其在肿瘤信号转导途径中的作用，跨膜粘蛋白的信号通路可能在抗肿瘤治疗研究中具有特殊的潜力。膜结合粘蛋白的胞外结构域也可以作为抗体介导治疗的良好靶点，如中和抗体、CAR-T、BsAb和ADC。某些粘蛋白的癌症特异性表达也表明了开发基于粘蛋白抗原的癌症疫苗的可能性。 MUC1的靶向治疗 MUC1的多种候选治疗药物正在开发中，用于多种癌症类型，包括实体瘤和血液瘤。  GO-203是MUC1二聚化的细胞穿透肽抑制剂，其直接结合到MUC1胞内结构域的CQCRK区域。GO-203通过阻断多种肿瘤类型中的AKT途径而具有抗肿瘤效力。GO-203还显示出与化疗耐药癌细胞或难治癌症类型的标准化疗相结合的潜力。 选择性RNA适配体结合MUC1胞外结构域是靶向MUC1的另一种策略。将抗肿瘤微RNA导入MUC1过度表达的癌细胞，这些搭载miRNA-29b的杂交纳米粒通过下调DNMT3B在肺癌小鼠模型中显示抗肿瘤作用。此外，使用双有效载荷策略，geistein-miRNA-29b双共轭杂化纳米颗粒通过靶向AKT、PI3K、DNMT3B和MCL-1在小鼠肺癌模型中显示出比单一有效载荷纳米颗粒更大的效力。 基于抗体的治疗方法，如ADC、BiTE和CAR-T以及中和治疗性抗体都在积极开发中。BM7-PE和M-1231是目前临床试验中MUC1 ADC的主要候选药物。BM7-PE是由抗MUC1抗体BM7与假单胞菌外毒素A（PE）偶联的ADC。在一项临床前研究中，BM7-PE在乳腺癌裸鼠模型中显示出抗转移作用并促进长期存活。BM7-PE目前正在进行转移性结直肠癌的1/2期临床试验（NCT04550897）。M-1231是一种针对EGFR和MUC1的双特异性抗体的ADC，目前正在进行各种转移性实体瘤的1期临床试验。 Pab-001是针对OT-MUC1（肿瘤栓系MUC1）的第一类治疗性抗体。Pab-001-MMAE ADC在各种临床前环境中对TNBC和其他癌症显示出有希望的结果。DS-3939是一种PankoMab GEX（gatipotuzumab）ADC，靶向肿瘤特异性粘蛋白碳水化合物-蛋白质表位（TA-MUC1）,目前正在同时开发使用PankoMab的双特异性抗体。PM-CD3-GEX是一种BiTE，它将抗肿瘤CD3+T细胞招募到表达MUC1的癌细胞。PM-IL15-GEX将IL-15与PankoMab GEX结合起来，同时刺激抗肿瘤NK或T细胞。PM-PDL-GEX是一种针对MUC1、PD-L1和FcγR的三功能抗体。 目前也正在开发几种针对MUC1抗原的CAR-T疗法。由Tmunity Therapeutics开发的Tn-MUC1-CAR是领先的MUC1-CAR-T细胞疗法，目前正在进行1期临床试验（NCT04025216）。由于Tn（GalNAcα1-O-Ser/Thr）是癌症组织中最常见的异常糖类，因此MUC1的Tn糖类（Tn-MUC1）是CAR治疗的一个有希望的靶点。Tn-MUC1 CAR-T已显示出针对T细胞淋巴瘤和胰腺肿瘤的靶向抗肿瘤效力。 Leucid Bio开发的MUC-1 pCAR是一个平行CAR平台，分别引入两个具有不同抗原结合域和共刺激域的嵌合抗原受体（WO2020183158）。这种双重受体的组合有望使T细胞对MUC1阳性肿瘤具有更高的特异性，并且比标准CAR-T更有效。 Minerva Biotechnologies Corp开发的huMNC2-CAR44 T细胞可对抗实体癌细胞上的MUC1裂解形式，huMNC2-CAR44正在进行乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和肺癌的1期临床试验（NCT04020575），这些肿瘤均是MUC1高表达的肿瘤类型。 ONKT-103是ONKTherapeutics开发的MUC1靶向CAR-NK细胞疗法。ONKT-103通过引入DR5-TRAIL变体死亡受体信号通路，最大限度地发挥抗肿瘤活性，ONKT-103目前处于临床前阶段。 MUC16和其他粘蛋白靶向治疗 与MUC1一样，其他膜结合粘蛋白也被认为是抗癌治疗的潜在靶点。 Oregovomab（OvaRex）是临床试验中研究的第一种单克隆抗体药物。Oregovomab以高亲和力结合MUC16的糖基化区域，并通过抗独特型抗体级联反应诱导间接免疫反应。Oregovomab与卡铂和紫杉醇（CP）联合治疗97例III/IV期卵巢癌患者的2期临床试验显示了非常有希望的结果。与CP对照组相比，CP加oregovomab组的无进展生存期（PFS）结果为41.8个月，而CP组为12.2个月（p=0.0027）。CP与oregovomab联合给药导致外周血中MUC16特异性IFN-γ+CD8+T淋巴细胞增加。然而，尽管与标准化疗的联合研究结果令人鼓舞，但oregovomab的单一疗法在2期和3期临床试验中并未显示出临床益处。oregovomab的另一个3期临床试验（NCT04498117）正在进行中。 Abagovomab是针对抗MUC16抗体OC125产生的抗独特型抗体。Abagovomab诱导特异性免疫反应，进而激活针对表达MUC16的癌细胞的细胞毒性反应。作为一种用于维持治疗的卵巢癌疫苗，在1b/2期试验中，abagovomab在免疫应答和总生存期（OS）方面改善（23.5个月vs.4.9个月；p<0.001）。然而，一项涉及888名患者的多中心3期临床研究（NCT00418574）未能证实这些临床益处。 DMUC5754A（RG-7458，sofituzumab-vedotin）是一种ADC，包含人源化抗MUC16抗体，与MMAE偶联。对铂类耐药卵巢癌（OC）和不可切除胰腺癌（PC）患者进行的1期研究显示，尽管DMUC5754A具有安全性，但OC患者的有效率仅为17%（5/29；1 CR；4 PRs），PC患者均未观察到CR或PR。 Regeneron目前正在开发MUC16的BiTE，在小鼠和猴子模型中，REGN4018显示出MUC16依赖性抗肿瘤效力和良好的耐受性。REGN4018目前正在进行2期临床试验，单独或与PD-1抗体cemiplimab或REGN5668（MUC16/CD28 BiTE）联合治疗复发性卵巢癌患者（NCT03564340、NCT04590326）。 JCAR-020由Juno/Celgene/Bristol-MyersSquibb开发，是一种含有IL-12受体激动剂的MUC16CAR-T细胞疗法。JCAR-020目前正在进行一期临床试验（NCT02498912）。 除了MUC1和MUC16外，其他跨膜粘蛋白也被评估为潜在的癌症靶点。Amgen正在开发一种针对CD3和MUC17的BiTE，用于治疗胃癌和食管癌，目前正在进行一期试验（WO2019133961A1，NCT04117958）。 肿瘤疫苗 除了以粘蛋白为靶点的被动免疫疗法，粘蛋白抗原疫苗也被积极尝试用于治疗各种实体瘤。 CVac是用甘露糖基化MUC1蛋白诱导的自体单核细胞衍生DC。目前已经对这些细胞进行了两项2期临床研究：一项用于标准化疗后病情进展的晚期OC患者，另一项用于OC患者临床缓解后的维持治疗。CVac DC疫苗被发现具有足够的安全性，副作用最小，但与单独标准化疗相比，未能增加PFS。 ImMucin是一种21肽疫苗，包含MUC1蛋白的信号肽结构域，与各种MHC I类和II类等位基因结合。多发性骨髓瘤ImMucin与GM-CSF联合应用的1/2期研究表明，该疫苗具有安全耐受性，成功诱导了疫苗介导的细胞和体液免疫应答，11/15患者的临床疾病得到控制。 ONT-10是一种脂质体治疗性疫苗，由来自MUC1的20-mer合成糖肽与季戊四醇脂质a（TLR4激动剂）的两个重复组成。ONT-10的临床前研究表明，在同基因B16-MUC1和MC38-MUC1模型中，诱导了对MUC1的细胞和体液免疫反应以及抗肿瘤作用。对28名晚期实体癌患者进行的1期研究表明，ONT-10安全且耐受性良好，但未观察到CR和PR。最近，在晚期卵巢癌和乳腺癌患者中进行了ONT-10与varlilumab（抗CD27激动性抗体）联合的1b期研究（NCT02270372）。 Emepepimut-S（L-BLP25）是另一种针对MUC1的已开发肽疫苗。然而，在非小细胞肺癌患者的3期研究中，观察到OS没有显著差异。 ETBX-061是一种靶向MUC1蛋白的治疗性腺病毒疫苗。考虑到实体瘤的异质性，ETBX-061已在临床试验中与其他疫苗或治疗药物进行联合研究。在一项针对晚期癌症患者的1期临床试验中研究了三重（CEA/MUC1/Brachyury）疫苗组合方案，该试验证实了抗原特异性T细胞的生成和疾病控制（60%SD和40%PD）。 TG4010是一种改良的安卡拉痘苗（MVA），表达MUC1和IL-2。在晚期非小细胞肺癌的2b/3期试验中，TG4010加化疗与安慰剂加化疗相比，PFS有显著改善，但生存期获益微乎其微（5.9个月vs.5.1个月）。 MicroVAC LLC正在开发一种ad-sig-hMUC1/ecdCD40L疫苗，其中MUC1与CD40配体（CD40L）的胞外结构域融合，以促进DC活化并促进T细胞和B细胞扩增。该疫苗的一项小型队列1期研究表明，它是安全的，并且具有令人鼓舞的抗肿瘤活性。 小结 跨膜粘蛋白在维持粘膜结构和生理稳态方面具有重要作用。粘蛋白是高度糖基化的蛋白质，在不同类型的癌症中过表达。人们一直在努力寻找新的治疗策略，以利用某些跨膜粘蛋白作为治疗靶点。许多以粘蛋白为靶点的治疗药物正在对几种癌症进行不同阶段的临床试验，这些药物包括基于抗体的疗法、小分子抑制剂、疫苗和细胞疗法。为了开发更有效的基于粘蛋白的治疗策略，需要更好地理解粘蛋白糖蛋白的脱落机制、异常糖基化、可能的剪接变体、致癌信号级联和相互作用的结合蛋白。 参考文献： 1.Mucin1 and Mucin16: Therapeutic Targets forCancer Therapy. Pharmaceuticals (Basel). 2021 Oct; 14(10): 1053. 药渡媒体商务合作 媒体公关 | 新闻&会议发稿 张经理：18600036371（微信同号） 点击下方“药渡“，关注更多精彩内容 免责声明 “药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！👇👇👇

*仅供医学专业人士阅读参考 肿瘤脑转移（BM）是脑癌的主要类型，是最危险的癌症结果之一。在医学技术已经进步的今天，脑转移的中位总生存（OS）仍然仅有10-16个月。肺腺癌（LUAD）是最常见的脑转移癌种，超过三成的肺腺癌患者最终会出现脑转移。 脑转移很隐秘，主要在患者因为头痛或神经系统症状就诊时被发现，但此时能做的治疗已经不多。但由于缺乏有效的预测生物标志物，我们也很难识别脑转移高风险患者，无从开展早期检测和治疗。 本周，多伦多综合医院及多伦多大学科研团队在《自然·医学》杂志发文，研究者们收集了四百余份肺腺癌患者的肿瘤和血浆样本，构建了肺腺癌DNA甲基化特征模型，用于预测患者的脑转移风险。 该模型预测效果不仅优于临床特征，还可以仅凭血浆甲基化标志物对脑转移和其他脑瘤进行准确区分，可以成为神经影像学难以处理的肿瘤的“照妖镜”。 论文题图 研究者首先对166例原发肺腺癌临床注释队列进行了分析，综合详细临床数据筛选甲基化谱，共确定了5553个差异甲基化CpGs可以有效预测脑转移的发展，并依此构建了预测模型。 模型构建流程图 研究者在独立的验证队列中测试了模型效果，预测的患者脑转移高、中、低风险分层符合生存曲线，且效果独立于临床因素。 甲基化模型与其他基于临床数据的预测效果 整合临床预后因素后，模型可以更好地预测5年内脑转移的发展，AUROC高达0.82。 研究者还分别测试了不同疾病负担和分子亚型，甲基化模型都能起到不错的预测效果。 综合临床因素模型预测效果 研究者观察到，与脑转移密切相关的染色体和基因水平的拷贝数改变中，预测效果最强的有 8q23.2、21q21.3、ACTG2、BLM、FGFR3、MCL1、CCND1、EGFR、MDM2和MYC，仅有后四者曾被报道。 脑转移与其他的脑肿瘤不易区分，研究者尝试通过血浆甲基化生物标志物鉴别脑转移和神经胶质瘤/CNS淋巴瘤等主要脑瘤类型，最终得到的模型AUROC达到0.8。 模型构建流程 不过该模型在肺鳞癌（LUSC）中表现不佳，说明肺鳞癌和肺腺癌之间存在较大的甲基化差异。 总而言之，在肺腺癌脑转移缺乏预测标志物的情况下，这项研究提供了一种高准确性的脑转移预测方法，尤其是无创鉴别脑转移和其他脑瘤，具有显著的临床价值。 奇点糕近期推出了《2024ASCO年会深度盘点》课程，为大家系统盘点了2024ASCO年会上实体瘤领域的重磅进展，让您在100分钟内迅速深入把握前沿。长按识别下图中的二维码即可购买，购买后您可以在「奇点网小程序」收听，或下载奇点网「医学奇点」苹果客户端收听。如果遇到任何技术问题大家可以戳我们下图中的客服小伙伴来解决~~ 参考资料： [1]https://www.nature.com/articles/s41591-024-03286-y 本文作者 | 代丝雨

摘要:凋亡是一种程序化和受控的细胞死亡形式，它占生物加工过程中细胞死亡的大多数。细胞死亡影响培养的寿命和产品质量；它是由生物反应器内细胞经历的多种压力引发的。了解导致凋亡的因素以及开发能够保护细胞的策略对于稳健的生物加工开发至关重要。本综述旨在：a) 从生物加工的角度探讨凋亡；b) 描述重要的凋亡机制，并将它们与生物反应器中遇到的最相关的压力联系起来；c) 讨论设计操作条件以避免细胞死亡；d) 聚焦于工业相关的细胞系；以及 e) 提出包括细胞工程和基于模型的生物加工优化在内的抗凋亡策略。此外，还强调了凋亡在从克隆筛选到生产规模的质量设计生物加工开发中的重要性。 1.引言 在快速增长和竞争激烈的生物制剂市场中，生物加工优化至关重要。一个优化的生物加工将涉及高产细胞培养和最小的凋亡压力。培养活性对于确定培养寿命至关重要，通常由活性截止点决定，超过该点产品质量将受到影响。存在三种主要的细胞死亡途径：坏死、自噬和凋亡。据报道，凋亡是所有工业相关细胞系中死亡的主要原因，在中华仓鼠卵巢（CHO）细胞中占细胞死亡的80%和TB/C3杂交瘤细胞培养中的90%。阐明凋亡及其构成机制对于提高培养寿命和产品滴度，同时保持高产品质量至关重要。本综述着重于与凋亡相关的生物加工开发挑战，通过：a) 介绍凋亡细胞死亡的主要机制；b) 检查各种生物加工变量和操作条件对凋亡压力的影响；c) 确定影响生物加工的压力；以及d) 讨论两种方法——细胞系工程和凋亡建模——作为传统基于实验的方法的替代，用于最佳操作设计（图1）。 图1. 凋亡的生物过程策略：a) 传统方法，基于实验优化培养条件，b) 细胞系工程方法，旨在产生抗凋亡细胞系，以及 c) 虚拟方法，将生物学机制整合到数学模型中，以实现基于模型的优化。 2.细胞死亡的生物学 2.1.凋亡的生物学 在凋亡中，内部和/或外部刺激引发一系列高度控制的反应，最终导致细胞死亡。参与凋亡的两组最重要的蛋白质，半胱天冬酶和Bcl-2（B细胞淋巴瘤2）家族蛋白，参与所有凋亡细胞死亡途径。半胱天冬酶是依赖半胱氨酸的内切蛋白酶，催化肽键的断裂。大多数半胱天冬酶以单体形式产生，活性很小或没有活性，通常称为前半胱天冬酶或酶原。激活后，它们同源二聚体形成生物活性蛋白。在小鼠或人类细胞中已报告有14种半胱天冬酶（编号1至14），对生物加工很重要。此外，还在小鼠或人类以外的哺乳动物细胞基因组中鉴定出四种其他半胱天冬酶（编号15至18），其中半胱天冬酶16是一个假基因（不翻译）。大多数半胱天冬酶可以根据其作用分为三组：a) 起始半胱天冬酶（半胱天冬酶8和9）；b) 执行者半胱天冬酶（半胱天冬酶3、6和7）；c) 参与炎症的半胱天冬酶（半胱天冬酶1、4、5、11和12L）。半胱天冬酶-2没有被分类，因为它与起始和执行者半胱天冬酶共享结构元素，是半胱天冬酶3和8的已知底物，也可以通过激活细胞色素C释放来触发凋亡体的形成。半胱天冬酶-2也可以被p53的下游靶标激活。半胱天冬酶-10的作用尚未完全阐明，它由半胱天冬酶-6激活，以及半胱天冬酶12S和14也仍未分类。半胱天冬酶级联反应一旦被触发，就会自我催化，如图2所示。 图2. 凋亡途径概述。已确定的五条主要途径包括：(1) 由外部刺激激活的外源性途径；(2) 由Bax通道促进的MOMP激活的内源性途径（Taylor等人，2008年）；(3) DNA损伤诱导的依赖caspase-2的途径；(4) 由Granzyme B诱导的途径，其中该分子作为caspase-3的诱导剂；以及 (5)由Granzyme A诱导的途径，其中不涉及任何caspases - Granzyme A诱导一种DNase，该酶诱导DNA片段化和细胞死亡。 Bcl-2家族蛋白（图2）在凋亡调节中起着重要作用，具有促进和抑制凋亡的活性，可以分为三个亚组。抗凋亡组包括Bcl-2、Bcl-xL（B细胞淋巴瘤超大）、Bcl-W（Bcl-2样蛋白2）、Mcl-1（诱导髓样白血病细胞分化蛋白）、Bcl2A1（Bcl-2相关蛋白A1）和Bcl-B（与Boo蛋白氨基酸序列相似的Bcl-2样蛋白）。这些蛋白有四个Bcl-2同源结构域（BH1、BH2、BH3和BH4）。除了Bcl2A1，所有其他成员都有跨膜结构域，通常与细胞、核或线粒体膜相关联。第二组由Bax（Bcl-2相关蛋白X）、Bak（Bcl-2同源拮抗剂杀手）和Bok（Bcl-2相关卵巢杀手）组成，缺乏BH4结构域。最后，第三组只有BH3结构域，由Bik（Bcl-2相互作用杀手）、Hrk（Harakiri）、Bim（Bcl-2样蛋白11）、Bad（Bcl-2相关死亡促进因子）、Bid（BH3相互作用域死亡激动剂）、PUMA（p53上调凋亡调节因子）、NOXA（Phorbol-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯诱导蛋白1）和Bmf（Bcl-2修饰因子）组成。BH4缺乏和仅有BH3结构域的蛋白在过表达时是促凋亡的。 已确定五种主要的凋亡途径，其中提出了多种途径。外源途径（通常称为类型I）由细胞外部刺激触发。死亡配体（如FasL或肿瘤坏死因子α，TNFα）与细胞膜上的受体结合，触发半胱天冬酶-8的激活，从而启动凋亡（图2）。内源途径（通常称为类型II或线粒体途径）由内部刺激（代谢或缺氧压力）激活，也可以由内质网应激触发。凋亡类型II触发的内部刺激促进半胱天冬酶和Bcl-2家族的促凋亡成员的激活（图2），通过Bax通道导致线粒体外膜通透性（MOMP）增加。Bax激活SMAC（线粒体来源的第二种半胱天冬酶激活剂），抑制XIAP（X连锁凋亡抑制蛋白）的抗凋亡活性。反过来，MOMP导致细胞色素C的释放，这诱导了凋亡体的形成，由七个半胱天冬酶-9单元组成的复合体。半胱天冬酶-9将触发一个执行者半胱天冬酶（3或7），确保过程的连续性。Bcl-2家族的抗凋亡成员（例如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1）能够通过抑制其促凋亡对应物的活性来抑制凋亡。在这个过程中，外源途径的激活也可以通过半胱天冬酶-8激活Bid发生。相反，外源途径作为内源途径的下游效应可能在p53激活CD95时发生。第三种途径依赖于半胱天冬酶-2的存在，它可以在持续DNA损伤时被肿瘤抑制基因p53激活。凋亡也可以通过Granzyme B直接激活半胱天冬酶-3触发。最后，由Granzyme A促进的DNA片段化也可以导致凋亡。对CHO细胞的蛋白质组学研究表明，内源途径是培养中最重要的凋亡驱动因素。它可以直接与生物反应器的操作条件联系起来，使其在生物加工中很重要，因为它可以被营养物质缺乏、过量蛋白质生产、温度或pH变化和高渗透压等触发。 凋亡的调节是通过蛋白质-蛋白质相互作用实现的，可能涉及第三个蛋白质作为介导。没有介导的蛋白质-蛋白质相互作用的例子包括Bax蛋白的BH3结构域产生四聚体，在线粒体膜上形成通道，或Bcl-2抑制Bax通道形成。相比之下，Bcl-2或Bcl-xL与半胱天冬酶-8之间的相互作用需要BAP31（Bcl-2相关蛋白31）的介导。内源途径导致由线粒体膜上的Bax通道或钙离子引起的线粒体外膜通透性（MOMP）。MOMP反过来会导致许多促凋亡分子的释放，如细胞色素C。如图2所示，半胱天冬酶-3在凋亡中起着重要作用，可以由起始半胱天冬酶8和9或Granzyme-B激活。一旦激活，它会反激活上游半胱天冬酶以确保过程的连续性。半胱天冬酶-3也是CAD（半胱天冬酶激活的DNase）的激活剂，它在增殖细胞中与其抑制剂形成复合体。当半胱天冬酶-3过表达时，该复合体会被切割，CAD降解染色体DNA，当聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）被半胱天冬酶-3（或7）抑制时也会发生这种情况。在晚期凋亡期间，半胱天冬酶-3作为细胞骨架重组和解聚诱导剂，导致凋亡小体的形成。尽管半胱天冬酶-3被认为是凋亡中必不可少的，但已经表明不表达半胱天冬酶-3的人类MCF-7乳腺癌细胞仍然可以经历凋亡。实际上，已经鉴定出一种由Granzyme A介导的半胱天冬酶独立途径，其中Granzyme A诱导DNA片段化导致细胞死亡。 在凋亡过程中，细胞的几种结构特征会发生变化：许多细胞骨架成分被降解导致膜泡形成；核层被破坏导致核膜塌陷、DNA片段化和染色质浓缩；形成含有完整细胞器的凋亡小体，随后被巨噬细胞降解；线粒体膨胀和伸长。尽管这些特征中的一些可以通过光学显微镜观察到，但这种技术不如流式细胞仪准确，流式细胞仪通常更受青睐用于凋亡监测。流式细胞仪已被用于分析DNA、RNA、线粒体膜电位和细胞膜完整性，两种染料的组合，荧光素-Annexin V和7-氨基放线菌素D（7AAD），已用于区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞。在某些条件下，凋亡可以逆转，如在多种细胞系中去除凋亡刺激后报道的那样。还有人提出DNA损伤诱导p53（一种肿瘤抑制基因），反过来同时诱导DNA修复、细胞周期停滞和凋亡停滞。此外，即使在由促凋亡蛋白诱导DNA损伤后，晚期凋亡也可能是可逆的。Anastasis（希腊语意为“复活”）被提议为细胞“复活”过程的名称。建议的逆转机制需要一组几种蛋白质，逆转凋亡后观察到一些遗传变化，包括染色体畸变和数量。 2.2.其他形式的细胞死亡 尽管凋亡是哺乳动物细胞培养中主要的细胞死亡形式，其他机制，特别是在细胞培养后期，也可能有所贡献。这些包括自噬和坏死性凋亡，下面简要描述（图3）。自噬是一种将细胞质物质运送到溶酶体进行降解的细胞死亡形式。尽管自噬被认为是一种细胞存活机制，但最近的研究表明自噬可以促进细胞死亡。在自噬过程中，隔离膜形成，通常位于线粒体/内质网接触区域。Beclin-1和液泡蛋白分选34（VPS34）促进隔离膜的成核；几个细胞器可能被招募到这种生长膜的内侧，包括线粒体、高尔基体和内质网。蛋白质轻链3（LC3）通过一组自噬相关蛋白（ATG）附着在隔离膜上。LC3将促进识别自噬体，然后与溶酶体融合以破坏细胞成分。这种细胞死亡形式最初由Hwang和Lee在葡萄糖和谷氨酰胺缺乏时在CHO细胞培养中观察到。自噬可能通过ATG5激活半胱天冬酶-8触发外源途径的凋亡。有趣的是，抗凋亡蛋白Bcl-2也是Beclin-1的抑制剂。虽然这种相互作用阻止了自噬，但它并不抑制Bcl-2的抗凋亡作用。BH3-only蛋白抑制Bcl-2/Beclin-1相互作用，从而促进自噬。一个例外是BIM，它将Beclin-1错误定位到动力蛋白轻链1（DLC1），阻止自噬。自噬也可能在凋亡的终末阶段通过Beclin-1切割被半胱天冬酶-3抑制，如图3A所述。另一种越来越受关注的细胞死亡形式是坏死性凋亡。当死亡受体被配体激活时，受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）被激活。这种蛋白反过来激活RIPK3，触发坏死性凋亡。由这些（RIPK1和RIPK3）和其他蛋白质形成的复合体称为坏死体，已知它能抑制糖原分解和谷氨酰胺分解，最终减少能量代谢。细胞内ATP总体减少导致坏死性凋亡死亡。这条途径不仅与半胱天冬酶无关，而且还受到半胱天冬酶的抑制；半胱天冬酶-8抑制RIPK1和RIPK3的相互作用，从而防止坏死性凋亡，如图3B所述。 图3. 其他细胞死亡机制。细胞培养中发生的其他形式的细胞死亡包括自噬（A）和坏死（B）。 总之，细胞死亡，特别是凋亡，在生物加工中具有显著影响，影响细胞活性、生产力和产品质量。上游工艺开发应考虑凋亡监测和尽可能避免凋亡的策略开发，而不是试图逆转它。这需要深入了解跨尺度的相关促凋亡压力以及如何最小化这些压力。这是下一节的范围。 3.生物加工开发过程中的凋亡压力 3.1.不同尺度上的凋亡 上游工艺开发的第一步是选择一个合适的克隆，通常基于生长和生产力。虽然克隆选择发生在微升级别，但在生物加工开发过程中，规模将逐渐增加到立方米级别的生物反应器。在这些步骤中，凋亡压力的性质不同，它们对生长和生产力的影响也不同。为了实现最佳操作条件，重要的是准确识别相关压力及其原因，理解细胞响应机制，并在生物加工开发的各个阶段消除/逆转凋亡（图4）。在摇瓶或微孔板尺度上，由于不进行搅拌，运输是由于扩散和轨道混合，凋亡压力主要由克隆选择中使用的有毒试剂所主导。两种广泛使用的试剂是无谷氨酰胺培养基用于谷氨酰胺合成酶（GS）基础选择和甲氨蝶呤（MTX），如果使用二氢叶酸（DHFR）系统。MTX也是一种已知的凋亡诱导剂，能刺激PUMA。当生长速率和生产力成为克隆选择的关键标准时，确保pH值、温度、营养物质耗竭和渗透压不抑制生长或触发凋亡变得至关重要。即使在小规模上，扩散足以确保均匀环境，由于计划维护/取样任务在孵化器外进行，除非采用自动化系统，否则可能会发生压力温度波动。随着规模的增加，扩散不再能够维持有效的物质运输，宏观环境变得越来越不均匀，需要混合系统，这是剪切应力的来源。与规模放大相关的另一个问题是提供足够的氧气。在大型生物反应器中，这通常是通过从底部通气来实现的，这可能会产生额外的剪切应力。相比之下，大规模的温度控制不是一个主要问题。由于生物加工开发包括不同的操作模式，必须注意考虑与规模相关的效应。为了最小化放大问题，从克隆选择阶段就使用微型搅拌罐系统。 图4. 不同尺度的凋亡应激。上游生物过程开发识别重要的流程和生物反应器参数以及各个生物过程尺度上的相关凋亡应激和途径。 3.2.生物反应器中的凋亡压力 本节讨论与生物反应器相关的压力，如缺氧、剪切、营养物质缺乏、温度、pH值、渗透压和蛋白质错误折叠，将与每种特定压力相关的细胞生物学联系到产品质量、生物加工变量和操作条件。重要的是要提到，不同压力的影响可能因使用的培养系统而异。灌注系统，例如，允许营养物质的供应和副产品的去除，减少代谢压力。然而，由于实现了更高的细胞密度，培养粘度的相应增加导致pH值、渗透压和剪切应力的增加，这些在分批培养中观察到的。 3.2.1.缺氧压力 氧气在哺乳动物细胞代谢中至关重要，是需氧能量代谢中的最终电子受体。在缺乏氧气的情况下，采用厌氧代谢进行能量生产，导致有毒代谢产物的产生，最终导致细胞周期停滞和凋亡。因此，能量消耗减少，分泌生存因子，如低氧诱导因子（HIFs），在调节细胞对缺氧的反应中起着关键作用。HIFs是具有α（O2-labile）和β（稳定）亚基的异二聚体蛋白。在正常氧水平下，α亚基通过脯氨酰羟化酶（PHDs）在两个保守的脯氨酸残基上羟化，标记HIFα进行蛋白酶体破坏。在缺氧条件下，PHDs活性降低，HIFα不被抑制，诱导缺氧反应基因。事实上，PHDs已被提议作为负责HIF对氧浓度反应的氧气传感器。对缺氧诱导的凋亡的反应可以根据线粒体感知的氧水平重新编程，导致产生活性氧（ROS），降低PHDs。确保氧气不是限制因素在生物反应器设计和放大中至关重要。氧传递系数（kL）和气泡表面积（a）的乘积，通常表示为kLa，用作衡量通气效率的指标。kLa与混合引起的能量耗散率成正比；确保高kLa和低剪切应力环境可能具有挑战性，特别是在哺乳动物细胞培养中实现的越来越高的细胞密度。关于氧气对哺乳动物细胞培养影响的文献综述见表1。 在摇瓶和控制生物反应器中的CHO细胞研究表明，与摇瓶培养不同，生物反应器培养没有经历缺氧，缺氧导致蛋白质表达减少。在50L生物反应器中也获得了类似的结果，其中溶解氧从60%降低到15%的空气饱和度导致寿命减少和蛋白质运输，从而影响生产力和滴度。尽管通过补充金属离子可以维持活力和生产水平，但这种策略对产品质量的影响没有报告。这将特别有趣，因为已经证明金属离子在糖基化中起着重要作用。尽管在CHO细胞生物学中起着重要作用，但缺氧本身不会导致死亡，除非氧分压降低到零或其他因素参与。即使当氧分压降低到2x10-4巴，细胞生长停止，也可能不会观察到细胞死亡。然而，当缺氧与pH值6-6.5结合时，会观察到时间和pH依赖的细胞毒性效应。在这些条件下，由于pH（独立于氧水平）导致的葡萄糖消耗和乳酸产生减少，并且在两种压力结合下ATP水平降低了85%，而单独任一压力对能量产生没有影响。在GS-NS0培养中观察到类似的效应，在缺氧12小时后，细胞周期在G2期（9小时）停止，随后是G1和S期的停止，并且mAb生产停止。报道了降低能量密集型过程（如DNA合成）和激活能量产生和氧气输送过程。这些研究表明，缺氧压力效应的某些方面在细胞系间是保守的。在产品质量方面，血清自由培养的CC9C10杂交瘤细胞中观察到缺氧的负面影响，其中观察到IgG1糖基化的不足。作者推测，糖基化不足可能是由于UDP-Gal核苷糖供体的可用性降低。还观察到增加的抗氧化酶活性，为活性氧提供了证据。总之，缺氧诱导的生长停滞似乎是细胞系独立的，对于低于1%的缺氧水平。需要更多的研究来完全阐明缺氧对产品质量的影响，这也将有助于在工艺开发过程中的质量设计。 3.2.2.剪切应力 剪切应力是由搅拌器和挡板产生的，它们被用来在生物反应器内实现均匀性，或者通过通气产生，这可能会产生剪切应力，直接导致细胞破裂，因为气泡在上升到气液界面时破裂。与通气相关的剪切应力随着气泡直径的减小而增加。使用表面活性剂，如Poloxamer F68，显著降低了细胞与气泡之间的表面张力，减少了剪切对培养活性的影响。然而，重要的是要确保消泡剂不影响细胞生长和产品质量，并且它们可以在下游处理中有效去除。剪切应力影响的其他培养参数包括单克隆抗体（mAb）生产、葡萄糖消耗和乳酸产生，这些参数以不受规模影响的方式受到影响。关于生物反应器内部剪切应力的流体动力学来源的详细概述，包括湍流、边界层和碰撞效应，见其他地方。一般来说，在大多数培养时间内，生物反应器内部经历的剪切应力水平低于诱导凋亡所需的水平。此外，抵抗力和可容忍的压力水平取决于细胞系、几何形状和操作条件。表2总结了剪切应力在工业相关细胞系中的影响。 CHO细胞可以耐受比Sp2/0细胞更高的剪切应力水平，然后才会观察到对生长或生产力的负面影响。随着工艺的放大，混合系统的设计必须确保细胞不会长时间暴露在高水平的压力下，据估计（在搅拌器周围经历的）仅发生在生物反应器体积的约5%或在良好混合反应器中的5%时间内。反应器的不均匀性和长时间暴露在高剪切下会以剂量和时间依赖性的方式影响细胞培养。在HDP1杂交瘤中，暴露于60 Pa（600 dyne/cm2）45分钟后观察到活性下降50%，而在20 Pa（200 dyne/cm2）下观察到类似的减少需要2小时。类似地，CRL-8018杂交瘤在暴露于50 dyne/cm2下10分钟后活性下降50%，在30分钟后下降80%。挡板是剪切应力的另一个来源，因为它们通过增加能量耗散率5倍。尽管从理论上讲，挡板可以被消除，但它们在防止涡流形成方面至关重要，涡流是剪切相关细胞死亡的主要原因。挡板的数量和位置体现了防止涡流和产生剪切应力之间的权衡。在设计混合系统时，应保持低能量耗散率；能量耗散率约为2-3x105 W/m3（>700 rpm）会在CHO细胞中诱导凋亡，而能量耗散率为1x108-1x109 W/m3会导致CHO细胞破裂。这些值在存在气相的情况下可能会改变，这将促进涡流、气泡夹带和气泡破裂，从而增强剪切应力，因此必须降低搅拌速率。事实上，当消除2L生物反应器中的气相空间时，CHO细胞在600 rpm下搅拌没有经历显著损伤，这与Mollet等人的估计一致。有趣的是，这些结果与高速搅拌下搅拌器设计和分布器位置无关，而在搅拌速率较慢时，分布器的位置起着更重要的作用。 已经假设细胞抵抗剪切应力的能力随着特定细胞系的培养历史而变化，而在T型瓶或低搅拌spinner flasks（低水平流体应力）中培养的杂交瘤比在高搅拌下培养的杂交瘤对剪切更敏感。然而，野生型和Bcl-2缺陷CHO细胞对剪切的抵抗力被发现与它们之前在T型瓶或悬浮培养中的培养无关。这一观察归因于细胞暴露于剪切时Bcl-2表达的丧失。还报告了基因表达损失，其中在5L生物反应器中培养的CHO细胞显示出较低的F-肌动蛋白表达水平，导致细胞骨架较弱。相反，Perani等人观察到Bcl-2确实在三个几何不同的系统中培养的NS1衍生的小鼠杂交瘤中提供了凋亡保护。这些不同的发现表明，剪切应力抵抗力是细胞系特定的。 3.2.3.营养物质/代谢物压力 限制生长的营养物质是细胞系和克隆特定的；确定它们对于设计合适的培养基和补充培养基进行分批和连续培养至关重要。几项研究已经检查了营养物质和代谢物对细胞生理学的影响，如表3所总结的。生长限制性营养物质的耗尽导致生长停滞，最终导致凋亡，这也由有毒代谢物的存在引起。葡萄糖作为重要的碳源，在调节凋亡方面至关重要，但其重要性可能更多的是调节性的而不是营养性的，这已通过使用GS-NS0细胞的研究建议，其中葡萄糖调节并延长了静止期，以及调节DNA修复和转录。此外，葡萄糖可以通过快速提供ATP来防止或延迟凋亡。除了主要的碳源（通常是哺乳动物细胞的葡萄糖），氨基酸非常重要，不仅作为蛋白质生产的构建块，还作为三羧酸（TCA）循环中间体的前体。 了解细胞系和克隆特定的氨基酸代谢使能够确定培养过程中必需营养物质的代谢转变，应避免这些转变，因为它们可能会影响生长、生产力和产品质量，导致制定适应所用细胞系/克隆特定需求的培养基和喂养策略。如果代谢发生变化，纠正措施可能不会产生预期的效果。在氨基酸中，谷氨酰胺已被证明与CHO培养中的乳酸代谢转变相关，从而也影响培养pH。包括任何代谢转变信息的详细代谢分析对于理解这些观察至关重要。 除了糖或氨基酸之外的其他必需营养物质包括蛋白质，如胰岛素和转铁蛋白，其撤除导致CHO细胞凋亡，以及磷，添加到高细胞密度NS0培养中成功防止活性损失，增加mAb滴度和抑制凋亡。另一组必需分子是脂质。当营养物质耗尽时，某些细胞系能够通过合成三酰甘油和形成脂滴来维持活性。目前对这种现象的了解不足，但已经表明在完全营养物质耗尽的情况下，CHO细胞能够通过β-氧化脂肪酸生存，这需要脂滴生物生成。 随着细胞的生长和营养物质的代谢，它们产生副产品，这些副产品变得有毒并导致凋亡。两个重要的有毒代谢物是乳酸和氨，分别是葡萄糖代谢和谷氨酰胺/天冬酰胺代谢的副产品。当葡萄糖从更高效的TCA循环转向更快的发酵途径时，会形成乳酸。如果氧气不可用，就不能进行氧化磷酸化，细胞将通过替代途径代谢葡萄糖，例如乳酸发酵，产生乳酸。乳酸产生速率取决于克隆，受培养基配方的强烈影响。乳酸积累最终可能导致代谢转向乳酸消耗，尽管如此，仍然会导致生长停止和活力下降。此外，当乳酸脱氢酶A（LdhA）和丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）1、2和3同时低表达时，CHO细胞中mAb产量增加，当丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）被化学抑制时也是如此。乳酸对哺乳动物细胞培养的影响已与乳酸积累导致的氧化磷酸化速率下降相关。尽管在几项研究中被识别，但并非所有CHO克隆都观察到乳酸代谢转变。即使在同一项研究中，这也是细胞系和克隆特异性属性。有趣的是，从培养基中摄取谷氨酰胺的细胞中可能发生的乳酸代谢转变与谷氨酰胺的存在相关，这表明谷氨酰胺分解可能促进乳酸产生。然而，由于乳酸存在时线粒体氧化途径活性降低，代谢并未恢复正常。乳酸消耗另一个重要作用是再生糖酵解所需的NAD+辅因子。表达丙酮酸羧化酶的CHO细胞的分批培养表明，尽管观察到乳酸代谢转变，但培养寿命仅延长了1天（从10天延长到11天），尽管达到了更高的细胞密度。值得一提的是，这一现象可能受温度影响。在33°C培养的HFN 7.1杂交瘤中，即使谷氨酰胺完全消耗，乳酸生产仍在继续导致细胞死亡。然而，当相同细胞在37°C培养时，谷氨酰胺耗尽时乳酸生产停止。作者团队的未发表结果显示，在无谷氨酰胺、化学定义的培养基中分批培养的GS-NS0细胞产生的乳酸很少（<4mM），这可以归因于这些细胞在无谷氨酰胺的培养基中生长，并且只会产生它们所需的谷氨酰胺量（来自谷氨酸）。然而，另一种在分批培养中消耗乳酸的GS-NS0细胞系直到谷氨酰胺（最初不出现）达到0.4mM才开始消耗乳酸。只要保持谷氨酰胺浓度低，乳酸浓度就保持稳定，当谷氨酰胺浓度仅增加时就会产生乳酸。对于可以将乳酸和谷氨酰胺代谢联系起来的细胞系，培养基设计的一个重要限制是确保将谷氨酰胺浓度保持在最低以避免乳酸产生。控制谷氨酰胺水平也很重要，以避免产生氨。氨是谷氨酰胺代谢的副产品，与乳酸相反，它将培养pH值转变为碱性值。氨在2.5mM、6mM和高达29mM的浓度下分别对杂交瘤、HEK 293和CHO细胞培养产生负面影响。此外，氨的产生可能是细胞系和克隆特异性的。使用GS-NS0细胞进行的工作报告了不同水平的氨，从低于1mM到接近6mM。 3.2.4.温度 哺乳动物细胞生长、蛋白质生产和生化反应由酶催化，其活性受温度影响。生物加工规模与哺乳动物细胞生物加工开发中的温度控制相互关联。在小规模，直到台式生物反应器，温度控制是在受控环境中实现的，例如在孵化器中，而随着规模的增加，需要冷却和/或加热系统来控制温度并避免温度曲线的显著偏差。关于温度对哺乳动物细胞培养影响的分子机制有大量文献。具体来说，与热休克诱导的凋亡相关的转录独立的p53、钙失调和Bax具有调节作用。热休克蛋白70（HSP70）通过几种可能的机制参与保护免受温度诱导的凋亡。 在CHO细胞中，HSP70很重要，因为它延迟了半胱天冬酶-3的表达。鉴定了200多种具有温度依赖性表达谱的蛋白质，其中118种上调，与生长、凋亡和糖蛋白质量控制直接相关的23种蛋白质与温度降低直接相关。几项研究表明，高于最佳温度（37°C）的培养温度会触发凋亡。在CHO细胞中，过表达HSP27和HSP70导致由于在37°C时延迟表达半胱天冬酶2、3、8和9而增加了寿命。尽管报告了产品滴度的增加，但未描述产品质量属性和遗传稳定性，也未证明这种策略是否会改善更高温度下的CHO培养。事实上，在39°C培养CHO细胞增加了生长速率，但导致G2/M期细胞周期停滞，活力和生产力下降，尽管整体产品滴度增加。在NS0细胞中，转染HSP70基因的克隆也导致对凋亡的抵抗力增加。野生型NS0细胞中缺乏HSP70表示细胞系对温度诱导凋亡的特异性反应。在产品质量方面，CHO细胞生产的Epo-Fc融合蛋白的唾液酸化在37和39°C之间没有显著差异。在几种杂交瘤中，37°C以上的培养温度对mAb生产不利。具体来说，这种效应在39°C和38°C的杂交瘤细胞培养中观察到。有人建议温度的效应可能是搅拌依赖的，因为非搅拌杂交瘤培养在38°C（与37°C相比）时具有更快的特定生长速率，产生mAb的速率相似；搅拌培养的情况正好相反，在38°C时生长较慢，产生mAb的速率较低。 低于最佳温度的温度也会影响培养寿命、细胞生长和生产力。在CHO培养中，单克隆抗体的聚集在33°C时比37°C高2到5倍。当生产双特异性抗体的CHO细胞的温度从36°C降低到32.5°C时，也观察到相同的效应。在这种情况下，重要的是确保细胞产生所需的双特异性mAb，而不是截短版本或完整的单特异性mAb。降低温度降低了生长，但促进了所需双特异性mAb结构的形成；尽管在较低温度下也观察到聚集，但总体上认为降低温度是有益的。建议采用两阶段培养策略，即在36°C进行生长，在32.5°C进行mAb生产，提高整体产品质量和下游处理产量。这些观察是细胞系和产品特异性的。在表达人类组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的CHO细胞中，将温度从37°C降低到30°C在指数生长期增加了细胞周期抑制剂2A（细胞周期停滞诱导剂）的表达，对DNA损伤响应基因没有影响，尽管相应的基因没有上调，但tPA生产率增加（未提供产品质量数据）。此外，与能量产生和凋亡保护相关的基因上调，葡萄糖和乳酸的代谢速率减慢，而谷氨酰胺消耗保持不变。 在低温（30°C）条件下，CHO细胞的代谢速度较慢与G0/G1期阻滞有关。Trummer等人报告了产品质量数据，并显示唾液酸化减少了40%。对NS0细胞的研究表明，将温度从37°C降低到34°C可以在不影响培养寿命的情况下略微提高单克隆抗体（mAb）的产量。进一步将温度降低到22°C则显示无增殖并诱导凋亡，同时细胞周期在G2/M期被阻滞。尽管有DNA微阵列证据表明，在低温条件下培养细胞会停止代谢并诱导凋亡，但据我们所知，还没有研究报告低温诱导凋亡的详细机制。 3.2.5.pH值 在哺乳动物细胞培养中，严格的pH控制至关重要，因为即使是微小的偏差也可能导致细胞死亡。此外，pH值影响生长、单克隆抗体（mAb）产量、多种氨基酸的摄取率以及产品质量，如表5所示。尽管pH值很重要，但其在凋亡中的作用机制尚未完全阐明。 尽管最佳pH值取决于细胞系，但在哺乳动物细胞生物加工中，接近7.0的pH值通常被认为是理想的。在pH 6.8下培养CHO细胞对培养寿命最有利，而最大细胞密度在pH 6.9下获得。在所有评估的pH条件下，主要碳源（葡萄糖）的耗尽导致显著的活性下降和代谢转向乳酸消耗。Brunner等人表明，即使是短期的pH扰动也会影响细胞生理，而Trummer等人则表明，尽管在pH 6.8下获得了最高的单克隆抗体滴度，但在pH 7.1下达到了最高的体积生产力。尽管Trummer等人没有观察到pH 6.8和7.1之间产品质量（Epo-Fc的唾液酸化）的显著差异，但Brunner等人报告了在pH 6.8、7.0和7.2下培养的mAbs的基本和酸性变体中的几种差异。在另一项研究中，CHO灌注培养中第9天将pH从7.15降至6.85，增加了细胞密度和寿命，并改善了单克隆抗体的糖基化和效力，同时保持了生产力。 对其他细胞系也观察到了类似的效果。在Sp2/0补料分批培养中，中性pH最理想，当pH从7.2降低到7.0时，活细胞的积分和滴度都有所增加，尽管没有报告产品质量数据。在F2N78细胞培养中，pH从6.8增加到7.4会减少寿命并加速代谢，导致副产品积累更多，pH 6.8被认为是最佳选择。Osman等人受到在添加碱/酸时对生物反应器进行pH扰动的调查的启发，将GS-NS0细胞在pH 7.3下培养，并研究了单一和多重pH扰动的影响。作者报告说，单一pH 8扰动没有显著的不利影响，但对pH 9扰动有时间和剂量依赖性的反应。因此，有效的搅拌和谨慎选择添加碱/酸的点对于避免生物反应器非均匀区域的凋亡很重要。 如上所述，有毒代谢物（如乳酸）的积累会降低培养pH值。虽然在某些研究中，酸化是早期凋亡的特征，与DNA损伤有关，但在其他研究中，酸化并未导致细胞死亡，也没有影响生长，Bcl-2和Mcl-1提供了保护。在NS0细胞培养中，凋亡可以独立于细胞内pH变化发生，在酸度下HL-60细胞中观察到增加的半胱天冬酶活性。事实上，Bax在pH 4.0时形成线粒体膜孔的能力是在pH 7.5时的8倍，而Bcl-2几乎可以完全抵消这种效果。由于氨的产生，培养基的碱化是一个已知的增殖过程特征。然而，其对细胞生理的影响机制仍需阐明。碱性环境可能会抑制半胱天冬酶-3，但如果之前已经激活，蛋白质在pH值增加后仍然保持活性。 3.2.6.渗透压 关于渗透压的研究评估了盐分和代谢物对生长和生产力的影响，如表6所总结。尽管高渗透压在CHO细胞中激活了半胱天冬酶3和7，导致DNA碎片化，在小鼠肾细胞中导致DNA双链断裂，但渗透压诱导凋亡的机制需要进一步研究。在生物反应器中，由于pH控制通常是通过碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂实现的，这需要CO2，因此很难将盐分和CO2的影响分开。一项使用低盐培养基配方的研究表明，高渗条件与凋亡强烈相关，而CO2分压单独对Sp2/0细胞培养的活性没有显著影响。相比之下，pCO2对CHO细胞的生长有显著影响，而高渗压（尽管在310至376 mOSm/kg的非常窄的范围内）没有。氯化钠（NaCl）通常用于渗透压研究，并且已经证明了其对CHO细胞生长的剂量依赖性影响。有趣的是，脯氨酸补充已被成功用于抵消由NaCl添加引起的高渗压力的影响。这些结果令人惊讶，因为添加溶质进一步增加了培养基的渗透压，表明对NaCl或氨基酸诱导的渗透压增加有不同的反应机制。事实上，向小鼠肾细胞培养中补充尿素至最终渗透压600 mOsm/kg对DNA的损伤程度与添加NaCl至最终渗透压300 mOsm/kg相同，证实了溶质特异性效应的假设。这在生物加工中特别相关，因为人们一直在努力使用氯化钠提高细胞对渗透压应激的抵抗力；然而，这样的研究可能并没有针对与渗透压相关的问题的真正原因。最近，通过使用“渗透压空间”成功地从培养基配方中去除了氯化钠（和其他成分），以增加营养物质浓度而不使细胞受到高渗压力。在蛋白质生产方面，高渗性效应是产品特异性的，导致EPO-Fc滴度降低但单克隆抗体滴度不变。 与CHO细胞不同，当渗透压从290增加到450 mOsm/kg时，NS0细胞培养实现了延长的寿命，尽管细胞密度较低。只有在高渗培养（450 mOsm/kg）的最后几天才观察到滴度差异，这归因于它们改善的寿命。然而，在高渗条件下，特定单克隆抗体（mAb）的生产力和特定增长率更高。有趣的是，另一项研究表明，将补料分批NS0培养的渗透压从平均276增加到平均326 mOsm/kg显著改善了生长和单克隆抗体滴度，而进一步增加到381 mOsm/kg则有轻微的负面影响。这些结果表明，渗透压对细胞生长的影响取决于细胞系，可能还特定于克隆，并且对生产力和滴度的影响是产品特异性的。 3.2.7.错误折叠蛋白引起内质网应激 为了实现高滴度培养，需要过度表达蛋白质。然而，过度表达蛋白质可能触发内质网（ER）应激，导致凋亡和产品质量下降，因为由于内质网无法应对高蛋白质浓度，不完全的产品被分泌出去。表7显示了有关内质网应激对相关生物加工细胞系影响的文献综述。 未折叠蛋白反应被描述为内质网和细胞核之间的相互作用。错误折叠或未折叠蛋白的聚集激活了ER应激受体，即atf6（激活转录因子6）和需要肌醇的酶1（IRE1）。这些事件，连同atf4的激活，导致内质网和细胞核之间的相互作用，目的是重新建立ER的折叠能力，并通过合成蛋白酶和分子伴侣来减少正在处理的蛋白质数量。严重的ER应激导致一系列不同的事件，包括CHOP（C/EBP同源蛋白，一种促凋亡转录因子）的表达阻断和JNK（c-Jun N端激酶）对Bcl-2的磷酸化。这些结果导致Bim激活，进而激活Bax通道在ER和线粒体膜上形成。因此，钙，细胞色素C和其他凋亡激活剂被释放，最终触发半胱天冬酶激活和凋亡细胞死亡。另一个关键的相互作用是ER和线粒体之间的串扰。ER是钙离子的主要内部储存库，它们介导几种信号传导途径，ATP产生和凋亡。肌醇三磷酸受体类型1（IP3R-1），是钙信号传导机制的关键因素，被认为是半胱天冬酶-3的底物，Bcl-2或BcL-xL可能与ER表面不同类型的IP3R（1、2或3）相互作用，以控制钙离子释放速率，这种相互作用被Bax阻止。删除IP3R1基因导致对凋亡的抵抗。这些发现证实了钙在ER应激诱导的凋亡中的重要作用。 来自同一亲本CHO克隆的高和低单克隆抗体生产克隆中ER应激的动态表明，重链mRNA的上调与每个克隆的生产水平相关，并且分子伴侣的浓度将在培养结束时增加，此时达到最大单克隆抗体滴度。然而，低生产者比高生产者晚2天进入凋亡，而凋亡率保持不变。在IgG生产的CHO细胞中，过度表达未折叠蛋白反应基因成功地产生了一个生产力更高的克隆，尽管没有评估产品质量。同样，在NS0培养的下降阶段，ER蛋白表达的增加与单克隆抗体产量的增加相关。这些结果表明，未折叠蛋白反应（UPR）基因是增加单克隆抗体生产的好目标。然而，也有研究表明高单克隆抗体生产与分子伴侣表达增加有关，但X盒结合蛋白1（XBP1）的表达没有变化，XBP1是UPR的标志，这表明未折叠蛋白反应途径在GS-NS0细胞中活性并不更高，这些细胞具有更高的单克隆抗体生产率。作者建议这一观察可能是特定于克隆的。 识别对ER敏感的克隆和ER报告基因可以帮助选择高产者并在凋亡发生之前的所有工艺开发阶段监控压力。基于ER的选择策略已应用于CHO细胞，采用GRP78（ER应激报告基因）的表达作为高表达的标志；类似的策略已应用于NS0细胞，使用GADD153基因，其在几个NS0克隆中的表达被修改。GADD153被认为是ER应激开始的良好报告基因，其过度表达本身并不是凋亡的原因。总之，ER应激应考虑在内，特别是在细胞系开发和克隆选择的早期工艺开发阶段。 4.系统方法  传统上，生物工艺优化是通过顺序实验进行的，因此仅限于筛选设计空间的一小部分区域。最近，高通量策略和“组学”技术使评估范围更广的设计空间成为可能，尽管它们既耗时又成本高昂。凋亡工程和凋亡建模是合理的“系统”方法，可以促进细胞生物工艺的优化，因为它们可以筛选整个设计空间，有可能减少时间和成本。下面回顾了这些策略，可以单独使用或结合使用（图1）。 4.1.凋亡工程 凋亡工程是一种针对细胞系工程的方法，目标是通过合理的基因表达修改，发展抗凋亡细胞系。可以过度表达抗凋亡蛋白和/或下调促凋亡蛋白。这些研究的总结见表8。 最常用的抗凋亡基因是Bcl-2，它在各种环境压力下都能提供抗凋亡能力。在杂交瘤细胞中过度表达Bcl-2延长了几种培养条件下的寿命。在NS0细胞中，过度表达Bcl-2导致相互矛盾的观察结果：一些研究报告了对细胞密度和单克隆抗体生产的积极影响，而其他报告则没有显著影响。在CHO细胞培养中，过度表达Bcl-2导致细胞密度增加，寿命改善和凋亡减少，但没有影响单克隆抗体生产。过度表达Bcl-xL或Mcl-1提供了有希望的结果的替代策略。一项关于CHO细胞中过度表达Bcl-xL和Bcl-2的比较研究得出结论，Bcl-xL是CHO细胞工程比Bcl-2更有希望的目标，因为后者可能会损害蛋白质生产。事实上，通过在CHO细胞中过度表达Bcl-xL实现了2.7倍的灌注蛋白生产增加，而另一个过度表达Mcl-1的CHO克隆报告了单克隆抗体滴度增加了40%，没有显著影响产品质量。有人建议Bcl-2和Bcl-xL的效果可能是功能上冗余的，这种可能性也在Sp2/0细胞的研究中被指出，其中Bcl-xL的表达显著改善了培养寿命。 在CHO细胞中的其他凋亡工程方法包括过度表达Aven（凋亡体抑制剂）和E1b-19k（BH3-only蛋白抑制剂），这可以延长培养寿命。另一种方法是消除促凋亡蛋白。具体来说，在CHO细胞中消除Bax和Bak增加了培养寿命，并产生了更高的单克隆抗体滴度，同时使细胞对凋亡更加抵抗（即使化学诱导的凋亡），在33和37°C下均如此。有关这些策略的详细评论，包括抑制其他基因和使用半胱天冬酶抑制剂，可以在其他地方找到。最后，据我们所知，尚未实施的凋亡工程的一个不同方法是直接针对凋亡逆转机制，通过过度表达凋亡可逆性基因（XIAP、PARP、HSPs等），这可能导致阻止凋亡事件并启动Anastasis，将凋亡群体恢复为活性。 尽管针对凋亡的细胞工程取得了有希望的结果，但关于产品质量和副作用（如代谢变化和遗传稳定性）的信息仍然不足。蛋白质生产要么没有报告，要么显示出微小的改进，这归因于生物能量学的下调。两个例外是使用NS0细胞进行的恒化器研究，其中实现了单克隆抗体产量的3倍增加，以及在CHO细胞中过度表达Bcl-xL的研究，实现了单克隆抗体产量的2倍增加。由于细胞将能量利用集中在基本功能上，因此非基本功能的能量减少。这突出了阐明细胞能量学、其在凋亡中的作用以及遗传操作引起的任何代谢变化的重要性。例如，一个潜在的有趣替代策略是通过氨基酸和葡萄糖喂养来提供凋亡保护。尽管理想情况下是互补的，但营养喂养和凋亡工程可能是不兼容的。在过度表达Bcl-xL的Sp2/0细胞克隆中，谷氨酰胺喂养后活性保持不变，而野生型在喂养后活性得到改善。细胞的遗传操作也引起了对过度表达抗凋亡蛋白的细胞系稳定性的担忧，不仅因为这些细胞中观察到异常，而且因为这些蛋白的表达可能在长期或在可能影响产品质量的特定应激条件下丢失。过度表达抗凋亡基因（Fadd、Faim、Alg-2和Requiem）的遗传工程CHO细胞不仅显示出增加的活细胞数量和γ-干扰素产量，而且还增加了唾液酸化。 4.2.凋亡的数学建模 如图2所示，凋亡是一个高度调节的过程，其中几种蛋白质的干预确保细胞以受控且无害的方式死亡。由于其在生物加工中的显著影响，凋亡的数学模型将有助于整合生物过程数据，并预测生物反应器几何形状和操作对细胞死亡的影响。然而，凋亡的生物学复杂性使建模具有挑战性。表9总结了各种有限的凋亡建模尝试。 详细数学描述参与不同凋亡途径的所有蛋白质和相互作用在（1）捕捉生物学，（2）获取验证模型预测所需的实验数据，以及（3）产生计算可追踪的预测模型方面提出了重大挑战，这些模型可用于基于模型的过程优化。因此，凋亡建模有两种先验选择。在生物学方面，需要仔细基于证据的决策，确定要建模的干预措施和相互作用，而在建模方面则决定模型结构。虽然一些研究人员选择了基于链反应的公式（启动、放大和执行）或模拟细胞群体在状态之间的转换（存活、凋亡和死亡），但大多数人选择了动力学/机制公式，由于其动态特性通常更受青睐（Kyriakopoulos等人，2018b年）。模型复杂性归因于通过建模少数相互作用以捕捉详细的动力学关联，或者通过考虑整个途径但仅考虑少数干预措施来建模。描述少数物种详细模型的例子包括（1）DNA损伤模型，（2）通过各种途径激活半胱天冬酶-3的模型，（3）Bax/Bcl-2相互作用模型，（4）包括双稳态研究的半胱天冬酶3和8相互作用模型，后来又与实验数据进行了比较，以及（5）UPR模型或自噬和凋亡之间相互作用的模型。复杂网络模型包括Fas信号模型，其中某些模拟与实验数据进行了比较，以及描述使用敏感性分析和实验验证的最小凋亡诱导配体/受体比例的CD95诱导凋亡途径模型。Bentele及其同事的工作提供了一个适合生物过程社区兴趣的模型特征示例，特别是在与生物过程优化相关的方面。在CHO细胞中使用代谢通量分析（MFA）对葡萄糖、乳酸、五种氨基酸和氨进行了代谢和凋亡的整合；然而，代谢物预测超出指数生长期与实验数据不符，未能捕捉代谢转变。尽管MFA提供了有关细胞平衡代谢状态的有价值信息，但它在动态过程中的应用有限。使用结合建模/实验方法分析了营养应激对GS-NS0细胞基因表达的影响，其中简化的动力学模型捕获了营养和代谢物剖面，并描述了批量模式下六个凋亡相关基因（半胱天冬酶3和8、atf5、bcl-2、bax和trp53bp2（p53结合蛋白2））的表达。这项工作的主要缺点是在补料分批模式下缺乏预测能力。 如前所述，跨尺度的凋亡诱导应激在生物过程开发中很重要（图4），需要在凋亡建模中纳入空间效应。例如，虽然细胞总体上可能不会经历高剪切应力环境，但有些细胞会物理上靠近搅拌器。同样，尽管pH可能得到了很好的控制，但在酸/碱添加点的局部扰动可能诱导暴露于扰动的细胞凋亡。同样，尽管气泡破裂在整体上不构成问题，但在气液界面附近可能是有害的。计算流体动力学（CFD）建模考虑了空间效应，集成CFD-动力学模型将为最佳反应器几何设计（尺寸、体积、挡板数量和搅拌器位置）、最佳操作条件（通气、O2水平、搅拌等）以及最佳培养基设计和补料策略提供有关生产力和产品质量优化的有价值信息。 5.结论和未来方向  生物反应器中的细胞死亡主要作为凋亡的结果，活力的降低可能会影响产品滴度和产品质量。为了实现最佳操作，了解引起凋亡的应激在生物过程开发中至关重要。对于各种工业相关的哺乳动物细胞系，仍然缺乏对凋亡的原因和效应的全面阐明，具体到细胞系和克隆。此外，建立稳健和快速的凋亡表征方法以及开发新方法，包括细胞工程和in silico建模，以对抗凋亡，将进一步改善生物过程优化。总之，生物过程开发和优化必须考虑细胞系和克隆特异性属性，并超越喂养策略、培养基配方和细胞工程，进行全生物过程设计，以减少/消除凋亡原因。上游改进将对下游加工产生积极影响，具有累加的有益影响。