ADC药物的数据开发：how to generate, how to use

2023-06-21

抗体药物偶联物

也许在ADC的发现和发展过程中遇到的所有障碍都可以归因于它们治疗窗口的狭窄。因此，通过一系列的体外、体内和临床研究，对ADC进行全面和定量的评估，对于优化ADC的设计，最终为患者提供更安全、更有效的治疗至关重要。利用体外和临床前数据有助于了解ADC的疗效、毒性、耐药性等作用机制。临床前的数据信息随后可以转化为临床研究设计。数学建模方法能够对整个发现和开发阶段产生的所有ADC数据进行进一步的定量评估，并能够对ADC进行客观评估和临床前到临床的转换。本文就如何利用体外、体内和临床研究来解决在ADC发现和开发过程中遇到的关键问题做一个简要介绍。体外研究细胞毒性试验研究细胞毒性试验是开发ADC的关键第一步。它提供了一个工具来选择有前途的ADC候选物，预测体内疗效，并评估ADC的细胞特异性。利用死/活细胞标记物的试验包括四唑还原（例如MTT，MTS试验），resazurin还原（alamarBlue试验），LDH释放，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶释放，蛋白酶活性标记物，ATP检测等。此外，不透过活细胞但可进入死细胞的染料可作为死细胞的指标。例如台盼蓝和许多荧光基因组DNA染料。四唑还原试验通常用于高通量、低成本地评估ADC的疗效。在进行ADC的细胞毒性试验时应该考虑一些技巧。首先，在决定实验中ADC的浓度范围时需要考虑DAR。从概念上讲，DAR更高的ADC比DAR较低的ADC表现出更多的细胞毒性。因此，基于payload IC50确定细胞毒性试验的浓度范围时，payload浓度（即将ADC浓度乘以DAR）可能是更好的预测指标。其次，ADC的孵育时间可能取决于细胞毒性药物的类型。对于两种主要类别的药物，即微管干扰剂和DNA损伤剂，通常需要至少3-5天才能评估这些药物的细胞毒性。最后，始终将对照组（即未处理的细胞、仅培养基、非靶向ADC等）包括在内，并通过规范化过程将活细胞和死细胞数量进行比较以提供更可靠的结果，从而更好地筛选潜在的ADC候选物。旁观者效应旁观者效应可以提高可切割ADC的疗效，但也可能增加非靶向细胞的毒性风险。因此，需要定量了解旁观者效应，以支持新型可切割ADC的发现和开发。在体外系统中，旁观者效应可通过使用含有抗原阳性（Ag+）和抗原阴性（Ag-）细胞的共培养方法或条件培养基转移试验进行表征。在共培养方法中，Ag+和Ag-细胞一起培养，将共培养系统中Ag-细胞的存活率与以相同ADC浓度处理的单培养系统中Ag-细胞的存活率进行比较。如果共培养系统中Ag-细胞的细胞毒性大于单培养系统中Ag-细胞的细胞毒性，则表明所测试的ADC能够引起旁观者效应。还可以设计不同的实验来定量评估旁观者效应。例如，在共培养系统中结合不同比例的Ag+和Ag-细胞（例如50% Ag+和50% Ag-），或使用不同的ADC浓度或孵育时间处理细胞。通过绘制旁观者效应系数与共培养系统中Ag+的%之间的关系图，可以评估旁观者效应程度与抗原可用性之间的关系。至于条件培养基转移试验，首先用ADC处理Ag+细胞不同时间，然后将条件培养基转移到Ag-细胞中，并在孵育期后测量Ag-细胞的存活率。值得注意的是，可以利用体外旁观者效应数据构建PD模型，并数学描述ADC的旁观者杀伤作用。PD模型还可以与系统PK模型相结合，形成PK/PD模型，从而促进具有最佳旁观者杀伤能力的ADC药物的开发。抗原表达在细胞水平上了解ADC和payload的PK对于评估癌细胞内靶点表达和ADC暴露之间的关系至关重要。这为在ADC的发现和开发过程中进行抗原选择和目标患者人群的筛选提供了至关重要的信息。考虑到ADC的作用机制，可以认为高靶点表达的患者比低或非表达者更具响应性。因此，探索ADC和payload的细胞PK可能有助于更好地了解生物测量（如抗原表达）和ADC疗效之间的关系。为了研究ADC的细胞PK，可以从研究payload的细胞分布开始，其中在给定时间内用payload孵育后测量培养基和细胞样品中的payload浓度。然后进行ADC的细胞PK研究，在细胞用ADC处理一段时间后，测量培养基和细胞样品中ADC的不同分析物（例如总mAb、未偶联的payload、总payload等）的浓度。通过利用表达不同靶点水平的细胞系，可以分析ADC不同分析物的细胞暴露与靶点表达之间的关系。该发现可能支持在患者中筛选抗原表达水平，以从ADC中获得最大的治疗效益。ADC的细胞内转运ADC可以被视为前药，在发挥其活性之前需要在肿瘤细胞内经过处理和代谢。ADC-靶标复合物经历内吞作用和溶酶体运输，释放payload并发挥抗癌活性。因此，ADC-靶标复合物的内吞作用、再循环和溶酶体运输的程度是ADC活性的重要因素。因此，在体外定量评估ADC的细胞内转运可以促进新型ADC的设计和优化。已经采用了几种体外测定来评估ADC的细胞内转运。首先，细胞积累测定研究ADC在细胞内的积累。细胞暴露于带有pH敏感染料标记的ADC中，该染料在中性pH下表现出微弱荧光，但在酸性pH下显示荧光。染料的性质允许跟踪ADC进入酸性内体和溶酶体的转运。第二个是内吞作用测定，研究ADC的摄取和内吞作用，结果可用于计算内吞速率。细胞表面标记了荧光标记的ADC，然后在37°C下孵育不同的时间间隔以进行表面荧光的内吞作用。接下来，细胞将在冰上孵育30分钟，然后进行流式细胞术分析，从而计算ADC的内吞作用程度。此外，已知多种受体，如HER2，在ADC-受体复合物内吞作用后迅速而有效地回收，而不是进入溶酶体降解途径。因此，可以使用回收测定来跟踪回收动力学。体内实验ADC的全面非临床评估至关重要，因为它提供了更好地预测临床疗效和安全性情况的机会，并增加ADC临床成功的机会。非临床研究计划应考虑单个组分（mAb或payload）和作为一个整体的ADC。需要在非临床研究中考虑的关键因素包括：（1）确定具有更好非临床结果可转化性的适当动物物种；（2）mAb、payload和ADC的PK和PD；（3）ADC的毒理。因此，在ADC开发的临床前阶段应包括PK、PD和毒理学研究。生物分析：多种形式对ADC系统PK和组织分布的定量理解对于建立暴露-效应关系、确定关键毒理学研究的适当剂量以及评估ADC的安全性至关重要。然而，ADCPK的表征是具有挑战性的，因为需要使用多个测定格式来测量不同的分析物。对于ADC来说，通常测量的分析物有：总抗体(conjugated mAb + naked mAb)、总payload（conjugated payload + unconjugated payload）、conjugated mAb、conjugated payload和unconjugated payload。因此，ADC的生物分析策略通常需要使用大分子的配体结合测定（如ELISA）和小分子的液相色谱-质谱（LC-MS/MS）方法。需要注意的是，当量化具有异质性DAR值的ADC的偶联抗体时，ELISA对于抗药物的抗体的选择是敏感的。因此，对于试验的开发来说，重要的方面是要确定一个对DAR影响最小的抗药物的抗体。ADC的另一个重要属性是DAR，它可能会影响ADC的稳定性、PK和疗效。目前已报道的用于测量平均DAR的分析方法包括UV、HIC、LC-MS、RP-HPLC和LC-ESI-MS。体内 PK 数据非临床体内研究是ADC开发和转化的基础，它连接了体外研究和首次人体临床试验。对ADC PK的定量理解对于建立暴露-效应关系和评估ADC的安全性至关重要。1.payload PK一般认为，ADC的毒性源于payload的药理作用，因此了解payload本身的PK和生物分布是不可或缺的。然而，在ADC的开发中，这些信息往往受到较少的强调甚至是缺乏的。此外，由于payload本身的毒性，无法在人体中进行payload的PK研究。因此，对于可切割型ADC（如MMAE）单独进行payload的非临床PK研究可以对其从临床前到临床的转化提供巨大价值。2.了解系统和组织PK临床前实验的另一个重要意义是研究ADC的全身PK，这在临床中几乎是不可能进行的。几项临床试验的观察表明，单纯的血浆PK可能无法充分反映ADC的毒性/疗效。例如，在BV的2期研究中，MMAE的浓度增加， ORR的概率降低，ADC的不良事件随着MMAE浓度的降低而增加。因此，有必要研究ADC在血浆和不同组织中的PK。3.了解不同的ADC 分析物关于ADC的全身PK的定量，最佳方式是测量ADC的不同分析物, 例如，total mAb, conjugated mAb和unconjugated payload，以充分确定其在体内的总体分布。众所周知，payload与mAb的偶联会改变ADC分子的物理化学特性，从而影响其PK。需要对多个分析物进行量化的另一个原因是，目前还没有关于哪个ADC 分析物来自哪个生物基质更适合于建立ADC暴露-效应关系的共识，因为每个分析物提供了对ADC整体PK的不同方面的洞察。对来自I期临床试验的8种vc-MMAE ADC的临床数据进行分析表明，conjugated MMAE是评估疗效和安全性的更好指标。因此，仅测量conjugated MMAE可能足以支持后期临床开发。然而，这样的结论可能不适用于具有不同linker-payload的其他ADC。体内 PD 数据尽管利用了各种动物模型，但与PK结果相比，从实验室到临床的疗效和PD结果的转化仍然相对具有挑战性。在临床前开发中，需要使用不同类型的动物模型来评估ADC的疗效和毒性。常用人源异种移植小鼠模型来测量药物的疗效，因为小鼠细胞系对ADC payload通常不太敏感。非人灵长类动物常用于测试毒性，因为大多数在鼠类系统中开发的mAb通常不与鼠抗原交叉反应，并且抗原表达水平在啮齿类物种中也不同。眼毒性被报道为许多ADC，如cantuzumab ravtansine, mirvetuximab soravtansine, coltuximab ravtansine等的剂量限制毒性，但这只能在兔子模型中检测到。显然，没有单一模型能够包括所有这些因素，并且已知临床前模型存在问题，如物种特异性代谢途径，不同物种之间的免疫系统差异，这使得ADC PD的临床转化更具挑战性。尽管存在上述限制，但临床前模型仍然是在改善ADC治疗指数的策略的有用工具。它还可以用于筛选不同的ADC设计，如连接子类型、连接子化学、偶联方法等并可帮助选择最佳ADC配方。毒性和安全性临床前毒性研究的目标可以分类为：（1）生成安全数据，以确定新型ADC的人类首次剂量并确定潜在的人类风险；（2）解决与ADC毒性相关的机制问题，例如，研究不同连接子化学、连接位点、DAR、剂量方案等对ADC毒性的影响。对于第一个目标，临床前研究至少应遵循ICH S6（R1）和ICH S9的监管指南，以支持IND提交。通常，这包括在相关物种（通常是非人灵长类动物和一种啮齿类动物）中进行GLP毒性研究，血浆中的体外稳定性、组织交叉反应、毒代动力学、慢性毒性以及基因毒性研究。在进行临床前毒性研究时，需特别考虑ADC的一些独特因素。首先，应利用已有的payload（如auristatins、maytansines、calicheamicins）或连接子类型相同的ADC的可用数据。许多ADC使用相同的mAb或细胞毒素药物，其中一些已获批准单独使用（如trastuzumab、紫杉醇、MTX）。因此，可能已经存在相当多的临床前和临床数据。其次，在设计或解释临床前毒性研究时，应考虑ADC的每个组成部分对观察到的毒性的贡献。例如，正常组织上抗原的低水平表达可能导致更特异的毒性，而payload的过早释放可能会导致更广泛的毒性。还应注意payload类别广泛的毒性，例如：MMAE引起的周围神经病和中性粒细胞减少症；MMAF引起的血小板减少症和眼部毒性；DM4相关的眼部毒性；calicheamicin引起的血小板减少症和肝毒性等。第三，临床前毒性研究中ADC的给药和暴露持续时间应足够长，以允许检测毒性的发生。经典的例子是vc-MMAE ADC在临床中观察到的周围神经病，但在猴子或大鼠的临床前毒性研究中未被预测到。经过评估，认为药物的不充分暴露持续时间是vc-MMAE周围神经病的可转化性不足的最可能原因。除了提到的考虑因素之外，调查ADC如何以及为什么对不同细胞类型产生观察到的毒性，以及为什么同类型的ADC（即相同的payload、linker）的毒性谱不一致，也是非常重要的。临床前毒性研究也可以用于指导选择最佳剂量策略或有利的ADC设计，这与监管毒性研究有所不同。例如，已有证据表明，调整剂量方案可以改善ADC的耐受性，例如 Hinrichs等人的研究所示，在大鼠和猴子中，PBD偶联的ADC的不同剂量方案（每周0.33mg/kg，三次）与单次1mg/kg相比，显著降低了系统毒性，但保持了类似的肿瘤生长抑制。临床数据临床数据的全面理解对ADC的开发非常重要，因为它有助于指导ADC的最终剂量方案，并为每个患者人群提供提供更安全和更有效的药物治疗机会。ADC的复杂性需要独特的考虑，专门的临床药理学策略和定量方法来支持ADC的开发和批准。根据2022年FDA指南，ADC的临床药理学考虑因素包括生物分析方法、剂量策略（PK / PD）、剂量-反应和暴露-效应分析、内在因素（即器官功能障碍、药物基因组学、体重、年龄、性别、种族）、QTc评估、免疫原性和药物相互作用（DDI）。为了表征ADC的临床PK，需要测量多种分析物。常见的ADC分析物包括conjugated mAb, conjugated payload, total mAb, unconjugated mAb 和 unconjugated payload。然而，与可能包括生物分布数据的临床前PK研究不同，临床PK仅限于血浆数据。I期剂量递增研究的PK数据可以进行剂量归一化和叠加，以评估PK的线性。首先通过非隔室分析(NCA)分析不同analyte的血浆浓度。虽然NCA似乎是一种简单的方法，但比较从NCA计算出的不同ADC分析物的PK参数可能会非常有启发性。以可断裂vc-MMAE ADC为例，说明PK参数如何为ADC的PK特性提供见解。首先，通过比较ADC总mAb清除率与常规mAb（即正常的IgG1）的清除率，可以确定偶联是否会影响mAb组分的PK。其次，与总mAb分析物相比，偶联的payload/mAb通常显示出更快的清除，这可能表明消除偶联物是由两个过程驱动的：解偶联和蛋白水解降解，其中降解过程仅驱动总mAb清除。第三，未偶联的payload的暴露通常比总mAb或偶联物低得多（> 100倍），它可作为ADC在系统循环中稳定性的指标。第四，未偶联的payload在达到最大浓度时的时间延迟加上半衰期延长，将提示释放药物的形成速率受限的动力学。此外，还应检查偶联payload和偶联mAb（或总mAb）之间的最大观察浓度（Cmax）的差异是否与ADC剂量配方中的DAR相对应（对于DAR为4的ADC，偶联MMAE的Cmax比偶联的ADC高4倍）。同时也观察到，一种ADC分析物的PK参数可以推广至具有类似payload-linker设计的另一种ADC。例如，Li等人已经证明，在I期临床试验中，无论其靶标和适应症如何，8种vc-MMAE ADCs在2.4mg/kg时三种不同分析物（总mAb、偶联的MMAE、未偶联的MMAE）的PK特征和PK参数非常相似。目前正在临床开发(或批准)的ADC通常利用已在其他已批准的ADC中使用的已建立的连接方法、连接子设计和payload。人们可以很容易地比较这些分子之间不同ADC分析物的PK参数，并利用已报道的值来预测具有相似linker-payload的新型ADC的PK。在剂量选择的关键研究中，暴露-效应分析是一个关键工具。目前还不确定哪种ADC分析物驱动了功效或安全性。根据当前已批准ADC的数据，ADC分析物（偶联的抗体或偶联的药物）在暴露-效应分析中往往具有更好的相关性。相比之下，大多数ADC中没有明显的暴露-安全性关系，而某些ADC中偶联的mAb，而不是未偶联的payload往往与不良事件具有更好的相关性。暴露-安全性关系可能与直觉相反，因为高效payload的释放可能会导致毒性。因此，这些临床观察结果再次强调了血浆PK可能无法代表不同ADC分析物的全身PK，因此，自下而上的建模方法，如生理药动学（PBPK）建模，可能有助于预测ADC的生物分布。小编小结ADC药物的数据开发对于药物研发和临床应用都具有重要的意义和价值，研究人员和临床医生应该密切关注其相关数据的收集和分析，以更好地评估和应用ADC药物。参考文献1.Overcoming Obstacles in Drug Discovery and Development.2.Chemical Linkers in Antibody–Drug Conjugates (ADCs).