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点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注 摘要 单克隆抗体( monoclonal antibody，简称单抗) 药物近年来得到快速发展，但研发周期长和成本高使其患者可及性有待提高。单抗生物类似药与原研参照药具有相似的安全性及有效性，生物类似药的开发是通过逐步递进的方式进行的，包括质量相似性、非临床相似性及临床相似性研究。这种递进式研究会降低临床研究的不确定性，提高药物开发成功率和患者可及性。因此，单抗生物类似药被很多生物科技公司视为重点研发方向。对原研药的质量属性分析和候选药质量相似性研究是生物类似药开发的基础，也为临床研究设计提供了重要依据。 本文结合国内外生物类似药的法规要求、生物类似药的开发和国内外申报经验，全面阐述了单抗生物类似药的质量相似性研究内容，特别是对于关键质量属性的评价难点进行了总结，对于工艺开发具有重要的参考作用，从而帮助企业加速药物的开发进度，也给监管机构提供技术支撑。 正文 单克隆抗体(简称单抗) 药物始于20世纪80 年代，经历了30 多年的发展，目前已成为生物药的最大类别。在2019 年全球最畅销的药物前十榜单中，仅单抗药物就占据6 个。为了使更多的人能够获得优质的单抗药物治疗，科学家及制药企业通过一系列的途径降低成本。其中，生物类似药的研发和上市将极大地降低患者使用负担，提高单抗药物可及性。 截至2020 年12 月，欧洲EMA 已批准69 个生物类似药，其中单抗类药物30 个; 美国FDA 已批准28 个生物类似药，其中单抗类药物19 个。中国的生物类似药起步较晚，但发展迅猛，自2019 年2 月，复宏汉霖公司研发的中国第一个生物类似药“汉利康®”上市后，国家药品监督管理局( NMPA) 已陆续批准6 个生物类似药上市，均为单抗生物类似药。在2020 年7 月29 日首个中国原研的单抗生物类似药曲妥珠单抗( Zercepac®) 获得欧洲EMA 的上市批准。 在进行单抗生物类似药研发及申报时，往往会遇到很多难题，如比对参照药的选择( 参照药批次､数量､效期等) ､分析方法的应用､相似性评价原则､产品质量属性的评估等。本文将针对这些问题进行讨论，以期为单抗生物类似药的研发提供思路。 1质量相似性研究 由于单抗药物生产工艺和分子结构的复杂性，实际上不可能获得与参照药完全一致的产品。如何评估生物类似药与参照药在质量､安全､有效性上的相似性是生物类似药研发过程中必须解决的问题。我国在生物类似药的研发数量上位居全球第一，笔者根据单抗生物类似药的研发实践经验，对质量相似性研究的解析，总结为如下4 个方面。 1. 1 基本原则 根据《生物类似药研发与评价技术指导原则》，生物类似药研发和评价的基本原则为: 比对原则､逐步递进原则､一致性原则和相似性评价原则。在2021 年发布的《生物类似药相似性评价和适应症外推技术指导原则》中，则和欧美的指导原则一致，包括整体相似性和逐步递进的原则。 整体相似性侧重于完整的证据链，包含对药学､非临床､临床比对研究的结果进行综合评价。逐步递进原则是指前期研究中，若候选药与参照药间存在差异，需评估该差异是否对安全性､有效性产生影响，若不确定其影响，则在后续的比对研究中应设计针对性的实验进行评估。 1. 2 原研参照药的考量 生物类似药质量属性的相似性评价接受标准，是基于原研参照药的质量分析结果而确定的。关于原研参照药的选择有以下几个方面需要考虑。 1. 2. 1 批次要求 欧洲EMA 和美国FDA 的相似性指导原则中对参照药的要求基本一致。以美国最新的指导原则为例，应进行包含至少10 批参照药的质量相似性比对研究，且涵盖原研药的效期范围。若因特殊原因而不足10批，需及时与美国FDA 沟通进行评估。对于候选生物类似药，需要包含6-10个代表商业化生产工艺批次样品，通常包括关键临床使用和工艺验证批次。用于相似性研究的候选药如果批次间发生了工艺变更，则需要提供工艺可比性研究，保证不同工艺产品在质量､安全性､有效性上的一致。 1. 2. 2 来源地考虑 在早期研发阶段，通常会尽可能地收集多个来源地的原研药为参考，进行候选药的工艺开发及质量研究。在生物类似药上市申请时，中国NMPA､欧洲EMA和美国FDA均要求参与质量相似性研究的参照药应为申报地同等来源。若选择了非申报地来源的参照药参与相似性评估，则需要提供候选生物类似药和不同来源参照药两两间的相似性研究数据作为支持。 美国FDA 在最新的指导原则中明确提出，用在比对研究( 包括理化分析､功能研究､动物实验和临床研究) 中的所有参照药和生物类似药的数据和信息都应体现在生物药上市申请( biologics license application, BLA) 资料包中。如果相似性研究中排除了某个批次的样品，需要提供相应的评估依据。 1. 2. 3 参照药管理 参照药的选择，除了批次数量和来源外，还需要关注其保存条件及管理流程。根据笔者经验，目前国内采购参照药周期较长，在进行头对头分析比对实验时，参照药可能会超过效期。为了解决此问题，可采用在效期前将样品冻存，但要有相应的方案和实验证明冻存步骤对样品的质量属性没有影响，这也是国内外监管机构所能接受的。(这里的意思是在效期之前把样品冻存起来可以当做不过期样品来用？)在上市申请的现场核查中，审评员也会关注参照药的管理，即采购､分装､保存和领用等记录，以保障质量相似性研究过程中参照药数据的真实性和可追溯性。 1. 3 分析方法 质量相似性研究是生物类似药注册申报的主要内容，对于应用的分析方法适用性及稳定性要求很高: ① 需要是当前行业和技术领域最先进的，即“state-of-the-art”分析方法，要有足够的灵敏度，能观察到生物类似药和原研参照药关键质量属性之间的细微差别，特别是稳定性比对中的降解产物的识别，即“stability indicating”能力。② 对于同一质量属性，要选择正交的分析方法和技术进行研究，如采用基于不同的原理( 物理､化学或生物学) 的分析方法。③ 除了正常的原液( drug substance, DS) /成品( drug product, DP) 放行检测外，质量相似性研究还应包括更全面的结构和特性鉴定研究。此类分析方法，根据其本身特性，虽不需要如放行检测方法的验证要求，但也要从科学角度证明其合理性､可靠性和可重复性。根据文献报道､监管部门审评要求和实践经验，一般用于质量相似性的分析方法汇总见表1。 1. 4 质量属性的相似性可接受标准 美国FDA 在2017 年推出了一个指导原则草案( 目前已撤销) ，该草案对质量相似性评估的属性分级( Tier) 和相应评估策略进行了描述，包括统计分析方法确定相似性评估的范围。2019年，美国FDA 发布了最新的生物类似药质量相似性评估的指导原则，强调了质量范围法确定相似性评估的范围，评估方式更加灵活。欧洲EMA在2017年发布的指导原则中，介绍了统计学评估方法，包括Min-Max法､Tolerance Intervals 法和质量范围法( X-sigma) ，与美国FDA 的法规中描述一致。对质量属性的分级需要建立在对产品质量全面认知的基础上，且需要遵循“case-by-case”的理念，表1 中的案例可供参考。需要注意的是，尽管推断统计方法( inferential statistical methods) ，如等效性分析，在临床研究中被广泛应用，但在质量属性评估中，受到样本数量和样本选择的影响，可能会得到假阳性的结论。 在根据参照药质量分析数据设定相似性评价标准时，要考虑到因参照药本身工艺变化，导致一些质量属性出现变化的因素。法规部门针对这个现象并没有明确的建议，企业的研究人员要积累不同阶段参照药的质量数据变化趋势，并评估这种变化对产品安全性､有效性的影响，以及相似性评价标准的合理设定。在“汉曲优”的质量相似性研究中，观测到有效期在2017 年3月-2021年3月的参照药呈现了糖型比例( 尤其是半乳糖化和去岩藻糖化) 变化，对应的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用( antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 和FcγRIIIa结合活性都呈现了一致的变化，经过评估，表明该变化和参照药工艺变更相关，对产品的安全性及有效性无影响。 2质量相似性研究中关键点的考量 质量相似性是生物类似药研发的基础，需要对原研药的质量属性进行剖析，并以此为参照开发相似药的工艺。单抗药物质量相似性研究重点关注的质量属性，包括一级结构､高级结构､糖基化､蛋白质含量､电荷异质性､分子大小变异体､颗粒分析､杂质分析､生物学活性及免疫学特性等。 2. 1 一级结构 一级结构通常指其氨基酸序列，是高级结构及生物学功能的基础。生物类似药原则上要求氨基酸序列和参照药保持一致。一级结构相关的质量属性分析通常包含氨基酸序列､蛋白分子量､翻译后修饰､二硫键和游离巯基等内容。 2. 1. 1 氨基酸序列及分子量 一级结构的表征方法多是基于液质联用技术( LC-MS) ，从分子的不同水平进行分析，再辅以其他方法进行正交分析。从完整分子､亚基水平和肽段水平3个维度，可以全面地比对分析生物类似药和参照药的氨基酸序列的一致性。一些方法，如氨基酸定量法和Edman降解法等，可以作为正交分析方法证明氨基酸序列的一致性。除了氨基酸序列之外，生物类似药和参照药的链间和链内二硫键的连接方式是否和理论一致也十分重要，一般通过二硫键鉴定和游离巯基定量检测2个方法进行评估。 2. 1. 2 二硫键 二硫键分析一般通过非还原肽图进行鉴定。样品经过Lyc-C和Trypsin顺序酶切，得到带有二硫键的肽段，进行肽段分子量和二级质谱分析，并与理论序列进行比对，以确证生物类似药和参照药的二硫键连接方式一致性。游离巯基的定量则通过Ellman试剂或其他荧光染料与巯基的反应进行，其检测结果也能侧面反映生物类似药和参照药的二硫键结构一致性。 2. 1. 3 翻译后修饰 翻译后修饰是单抗异质性的原因之一，也是影响其生物学活性和功能的因素之一，生物类似药和参照药翻译后修饰位点和含量的一致性是质量相似性研究的重要一环。针对除糖基化之外的翻译后修饰，按照位点和修饰类型进行分类。 2. 1. 3. 1 脱酰胺 单抗分子的天冬酰胺和谷氨酰胺会发生脱酰胺转化为天冬氨酸和谷氨酸，是一种常见的翻译后修饰。正常人体内的免疫球蛋白G1( immunoglobulin G1, IgG1) 和免疫球蛋白G2( immunoglobulin G2, IgG2) 在315 位和384 位天冬酰胺易发生脱酰胺修饰，有报道约23%的Asn384 发生了脱酰胺修饰，而谷氨酰胺的脱酰胺修饰常见于抗体的恒定区。脱酰胺修饰会发生在抗体的多个位点，不同位点的敏感程度不同，跟单抗高级结构有一定的联系。若抗体分子存在NG基序，则易受到样品处理的影响而产生高比例的翻译后修饰。因此，在质量相似性研究中，应关注脱酰胺修饰的位点和比例，评估其对单抗分子的安全性和有效性的影响。 2. 1. 3. 2 氧化 抗原互补决定区( complementarity determining region,CDR) 中甲硫氨酸( methionine,M) 氧化可能会影响抗原结合活性; 抗体可结晶区域( crystallizable fragment,Fc) 的氧化修饰可能会影响抗体的热稳定性､蛋白A( protein A) 结合能力和新生儿受体( neonatal Fc receptor,FcRn) 结合活性。因此，在评估氧化修饰时，应同时关注其氧化修饰的位点和水平。 例如，Fc 段的M252和M428是较易发生氧化修饰的2 个位点，构象上比较接近，均位于CH2 /CH3 的交界表面，临近FcRn 结合区域和Protein A 结合区域。研究表明，约40% 的M252氧化修饰会显著降低单抗血清半衰期。然而，单抗分子普遍存在低比例的M252和M428氧化修饰，如赫赛汀和其生物类似药分别发现有约4%和10%的氧化修饰。 2. 1. 3. 3 N-端修饰 单抗分子的N-端多发生谷氨酰胺或谷氨酸的环化反应而形成焦谷氨酸，是生物体内比较常见的修饰，一般认为其不影响生物学活性和功能，但该修饰和单抗的电荷异质性相关，相似性研究中可结合电荷异质性分析结果综合评估。 2. 1. 3. 4 C-端修饰 血清中的抗体重链C-端通常为甘氨酸，而IgG 的编码基因显示C-端为赖氨酸。研究表明，在体内存在一种内源羧肽酶B，可以将抗体的C-端赖氨酸切除。因此，在质量相似性研究中，通常认为C-末端赖氨酸的切除不影响产品的安全性和有效性。在单抗生产过程中，C-端赖氨酸未完全切除会导致单抗的电荷异质性发生变化。因此，在电荷异质性的相似性评估中要考虑这种修饰带来的影响。 一些其他修饰如异构化､胱氨酸化､糖化等，应结合其含量､位点和相关活性及功能研究进行相似性评估。 2. 2 高级结构 高级结构对单抗药物的生物学功能发挥十分重要，采用正交技术从各个方面对其进行相似性评估，包括抗体二级结构及三级结构分析。 二级结构分析一般采用远紫外圆二色谱和红外光谱2种技术，三级结构通过近紫外圆二色谱的方法进行分析; 差示扫描量热分析通过蛋白质的热稳定性变化反映结构的变化; 荧光光谱则反映蛋白质中特定氨基酸( 色氨酸等) 在空间的位置和环境; 蛋白质的核磁图谱取决于其所有的高级结构形式，包括氨基酸类型､二级结构和三级结构引起的化学位移，以及氢氘交换的动力学差异; 超速离心方法通过对比蛋白质单体､碎片及聚体在自然状态下的沉降速率，从而反映蛋白质在溶液状态下的高级结构差异。 由于高级结构的分析方法多为定性方法，其比对方式多为图谱相似; 或者采用一些经验模型对图谱进行进一步解析，获得一些参数进行相似度比较。经验模型多来源于文献或者自建，因此需要在分析结果处备注计算的软件或模型出处。例如，采用Thermo OMINC 计算图谱相似度，数值越接近于1，说明图谱越相似。但此方法需要一定的实验次数，且对微小信号的差异不敏感，仍需结合图谱目视比较进行分析。Amgen 公司的科学家提出一种WSD( weighed spectra difference) 的计算公式，通过加权偏差计算的方式，更敏感地反映图谱间差异。对于高级结构分析而言，统计学分析手段的应用将是趋势。 2. 3 糖基化 治疗用单克隆抗体制品是一种糖蛋白，单抗的糖基化通常发生在Fc段，较少情况下发生在Fab端。在相似性研究中，主要从有效性和安全性两个方面对糖基化进行评价。糖基化对有效性的影响表现在不同糖型对抗体空间结构的影响，从而影响到Fc 段介导的效应功能。不同单抗药物的作用机制不同，糖型类别的相似性评价要求也相应不同。如IgG2/IgG4亚型的单抗药物，因为CH2 结构域里对Fcγ 受体和补体C1q( complement C1q) 结合能力特异的氨基酸序列缺失，导致其ADCC 和补体依赖细胞毒作用( complementdependent cytotoxicity,CDC) 较弱，此类抗体一般用来中和抗原或阻断受体配体的结合; 因此，这类抗体的去岩藻糖化糖( Afuc) 和半乳糖苷化糖( Gal)风险级别不高，相似性评价中主要考虑其能反映抗体的结构完整性和工艺一致性属性。对于IgG1亚型抗体，ADCC 和CDC 效应是其典型的作用机制，如利妥昔单抗，Gal，Afuc 和高甘露糖( Man) 的相似性评价要重点考虑; 但也要遵守case-by-case 的原则，如曲妥珠单抗[4]和贝伐珠单抗，前者因为人表皮生长因子受体2 ( human epidermal growth factorreceptor 2,HER2) 高表达抑制补体通路，缺失CDC效应，后者因为靶向可溶性抗原，MoA 中ADCC 和CDC 效应均缺失，相应糖型的微小差异并不影响产品有效性。还有研究表明，含有高比例Man5 修饰的抗体在血清中的半衰期会降低。 糖基化对安全性的影响主要是免疫原性，表现为末端唾液酸和α-1,3连接半乳糖。唾液酸有N-羟乙酰神经氨酸( N-glycolylneuraminic acid,NGNA) 和N-乙酰神经氨酸( N-acetylneuraminic acid,NANA) 2 种形式，NANA 类型的唾液酸在正常人血清抗体中普遍存在，而人体内存在抗NGNA 抗体，Reusch等研究报道了抗NGNA 抗体引发的免疫反应。在部分由鼠源细胞表达生产的抗体中，存在NGNA和α-1,3连接半乳糖的修饰，但对于大多数由中国仓鼠卵巢细胞表达的单抗产品，NGNA 和α-1,3 连接半乳糖的含量通常低于检测方法的检测限，在这种情况下相似性研究的评级可考虑为中等级别。 2. 4 含量 含量是相似性评价的重要内容，生物类似药的制剂处方和规格原则上要和参照药一致，因此需要评价蛋白浓度的相似性，欧洲EMA 的生物类似药指导原则明确指出了“strength”要相似。对于液体或冻干制剂，蛋白浓度的测定通常采用紫外分光光度法，在头对头的比对分析中，消光系数也是非常重要的一环。 蛋白质的消光系数通常由氨基酸序列决定。在研发早期通常采用理论消光系数的数值进行浓度测定，在工艺开发进入一定的阶段后( 工艺参数锁定)，通常需要对消光系数进行实验确认。推荐采用氨基酸含量测定､凯氏定氮法､Edelhoch 法等多种方法，对蛋白质的消光系数进行测定和评估，并建立可接受标准，最终确定消光系数。对于生物类似药而言，不能仅仅根据市售产品的标识浓度反推获得，而是要采用实验方法确定。 2. 5 电荷异质性 抗体在生产､储存和运输过程中，会产生蛋白分子的翻译后修饰以及聚体和碎片，导致了具有不同等电点( isoelectric point,pI) 蛋白变异体的产生。相似性评价对电荷异质性要求较高，首先要通过色谱技术( 适用于IgG1抗体) ，或者自由流电泳技术( 适用于IgG2和IgG4抗体) 制备和富集抗体中的酸和碱性变异体，鉴定其形成原因，建立结构和功能的关系( structure-function relationship,SFR)，并评估各变异体对安全性和有效性的影响; 其次，需要建立合适的分析方法，对各酸碱组分的含量进行分析､统计计算和相似性评价。抗体的电荷变异体分析，根据不同的原理可采用离子交换色谱法( ion exchange chromatography, IEX) 和毛细管等电聚焦技术( capillary isoelectric focusing,cIEF)，前者是根据不同电荷变异体表面电荷的差异在色谱柱上实现分离，后者是根据不同变异体的等电点差异进行分离分析。电荷异质性受蛋白表达平台( 细胞株和培养工艺) 和纯化工艺影响很大，工艺开发中要平衡生产收率和相似性评价2 个因素，例如对于C 末端赖氨酸剪切程度不同引起的碱性组分，如前文描述，其不会影响临床安全性和有效性，相似性评价时样品可经过CpB 酶切后进行测试和评估。 2. 6 分子大小变异体 分子大小变异体为产品相关杂质，主要表现为高分子量物质( high molecular weight species,HMWS) 和低分子量物质( low molecular weight species,LMWS) ，具有潜在的安全性影响，是需要严格控制的质量属性。HMWS 的鉴定采用多角度激光光散射检测器(multi-angle light scattering,MALS) 和超速离心分析(analytical ultracentrifugation，AUC) ，定量分析通常采用2 种正交的分析技术，即体积排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC) 和AUC; LMWS 的评估采用毛细管电泳分析技术(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS) 。在相似性评估中，首先要确认候选药的HMWS和LMWS 的种类和含量要与参照药相似，否则要加以鉴定和评估; 其次，纯度和杂质的定量分析方法要经过验证，特别是杂质含量的定量限(limit of quantitation,LOQ) 或检测限(limit of detection,LOD) 验证; 最后，相似性评估的标准是建立在至少10 批次以上参照药分析数据的基础上计算得出。对于杂质的范围，可采用单边的限定方式，但不应该超出放行标准范围。 2. 7 颗粒分析 蛋白颗粒是抗体药物的重要质量属性之一，与产品的安全性息息相关。颗粒粒径在100 nm -1μm 被定义为亚微颗粒，1-100μm 通常为亚可见颗粒，大于100 μm为可见颗粒，小于100 nm为可溶性聚体或者蛋白分子。通常，可见颗粒和聚体在生产过程中被严格监控，并控制在极低水平下; 对于亚可见微粒，有体外实验表明其可能引起免疫原性，且有堵塞毛细血管的风险。 在质量相似性评估中，颗粒分析通常不进行考察，需要在候选药的放行和稳定性中进行监控和评估。但一些国内外的生物类似药的相似性研究中都包含了此项比对，如Amgen公司利用微流成像法(micro-flow imaging,MFI) 和光阻法(light obscuration,LO) 比对了贝伐珠单抗和阿达木单抗类似药的亚可见颗粒，采用动态光散射(dynamic light scattering,DLS) 和场流分析(field flow fractionation,FFF) 研究比对了亚微颗粒; 上海复宏汉霖公司采用DLS 和MFI 分析了曲妥珠单抗及其生物类似物的颗粒表现。 2. 8 杂质分析 根据ICH Q6B，单抗产品的杂质可以分为产品相关杂质(product-related impurities) 和工艺相关杂质(process-related impurities) 2 类。在相似性评估中，对产品相关杂质的评估主要在于其对安全性､有效性的影响。工艺相关杂质和产品相关杂质一样，能引起安全性风险，是需要严格控制的，包括如: 细胞株构建和细胞培养过程引入的残留宿主细胞蛋白､宿主细胞DNA､抗生素､糖型调节剂､保护剂等，下游工艺引入的残留Protein A 以及残留于制剂终产品中的内毒素和浸出物等，工艺相关杂质种类和残留量取决于具体工艺情况。这些杂质是不需要和参照药相似，但要采用先进灵敏的分析方法进行检测和必要控制，使其在安全的限值以内。因此，工艺相关杂质不在相似性研究范围内。 2. 9 生物学活性 生物学活性和药物的MoA 相关。生物学活性分析是相似性评价的重点，根据抗体结构分为Fab，Fc以及Fab /Fc 共同参与的功能。抗原抗体结合活性是单抗活性的基础，属于Fab 端的功能区。Fc 段的生物学功能将在免疫学特性章节介绍。Fab /Fc 共同调节的生物学功能包括ADCC，CDC 及抗体介导的细胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP) 等。 生物学活性的评估应根据药物MoA，并遵循case-by-case 的相似性评价原则。如IgG1抗体具有较强的Fcγ 受体和C1q 结合能力，因此具有较强的ADCC和CDC作用; 如利妥昔单抗的相似性评价的级别通常为高或中等; 而曲妥珠单抗ADCC 在相似性评价中被评为了高等级，但HER2高表达的细胞会抑制补体途径，CDC为阴性，所以相似性评价中被设为低等级; 阿达木单抗的MoA为与可溶性肿瘤坏死因子α( tumor necrosis factor α，TNFα) 特异性结合以阻断其与细胞表面TNFα 受体相互作用，因此相似性评价中抗体中和活性为高等级，ADCC和CDC活性为低等级。此外，对于利用抗体Fab 端特异结合，阻断内皮/表皮生长因子通路信号的机制，细胞增殖抑制活性应为高等级，如贝伐珠单抗和曲妥珠单抗; 对于Fc 段介导的效应细胞杀伤作用低的IgG2和IgG4，阻断效应功能应为高等级，如抗PD-1抗体。同时，在《生物类似药相似性评价和适应证外推技术指导原则》中提出，生物类似药的适应证外推应针对适应证类型设计合适的生物学活性比对方案。 生物学活性与分子的翻译后修饰､糖基化水平､高级结构等质量属性密切相关，对以上属性相似性有不确定性时，可以用生物学活性进一步说明和佐证。 2. 10 免疫学特性 抗体是获得性免疫系统的关键组成部分，其相对保守的Fc段具有特定的免疫学特性。治疗性抗体药物的Fc段生物学功能包含对Fc受体结合能力及C1q结合能力的评价。 FcRn在体内参与血清IgG的回收，影响血清半衰期，进而影响药效，相似性研究中，抗体的FcRn结合能力通常归为中等级。 C1q是补体经典激活途径的第一个结合蛋白，与IgG的Fc段结合后能够启动CDC效应; FcγRIIIa结合能力与高甘露糖化和去岩藻糖化修饰密切相关，从而影响抗体的ADCC 效应，C1q和FcγRIIIa 结合能力在相似性评估中通常被定义为中等级。特定情况下，比如ADCC和CDC不是MoA，但C1q和FcγRIIIa 结合能力可以评估Fc段的糖链结构以及抗体高级结构完整性，所以也将其归为中等级；FcγRIa，FcγRIIa(R)，FcγRIIa(H)，FcγRIIb/c和FcγRIIIb与糖型修饰关联不如FcγRIIIa 紧密，通常归为低等级。 值得注意的是，通常认为抗体与FcγRIIIa 的结合能力和糖型中Man% 和Afuc% 的含量有关联，但需要根据糖型的比例进行综合考量。如Amgen 公司的贝伐珠单抗生物类似药中，虽然观察到类似药和原研药中Man%和Afuc%的含量微小差异，但在FcγRIIIa结合能力的结果中显示了高度相似性。因此，Man%和Afuc%微小差异不影响产品有效性。 2. 11 稳定性研究 国内外的生物类似药指导原则中，均提到了对生物类似药和参照药进行头对头的稳定性研究，包括加速稳定性和强制降解试验，以观察生物类似药和参照药的降解趋势和途径的相似性评价。 根据《生物制品稳定性研究技术指导原则(试行)》，对于4℃保存条件下的产品，加速稳定性研究通常在25℃的条件下开展，选择的生物类似药和参照药的批次数及研究周期､检项应根据实验设计和目的进行选择。最终可以观察到生物类似药和参照药在加速条件下的稳定性趋势的相似性。强制降解研究中包含了高温､光照､强酸､强碱､振摇､氧化和冻融等条件，在经历了这些条件后，通过监测抗体一级结构､纯度和杂质､电荷异质性､生物学活性等变化趋势，最终进行相似性比对。值得注意的是，对于产品有效期，在欧洲EMA的指导原则中推荐采用生物类似药自身稳定性研究结果而定，不用和参照药进行效期比对。 3结论和展望 质量相似性是生物类似药研究和开发的前提，决定了工艺开发的方向，为非临床和临床研究方案的设计提供参考。本文是基于多年来对生物类似药的开发和国际申报经验，在总结国内外最新生物类似药法规基础上，对抗体类生物类似药的质量相似性研究进行了总结。系统介绍了质量相似性研究的逐步递进原则和整体相似性原则，从参照药、分析方法、相似性评价标准以及研究关键点方面，全面介绍了生物类似药的质量相似性研究和评价，为抗体研发企业提供参考。国内外生物类似药的市场巨大，制药企业的技术和平台逐渐成熟，监管体系也越来越完善，如何实现规范化、系统化引导，如原研药质量信息共享、相似性评价标准的统一化、靶点和产能的优化，形成数据共享和产能的宏观引导，避免资源浪费，是将来制药企业和监管机构面临的新挑战和机会。 一点感想 从文中作者引用了大量Amgen的文献可以看出，复宏汉霖的研究人员对于Amgen的仿制药与原研药的相似性评价进行了深入的分析，并应用于自己公司的仿制药相似性评价。我自己在文献调研的过程中也会发现大量的国外MNC公司发表的文章，比如各种稀奇古怪的案例等等。反观国内的药企，缺乏的是对某些小而重要的问题进行深入研究的精神，也不是很注重药物的质量研究。当然，随着越来越多的药企出海捞钱，与国外的质量研究标准接轨是必然的，相信这会促进国内药物质量研究的发展。 参考文献： 1.李思鹏,张仲理,许圣昌,张磊.单抗生物类似药与原研药质量相似性研究解析[J].中国新药杂志,2022,31(6):523-531. 文章信息源于公众号质控实验室，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。 学如逆水行舟，不进则退； 心似平原走马，易放难收。 行舟Drug 每日更新 欢迎订阅+ 医药大数据|行业动态|政策解读

导读 单克隆抗体（Monoclonal antibodys，mAbs）是一种约150千道尔顿的可溶性糖蛋白，由两条相同的重链和轻链组成，通过二硫键连接形成四聚体结构，包含两个抗原结合片段（Fab）和一个Fc结构域（图1）。近年来，治疗性mAbs及其衍生物在癌症和自身免疫疾病等领域得到广泛应用。 大多数治疗性mAbs在哺乳动物细胞（如CHO细胞）中生产，但部分抗体片段已在大肠杆菌中实现量产。尽管大肠杆菌缺乏糖基化等翻译后修饰，但生产的无糖基化抗体除了Fc片段介导的免疫效应功能，其在生物、物理特性和体内稳定性上与糖基化抗体相似。因此，对于不依赖免疫效应的抗体，无糖基化形式可成为标准。此外，经过Fc片段工程化处理后，抗体仍可激活免疫效应，并发现新的作用机制[1]。 图1全长糖基化单克隆IgG1抗体的晶体结构[2] 一、大肠杆菌中的重组抗体的生产 大肠杆菌自上世纪80年代以来成为重组蛋白生产的理想宿主，至今已有超过85种药物通过大肠杆菌生产。与其他宿主相比，大肠杆菌具备生长快速、成本低、操作简便、生产率高等优势。此外，大肠杆菌能够在细胞质、周质或培养基中表达重组蛋白，提供更大的生产灵活性（图2）。目前，已有七种获得批准的抗体片段或衍生物在大肠杆菌的不同区域中生产（表1）[2]。 表1 已获批大肠杆菌系统生产的 单克隆抗体片段以及片段融合蛋白 图2 大肠杆菌特有的抗体表达区室选择 1.1 大肠杆菌周质生产FL-IgG及抗体 1984年，研究人员发现在大肠杆菌还原性细胞质中表达全长免疫球蛋白（Full-length immunoglobulin G，FL-IgG）时，形成包涵体，随后通过溶解和复性进行处理，但仅观察到极少的抗原结合活性，随后，研究重心从还原性细胞质转向氧化性周质空间。2002年，Simmons等首次报道在周质中表达功能性FL-IgG（图3a）。通过优化周质中重链和轻链的表达与分泌平衡，并使用特定启动子和信号序列，成功在10 L发酵罐表达了几种FL-IgG。随后，Reilly和Yansura通过过表达氧化和异构化伴侣蛋白DsbA和DsbC，使IgG1在高密度发酵中实现高产量。此外，Genentech公司利用Knobs-into-Holes（KiH）技术，在大肠杆菌周质中开发了双特异性抗体表达系统（图3b），成功生产多种抗体，包括靶向IL-4和IL-13的IgG4双特异性抗体（Bispecific antibodys，BsAbs），应用于哮喘治疗。该公司还通过共培养方法生产了27种不同的BsAbs，并报告了成功生产抗CD3 BsAbs。 图3 大肠杆菌系统生产无糖基化单克隆抗体 （a）和双特异性抗体（b）示意图 1.2 大肠杆菌细胞质生产FL-IgG 尽管大肠杆菌周质空间已被广泛应用生产FL-IgG，但由于其体积较小和转运瓶颈，大肠杆菌细胞质成为FL-IgG生产的另一个选择。1984年，Genentech和Celltech分别在大肠杆菌细胞质中首次报道了FL-IgG和FL-IgM抗体的表达。但是由于细胞质环境过于还原，抗体通常积累在包涵体中，需通过复性处理恢复抗原结合活性。 1.3 大肠杆菌半氧化细胞质生产FL-IgG 细胞质中过于还原的环境阻碍了二硫键的正确配对，影响了FL-IgG的功能表达。为克服这一问题，研究人员通过改造大肠杆菌菌株，创造了一个更具氧化性的细胞质环境，成功表达了包括FL-IgG在内的二硫键蛋白。 大肠杆菌细胞质中存在两条还原途径——硫氧还原蛋白和谷胱甘肽还原蛋白途径，它们会还原二硫键，通过删除相应还原酶基因gor和trxB来去除这两条还原途径，并通过突变过氧化物酶基因ahpC，研究者开发出能够支持二硫键形成的SHuffle®菌株。该菌株可以在细胞质中成功生产多种可溶性且功能性强的FL-IgGs。2015年，Robinson等人首次报告了在SHuffle®菌株中成功生产具有正确二硫键结构的抗HER2和抗VEGF抗体。 1.4 在CFPS中生产FL-IgG和BsAbs 除传统的细胞表达系统外，FL-IgG也可以在无细胞蛋白表达系统（Cell-free protein synthesis，CFPS）中生产。2008年，首次有报道展示了在大肠杆菌无细胞系统中生产活性抗体。Sutro Biopharma进一步优化了CFPS方法，通过调整重链和轻链基因的翻译起始区，并添加伴侣蛋白DsbC和FkpA，成功实现了1 g/L的IgG产量。此外，该公司还通过CFPS成功生产了带有KiH突变的BsAbs，并将DsbC和FkpA基因整合到其CFPS提取物来源菌株的染色体中，开发了一种基于连续发酵的细胞提取物制备方法，用于生产抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugates，ADCs） 二、抗体的表征和质量控制 2.1 生化表征 生化表征是抗体质量控制的基础，通过高效液相色谱、质谱分析、SDS-PAGE电泳等方法分析抗体的分子结构、氨基酸序列、糖基化修饰和分子量等，并测定抗体的抗原结合能力、亲和力和特异性。 首个经过生化特征彻底表征的大肠杆菌生产的FL-IgG是由Genentech在大肠杆菌的周质中生产的抗TF抗体，表征表明其抗原结合活性与哺乳动物细胞生产的同类抗体在抗原结合活性上相同。2008年，首次报道了大肠杆菌CFPS系统生产的抗肌酸激酶抗体的表征，与在哺乳动物细胞系中生产的同类抗体在亲和力上几乎没有差异。 总之，许多mAbs、BsAbs和ADCs已经成功地从大肠杆菌细胞质或周质，或从体外无细胞系统（如CFPS和PURE系统）中生产、纯化并表征，表明大肠杆菌表达系统在表征上取得了重要进展[3]。 2.2 生物物理表征 生物物理表征包括评估其均一性、溶解性和聚集倾向。抗体的稳定性可通过对温度、储存条件、pH值、盐浓度等因素的评估来测试。通常大肠杆菌生产的去糖基化抗体认为具有稳定性较差的特性，但研究表明其稳定性与糖基化抗体相似。2002年Genentech公司报告，在大肠杆菌周质中生产的抗TF抗体与CHO细胞生产的抗体具有相似的四级结构和稳定性。2008年，CFPS系统生产的抗MAK33抗体与CHO细胞生产的同类抗体展现出相似的热稳定性。尽管生物物理表征研究有所局限，但已显示大肠杆菌生产的去糖基化抗体在所测试的条件下展现出与哺乳动物细胞生产的糖基化抗体相似的稳定性特征。 2.3 生物学表征 生物学表征用于评估抗体的生物活性，包括细胞培养实验、流式细胞术、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、补体依赖性细胞溶解（Complement dependent cytotoxicity，CDC）等,这些方法可以验证抗体的免疫学效应，确认其是否能够有效结合靶标，并诱导免疫反应。IgG类药物的治疗效果来源于两种机制：首先，通过Fab区域与靶抗原结合；其次，通过Fc域介导免疫反应，发起抗病原体或癌细胞的免疫反应。分析结果表明去糖基化抗体在这些机制上与糖基化抗体相似。 2.4 大肠杆菌产生的IgG的效应功能 早期的研究表明，由于大肠杆菌产物缺乏糖基化修饰，所生产的抗体分子无法与FcɣRI、FcɣRIIIa和C1q结合，因此缺乏ADCC、CDC活性。随后，经进一步研究显示，大肠杆菌生产的无糖基化曲妥珠单抗（trastuzumab）与FcɣR1结合的亲和力降低，导致ADCC、CDC功能完全丧失。尽管如此，这些无糖基化抗体仍能在其他方面保持治疗效能。 2.5 大肠杆菌产生的 IgG 的药代动力学特性 研究表明，缺乏N-糖基化的IgG能够维持较长的血清半衰期，这主要归因于其与FcRn受体的pH依赖性结合。因此，大肠杆菌生产的无糖基化IgG可能在缺乏Fc效应功能的情况下，仍能维持较长的血清半衰期。 例如，比较大肠杆菌来源的抗TF IgG1抗体与CHO细胞来源的IgG2和IgG4抗体在黑猩猩中的药代动力学，结果显示它们的半衰期相似。此外，大肠杆菌生产的无糖基化抗体与CHO细胞生产的糖基化抗体在猕猴中的药代动力学特性也相似。Genentech公司还研究了至少六种通过其KiH技术在大肠杆菌中生产的BsAbs的药代动力学特性。研究发现，在所测试的动物模型中，大肠杆菌生产的无糖基化抗体的药代动力学特性与其哺乳动物细胞生产的糖基化同类抗体相似。 三、抗体效应功能（Fc片段）工程 大肠杆菌生产的去糖基化抗体因缺少N糖链，无法有效结合FcɣRs或C1q，从而丧失ADCC和CDC等免疫效应。通过工程化改造Fc结构域，可以恢复或增强这些功能（表2）。例如，Jung等人通过展示Fc突变体文库，筛选出能够选择性结合FcɣRI并诱导HER2过表达肿瘤细胞强烈ADCC的突变体（Fc5）。其他研究也通过优化Fc结构域，提高了与不同FcɣRs和C1q的结合选择性，从而增强了ADCC效应功能[4]。 此外，设计去糖基化抗体与FcɣRIIIa结合，可以显著增强免疫效应，尤其是在与巨噬细胞结合时，能够触发强烈的抗体依赖性细胞吞噬活性。这些工程化抗体不仅在体外表现出显著生物效应，还在体内展现了良好的免疫活性和治疗潜力。总体来说，Fc工程化为恢复去糖基化抗体的免疫效应提供了有效方案，提升了其在肿瘤免疫治疗中的应用前景。 表2 大肠杆菌系统生产的抗体Fc结构域工程化 结语 在过去十年中，mAbs的生产在大肠杆菌的细胞质和周质区室及无细胞系统中取得了重要进展，显著提高了抗体的滴度和质量，降低了制造成本。这些进展使得大肠杆菌生产的无糖基化抗体在过敏、免疫学和肿瘤学等领域的临床应用具有更大潜力。虽然无糖基化抗体缺乏ADCC、CDC等Fc介导的效应功能，但通过工程设计，一些无糖基化抗体展现出增强的效应功能，甚至发现了新的效应子功能。总而言之，大肠杆菌生产的无糖基化抗体具有与哺乳动物细胞生产的糖基化抗体相当的治疗潜力。预计未来将有更多基于大肠杆菌生产的无糖基化抗体分子进入临床研究。 参考文献 [1] Siegall WB, Lyon RB, Kelman Z. An important consideration when expressing mAbs in Escherichiacoli. Protein Expr Purif. 2024 Aug; 220:106499. [2] Rashid MH. Full-length recombinant antibodies from Escherichia coli: production, characterization, effector function (Fc) engineering, and clinical evaluation. MAbs. 2022 Jan-Dec;14(1):2111748. [3] Blake-Hedges J, Groff D, Foo W, Hanson J, Castillo E, Wen M, Cheung D, Masikat MR, Lu J, Park Y, Carlos NA, Usman H, Fong K, Yu A, Zhou S, Kwong J, Tran C, Li X, Yuan D, Hallam T, Yin G. Production of antibodies and antibody fragments containing non-natural amino acids in Escherichia coli. MAbs. 2024 Jan-Dec;16(1):2316872.  [4] Lee CH, Romain G, Yan W, et al. IgG Fc domains that bind C1q but not effector Fcγ receptors delineate the importance of complement-mediated effector functions. Nat Immunol. 2017 Aug;18(8):889-898.  [5] Kaplon H, Reichert JM. Antibodies to watch in 2021. MAbs. 2021 Jan-Dec;13(1):1860476.  识别微信二维码，可添加药时空小编 请注明：姓名+研究方向！