Gemtuzumab Ozogamicin

还记得化疗药物在体内横冲直撞、敌我不分的年代吗？健康细胞和癌细胞一起遭殃，患者头发掉光、呕吐不止、免疫力崩溃。那种“杀敌一千自损八百”的治疗方式，让多少人在抗癌路上身心俱疲。 但今天，医学界悄然迎来了一场静默的革命。 一种被称为“生物导弹”的疗法正在精准打击癌细胞——它叫ADC，抗体药物偶联物。这个听起来有些复杂的名字，背后是一个极其精妙的设计：用抗体作为“导航系统”，精准识别癌细胞表面的特定靶点；用连接子作为“挂钩”，将抗体和强力毒素牢牢拴在一起；最后，用细胞毒性药物作为“弹头”，在癌细胞内部引爆，实现精准爆破。 自2000年首个ADC药物Mylotarg获批上市以来，这个领域已经走过了二十多年的发展历程。但真正的爆发，却是最近五年。2023年，全球ADC药物市场规模已突破100亿美元，预计到2030年将超过300亿美元。制药巨头们在这一赛道疯狂押注，并购案金额屡创新高。 那么，目前到底有多少ADC药物成功上市？它们的疗效究竟如何？最新的临床数据又揭示了哪些趋势？ 已上市ADC药物全景扫描：从血液肿瘤到实体瘤的跨越 截至2024年初，全球范围内已有超过15款ADC药物获得监管批准。这个名单还在以惊人的速度增长。我们不妨将这些药物分为几大阵营，看看它们各自攻克的战场。 第一阵营：血液肿瘤领域的开拓者。这包括靶向CD33的吉妥珠单抗（Mylotarg）、靶向CD22的奥英妥珠单抗（Besponsa），以及真正引爆市场的靶向CD30的维布妥昔单抗（Adcetris）。Adcetris在复发/难治性霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤中展现的疗效，让医学界第一次真切看到了ADC的威力——它甚至改变了某些淋巴瘤亚型的治疗指南。 但ADC的故事远不止于血液肿瘤。 第二阵营：实体瘤领域的突破者。这无疑是当前最炙手可热的领域。其中，靶向HER2的恩美曲妥珠单抗（Kadcyla，T-DM1） 和德曲妥珠单抗（Enhertu，T-DXd，DS-8201） 构成了最耀眼的双子星。T-DM1早在2013年就获批用于HER2阳性乳腺癌的二线治疗，将ADC的概念带入了实体瘤的广阔天地。而Enhertu的出现，则堪称“降维打击”。 Enhertu在HER2低表达乳腺癌中的突破 2022年，Enhertu的一项临床研究结果登顶《新英格兰医学杂志》，震撼了整个肿瘤学界：在传统上不被认为是HER2靶向治疗受益人群的“HER2低表达”乳腺癌患者中，Enhertu相比化疗，将疾病进展风险降低了惊人的50%。这直接重新定义了乳腺癌的分子分型，让成千上万原本没有靶向药可用的患者看到了曙光。 随后，它在胃癌、肺癌中的优异数据接踵而至，展示了“泛癌种”治疗的潜力。 第三阵营：新兴靶点的探索者。靶向TROP-2的戈沙妥珠单抗（Trodelvy）在难治性三阴性乳腺癌和尿路上皮癌中取得了成功。靶向Nectin-4的维恩妥尤单抗（Padcev）成为晚期尿路上皮癌的重要选择。还有靶向BCMA的贝兰妥尤单抗（Blenrep）用于多发性骨髓瘤，尽管因验证性临床试验未达终点而暂时撤市，但其作用机制仍被广泛研究。 这个名单之外，还有更多ADC药物正在排队等待上市审批。 靶向HER3、c-MET、CEACAM5、FRα等靶点的ADC，都已进入临床后期阶段。ADC的战场，正从少数几个成熟靶点，快速蔓延至整个“癌细胞表面抗原图谱”。 深度疗效拆解：数据背后的希望与挑战 光知道有哪些药物还不够，关键要看它们为患者带来了什么。我们选取几个最具代表性的ADC，深入看看它们交出的成绩单。 德曲妥珠单抗（Enhertu）：重新定义标准的“游戏规则改变者” 如果要用一个词形容Enhertu，那只能是“颠覆”。在HER2阳性乳腺癌后线治疗中，其客观缓解率（ORR）超过60%，中位无进展生存期（PFS）接近20个月，数据碾压传统疗法。但更颠覆的是它对“HER2低表达”群体的疗效。DESTINY-Breast04研究显示，Enhertu组的中位PFS为9.9个月，而化疗组仅为5.1个月；总生存期（OS）的差距更大（23.4个月 vs 16.8个月）。这意味着，Enhertu不仅仅是在延长疾病控制时间，它是在实实在在地延长患者的生命。 在非小细胞肺癌领域，Enhertu同样表现惊人。DESTINY-Lung02研究显示，对于HER2突变型肺癌患者，其确认的ORR达到58%，疾病控制率超过90%。要知道，这类患者过去几乎没有有效的靶向治疗选择。 戈沙妥珠单抗（Trodelvy）：攻克“最凶险”乳腺癌的利器 三阴性乳腺癌素以侵袭性强、治疗手段有限、预后差著称。Trodelvy的ASCENT研究，为这类患者带来了实质性突破。研究显示，对于既往接受过至少两种治疗的转移性三阴性乳腺癌患者，Trodelvy相比医生选择的化疗，将中位PFS从1.7个月提升至4.8个月，死亡风险降低了52%。尽管数字上看起来不如Enhertu亮眼，但在三阴性乳腺癌这个“硬骨头”面前，任何一点进步都弥足珍贵。 维布妥昔单抗（Adcetris）：联合疗法的典范 Adcetris的成功，不仅在于其单药疗效，更在于它开启了ADC与化疗、免疫疗法联合的新模式。在晚期经典霍奇金淋巴瘤的一线治疗中，“Adcetris+AVD化疗”的方案，相比传统的ABVD方案，显著改善了患者的长期无进展生存，且降低了肺毒性风险。这提示我们，ADC的未来可能不在于单打独斗，而在于融入现有的治疗体系，发挥“1+1>2”的协同效应。 然而，光环之下，阴影并存。ADC药物并非完美无缺。 耐药性已经开始出现。肿瘤细胞可以通过下调靶抗原表达、改变内吞途径、增强药物外排泵功能等方式，逃避ADC的攻击。毒性问题同样不容忽视。除了传统的化疗毒性（如骨髓抑制），ADC还有一些独特的不良反应。例如，Enhertu相关的间质性肺病（ILD）虽然总体发生率不高，但一旦发生可能危及生命，需要医生高度警惕和密切监测。Trodelvy则可能导致严重的腹泻和中性粒细胞减少。 这些挑战，正是下一代ADC研发需要攻克的核心堡垒。 未来趋势与展望：下一代ADC将走向何方？ 眼前的成功只是起点，ADC技术的进化速度远超想象。下一代ADC的研发，正围绕以下几个核心方向展开： 第一，开发全新靶点，扩大受益人群。 目前的上市药物集中在HER2、TROP-2、Nectin-4等少数靶点。未来，针对在肿瘤中特异性高表达、而在正常组织中表达极低的新靶点（如B7-H3、CDH6、PTK7等）的ADC，将把更多癌种和患者纳入靶向治疗的范围。 第二，优化技术平台，提升治疗指数。 治疗指数（疗效与毒性的比值）是ADC的灵魂。科学家们正在从各个维度优化它： 新型抗体：使用更稳定、免疫原性更低的全人源抗体；开发双特异性抗体，同时结合两个靶点，提高肿瘤特异性。 可裂解连接子：设计在肿瘤微环境（如酸性pH、高浓度蛋白酶）中特异性断裂的连接子，实现更精准的“肿瘤内爆破”。 新型载荷：除了传统的微管蛋白抑制剂（如DM1、MMAE），越来越多的高活性DNA损伤剂（如拓扑异构酶I抑制剂DXd）、免疫刺激剂甚至放射性核素被用作“弹头”，杀伤机制更加多元。 定点偶联技术：通过基因工程使抗体在特定位置（如特定氨基酸）携带偶联位点，实现均一的“药物-抗体比”（DAR），避免传统随机偶联导致的产物不均一和药代动力学问题。 第三，探索联合策略，克服耐药瓶颈。 ADC与免疫检查点抑制剂（如PD-1抗体）的联合，是当前最热门的临床研究方向之一。ADC在杀死肿瘤细胞的同时，可以释放肿瘤抗原，改变免疫微环境，理论上与免疫疗法能产生强大的协同作用。早期临床数据也显示出了鼓舞人心的前景。 ADC与靶向药、化疗、放疗甚至其他ADC的联合，都在积极探索中。未来的肿瘤治疗，很可能是多种机制ADC的“组合拳”时代。 第四，拓展应用场景，迈向更早线治疗。 目前多数ADC获批用于晚期后线治疗。随着疗效和安全性数据的积累，它们正在向一线治疗、新辅助治疗（术前治疗）、辅助治疗（术后治疗）甚至早期患者的治愈性治疗迈进。这将是ADC价值最大化的关键一步。 回望ADC药物的发展之路，从最初的坎坷波折（首个药物Mylotarg曾因毒性撤市），到如今的百花齐放，它诠释了生物医药创新是如何一步步将科幻构想变为救命现实的。它不再是一个遥远的概念，而是肿瘤科医生手中实实在在的武器，是无数患者床头新的希望。 我们仍需清醒：ADC不是万能神药，它无法治愈所有癌症。高昂的费用、可及性问题、仍需管理的毒性，都是横亘在理想与现实之间的沟壑。 但毋庸置疑的是，ADC已经打开了肿瘤精准治疗的一扇新大门。门后的世界，正在被越来越多的光芒照亮。这场关于“生物导弹”的故事，高潮，或许才刚刚开始。

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ADC的吸收、分布、代谢和消除（ADME）特性具有与单克隆抗体相似的特性，同样具有较低的清除速率、较长的半衰期、低分布容积、以及蛋白水解介导的分解代谢作用。此外，其作用机制涉及内化小分子毒素的释放过程、大分子抗体和小分子毒素的分解代谢过程，因此受试者体内会续存多种ADC药物的组分形式，每种分析物都可能提供关于ADC药物在体内的独特信息，以单一组分或组合组分的分析均有助于深入阐明ADC的PK特性。 产生ADC药物的复杂分析物可归纳为两个过程，ADC解偶联过程包括通过酶促或化学过程从ADC上释放出小分子毒素或其产物，同时保留大分子抗体部分；ADC分解过程包括抗体的蛋白水解和小分子毒素的分解代谢，这些过程可能在体内同时发生。由于ADC药物自身具有组分多样性和异质性，对其生物分析方法的建立具有极大的挑战性。ADC药物的不同组分对分析方法要求不同，很难应用单一生物分析方法来应对ADC不同组分的分析，因此ADC的生物分析要整合多个检测方式。 药代动力学分析物 ADC Pharmacokinetics analytes 总抗体分析物 针对ADC抗体部分的生物分析主要聚焦在总抗体（偶联和非偶联形式）和ADC（偶联形式）的血药浓度定量测定。总抗体的药代动力学分析主要描述ADC抗体部分的总含量评估，并提供信息理解抗体浓度随时间变化的过程。总抗体的检测主要基于酶联免疫分析方法，其常用的设计为靶点抗原作为捕获试剂，在ADC结合捕获试剂后，再通过孵育抗人IgG抗体作为侦测试剂进行检测（图2）。但该方法可能受到生物基质中的靶点干扰，因为游离形式的靶点蛋白胞外域部分能够与抗体结合、可能导致检测结果偏低。在方法开发阶段，如果检测结果可以控制在理论值的±20%以内，表示所开发的方法可以用于PK样品的检测。在靶点蛋白造成严重干扰的情况下，应考虑其它设计，例如使用非阻断型抗独特性抗体替代靶点蛋白作为捕获试剂。对于临床前的生物分析，也可以采用通用型的抗体试剂，例如对人源抗体重链或轻链特异性的抗体试剂。 图2 总抗体分析format 总抗体分析的常用format为ADC的靶点抗原作为捕获试剂，再利用标记的抗ADC独特型表位抗体/抗人IgG抗体作为侦测试剂进行检测。 ADC抗体分析物（结合型抗体） ADC的分析方法建立在能够检出至少偶联一个小分子毒素的ADC的混合物（DAR≥1），目标分析物需要同时存在完整抗体和偶联在抗体上的小分子毒素组分，偶联形式的分析物浓度通常作为活性/有效ADC浓度的估量值，是大部分ADC的PK分析的核心。测量偶联药物的方法有多种，经典的方法包括酶联免疫法，它通过特异性试剂对（一个是结合抗体部分的试剂，另一个是结合小分子毒素的抗体）来检测ADC抗体与偶联小分子毒素这一整体（图3）。ADC在体内主要通过两种机制降低浓度，其一是由血液循环系统或组织中细胞的蛋白水解作用分解完整抗体（即使小分子组分仍结合在抗体片段上），其二是小分子毒素从抗体组分上完全脱离（即DAR=0）。这些机制均会导致非偶联抗体不被ADC分析方法所检测，ADC浓度的检测值理论上应低于总抗体浓度的检测值。 抗小分子毒素表位抗体的筛选和制备比较困难，需要在方法开发时提前准备相关试剂，一般对于完全新制备的抗小分子毒素表位抗体至少预留6个月的时间以保证所筛选试剂的特异性和亲和力。方法开发同样应尽早规划和开展，一般须在临床试验开展后的首位受试者入组前将方法验证完成，以便及时进行受试者临床样本的检测。对于总抗体和ADC的分析，均可采用经典的双抗夹心法。分析方法的验证应参考相关法规要求、指南和专家共识，建议考察的验证分析项可以包括定量范围、准确度和精密度、选择性、药物耐受度、钩状效应与稀释线性、稳健性等。 图3 ADC抗体分析format ADC抗体分析的常用format为抗ADC小分子毒素部位的抗体作为捕获试剂，再利用标记的靶点抗原/抗ADC独特型表位抗体/抗人IgG抗体作为侦测试剂进行检测。 在实际的临床样本检测时可能会出现ADC检出浓度比总抗体检出浓度高的现象，如果ADC的检出浓度持续地高于总抗检出浓度，应重新审视方法设计。在总抗和ADC的检测方法均经过全验证的情况下，可能的原因有：  1）两种方法本身的检测原理和assay format可能有所不同，其方法的平行性比较可能并非等价且线性正相关；  2）ADC药物的抗体组分在血液循环系统中可能被蛋白酶水解或代谢所截短，如果片段抗体的ADC仍带有小分子毒素（即片段ADC分子的DAR≥1），则可被ADC分析方法的format检出片段ADC的信号值，但在总抗体的分析方法中无法检出，这将导致ADC检测浓度可能高于总抗体浓度；  3）由于ADC在体内的代谢分解，真实样本的分析物由多种组分构成，标准品可能难以准确拟合真实生物基质样本中的分析物。此外，关键试剂对ADC混合物检测性能的差异，以及抗偶联小分子的抗体试剂对载荷量的变化敏感度和效力不同，无法准确表征不同载荷（DAR）的ADC，均可能导致分析检测值偏离样本真实值，检测浓度无法准确反映总抗体和ADC两者的关系。研究报道毒素部分的代谢可能引起针对毒素的抗体亲和力发生改变造成ADC检测值偏高。例如喜树碱类毒素（SN38, DXd）发生代谢时内酯环打开，会增加部分抗体试剂的亲和力，从而导致ADC测量值高于总抗。解决方案包括换用对内酯环开闭状态不敏感的抗体试剂，或者对检测样品进行酸化，抑制内酯环的代谢。 游离小分子分析物 从ADC药物中释放出游离的小分子毒素是临床治疗评估安全性与效率的一个严峻问题，这将导致疗效的降低以及系统性毒性风险的增加。因此，检测游离小分子毒素的含量是ADC生物分析一项重要的评估。多数情况下游离小分子毒素的浓度用于推断血液系统中由ADC解离释放的小分子暴露量。ADC药物的偶联连接子通常分为可裂解形式和不可裂解形式两种，它们在体内的作用机理和生物学行为不完全相同。可裂解形式的连接子对癌细胞胞内环境敏感，可通过特定的蛋白酶、pH和谷胱甘肽等的相互作用将ADC的小分子毒素选择性的解离释放，目标分析物主要涉及单独游离的小分子毒素；而不可裂解形式的连接子主要由细胞内化ADC后抗体部分被蛋白水解作用释放出的小分子产物，因此目标分析物主要涉及氨基酸-连接子-小分子毒素为整体的复合分子。针对不同的目标分析物，研究者需要根据ADC药物的自身特性设计不同的生物分析方法。游离小分子毒素的测定可以采用竞争性酶联免疫法以及LC-MS/MS法。竞争性ELISA法用抗小分子毒素抗体包被微孔板，将样品去除蛋白后，与经过标记的小分子毒素混合，最后孵育板中检测信号。其难点在于需要获得抗小分子毒素抗体试剂。 与酶联免疫法相比，LC-MS/MS法的检测无需抗体类关键试剂，且在检测目标小分子毒素的同时，还可以监测氨基酸-连接子-小分子毒素复合物、断裂连接子-小分子复合物、以及小分子多级代谢产物等的产生并对其进行定量。LC-MS/MS法需要对样品进行预处理过程，采用蛋白沉淀和/或固相萃取（SPE）法，随后进行LC-MS/MS上机分析。有时根据分析物的结构性质添加适当的样品预处理步骤，将有助于更为准确的定量分析。优先建议研究者使用LC-MS/MS法测定ADC药物中游离的小分子毒素，方法验证可参考小分子化合物的LC-MS/MS方法指导原则。尽管，当前的临床研究结果很难给出十分明确的游离小分子毒素浓度所代表的临床意义，游离小分子毒素的浓度可能很低，也缺乏完整的临床数据和疗效数据支持。不过，阐明相关产品的小分子毒素对于药理学以及细胞毒性相关的潜在药物相互作用（DDI）至关重要。 偶联小分子分析物（结合型药物） 有时候需要进一步考虑和分析偶联在抗体上的小分子含量。这个分析能够直接提供ADC药物载量的信息，并对药物载药量的变化进行监测。测量偶联ADC的小分子分析物，传统的检测方法是使用混合LBA-LC-MS/MS法，它可以同时测量总抗体、ADC以及偶联小分子毒素的浓度。首先通过捕获试剂（抗ADC抗体、抗原等试剂）捕获ADC药物，利用酶解离小分子毒素（该方法适用于连接子可通过酶切或化学切除的ADC药物），通过LC分离并进行MS检测，提供一种偶联抗体中小分子毒素总量的测定方法（图4）。基于LC-MS/MS方法的总抗体和ADC抗体检测对捕获试剂的选择性和特异性等性能要求通常低于酶联免疫的方法。当研究者难以获取酶联免疫法所需的所有关键试剂时，采用LBA-LC-MS/MS同时分析总抗和ADC也可以考虑作为一种可行的替代检测手段。 图4 LBA-LC-MS/MS分析流程 这种测定方法也可以描述ADC混合物的含量，并且偶联小分子毒素的浓度变化可以反映ADC药物从血液循环系统中的消除以及从抗体骨架上的损失情况。但是，与ADC偶联抗体形式的检测方法相比，偶联小分子毒素的测定结果可能产生低浓度的ADC含有高DAR值与高浓度的ADC含有低DAR值检测水平相当的这一局限性（例如， DAR = 8、10 nM浓度与DAR = 1、80 nM浓度的偶联小分子毒素检测水平是相当的）。尽管偶联小分子毒素的药物浓度相当，但两者的疗效和安全性可能具有不同的临床治疗意义。 药代动力学分析挑战 ADC Pharmacokinetics challenges 标准品 ADC药物标准品的设计和制备是其难点之一，直接的ADC药物作为标准品有时不能完全代表各给药阶段采集的PK样本，这是因为ADC药物在体内给药后的生化过程将带来复杂的ADC动态异质性，主要包括完整的ADC药物、不含小分子的完整抗体、已被降解的抗体片段/多肽片段、游离的小分子毒素、以及毒素相关的代谢产物等。在生物基质样本中（如血清、血浆样本），ADC待分析物是各种复杂组分的混合物，而不同给药阶段和采集时间的ADC组分也具有一定程度上的差异。这将导致在定量检测ADC药物时，不同组分间的特性所带来的干扰，单一ADC标准品有时不能准确表征真实样本中的血药浓度。即使ADC药物具有相似的PK特性，由于血液循环系统中ADC的DAR分布异质性也可能导致不同的药理活性，并且难以建立相关的浓度和疗效关系。 关键试剂 各类ADC产品的DAR具有差异，且同一个ADC药物的抗体分子偶联的数量也处于一个范围内而非定值，通常以平均值表示DAR。这是由于ADC药物在生产制备过程中涉及抗体与小分子毒素的偶联，这一过程主要在特定氨基酸残基（半胱氨酸、赖氨酸等）位点上进行化学修饰，但化学修饰并非完全受控的化学反应，可能导致抗体结合的小分子毒素数量不同，在连接的位点上也不尽相同。由ADC药物所开发的捕获试剂或侦测试剂可能由于DAR值的不同导致其亲和力/结合能力对不同DAR的ADC分子具有差异，但实际很难准确评估不同DAR值的ADC抗体分子与关键试剂的影响程度，这种非线性的差异将影响到检测方法的准确度。此外，ADC药物进入人体内后可能持续发生着生物修饰和生物转化，若关键试剂所针对的检测位点发生这类非预期的生物转化，检测试剂与经转化的目标分析物结合能力产生差异，将一定程度上干扰酶联免疫法的生物分析准确度。 其它分析技术与平台 一些新的生物分析方法也逐渐应用到ADC的检测之中。例如高分辨率质谱（HRMS），以及尺寸排斥色谱（SEC）和疏水作用色谱（HIC）等。完整的HRMS方法可以作为生物分析方法的补充手段，HRMS可以检测ADC的整体和其组分，定量的灵敏度更高，可表征ADC药物随时间的结构变化情况。应用完整的HRMS进行ADC定量可以评估多种分析物，更全面的表征ADC药代动力学特征以及代谢特征。SECHIC也可用于ADC的鉴定和分析，自上而下的方法从完整形式开始分析ADC相关分析物，是获取ADC样品相关信息的有力技术。HIC与紫外（UV）检测器联用是分析ADC链间半胱氨酸偶联DAR值的金标准。对于半胱氨酸连接的ADC，由于抗体上存在4个二硫键，偶联过程通常会形成每个抗体平均含有0、2、4、6或8个DAR的药物。DAR=0的ADC为未偶联抗体，而DAR为奇数（DAR=1、3、5等）的分析物将被视为一种降解产物。对于ADC样品不同DAR值的异构体可能具有不同的毒理学和药代动力学特性。在HIC中通过ADC不同DAR值组分的疏水性不同来分离。而SEC的聚体分析也是ADC一个重要的分析方向，ADC样品中尺寸异质性的表征可以通过SEC和非变性MS得以表征，包括检测其聚体、片段杂质等，此外通常采用小孔径SEC进行小分子脱落检测，用离子交换色谱（IEX）分析电荷异质性研究；反向色谱检测小分子毒素，甚至其分子异构和手性异构的分析。这些分析方法可以作为补充手段来支持临床试验的生物分析，以获得更为全面信息、以完备地理解ADC药物在人体内的特性。 ADC药代动力学数据解读 整合来自多个检测维度的数据信息对于理解和解读ADC药物的药效和行为是至关重要的。 小分子毒素偶联对抗体的药代动力学行为（暴露和清除）的影响 将ADC的总抗体药代动力学特征与未偶联抗体（以未偶联抗体进行给药）的药代动力学特征进行比较，可以观察ADC的偶联对抗体清除产生的影响，通常DAR值更高的ADC比DAR值低的清除速率更快。这可能由于偶联产生新的ADC表位和新的代谢途径，这可能导致ADC非预期的进入到正常组织和细胞，从而产生细胞毒性。 ADC的小分子毒素损失 ADC中的小分子毒素的丢失可能导致药物疗效的降低以及系统性毒性的发生。在比较总抗体PK和ADC的PK特征时，通常观察到ADC浓度比总抗体浓度下降的更快，两者的偏离程度一般反映了ADC的小分子毒素丢失速率。通常ADC的降低速率会更快，这是因为ADC的损失可以通过两种途径，即抗体和小分子毒素分别由蛋白水解机制和分解代谢机制而减少、以及小分子毒素从抗体上的解偶联；但总抗体的代谢机制比较单一，主要通过抗体的蛋白水解机制而减少。 用于评估ADC临床药代动力学的生物分析方法需要经过验证，有足够灵敏度和稳健性，以满足相关药监机构的要求。尽管有多种检测平台已在临床ADC的药代动力学分析上进行应用，但在设计和实施ADC的生物分析策略时，应仔细考虑项目实际生命周期的每个阶段以及整体的生物分析关注点，综合临床试验方案的大背景下以选择最佳的生物分析策略方案。 ADC免疫原性分析 ADC immunogenicity analysis 与其它生物大分子药物相似，ADC药物同样可能引起受试者的免疫原性反应，这对药代动力学、药效学和安全性具有潜在的影响。产品相关和受试者相关的因素均可能影响免疫原性的发生和发展，而分子异质性更高、抗体工程化更高的ADC药物相比传统单克隆抗体药物的免疫原性风险也可能更高。因此需要全面的风险评估、分析方法和检测策略来监测和表征ADC药物的免疫原性，以了解ADC药物潜在的安全性和临床疗效。虽然目前的ADC药物开发已经多采用人源化或全人源的单克隆抗体形式，但ADC药物仍存在抗体本身抗原表位的影响，也可能由抗体与连接子、小分子毒素偶联产生复合体新表位、以及由代谢和分解作用产生的次级代谢产物（如短肽-连接子-小分子毒素复合物等形式）和抗体片段，这些因素都可能引起机体产生ADA。除此之外，其他因素如分子序列特征、制造生产过程（表达系统、纯化系统）、制剂以及剂型（辅剂、剂型状态）、在给药时ADC药物已形成多聚体、以及受试者的遗传史和疾病史，都可能是引发免疫原性的因素。 ADC药物的ADA分析比单克隆抗体的ADA分析方法可能更加复杂，虽然ADC药物的主体成分是大分子抗体，但连接子和/或小分子毒素都可能充当其抗原表位，导致抗ADC药物的ADA机制也更加多样化。根据每个ADC药物的风险评估，通常由分层测定方法组成，这些方法对临床样品中ADC药物的存在需要开发具有适合的灵敏度和耐受性（包括筛选、确证、表征和中和测定）。初始的筛选检测用于评估血浆/血清样品中与ADC药物结合的所有ADA抗体。随后进行确证试验，以评估真正与ADC药物相互结合的阳性样品。用于区分阳性和阴性样品的测定阈值称为“临界值”。在对治疗前受试者/健康供者的样本进行统计分析后，计算获得临界值。筛选后，ADA将进行滴度或中和活性的进一步表征。滴度测定通常使用类似于筛选测定的方法进行，但样品是以系列稀释的方式进行检测。根据所使用的方法，滴度测定方法的临界值可以与ADA筛选测定相同或不同。中和测定用于分析中和抗体（NAb），通常有两种形式的中和测定方法来评估NAb水平：基于细胞反应的方法（CBA）和基于配体结合的方法（LBA）。开发CBA时，通常采用高药物耐受性、以及可以优化药物响应性的细胞系，确定适当的终点读值、选择对照NAb以及优化测定参数。LBA法是一种竞争性免疫测定法，其实验操作和流程更为简单，通常具有更高的灵敏度和精确性等性能指标。评估ADC药物的免疫原性应采用多层分析策略（图5）。 图5 ADC药物免疫原性分析多层评估策略 关键试剂 与其它LBA一样，关键试剂的生物物理性质和三级构象对其使用性能具有影响。在制备关键试剂时，应注意ADC药物自身已经经历了抗体和小分子毒素的偶联化学反应，其生物物理特性与未偶联的单克隆抗体具有一定差异，如果偶联和化学标记都依赖同样的氨基酸残基的特定基团，标记ADC关键试剂时可能造成更多的净电荷变化；同样如果标记的是疏水性生物素分子则可能严重影响ADC试剂的溶解度。标记反应的结果可能导致所制备的ADC关键试剂难以检测ADA。应在早期评估关键试剂的生物物理参数以确定其可用性，并配合优化标记方式和种类、特定的缓冲溶液等，以构建最佳的检测分析方法。 耐药性 为了提高ADA检测方法的耐药性，在开发方法时通常使用酸化进行预处理。但要注意ADC药物中小分子毒素对pH值变化的反应性，包括连接子的断裂和小分子的分解作用，如对酸敏感型连接子。如果需要使用酸化进行预处理，则必须在与标记的ADC关键试剂孵育前完成样品的中和，以确保关键试剂的完整性。 结构域特异性表征 由于ADC药物结构的复杂性，受试者产生的ADA可能针对ADC药物的不同结构域，对抗体、连接子和小分子毒素等结构域的反应性应该作为ADA监测分析的一部分。两种方法常用于评估结构域特异性表征，即竞争法和直接法。在竞争法中，样品在类似于确证实验中与单独的ADC结构域组分（抗体、小分子毒素、或其片段的复合物）进行孵育，若有信号的显著降低表明ADA具有相应结构域的结合特异性。另一种则是直接法，将ADC结构域组分直接用于捕获/侦测试剂，以评估ADA中针对该结构域的成分。对ADA进行结构域特异性表征分析需要专门的阳性对照试剂，它们可能是含有针对ADC药物所有结构域组分的抗体，即抗ADC药物的多克隆抗体，也可能是针对某一结构域或结合表位的单克隆抗体。 ADC生物标志物分析 ADC Biomarker analysis 肿瘤组织抗原的表达 基于ADC药物的作用机理，其药物的靶向性主要依赖于抗体对目标抗原的特异性识别，靶点抗原可能是过表达状态（如HER2），也可能是目标细胞特异性表达（如CLDN18.2）。由此首要考虑的入排标准应该是生物标志物即肿瘤组织中抗原的表达情况，例如乳腺癌与胃癌的受试者在接受抗HER2的ADC药物治疗时，将先进行HER2蛋白表达水平或基因拷贝数水平的检测，当检测结果为阳性的患者将纳入临床试验，。诸如过表达抗原、免疫检查点、肿瘤组织相关的免疫细胞群等均可能成为评估的生物标志物。IHC与FISH的方法开发和临床应用已相较成熟，使用已有的检测试剂盒即可快速批量的完成肿瘤组织的抗原表达分析。由此，该类方法也能够同步开发为伴随诊断（CDx）产品，并在ADC药物治疗前进行评估以判断患者从该疗法中受益的可能。 游离抗原水平 对于ADC药物的靶点抗原，尤其是膜蛋白的胞外域部分，肿瘤细胞和正常组织细胞会将靶点抗原通过蛋白酶水解作用解离并释放至血液中，以游离的形式稳态存在。ADC药物仍可以与游离抗原特异性结合，形成ADC-游离抗原复合物留存在血液循环系统中，无法与组织内的目标细胞相结合。这会影响ADC药物的分布和清除，ADC-游离抗原复合物将由肝脏代谢的途径进行清除，这可能导致数量可观的ADC药物定向运输至该器官，以发生ADC相关的肝毒性，也可能导致ADC疗效的下降、甚至发生脱靶毒性和安全性风险。 小结 Summary ADC的生物分析既复杂又具有极高的挑战性，需要在单克隆抗体以及小分子生物分析的基础上进行整合研究，成熟稳健的生物分析策略对于ADC药物的临床试验成功至关重要。无论是LBA、CBA，还是LC-MS/MS、HRMS，以及适用于生物标志物分析的其它技术平台，都随着临床试验阶段的进行有着不同的侧重点，这些分析平台能够更好帮助研究者分析ADC药物的药代动力学、药效学、免疫原性和生物标志物。 关于康维讯生物 About Kanwhish 二、ADC生物分析面临的挑战和检测手段 （原创 BioPlus编辑部 BiG生物创新社） 随着蛋白质工程的进展，极大推动了ADC药物的开发，同时也带来生物分析挑战，ADC的组分复杂，体内分解代谢和生物转化难以摸透，因此急需成熟可靠的ADC生物分析方法为临床前/临床研究提供数据信息。本文探讨抗体-药物偶联物（ADC）的生物分析策略，并综述用于定量和表征ADC的生物分析方法的最新进展。   01    ADC的EPR效应和体内作用过程 众所周知，肿瘤具有EPR效应（enhanced permeability and retention effect），即实体瘤的高通透性和滞留效应。正常组织中血管壁结构完整紧密，有淋巴回流。而肿瘤组织诱导下产生的血管间隙比较大，并且血管丰富，基本上没有淋巴回流，结构上的完整性比较差，血流通过这里的时候大分子可以扩散出来，进入肿瘤组织间隙。 因此ADC静脉给药进入血液循环，通过ERP效应进入肿瘤组织，然后通过内化作用，特异性的胞吞、胞饮，进入细胞内部，通过溶酶体的转运，进入溶酶体内，在溶酶体酶的作用下裂解释放毒素，通过DNA损伤或抑制微管蛋白合成等使细胞死亡。细胞死亡以后，毒素还能够直接通过邻近的细胞膜，直接进入到邻近细胞内，起到旁观者效应（bystand effects）的作用，直接杀伤邻近细胞。 图2 ADC的体内过程及其肿瘤免疫机制示意图   02    ADC生物分析面临诸多挑战 2.1 ADC成分复杂，行为各异，无法通过单一方法分析 ADC有大分子部分，也有小分子部分，不同组分对分析方法要求不同，很难用一个生物分析方法描述ADC在体内的过程，状态，行踪。 ADC中的偶联接头通常分为可裂解和不可裂解，它们在生物系统中的行为完全不同，并在体内释放毒素形式也不同。具体而言，可裂解接头（例如，缬氨酸-瓜氨酸二肽、肼和二硫键）特异性的对癌细胞细胞内特性敏感，例如某些蛋白酶、pH和谷胱甘肽的表达，以此实现毒素选择性释放。相比之下，不可裂解的接头不含特异性释放机制，依赖于ADC内化后的细胞内蛋白水解。从分析的角度来看，虽然具有可裂解接头的ADC在生物系统中释放游离毒素，但具有不可裂解接头的ADC通常会释放ADC完全降解后的产物——活性毒素-接头-氨基酸部分。因此，应针对不同的分析物，要施行不同的生物分析方法。 2.2 ADC体内持续生物转化，干扰精确度 由于内环境、偶联位点、接头的不稳定性和复杂性，ADC体内生物转化（如毒素脱落、蛋白质质量增加/损失和有效载荷代谢）经常发生。这种生物转化可能会降低疗效并增加脱靶毒性。尽管一些新的工程技术（例如胱氨酸工程、非天然氨基酸工程、酶介导的偶联、肽标签工程、新型异双功能试剂）用位点特异性方式生产出更均匀和稳定的ADC，但体内生物转化仍可能持续存在。若ADC上的检测位点发生生物转化，会干扰生物分析方法的准确性。 2.3 体内代谢动态变化，测定复杂且间接 在临床的时候不可能测肿瘤组织中药物的浓度，只能测定血循环中ADC的浓度。如何通过有限的数据去反应最终的药效，绝对是临床PK模型的挑战。药物抗体比（DAR）是描述与抗体偶联的有效载荷数量的重要参数，但DAR物种可以在体内动态变化，这给生物分析带来了额外的挑战，增加了ADME（吸收、分布、代谢和排泄）研究的复杂性。 2.4 游离药物测定要求高灵敏度 ADC进入体内到最终于靶部位发挥作用经过了很多步骤。在每一步都只有50%左右的药物能够进行继续的情况下，能到达靶部位的药物量非常少。到最后就只有不到2%的药物发挥作用，因此毒素的毒性要求是相当高的。在毒素毒性如此高的情况下，ADC的治疗窗口非常窄，且必须要求ADC的毒素不能在循环系统中脱落，因此对游离药物测定方法的灵敏度要求是非常高的。   03    ADC生物分析方法有哪些？ 2013年一份美国药物科学家协会的文件建议，在ADC药物开发早期阶段应测量以下成分以进行评估：总抗体，ADC和游离毒素（表1）。除了这三个基本的评估成分外，根据ADC分子的结构和毒素的特性，还可以额外地测定结合型毒素、体内DAR值、免疫原性等，以便更好地了解ADC的药代动力学和ADME。LC-MS/MS通常用于小分子游离毒素分析；配体结合测定（LBA）或LC-MS方法用于定量总抗体和ADC。 表1 :FDA 批准的ADC监管备案的生物分析方法 3.1 药物早期开发阶段的定量和药代动力学评估 在药物开发筛选的时候，通常需要快速、高通量和高效的药代动力学表征，指导我们避免和改进药物一些不好的特质。 对于动物研究中的人源化单克隆抗体（mAb）或ADC，可以使用LBA或LC-MS测定形式实现通用定量方法；总抗体的通用LBA方法通常用于初始药代动力学评估，一般抗人免疫球蛋白抗体或配体作为捕获和/或检测试剂，应用LBA方法定量ADC需要使用针对特定毒素的选择性试剂。抗毒素抗体的生成非常耗时，并且在同时评估多个不同接头变体的毒素优化期间可能很困难。 对于具有可裂解接头的ADC，混合LBA–LC-MS/MS方法仅使用一种捕获试剂即可测量总抗体和ADC浓度。它利用酶释放肽或毒素，这些肽或毒素可以通过LC分离，并通过MS使用多反应监测模式进行检测。与LBA不同，基于质谱的方法对捕获试剂选择性/特异性的要求通常不那么严格，但质谱方法依赖于替代检测肽。通常选择人免疫球蛋白框架特有的几种片段可结晶（Fc）区常见肽作为动物研究的检测肽。 发现和早期开发工作的生物分析方法的鉴定可以遵循实用性，通常在样品分析之前对任何定量方法的准确性、精密度和选择性进行最低限度的评估。 3.2 毒理学或临床研究阶段的检测手段 对于在毒理学或临床研究中进行评估的候选药物，需要一种经过验证、稳健且高通量的生物分析方法，以满足相关监管机构的期望，以支持此类研究和长期样品检测。 为了支持临床研究，对于使用人或人源化抗体支架的ADC，通常需要采用高选择性捕获抗体的方法在人基质中展示必要的灵敏度和选择性。对于LBA，通常需要一对抗特异型抗体。LBA-LC-MS方法只需要一种具有蛋白型肽（通常来自互补性决定区）的捕获抗体即可达到所需的选择性。试剂采集应尽早进行，以便进行临床检测开发。尽管多种方法可以解决生物分析挑战，但应仔细考虑项目生命周期的每个阶段以及整体生物分析策略，最终在这种更大背景下进行生物分析方法的选择。 简而言之，LBA具有高通量和低设备成本的特点，在几种已获批准的ADC（表1）的药代动力学评估中发挥了关键作用。然而，当我们对结构和生物转化信息更感兴趣，或者没有关键试剂时，LBA-LC-MS方法具有优势。 3.3 新的生物分析方法——高分辨率质谱（HRMS）能够识别ADC生物转化 如前所述，ADC具有复杂的结构，会产生众多的生物转化。完整的HRMS方法可以为替代分析物方法提供补充信息，从而为药物发现和开发提供信息。与自下而上的替代肽方法相比，完整分析方法可检测大分子的整体或组分（例如，部分蛋白水解方法中释放的片段抗原结合区域）。完整HRMS定量的灵敏度显著提高。在体内猴药代动力学研究中，与替代肽法相比，完整分析方法可以提供等效的定量结果。 尽管替代分析物测定法测量了可通过酶释放的总毒素，但完整的HRMS测定揭示了ADC随时间推移的结构变化。因此，使用完整的HRMS进行定量可以进一步评估以前遗漏的单个分析物，并可作为更全面地表征ADC药代动力学和代谢的补充工具。 小结 与传统的大分子或小分子药物相比，ADC的生物分析既复杂又具有挑战性，需要创新的生物分析技术来克服生物转化、ADME和组织样品分析等方面的挑战。成熟的生物分析策略对于ADC的临床成功至关重要。随着技术和仪器的发展，LBA或混合LBA-LC-MS等生物分析方法继续作为强大可靠的工具，同时HRMS等一些新的手段也在慢慢成型。这些工具伴随着我们从药物开发的早期阶段走到实验室毒理学和临床研究，有助于我们更好地分析ADC的药代动力学（PK）、代谢和生物分布，掌握ADC的暴露、体内分解代谢和生物转化，把握ADC的功效和毒性。PK研究可以指导新药设计，优化给药方案，改进药物剂型。但PK只是提供数据和参考，需要和药效、毒理、副作用等联合起来，才能得到比较优质的给药方案。 参考文献： 1 Mu R, Yuan J, Huang Y, et al. Bioanalytical Methods and Strategic Perspectives Addressing the Rising Complexity of Novel Bioconjugates and Delivery Routes for Biotherapeutics. BioDrugs. 2022;36(2):181-196. doi:10.1007/s40259-022-00518-w 2 Zhu X, Huo S, Xue C, An B, Qu J. Current LC-MS-based strategies for characterization and quantification of antibody-drug conjugates. J Pharm Anal. 2020;10(3):209-220. doi:10.1016/j.jpha.2020.05.008 3 Evolène Deslignière, Hélène Diemer, Stéphane Erb, Pierre Coliat, Xavier Pivot, Alexandre Detappe, Oscar Hernandez-Alba, Sarah Cianférani. A Combination of Native LC-MS Approaches for the Comprehensive Characterization of the Antibody-Drug Conjugate Trastuzumab Deruxtecan. Front. Biosci. (Landmark Ed) 2022, 27(10), 290. https://doi.org/10.31083/j.fbl2710290 三、ADC药物的临床生物分析策略和挑战 （原创 LTDBAS 药明康德测试事业部） 背景 癌症已成为全球第二大健康威胁，近几年来，每年约有1000万人死于癌症[1,2]。传统的基于细胞毒性药物的化疗虽然在治疗多种癌症方面有一定效果[3]，但由于非特异性药物暴露于各种组织，常导致严重的副作用[4]。为了提高治疗的特异性和效果，科学家们开发了抗体偶联药物(ADC)，这种新型抗癌药物结合了单克隆抗体的高靶向能力和细胞毒性药物的强杀伤力，实现了对癌细胞的精准、高效清除[5]。自2000年美国食品药品监督管理局(FDA)首次批准ADC药物Mylotarg以来，全球已有14种ADC药物获得FDA批准（表1），并有100多种候选药物正在临床试验中。ADC通过精准靶向癌细胞并在内部释放细胞毒素载荷，显著改善了治疗效果，减少了副作用，正引领新的癌症靶向治疗时代，有望成为未来传统化疗的替代品[6]。 *Blenrep于2022年11月22日从FDA撤回。 表1：FDA批准的ADC药物 ADC的结构由三部分组成：单克隆抗体(Antibody)、连接子(Linker)和细胞毒药物(Cytotoxic drug/Payload)。单克隆抗体负责靶向特定的癌细胞表面抗原，确保药物能够准确到达癌细胞。连接子是将抗体和细胞毒药物连接起来的化学桥梁。细胞毒药物则是通过破坏癌细胞的DNA或阻碍其分裂等方式实现杀伤效果[7]。 图1 ADC药物结构与特性[8] ADC就像精确制导的“生物导弹”，能够准确摧毁癌细胞，提高治疗窗口并减少非靶向副作用。ADC的主要作用机制如图2所示，一旦ADC的单克隆抗体(mAb)与特异性表达于癌细胞表面的靶抗原结合，ADC被细胞内吞形成早期内体，随后成熟为晚期内体，最终与溶酶体融合。细胞毒性载荷最终通过化学或酶介导的方式在溶酶体中释放，导致细胞凋亡或通过靶向DNA或微管而死亡。当释放的载荷是可透膜或跨膜的，它还可能通过旁观者效应增强ADC的疗效。此外，这些药物的旁观者效应还可能改变肿瘤微环境，进而可能进一步增强ADC的杀伤效果[8]。 图2 ADC作用机制[8] 尽管ADC在多种癌症类型的治疗中取得了显著成功，但其在治疗难治性癌症中的潜力常常受限于肿瘤异质性和耐药性等因素[9]。通过改进ADC的设计，包括优化抗体、连接子和载荷，以及识别肿瘤特异性靶抗原和有效的生物标志物，涌现出了许多新型ADC药物。包括像双特异性抗体偶联药物，Probody偶联药物，免疫刺激抗体偶联物(ISACs)，双药ADC[10]等等。每种ADC都提供了应对这些各种挑战的独特能力，为癌症患者提供更多更好的治疗选择。 图3新型ADC药物[9] ADC药物临床生物分析策略 ADC药物结构复杂，每个不同的组份，包括像抗体的结构，作用的靶点，药物连接的载荷，链接子，药物抗体比等等，都会影响药物的疗效和在人体的给药策略。了解这些药物临床研发阶段的药代和药效特征，以及免疫原性和安全性，可以对ADC在体内的作用机制和生物过程进行准确和全面的评估，从而促进安全有效的ADC药物的开发。 ADC药物由于结构的复杂性，在体内会经历分解代谢和生物转化等过程，导致ADC药物在体内会存在多种形式的ADC分子和多个ADC药物的组成分子，包括偶联抗体、抗体偶联药物、总抗体、裸抗、游离的小分子payload以及payload相关的代谢产物等，需要建立多个不同的临床生物分析方法，一般ADC的主要临床生物分析包括药代动力学的检测，抗药抗体的检测，中和抗体的检测，生物标志物检测等。 ADC药物PK生物分析策略 ADC进入体内后，payload可通过酶解或者化学反应从主体结构上逐渐解离，主要包括偶联抗体、抗体偶联药物、总抗体、裸抗、游离的小分子payload以及payload相关的代谢产物等。他们在体内的浓度变化对解读ADC的PK药代动力学特点至关重要。ADC为抗体或抗体片段至少结合一个payload（抗体偶联比（Drug to antibody ratio，DAR）≥1）；总抗体为未偶联和偶联至少一个payload分子的抗体的总和（DAR≥0）；Payload为ADC裂解或被分解代谢后形成的游离的payload，在FDA于2022年2月发布的“Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates”指导原则草案中指出，在对ADC药物进行生物分析时，应该测定多种生物分析物用于评估ADC暴露量，例如：体内的总抗体含量、ADC含量以及小分子payload部分和药理活性代谢产物的含量[11, 12]。目前已经上市的ADC药物的PK检测主要包括总抗体、ADC和小分子化合物部分。一般总抗体和ADC的检测主要在LBA平台开展，小分子化合物部分在LC-MS平台进行。不过，随着ADC药物结构越来越复杂，检测的需求，ADC药物也开始在LC-MS平台进行总抗体，抗体偶联药物以及小分子毒素的检测。 对于总抗体和ADC部分的检测，通常在LBA平台上进行检测，采用ELISA或MSD平台。针对总抗体，通常利用靶点或抗裸抗的特异性抗体作为捕获试剂进行包被，再选择酶标的抗裸抗特异性抗体或普抗作为检测抗体进行检测（图4）。针对ADC，通常利用抗payload特异性抗体作为捕获抗体进行包被，再选择酶标的抗裸抗特异性抗体、普抗或者靶点作为检测抗体进行检测（图4）。以已上市的ADC药物Enhertu为例，它的主体是抗Her2抗体，有效载荷为Dxd，该上市药物的PK检测中，总抗体和ADC的检测是在ECL平台进行的，总抗体的检测中分别使用anti-HER2 antibody的特异性单克隆抗体作为捕获试剂和检测试剂，而ADC的检测中使用抗小分子抗体anti-Dxd antibody作为捕获抗体，检测抗体则使用测的是anti-HER2 antibody的单克隆抗体。当下双特异性抗体偶联药物(Bispecific ADCs)较为火热，双异性抗体ADC可以同时靶向两个不同的抗原，他们能够识别并结合两个不同的肿瘤抗原或同一抗原的不同位点，从而提高肿瘤特异性和治疗效果。像双抗ADC类的PK总抗体和ADC的检测策略可以参考双抗药物或者单抗ADC的PK生物策略。 液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）由于具有高选择性和高灵敏度的特性，是分析检测生物基质样品中痕量游离小分子毒素PK检测的首选方式。LC-MS/MS平台并不仅限于游离的小分子细胞毒性药物的定量分析，当采用沉淀蛋白，免疫捕获及酶解或化学水解处理之后，LC-MS/MS平台可以用于定量生物样品中偶联在抗体上的小分子毒素（conjugated drug）和ADC抗体的特征肽段（Total antibody）。蛋白沉淀后，进行酶解或者化学水解，是同时检测两个成分相对简单的方式。对血浆样品先进行蛋白沉淀并离心，之后分离上清（supernatant）和蛋白沉淀部分（protein layer）。上清在经过了吹干、复溶和过滤等操作后，所得样品溶液进行LC-MS/MS分析，即可获得非偶联小分子及其代谢产物的血浆浓度。与此同时，对蛋白沉淀部分进行酶解处理，从而释放偶联在抗体上的小分子和表征总抗的特征肽段，之后新添加沉淀剂对水解样品进行提取，取其上清吹干、复溶和过滤之后，所得样品溶液亦使用LC-MS/MS定量分析，可得偶联小分子毒素和总抗的血浆浓度[13]。使用免疫捕获和酶切进行样品前处理，从而可用LC-MS/MS分别测定人血浆酶解所得的小分子总量和酶解所得的特征肽段，来表示血浆基质中ADC和抗体PK[14]。通过前两种途径，都可以实现用一个方法同时检测出ADC和总抗的浓度数据，不仅降低了项目成本，同时也能在某种程度上，避免DAR敏感的问题，提高数据的可靠性。免疫捕获和LC-MS/MS技术，结合了LBA和LC-MS/MS的优势，也被广泛的用于到了ADC各个成分的PK分析中了。 图4：ADC的PK生物分析[15] ADC药物PK生物分析挑战 由于ADC自身所具有的特殊结构和复杂的组分多样性，其PK生物分析方法的建立具有很大的挑战性，在LBA平台进行ADC的检测时主要有以下几个挑战：（1）DAR值敏感性，当ADC进入体内后，payload可通过酶解或者化学反应从主体结构上逐渐解离，产生不同DAR值的ADC药物，而ADC标准品往往不能准确的反应体内ADC药物的真实情况，尤其是PK靠后的一些采样时间点样本[16]，另外不同DAR值的ADC药物与捕获试剂或者检测抗体的结合能力可能不同，影响总抗体和ADC浓度的准确度测定，尤其体现在一些高DAR值的ADC和低DAR值的ADC药物间。（2）小分子毒素结构的改变，目前在研的小分子毒素主要有DNA损伤剂、DNA转录抑制剂、微管蛋白抑制剂、美登素、喜树碱类、Tubulysin B类似物等，其化学结构可能会随着药物在体内的生物转化和分解代谢而发生改变，从而也带来它独特的生物分析挑战。例如，像喜树碱类的衍生物，作为DNA拓扑异构酶I的抑制剂，分子中的内酯环，是主要的活性基团，但结构不稳定，在pH上升时会打开，打开后的结构会改变和抗体之间的结合能力，从而影响PK的检测[17]；另外有些小分子毒素在体内会发生转化，PK的检测形式也会增多，例如ADC药物MEDI4276，临床的PK检测包含了总抗体，小分子毒素转化前后的ADC，游离的转化前后的小分子毒素5种形式[18]。（3）可溶性靶点蛋白，当循环系统中有高浓度游离的可溶性靶点蛋白时，可能会影响抗原或者是特异性抗体和药物的结合效率，从而对PK的检测带来一定的影响。（4）抗药抗体，当体内有抗药抗体或者是中和抗体产生时，都会对PK的检测带来影响，抗药抗体可能会带来空间位阻的影响，而中和抗体会直接影响抗原或者特异性抗体和药物的结合。在LC-MS平台进行小分子毒素的检测时主要有以下几个挑战：（1）小分子毒素的血浆浓度通常比较低，方法的检测下限通常比较低，例如在一项对8种MMAE ADC的PK研究中，在单次静脉注射2.4 mg/kg的剂量之后，血浆中游离MMAE的浓度Cmax均比其相应的ADC及总抗体的浓度低至少100倍，仅为不到10 ng/mL[19]。这就意味着这类小分子基质样品的检测下限需要低至几百甚至几十pg/mL[13, 14]（2）在对ADC小分子药物进行生物分析方法开发时，研究者除了要考虑小分子可能在不同温度、不同pH条件、或在基质中酶解而产生的不稳定性，也要考察在一定浓度的ADC存在的条件下，在基质样品中游离小分子的“稳定性”。而这后一种情况若存在不稳定性，则通常表现为游离小分子的浓度随时间增长或温度升高而升高，与小分子由于自身的不稳定性所导致的浓度下降刚好相反。这种导致小分子浓度升高的“不稳定性”与ADC连接子的性质相关，研究者可以根据连接子和小分子本身的性质提出应对的稳定性解决方案。例如：是否在样品中添加缓冲试剂以控制pH或抑酶剂，在哪个阶段添加（临床采样、第一次化冻或是样品提取后），样品提取时是否可置于室温或是必须浸于湿冰浴中，等等。这些稳定性考察实验包括且不限于全血稳定性、实验台（样品前处理）稳定性、储存稳定性、冻融稳定性和样品提取后的稳定性等。 ADC药物ADA生物分析策略 跟其他生物制剂一样，患者接受ADC药物治疗后，体内可能会产生相应的抗药抗体(ADA)和中和抗体(NAb)。考虑到免疫原性跟药物的有效性和安全性高度相关，药监部门要求对所有生物药都要进行免疫原性的评估和检测。对于ADC的免疫原性分析，FDA发布的“Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates”指导原则草案的免疫原性相关章节指出，ADC的任何组成部分都可能产生免疫应答，包括抗体、payload或由连接子产生的表位[20]。同时该指导原则草案[21]指出对于免疫原性的评估，应按照FDA指南“Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products —Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection” (2019年1月)[21]中概述的方法进行免疫原性评估，包括检测ADC抗药抗体(ADAs)的确认性评估。此外，应开发多种检测方法来测量对ADC组成部分的免疫反应，例如偶联产生的额外表位或结构域。对于多结构域蛋白的抗药抗体生物分析，2019年美国FDA发表的“Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products —Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection”和2021年国家药品监督管理局发布的《药物免疫原性研究技术指导原则》[22]均明确指出“对于多结构域治疗性蛋白药物，如聚乙二醇化蛋白、多特异性抗体，建议针对整个治疗性蛋白药物进行初步筛选试验和确证试验，基于风险或产品特征，对确证为阳性的样本进一步开展域特异性评价。” ADC药物的抗药抗体(ADA)检测主要是基于MSD平台的桥联（Bridging Assay）法。如图5，生物素（Biotin）标记的ADC药物作为捕获试剂，钌标记的ADC药物作为检测试剂，该方法具有灵敏度高、有效线性范围宽、均一性、重复性高、基质效应小、稳定好、检测通量高等特点，广泛用于ADC药物的ADA检测。 图5. MSD平台的桥联（Bridging Assay）法 ADC药物的ADA检测主要遵循分层级免疫原性分析策略，但由于独特的结构特征，不仅抗体部分可以引发免疫反应，连接子或小分子毒素部分虽然分子量比较小，免疫原性比较弱，但也有可能产生ADA。因此在检测ADC药物的ADA时，对ADC药物确证为阳性的样本根据需要进一步开展域特异性评价。双特异性抗体偶联药物（BsADCs）的结构更加复杂，根据结构特性可以做更多不同表位的特异性检测。 图6. ADA检测策略 ADC药物ADA生物分析挑战 为支持ADC药物的研发和临床试验，药明康德生物分析部已经开发了多款ADC药物的ADA的检测方法，包括单抗ADC和双抗ADC，在方法建立过程中常有的几个挑战如下：1)如果临床给药剂量比较高，生物样本中可能含有高浓度的游离受试药物，可以与捕获试剂/检测试剂竞争结合ADA，进而干扰ADA检测导致假阴性结果。因此，为提高药物耐受水平，可通过如酸解离、通过固相吸附除去过量的药物、延长孵育时间、以及稀释样本等多种方法解决。2）由于连接子或小分子毒素部分免疫原性弱，用ADC药物免疫制备的阳性对照抗体与之亲和力差，如果开展这部分的域特异性评价，需要额外制备亲和力高的阳性对照抗体。 ADC药物Nab生物分析策略 对于抗药抗体（ADA）阳性的样本，通常需要分析中和抗体（Nab）。中和抗体是抗药抗体中的一类抗体，能够通过直接与药物作用结合位点结合，或者通过空间位阻的作用，使药物失去与其靶点结合的能力，从而封闭、中和药物的治疗活性。中和抗体的产生通常与血药浓度降低，药效降低，副作用的出现有着很强的关联性，因此对机体在使用生物药后产生的中和抗体检测是免疫原性检测中关键的一个部分。针对抗体部分的中和抗体（NAb）会阻碍ADC药物对细胞的杀伤作用，因而可以基于细胞的增殖凋亡实验来开发NAb的检测方法。基于ADC药物的作用机理和国内外法规及指导原则的要求[22-24]，一般推荐使用基于细胞（Cell based）的检测方法来进行中和抗体的检测。 对于细胞平台的NAb检测，要选择合适的对于药物敏感的细胞株。例如，靶向HER2的ADC单抗药物，可以选择高表达HER2的人乳腺癌SK-BR-3细胞，药物能够与细胞上的HER2结合，并经内吞作用进入细胞，进而释放小分子毒素杀伤细胞；若样品中存在NAb，它能够与药物结合，阻断药物和细胞上的HER2的结合，使肿瘤细胞免于杀伤。用细胞活性试剂检测时，表现为荧光信号升高，具体检测原理见下图。 对于ADC双抗药物，需要基于药物分子的设计和药物的作用机理来制定相应的中和抗体检测策略。例如，药物需要同时结合两个靶点时才能发挥杀伤作用，则需要使用表达同时表达两个靶点的细胞株，开发一个Cell based NAb方法；若药物在分别结合单个靶点时就可以发挥作用可考虑使用分别表达两个靶点的细胞株，并开发两个Cell based NAb方法。 图7.NAb检测策略示意图 ADC药物Nab生物分析挑战 ADC药物的Nab生物分析方法建立过程中常遇到的可能有以下几个挑战：(1)由于临床中可能涉及多次给药，人体中存在高浓度的药物或药物与中和抗体的复合物，游离的药物会与细胞上的受体结合，干扰NAb检测，导致假阴性。因此，在方法开发过程中需要对药物耐受进行充分评估；一般可以采用固相萃取、磁珠提取或者热灭活[25]等方式来尝试提高药物耐受水平。(2)另外样品中也可能存在一定水平的靶点。可溶性靶点会和NAb竞争结合药物，干扰NAb检测，造成假阳性。因此，方法开发过程中也需要对靶点干扰水平进行考察。样本的前处理，如酸碱提取等，会影响样本的pH条件，进而影响细胞活性和实验的灵敏度。若ADC药物的linker不耐酸[25]，样本的前处理受限等情况下，也可以选择非细胞平台的检测方法。 总结 ADC药物由于自身的特殊结构和复杂的组分多样性，对生物分析带来了很多的挑战，开发准确而稳定的ADC生物分析方法对研究ADC药物的药代和药效特征，免疫原性和安全性都极其重要，能更好的帮助我们理解药物在体内的真实情况，更好的助力药物获批上市，ADC药物的生物分析对于检测实验室的整体要求也越来越高，ADC药物的临床生物分析方法还是基于NMPA、FDA、以及EMA等相关指导原，PK的检测一般包括总抗体，ADC和小分子毒素等，常用的分析方法平台包括LBA平台和LC-MS平台，一般总抗体和ADC的检测在LBA平台展开，小分子化合物的检测在LC-MS平台开展；近年来随着LC-MS技术的发展，运用LC-MS, LBA-LC-MS, HRMS等平台定量检测ADC分子的报道也越来越多。在LBA平台进行ADC的定量检测一般需要考虑DAR值敏感性、靶点干扰、小分子毒素带来的影响之外，也需要关注总抗体和ADC检测浓度之间的关系。在LC-MS平台进行小分子毒素的定量检测则需要关注检测的灵敏度以及待测物的稳定性等。 ADC药物的免疫原性评估包括抗药抗体ADA和中和抗体Nab的检测，ADC药物的ADA检测主要遵循分层级免疫原性分析策略，另外基于风险或产品特征，对确证为阳性的样本进一步开展域特异性评价。对于ADA的生物分析方法需要重点关注方法的药物耐受度和关键试剂的标记等。Nab的检测有基于细胞的中和抗体检测方法(cell-based analysis)和非基于细胞的中和抗体检测方法(non-cell-base analysis)，监管机构（FDA）更推荐使用cell-based，它更接近反映体内的真实情况，难点是需要找到合适的细胞系，更长时间的开发、优化和验证，变异大，基质效应明显，干扰大。在难以获得相关细胞系，或者基质干扰无法解决，cell assay 的信号弱等情况下，可以选择non-cell-based analysis，该方法简单，快速，而且更稳健，灵敏度更高（可能）。与ADA分析不同的是，Nab分析的阳性抗体需要有明显的中和活性（单抗和多抗都可以）。 目前药明康德测试事业部临床生物分析团队已经开发并验证了多种符合GLP法规要求的ADC生物分析方法，经验包含Her2，Her3，Trop-2，Claudin 18.2，PSMA，CDH3，CD38等单双抗靶点，Payload包括像MMAE，MMAF，DM1，DM4，SN38，DXD等，也支持过上市ADC药物的临床分析工作；同时在LC-MS平台也开发了多种检测基质中ADC和抗体PK的临床生物分析方法，无论在LBA平台还是LC-MS平台都积累了丰富的ADC临床分析经验，可以帮助客户解决ADC药物在临床生物分析中遇到的各种挑战，加速药物获批上市。 表2:药明康德测试事业部ADC临床检测经验（部分） 参考文献 [1]https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/global-cancer-facts-and-figures.html [2]Sung, Hyuna, et al. "Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries." CA:a cancer journal for clinicians 71.3 (2021): 209-249. [3] Loadman, P. "Anticancer drug development." British journal of cancer 86.10 (2002): 1665-1666. [4] Lindley, Celeste, et al. "Perception of chemotherapy side effects cancer versus noncancer patients." Cancer practice 7.2 (1999): 59-65. [5] Lambert, John M., and Anna Berkenblit. "Antibody–drug conjugates for cancer treatment." Annual review of medicine 69.1 (2018): 191-207. [6]Ethan Ennals For The Mail On Sunday. New breed of drug which reduces bladder cancer deaths could replace chemotherapy in other cases. At dailymail.co.uk (2021). [7] Riccardi, Federico, et al. "A comprehensive overview on antibody-drug conjugates: from the conceptualization to cancer therapy." Frontiers in Pharmacology 14 (2023): 1274088. [8] Fu, Zhiwen, et al. "Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted can end 本公众号声明： 1、如您转载本公众号原创内容必须注明出处。 2、本公众号转载的内容是出于传递更多信息之目的，若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请作者或发布单位与我们联系，我们将及时进行修改或删除处理。 3、本公众号文中部分图片来源于网络，版权归原作者所有，如果侵犯到您的权益，请联系我们删除。 4、本公众号发布的所有内容，并不意味着本公众号赞同其观点或证实其描述。其原创性以及文中陈述文字和内容未经本公众号证实，对本文全部或者部分内容的真实性、完整性、及时性我们不作任何保证或承诺，请浏览者仅作参考，并请自行核实。