Navitoclax

PharmaView JMC速览 2026.03.20 近日，复旦大学王任小/李嫣/周璐团队在药物化学权威期刊Journal of Medicinal Chemistry（JMC）上发表了一篇题为"苯基吡咯类小分子BAX激活剂的设计、合成及活性评价Design, Synthesis, and Evaluation of Phenylpyrrole Derivatives as Small-Molecule Activators of BAX"的研究论文。该研究针对BCL-2抑制剂临床应用中存在的耐药性问题，提出了一种直接激活促凋亡蛋白BAX的创新策略。研究团队通过大规模虚拟筛选结合系统的药物化学优化，成功将复杂的六氢环戊[c]喹啉骨架转化为结构新颖、合成简便的苯基吡咯骨架，最终获得化合物27c。该化合物以亚微摩尔亲和力（IC₅₀ = 300 nmol/L）选择性结合BAX的Trigger位点，通过诱导α1-α2环构象变化促进BAX激活、线粒体转位及寡聚化，进而触发内源性凋亡通路。值得注意的是，27c不仅对血液系统肿瘤表现出强效杀伤作用，与BCL-XL抑制剂联用时更能克服实体瘤的凋亡抵抗，为开发新一代抗癌药物提供了重要的先导化合物和结构模板。 1 min速览 研究背景 BCL-2蛋白家族调控的线粒体凋亡通路是癌症治疗的重要靶点。目前临床使用的BCL-2抑制剂（如Venetoclax）通过竞争性结合抗凋亡蛋白释放促凋亡因子，但存在明显局限性：部分癌细胞因BH3-only蛋白表达受抑而响应不佳，或因MCL-1等蛋白过表达产生耐药。BAX作为执行细胞凋亡的关键效应蛋白，其直接激活可绕过上述限制，成为更具前景的抗癌策略。然而，目前已报道的BAX激活剂结构类型有限，且大多处于临床前研究阶段，亟需开发具有新颖化学骨架和更优药理性质的候选化合物。 重点内容 研究团队首先针对BAX的Trigger位点，对160万化合物进行多轮虚拟筛选，获得苗头化合物F102；继而采用骨架跃迁策略，将复杂的六氢环戊[c]喹啉骨架（含5个手性中心、合成收率仅7.5%）简化为苯基吡咯骨架，通过引入分子内氢键维持活性构象并消除手性中心，经系统SAR优化最终获得最优化合物27c（IC₅₀ = 0.30 μmol/L）。该化合物对BAX表现出亚微摩尔级亲和力及>40倍的选择性，在多种AML细胞系中IC₅₀ < 10 μmol/L。深入的机制研究表明，27c结合胞质BAX的Trigger位点，诱导α1-α2环构象变化，促进BAX膜转位、寡聚化及线粒体外膜通透化，最终激活caspase级联反应诱导凋亡。此外，27c与BCL-XL抑制剂Navitoclax联用可显著增强对耐药实体瘤的杀伤效果；初步药代动力学研究显示其具有快速吸收（Tₘₐₓ=0.25h）和中等生物利用度（F=58.6%），但半衰期较短（T₁/₂≈1.3h），提示需进一步优化代谢稳定性。 研究总结 该研究成功开发了一类结构新颖的苯基吡咯类BAX直接激活剂，代表性化合物27c在分子和细胞水平展现出与现有最佳BAX激活剂BTSA1相当的活性，且具备更好的结构可修饰性和合成可及性。该研究不仅为克服BCL-2抑制剂耐药提供了新的联合用药方案，更为靶向BAX的抗癌药物研发提供了重要的先导化合物和结构优化策略，具有重要的转化医学价值。 图片来源：ACS 详细阅读 01 INTRODUCTION 研究背景 癌细胞常通过上调抗凋亡BCL-2蛋白（如BCL-2、BCL-XL、MCL-1）或下调促凋亡BH3-only蛋白来逃避凋亡。靶向BCL-2的抑制剂（如Venetoclax）已获批临床，但存在血小板减少、肿瘤溶解综合征等副作用，且部分癌细胞因BH3-only蛋白表达受抑或MCL-1过表达而耐药。BAX是介导线粒体外膜通透化的关键效应蛋白，其直接激活可绕过BH3-only蛋白依赖，成为更直接的促凋亡策略。然而，目前报道的BAX小分子激活剂（如BAM7、BTSA1、BDM19等）结构多样性有限，大多处于临床前阶段。本研究旨在通过虚拟筛选和结构优化，发现具有新颖骨架的强效BAX激活剂。 02 Drug Design ①先导化合物的发现 由于目前尚无实验解析的小分子激活剂与BAX相互作用的结构，这对BAX激活剂的理性设计构成重大障碍。为此，研究团队在前期工作中采用共溶剂分子动力学模拟（MixMD）评估了BAX蛋白表面的可能结合热点，随后针对BAX的Trigger位点，利用分子模拟产生的多种BAX构象进行平行虚拟筛选。如第4.3节所述，约160万种ChemDiv化合物库中的化合物经过类药性筛选、分子对接、分子动力学模拟和MMGB/SA计算的多步骤程序进行筛选，计算优选的分子根据其预测结合模式、结合能以及PAINS检查进行人工评估，最终从本地化学品供应商处购买了234种化合物的样品。所有获得的化合物随后在基于FP的结合实验中进行测试，其中两种化合物（即图3A中的F005和F102）因其对BAX表现出中等结合亲和力而对BCL-2家族抗凋亡蛋白结合较弱而引起关注。为提高发现可行先导化合物的可能性，研究团队使用上述两个苗头化合物作为查询，在ChemDiv和TargetMol化合物库中进行二维结构相似性搜索，并根据搜索结果另外购买了34种化合物进行FP结合实验测试。由于BAX在激活时形成寡聚体，体外测量BAX寡聚化是评估潜在BAX激活剂的有用方法，因此研究团队选择了FP结合实验中鉴定的几个活性苗头化合物（包括F005、F102、F130和F240）在该实验中进行进一步测试。如图3B所示，F005、F130、F240和Ac-BIM-SAHB诱导BAX寡聚化的程度相似，而F102在该实验中基本为阴性。值得注意的是，这些化合物在BAX寡聚化实验中的活性与FP结合实验中测得的结合亲和力相关性不佳，这表明有效的BAX激活剂不应仅通过考虑对BAX的结合亲和力来选择。基于FP结合实验和BAX寡聚化实验的结果，研究团队选择了化合物F102和F130进行热位移实验的进一步评估，两种化合物确实引起了Tm的明显变化，与参比化合物BTSA1相当。这两个化合物的另一个吸引人之处在于，尽管它们对BAX表现出有前景的结合亲和力（F102和F130的IC₅₀分别为0.63 μmol/L和1.1 μmol/L），但在FP结合实验中对BCL-2家族抗凋亡蛋白（包括BCL-2、BCL-XL和MCL-1）的结合可忽略不计。这种选择性对于推导清晰的BAX介导凋亡机制是理想的，即如果这些化合物确实产生促凋亡效应，可归因于直接BAX激活而非抑制抗凋亡蛋白。鉴于F102含有水杨酰胺基团，这在许多已知药物分子中很常见，可能导致不可忽视的脱靶效应，综合所有结果，研究团队得出结论：F130代表了进一步优化的有前景的先导化合物。 ②结构优化与构效关系 基于上述分析，研究团队采用基于结构的药物设计策略，包括骨架跃迁和取代位点修饰，合成并系统评价了多系列新型萘骨架VEGFR2抑制剂。鉴于氯取代基的立体体积未能充分填充疏水区域I的可用空间，首先保留疏水区域II的结构框架，通过骨架跃迁策略将氯代苯环替换为萘环部分，得到化合物A1-A8，该修饰旨在更有效地填充疏水区域I，从而增强与Lys868和Val916残基的疏水相互作用。A1-A8的合成路线如Scheme 1所示：化合物2通过2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4,6-二酮与三甲氧基甲烷的醛醇缩合，再与化合物1发生亲核取代得到；化合物2在高温条件下环化得到化合物3；化合物3经氨处理得到化合物4；化合物5经重氮化和Sandmeyer反应得到中间体6；化合物4与6在碳酸铯存在下经Williamson醚合成制备化合物7和8；化合物7和8分别还原得到关键胺类化合物9和10；最后化合物9和10与不同氨基反应得到目标酰胺化合物A1-A8。随后评价了合成化合物的抑制活性，如Table 1所示，所得化合物A1对VEGFR2激酶的抑制活性约为仑伐替尼的6倍，验证了初始设计假设。接着将疏水区域II的环丙基替换为一系列不同取代的芳香基团，得到化合物A2-A5；在这些衍生物中，A4显示出最显著的活性改善，其VEGFR2激酶抑制活性约为仑伐替尼的9倍，这一显著增强可能归因于A4的芳香环与VEGFR2活性位点中Phe1047的苯基形成有利的π-π堆积相互作用。进一步的结构修饰将脲基替换为酰胺连接子，比较A1与A6、A7与A2发现该改变导致VEGFR2抑制活性显著降低；类似地，将脲基替换为1,1-环丙烷二甲酰胺基团也使A8与A4之间的抑制活性下降。这些发现强调了脲基在与Glu885和Asp1046的羧基形成关键氢键相互作用中的重要作用，这对维持强效抑制活性至关重要。除评价VEGFR2酶抑制外，还评估了合成化合物对肺癌A549和肝癌HepG2细胞系的抗增殖作用；如Table 1所示，仑伐替尼显示出良好的抗增殖活性，对A549和HepG2细胞的半数抑制浓度分别为0.83 μM和1.46 μM；在A1-A8中，A4表现出最强的抗增殖活性，IC₅₀值分别为0.293 μM（对A549细胞）和1.33 μM（对HepG2细胞），优于仑伐替尼。 ③化学合成 苯基吡啶和苯基呋喃衍生物（5a、5b、12a-12f）通过亲核取代、Suzuki-Miyaura偶联、Buchwald-Hartwig胺化及水解反应合成。化合物19以甲基5-溴-1H-吡咯-2-甲酸酯为原料，经Suzuki偶联、亲核取代、还原、胺化及水解制得。化合物27a-27s和29a-29c的合成采用模块化策略：先分别制备联苯酚（21）和苯基哌啶/吗啉（23）片段，吡咯羧酸酯（13）与硼酸Suzuki偶联后，经亲核取代、还原、Buchwald-Hartwig胺化或磺酰化/酰化，最终水解得到目标产物。 03 RESULTS ①化合物27c与BAX直接相互作用的实验验证 为验证27c与BAX的直接结合，研究团队合成了FAM/FITC标记的27c，FP实验显示两者均在微摩尔水平保留结合活性；热位移实验表明27c、27d等可增强BAX热稳定性。CETSA实验显示27c和27d仅升高BAX熔解温度，对同源蛋白BAK无影响，证实活细胞中的选择性直接作用。生物素标记的27c保留结合亲和力，pull-down实验显示其剂量依赖性结合纯化BAX及胞质BAX，但不结合线粒体BAX，提示其靶向Trigger位点；同时不结合BAK或VDAC1，证实高度选择性。 ②化合物27c在BAX Trigger位点的预测结合模式 为揭示27c激活BAX的机制并解释构效关系，研究团队采用分子动力学模拟预测了27c在BAX Trigger位点的结合模式。预测的27c结合模式显示其与BAX存在几个关键相互作用：首先，受分子内氢键约束，27c整体构象契合Trigger位点；其次，吡咯环上的羧基与Lys21残基形成明显的盐桥，这解释了为何去除该羧基会显著降低大多数情况下的BAX结合亲和力；此外，庞大的联苯部分位于由Ala24、Leu25和Pro49形成的疏水亚口袋中，附近Gln28侧链的酰胺基团可能与该联苯部分形成偶极-π相互作用，事实上用哌啶、饱和或不饱和杂环替换该部分会导致结合亲和力一定程度降低。已知BAX蛋白激活过程中α1-α2环会发生构象变化转变为开放状态，尽管200 ns的MD模拟不足以完全揭示这一转变，但提供了有用线索。文献中常用Asp48与Asp142之间的距离作为区分α1-α2环开放与闭合构象的指标，距离>20 Å与开放状态相关。根据预测的27c结合模式，其联苯部分与α1-α2环上的Pro49接触，使该环稳定在开放构象；整个MD模拟过程中，27c存在时Asp48-Asp142距离始终维持在20 Å以上，而无配体BAX（即非活性形式）该距离大多低于20 Å。此外，沿MD轨迹的均方根波动分析显示，27c在Trigger位点的结合不仅稳定了α1-α2环的开放构象，还通过α5螺旋诱导长程变构效应，影响BAX蛋白的其他部分如α6、α7、α8和α9螺旋。综上，MD模拟结果表明化合物27c可通过结合BAX Trigger位点促进α1-α2环的打开。 ③化合物27c激活BAX的实验研究 在确认27c和27d与活细胞中BAX直接相互作用后，研究团队进行了额外的生化和细胞实验以表征其对BAX激活的影响。BAX激活始于其N端α1-α2环的构象开放及随后该区域的6A7抗体表位暴露。为确定27c结合如何影响BAX构象，研究团队进行了氢-氘交换质谱（HDX-MS）实验，结果显示27c或27d结合诱导BAX N端特别是α1-α2环附近的暴露增加，其位移是BAX激活已知的起始步骤；此外，α7螺旋和α4-α5环的更大分散性证明了构象柔性增加。HDX-MS结果表明27c和27d以与已建立的Trigger位点配体BTSA1高度相似的方式扰动BAX构象。为提供额外的直接证据，研究团队还使用特异性识别BAX活化形式的6A7抗体检测了BAX埋藏N端的暴露，结果证实27c以及BTSA1能够以剂量依赖性方式诱导BAX激活所需的构象变化。激活后，BAX通过两个关键步骤执行其促凋亡功能：转位至线粒体外膜和形成寡聚体。为表征27c在这些方面的作用，研究团队采用脂质组成模拟线粒体外膜的大单层囊泡（LUVs），脂质体转位实验结果显示27c诱导剂量依赖性BAX向脂质体膜转位，有趣的是，当27c与在BH3结构域结合口袋结合BAX的BIM SAHB肽联合使用时，该效应显著增强，这种协同作用与BAX激活需要Trigger位点和BH3结构域结合口袋共同参与的知识一致，两者分别介导激活的早期和晚期阶段。研究团队还用ANTS/DPX脂质体测试了27c，通过测量荧光团渗漏评估膜通透化，结果显示27c单独不引起荧光团渗漏，但与BIM-BH3肽联合使用时渗漏水平显著高于肽本身，证实了其在孔形成中的功能协同作用。随后，研究团队采用尺寸排阻色谱评估了27c诱导BAX寡聚化的能力，结果显示27c以时间依赖性方式诱导BAX寡聚化，尽管在该实验中效力略低于BTSA1。接下来，为检验27c是否能在活细胞中诱导BAX激活所需的构象变化，研究团队进行了6A7抗体的免疫沉淀实验，在5-10 μmol/L浓度下，27c能有效促进THP-1细胞中6A7对活化BAX的识别，与BTSA1相当。由于活化BAX预期从胞质转位至线粒体，研究团队在27c处理THP-1细胞后分离胞质和线粒体组分并通过Western blot分析检测BAX水平，观察到27c明显以剂量依赖性方式诱导BAX线粒体转位；同一实验中观察到27c处理引起细胞色素c以剂量依赖性方式释放至胞质。与该机制一致，TMRE实验结果也表明27c在5-10 μmol/L浓度下引起显著的线粒体电位丧失。值得一提的是，27c的类似物27d在所有这些实验中也表现出大致相同的活性水平。 ④化合物27c促进凋亡的实验研究 活化BAX在线粒体外膜上的寡聚化增加膜通透化，导致细胞色素c释放，进而触发caspase级联激活，包括caspase-9、caspase-3和PARP的切割，最终导致凋亡。作为BAX的直接激活剂，化合物27c和27d预期可促进凋亡。事实上，研究团队对THP-1细胞的Western blot分析显示，27c以剂量依赖性方式促进caspase-9、caspase-3和PARP的切割。此外，研究团队采用annexin-V/碘化丙啶（PI）双染流式细胞术检测THP-1细胞中的凋亡事件，结果显示27c主要诱导晚期凋亡，10 μmol/L剂量下62.8%的细胞发生晚期凋亡，该实验中27c的效力实际上优于BTSA1（10 μmol/L下36.8%晚期凋亡）和27d（10 μmol/L下29.1%晚期凋亡）。由于癌细胞可通过缺陷性凋亡和致癌改变逃避细胞死亡，研究团队在具有不同p53和/或RAS突变以及不同水平和促凋亡/抗凋亡BCL-2家族蛋白的癌细胞组中评估了27c的细胞毒性。结果显示，27c在血液系统癌细胞中表现出合理活性（IC₅₀ 2-5 μmol/L），但在实体瘤细胞中活性相对较低；值得注意的是，27c在野生型A549细胞中表现出中等活性（IC₅₀ = 6.97 μmol/L），而在BAX⁻/⁻ A549细胞中活性显著降低（IC₅₀ > 80 μmol/L），表明27c引起的细胞毒性是BAX依赖性的，而非一般线粒体应激的反应。此外，研究团队在四种非癌细胞系（HEK293T、COS7、STO和THLE-2）中测试了27c，结果显示IC₅₀ = 41.55 μmol/L（HEK293T）或> 80 μmol/L（COS7、STO、THLE-2），表明27c对某些血液系统癌细胞具有良好的选择性细胞毒性。实体瘤细胞对BAX激活剂的不敏感可能归因于BCL-XL过表达或未启动的凋亡状态，BCL-2家族蛋白的Western blot分析支持这一假设。此外，BxPC-3细胞BAX免疫沉淀物的免疫印迹分析显示，27c处理后部分BAX被BCL-XL而非MCL-1或BCL-2隔离。用强效BCL-XL抑制剂Navitoclax处理实体瘤细胞可破坏BAX/BCL-XL相互作用，导致活化的BAX释放。因此，研究团队尝试将27c与Navitoclax联合应用以克服实体瘤细胞中的BAX隔离，观察到添加27c确实增强了Navitoclax在A549和HCT116等实体瘤细胞中的细胞毒性。综上，研究结果表明，作为有效的BAX激活剂，化合物27c不仅适用于血液系统恶性肿瘤的治疗，与现有BCL-2/BCL-XL抑制剂联合使用时也可能对实体瘤具有药学潜力。 图片来源：ACS ⑤化合物27c药代动力学性质的初步评价 为揭示其作为有意义药物候选的潜力，研究团队还评估了27c的几个关键理化性质及体内药代动力学（PK）性质。27c在PBS（pH = 7.4）中的热力学溶解度测定为0.19 ± 0.06 μg/mL，处于相对较低水平。在Caco-2单层中评估了27c的双向渗透性，表观渗透系数（Papp）测定为（2.86 ± 0.64）× 10⁻⁶ cm/s（A→B）和（3.30 ± 0.09）× 10⁻⁶ cm/s（B→A），外排比（ER）为1.15，表明27c具有中等被动渗透性且主动外排可忽略。采用人（HLM）、犬（DLM）和猴（MLM）肝微粒体评估了27c的代谢稳定性，HLM、DLM和MLM中的半衰期（T₁/₂）分别为1.65 h、1.65 h和11.55 h，相比之下BTSA1在HLM和MLM中的半衰期分别为1.08 h和1.46 h，因此27c在这方面略有优势。通过小鼠腹腔注射（i.p. 10 mg/kg）和静脉注射（i.v. 5 mg/kg）给药评估了27c的体内药代动力学性质。腹腔注射时，27c表现出较短的Tmax（0.25 h），提示通过腹膜途径快速吸收进入体循环；其生物利用度（F = 58.60%）也支持有效吸收。静脉注射时，27c表现出显著大于BTSA1报道值（323 mL/kg）的分布容积（Vss_obs = 791 ± 85 mL/kg），表明27c具有更广泛的组织分布；然而，27c显示出适中的半衰期（T₁/₂ = 1.24 ± 0.17 h）和快速清除（CL_obs = 16.1 ± 3.1 mL/min/kg），相比之下BTSA1在小鼠血浆中具有显著的半衰期（T₁/₂ = 15 h）和极慢的清除（CL_obs ≈ 0）。综上，27c的体内药代动力学性质研究显示其吸收快速、分布良好、生物利用度适中，但相对较短的半衰期和快速清除可能阻碍持续药理活性的实现，研究团队得出结论：改善药代动力学性质与增强生物活性对于未来该类化合物的结构优化同等重要。 总结与展望 小分子BAX激活剂的开发极具挑战性。迄今为止，仅少数几类化合物被证实有效，其中一些的作用机制研究不足，这种情况实际上限制了探索BAX激活剂药学潜力的努力。本研究中，研究团队旨在获得一类新型选择性BAX激活剂，能够直接诱导BAX介导的线粒体凋亡，同时排除抗凋亡BCL-2家族蛋白及其他凋亡调控蛋白的潜在干扰。研究团队从虚拟筛选鉴定的活性苗头化合物出发，进行了多轮结构优化，最终聚焦于一类含苯基吡咯核心骨架的化合物。该类化合物中的最优化合物27c以亚微摩尔亲和力（IC₅₀ = 300 nmol/L）选择性结合BAX；此外，功能实验证实该化合物在体外和活细胞中均诱导了BAX激活所需的构象变化，该效应触发BAX从胞质转位至线粒体外膜，继而引起线粒体渗漏和caspase级联激活，最终导致凋亡。细胞活力实验表明，该化合物不仅对血液系统癌症有效，与BCL-2/BCL-XL抑制剂（如Navitoclax）联合使用时对耐药实体瘤也有效。总之，研究团队获得了一类具有完整作用机制证据的新型小分子BAX激活剂。就生物活性和基本药代动力学性质而言，化合物27c在许多方面与BTSA1相当，但其具有新颖的结构骨架。尽管该类化合物作为抗癌药物候选的潜力尚需在适当的动物模型上进一步研究，但其引人注目的体外和细胞活性使其成为未来开发的有前景起点。 文献详细全面信息请跳转原文阅读： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c02670 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

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μmol/L）。该化合物对BAX表现出亚微摩尔级亲和力及>40倍的选择性，在多种AML细胞系中IC₅₀ < 10 μmol/L。深入的机制研究表明，27c结合胞质BAX的Trigger位点，诱导α1-α2环构象变化，促进BAX膜转位、寡聚化及线粒体外膜通透化，最终激活caspase级联反应诱导凋亡。此外，27c与BCL-XL抑制剂Navitoclax联用可显著增强对耐药实体瘤的杀伤效果；初步药代动力学研究显示其具有快速吸收（Tₘₐₓ=0.25h）和中等生物利用度（F=58.6%），但半衰期较短（T₁/₂≈1.3h），提示需进一步优化代谢稳定性。 研究总结 该研究成功开发了一类结构新颖的苯基吡咯类BAX直接激活剂，代表性化合物27c在分子和细胞水平展现出与现有最佳BAX激活剂BTSA1相当的活性，且具备更好的结构可修饰性和合成可及性。该研究不仅为克服BCL-2抑制剂耐药提供了新的联合用药方案，更为靶向BAX的抗癌药物研发提供了重要的先导化合物和结构优化策略，具有重要的转化医学价值。 图片来源：ACS 详细阅读 01 INTRODUCTION 研究背景 癌细胞常通过上调抗凋亡BCL-2蛋白（如BCL-2、BCL-XL、MCL-1）或下调促凋亡BH3-only蛋白来逃避凋亡。靶向BCL-2的抑制剂（如Venetoclax）已获批临床，但存在血小板减少、肿瘤溶解综合征等副作用，且部分癌细胞因BH3-only蛋白表达受抑或MCL-1过表达而耐药。BAX是介导线粒体外膜通透化的关键效应蛋白，其直接激活可绕过BH3-only蛋白依赖，成为更直接的促凋亡策略。然而，目前报道的BAX小分子激活剂（如BAM7、BTSA1、BDM19等）结构多样性有限，大多处于临床前阶段。本研究旨在通过虚拟筛选和结构优化，发现具有新颖骨架的强效BAX激活剂。 02 Drug Design ①先导化合物的发现 由于目前尚无实验解析的小分子激活剂与BAX相互作用的结构，这对BAX激活剂的理性设计构成重大障碍。为此，研究团队在前期工作中采用共溶剂分子动力学模拟（MixMD）评估了BAX蛋白表面的可能结合热点，随后针对BAX的Trigger位点，利用分子模拟产生的多种BAX构象进行平行虚拟筛选。如第4.3节所述，约160万种ChemDiv化合物库中的化合物经过类药性筛选、分子对接、分子动力学模拟和MMGB/SA计算的多步骤程序进行筛选，计算优选的分子根据其预测结合模式、结合能以及PAINS检查进行人工评估，最终从本地化学品供应商处购买了234种化合物的样品。所有获得的化合物随后在基于FP的结合实验中进行测试，其中两种化合物（即图3A中的F005和F102）因其对BAX表现出中等结合亲和力而对BCL-2家族抗凋亡蛋白结合较弱而引起关注。为提高发现可行先导化合物的可能性，研究团队使用上述两个苗头化合物作为查询，在ChemDiv和TargetMol化合物库中进行二维结构相似性搜索，并根据搜索结果另外购买了34种化合物进行FP结合实验测试。由于BAX在激活时形成寡聚体，体外测量BAX寡聚化是评估潜在BAX激活剂的有用方法，因此研究团队选择了FP结合实验中鉴定的几个活性苗头化合物（包括F005、F102、F130和F240）在该实验中进行进一步测试。如图3B所示，F005、F130、F240和Ac-BIM-SAHB诱导BAX寡聚化的程度相似，而F102在该实验中基本为阴性。值得注意的是，这些化合物在BAX寡聚化实验中的活性与FP结合实验中测得的结合亲和力相关性不佳，这表明有效的BAX激活剂不应仅通过考虑对BAX的结合亲和力来选择。基于FP结合实验和BAX寡聚化实验的结果，研究团队选择了化合物F102和F130进行热位移实验的进一步评估，两种化合物确实引起了Tm的明显变化，与参比化合物BTSA1相当。这两个化合物的另一个吸引人之处在于，尽管它们对BAX表现出有前景的结合亲和力（F102和F130的IC₅₀分别为0.63 μmol/L和1.1 μmol/L），但在FP结合实验中对BCL-2家族抗凋亡蛋白（包括BCL-2、BCL-XL和MCL-1）的结合可忽略不计。这种选择性对于推导清晰的BAX介导凋亡机制是理想的，即如果这些化合物确实产生促凋亡效应，可归因于直接BAX激活而非抑制抗凋亡蛋白。鉴于F102含有水杨酰胺基团，这在许多已知药物分子中很常见，可能导致不可忽视的脱靶效应，综合所有结果，研究团队得出结论：F130代表了进一步优化的有前景的先导化合物。 ②结构优化与构效关系 基于上述分析，研究团队采用基于结构的药物设计策略，包括骨架跃迁和取代位点修饰，合成并系统评价了多系列新型萘骨架VEGFR2抑制剂。鉴于氯取代基的立体体积未能充分填充疏水区域I的可用空间，首先保留疏水区域II的结构框架，通过骨架跃迁策略将氯代苯环替换为萘环部分，得到化合物A1-A8，该修饰旨在更有效地填充疏水区域I，从而增强与Lys868和Val916残基的疏水相互作用。A1-A8的合成路线如Scheme 1所示：化合物2通过2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4,6-二酮与三甲氧基甲烷的醛醇缩合，再与化合物1发生亲核取代得到；化合物2在高温条件下环化得到化合物3；化合物3经氨处理得到化合物4；化合物5经重氮化和Sandmeyer反应得到中间体6；化合物4与6在碳酸铯存在下经Williamson醚合成制备化合物7和8；化合物7和8分别还原得到关键胺类化合物9和10；最后化合物9和10与不同氨基反应得到目标酰胺化合物A1-A8。随后评价了合成化合物的抑制活性，如Table 1所示，所得化合物A1对VEGFR2激酶的抑制活性约为仑伐替尼的6倍，验证了初始设计假设。接着将疏水区域II的环丙基替换为一系列不同取代的芳香基团，得到化合物A2-A5；在这些衍生物中，A4显示出最显著的活性改善，其VEGFR2激酶抑制活性约为仑伐替尼的9倍，这一显著增强可能归因于A4的芳香环与VEGFR2活性位点中Phe1047的苯基形成有利的π-π堆积相互作用。进一步的结构修饰将脲基替换为酰胺连接子，比较A1与A6、A7与A2发现该改变导致VEGFR2抑制活性显著降低；类似地，将脲基替换为1,1-环丙烷二甲酰胺基团也使A8与A4之间的抑制活性下降。这些发现强调了脲基在与Glu885和Asp1046的羧基形成关键氢键相互作用中的重要作用，这对维持强效抑制活性至关重要。除评价VEGFR2酶抑制外，还评估了合成化合物对肺癌A549和肝癌HepG2细胞系的抗增殖作用；如Table 1所示，仑伐替尼显示出良好的抗增殖活性，对A549和HepG2细胞的半数抑制浓度分别为0.83 μM和1.46 μM；在A1-A8中，A4表现出最强的抗增殖活性，IC₅₀值分别为0.293 μM（对A549细胞）和1.33 μM（对HepG2细胞），优于仑伐替尼。 ③化学合成 苯基吡啶和苯基呋喃衍生物（5a、5b、12a-12f）通过亲核取代、Suzuki-Miyaura偶联、Buchwald-Hartwig胺化及水解反应合成。化合物19以甲基5-溴-1H-吡咯-2-甲酸酯为原料，经Suzuki偶联、亲核取代、还原、胺化及水解制得。化合物27a-27s和29a-29c的合成采用模块化策略：先分别制备联苯酚（21）和苯基哌啶/吗啉（23）片段，吡咯羧酸酯（13）与硼酸Suzuki偶联后，经亲核取代、还原、Buchwald-Hartwig胺化或磺酰化/酰化，最终水解得到目标产物。 03 RESULTS ①化合物27c与BAX直接相互作用的实验验证 为验证27c与BAX的直接结合，研究团队合成了FAM/FITC标记的27c，FP实验显示两者均在微摩尔水平保留结合活性；热位移实验表明27c、27d等可增强BAX热稳定性。CETSA实验显示27c和27d仅升高BAX熔解温度，对同源蛋白BAK无影响，证实活细胞中的选择性直接作用。生物素标记的27c保留结合亲和力，pull-down实验显示其剂量依赖性结合纯化BAX及胞质BAX，但不结合线粒体BAX，提示其靶向Trigger位点；同时不结合BAK或VDAC1，证实高度选择性。 ②化合物27c在BAX Trigger位点的预测结合模式 为揭示27c激活BAX的机制并解释构效关系，研究团队采用分子动力学模拟预测了27c在BAX Trigger位点的结合模式。预测的27c结合模式显示其与BAX存在几个关键相互作用：首先，受分子内氢键约束，27c整体构象契合Trigger位点；其次，吡咯环上的羧基与Lys21残基形成明显的盐桥，这解释了为何去除该羧基会显著降低大多数情况下的BAX结合亲和力；此外，庞大的联苯部分位于由Ala24、Leu25和Pro49形成的疏水亚口袋中，附近Gln28侧链的酰胺基团可能与该联苯部分形成偶极-π相互作用，事实上用哌啶、饱和或不饱和杂环替换该部分会导致结合亲和力一定程度降低。已知BAX蛋白激活过程中α1-α2环会发生构象变化转变为开放状态，尽管200 ns的MD模拟不足以完全揭示这一转变，但提供了有用线索。文献中常用Asp48与Asp142之间的距离作为区分α1-α2环开放与闭合构象的指标，距离>20 Å与开放状态相关。根据预测的27c结合模式，其联苯部分与α1-α2环上的Pro49接触，使该环稳定在开放构象；整个MD模拟过程中，27c存在时Asp48-Asp142距离始终维持在20 Å以上，而无配体BAX（即非活性形式）该距离大多低于20 Å。此外，沿MD轨迹的均方根波动分析显示，27c在Trigger位点的结合不仅稳定了α1-α2环的开放构象，还通过α5螺旋诱导长程变构效应，影响BAX蛋白的其他部分如α6、α7、α8和α9螺旋。综上，MD模拟结果表明化合物27c可通过结合BAX Trigger位点促进α1-α2环的打开。 ③化合物27c激活BAX的实验研究 在确认27c和27d与活细胞中BAX直接相互作用后，研究团队进行了额外的生化和细胞实验以表征其对BAX激活的影响。BAX激活始于其N端α1-α2环的构象开放及随后该区域的6A7抗体表位暴露。为确定27c结合如何影响BAX构象，研究团队进行了氢-氘交换质谱（HDX-MS）实验，结果显示27c或27d结合诱导BAX N端特别是α1-α2环附近的暴露增加，其位移是BAX激活已知的起始步骤；此外，α7螺旋和α4-α5环的更大分散性证明了构象柔性增加。HDX-MS结果表明27c和27d以与已建立的Trigger位点配体BTSA1高度相似的方式扰动BAX构象。为提供额外的直接证据，研究团队还使用特异性识别BAX活化形式的6A7抗体检测了BAX埋藏N端的暴露，结果证实27c以及BTSA1能够以剂量依赖性方式诱导BAX激活所需的构象变化。激活后，BAX通过两个关键步骤执行其促凋亡功能：转位至线粒体外膜和形成寡聚体。为表征27c在这些方面的作用，研究团队采用脂质组成模拟线粒体外膜的大单层囊泡（LUVs），脂质体转位实验结果显示27c诱导剂量依赖性BAX向脂质体膜转位，有趣的是，当27c与在BH3结构域结合口袋结合BAX的BIM SAHB肽联合使用时，该效应显著增强，这种协同作用与BAX激活需要Trigger位点和BH3结构域结合口袋共同参与的知识一致，两者分别介导激活的早期和晚期阶段。研究团队还用ANTS/DPX脂质体测试了27c，通过测量荧光团渗漏评估膜通透化，结果显示27c单独不引起荧光团渗漏，但与BIM-BH3肽联合使用时渗漏水平显著高于肽本身，证实了其在孔形成中的功能协同作用。随后，研究团队采用尺寸排阻色谱评估了27c诱导BAX寡聚化的能力，结果显示27c以时间依赖性方式诱导BAX寡聚化，尽管在该实验中效力略低于BTSA1。接下来，为检验27c是否能在活细胞中诱导BAX激活所需的构象变化，研究团队进行了6A7抗体的免疫沉淀实验，在5-10 μmol/L浓度下，27c能有效促进THP-1细胞中6A7对活化BAX的识别，与BTSA1相当。由于活化BAX预期从胞质转位至线粒体，研究团队在27c处理THP-1细胞后分离胞质和线粒体组分并通过Western blot分析检测BAX水平，观察到27c明显以剂量依赖性方式诱导BAX线粒体转位；同一实验中观察到27c处理引起细胞色素c以剂量依赖性方式释放至胞质。与该机制一致，TMRE实验结果也表明27c在5-10 μmol/L浓度下引起显著的线粒体电位丧失。值得一提的是，27c的类似物27d在所有这些实验中也表现出大致相同的活性水平。 ④化合物27c促进凋亡的实验研究 活化BAX在线粒体外膜上的寡聚化增加膜通透化，导致细胞色素c释放，进而触发caspase级联激活，包括caspase-9、caspase-3和PARP的切割，最终导致凋亡。作为BAX的直接激活剂，化合物27c和27d预期可促进凋亡。事实上，研究团队对THP-1细胞的Western blot分析显示，27c以剂量依赖性方式促进caspase-9、caspase-3和PARP的切割。此外，研究团队采用annexin-V/碘化丙啶（PI）双染流式细胞术检测THP-1细胞中的凋亡事件，结果显示27c主要诱导晚期凋亡，10 μmol/L剂量下62.8%的细胞发生晚期凋亡，该实验中27c的效力实际上优于BTSA1（10 μmol/L下36.8%晚期凋亡）和27d（10 μmol/L下29.1%晚期凋亡）。由于癌细胞可通过缺陷性凋亡和致癌改变逃避细胞死亡，研究团队在具有不同p53和/或RAS突变以及不同水平和促凋亡/抗凋亡BCL-2家族蛋白的癌细胞组中评估了27c的细胞毒性。结果显示，27c在血液系统癌细胞中表现出合理活性（IC₅₀ 2-5 μmol/L），但在实体瘤细胞中活性相对较低；值得注意的是，27c在野生型A549细胞中表现出中等活性（IC₅₀ = 6.97 μmol/L），而在BAX⁻/⁻ A549细胞中活性显著降低（IC₅₀ > 80 μmol/L），表明27c引起的细胞毒性是BAX依赖性的，而非一般线粒体应激的反应。此外，研究团队在四种非癌细胞系（HEK293T、COS7、STO和THLE-2）中测试了27c，结果显示IC₅₀ = 41.55 μmol/L（HEK293T）或> 80 μmol/L（COS7、STO、THLE-2），表明27c对某些血液系统癌细胞具有良好的选择性细胞毒性。实体瘤细胞对BAX激活剂的不敏感可能归因于BCL-XL过表达或未启动的凋亡状态，BCL-2家族蛋白的Western blot分析支持这一假设。此外，BxPC-3细胞BAX免疫沉淀物的免疫印迹分析显示，27c处理后部分BAX被BCL-XL而非MCL-1或BCL-2隔离。用强效BCL-XL抑制剂Navitoclax处理实体瘤细胞可破坏BAX/BCL-XL相互作用，导致活化的BAX释放。因此，研究团队尝试将27c与Navitoclax联合应用以克服实体瘤细胞中的BAX隔离，观察到添加27c确实增强了Navitoclax在A549和HCT116等实体瘤细胞中的细胞毒性。综上，研究结果表明，作为有效的BAX激活剂，化合物27c不仅适用于血液系统恶性肿瘤的治疗，与现有BCL-2/BCL-XL抑制剂联合使用时也可能对实体瘤具有药学潜力。 图片来源：ACS ⑤化合物27c药代动力学性质的初步评价 为揭示其作为有意义药物候选的潜力，研究团队还评估了27c的几个关键理化性质及体内药代动力学（PK）性质。27c在PBS（pH = 7.4）中的热力学溶解度测定为0.19 ± 0.06 μg/mL，处于相对较低水平。在Caco-2单层中评估了27c的双向渗透性，表观渗透系数（Papp）测定为（2.86 ± 0.64）× 10⁻⁶ cm/s（A→B）和（3.30 ± 0.09）× 10⁻⁶ cm/s（B→A），外排比（ER）为1.15，表明27c具有中等被动渗透性且主动外排可忽略。采用人（HLM）、犬（DLM）和猴（MLM）肝微粒体评估了27c的代谢稳定性，HLM、DLM和MLM中的半衰期（T₁/₂）分别为1.65 h、1.65 h和11.55 h，相比之下BTSA1在HLM和MLM中的半衰期分别为1.08 h和1.46 h，因此27c在这方面略有优势。通过小鼠腹腔注射（i.p. 10 mg/kg）和静脉注射（i.v. 5 mg/kg）给药评估了27c的体内药代动力学性质。腹腔注射时，27c表现出较短的Tmax（0.25 h），提示通过腹膜途径快速吸收进入体循环；其生物利用度（F = 58.60%）也支持有效吸收。静脉注射时，27c表现出显著大于BTSA1报道值（323 mL/kg）的分布容积（Vss_obs = 791 ± 85 mL/kg），表明27c具有更广泛的组织分布；然而，27c显示出适中的半衰期（T₁/₂ = 1.24 ± 0.17 h）和快速清除（CL_obs = 16.1 ± 3.1 mL/min/kg），相比之下BTSA1在小鼠血浆中具有显著的半衰期（T₁/₂ = 15 h）和极慢的清除（CL_obs ≈ 0）。综上，27c的体内药代动力学性质研究显示其吸收快速、分布良好、生物利用度适中，但相对较短的半衰期和快速清除可能阻碍持续药理活性的实现，研究团队得出结论：改善药代动力学性质与增强生物活性对于未来该类化合物的结构优化同等重要。 总结与展望 小分子BAX激活剂的开发极具挑战性。迄今为止，仅少数几类化合物被证实有效，其中一些的作用机制研究不足，这种情况实际上限制了探索BAX激活剂药学潜力的努力。本研究中，研究团队旨在获得一类新型选择性BAX激活剂，能够直接诱导BAX介导的线粒体凋亡，同时排除抗凋亡BCL-2家族蛋白及其他凋亡调控蛋白的潜在干扰。研究团队从虚拟筛选鉴定的活性苗头化合物出发，进行了多轮结构优化，最终聚焦于一类含苯基吡咯核心骨架的化合物。该类化合物中的最优化合物27c以亚微摩尔亲和力（IC₅₀ = 300 nmol/L）选择性结合BAX；此外，功能实验证实该化合物在体外和活细胞中均诱导了BAX激活所需的构象变化，该效应触发BAX从胞质转位至线粒体外膜，继而引起线粒体渗漏和caspase级联激活，最终导致凋亡。细胞活力实验表明，该化合物不仅对血液系统癌症有效，与BCL-2/BCL-XL抑制剂（如Navitoclax）联合使用时对耐药实体瘤也有效。总之，研究团队获得了一类具有完整作用机制证据的新型小分子BAX激活剂。就生物活性和基本药代动力学性质而言，化合物27c在许多方面与BTSA1相当，但其具有新颖的结构骨架。尽管该类化合物作为抗癌药物候选的潜力尚需在适当的动物模型上进一步研究，但其引人注目的体外和细胞活性使其成为未来开发的有前景起点。 文献详细全面信息请跳转原文阅读： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c02670 说明 公众号以个人学习和分享最新科研成果为目的，本文内容为阅读文献提炼总结的内容，因学识有限，难免有所疏漏和谬误，恳请批评指正。标记【原创】指原创编译，是出于便于传播目的，著作权归出版社与作者所有。投稿，合作，交流请后台联系。欢迎课题组投稿，可刊载研究成果宣传，人才招聘信息。欢迎合理转载，请写明来源于【药研视角】 求点赞 求分享 求喜欢