核酸适体降解剂,或将引领TPD发展新方向?

2023-04-19
核酸药物临床研究
当前,靶向蛋白降解技术(TPD)在慢性病、罕见病、癌症等领域显示出巨大的治疗前景。过去数十年的研究主要集中于开发基于小分子或抗体的靶向蛋白质降解(TPD)技术。研究表明,基于小分子的降解剂存在较差的药代动力学性质以及脱靶等问题。而基于抗体的降解剂存在较大的分子量,导致了较低的生物利用度等问题。
核酸适体是短的RNA或DNA寡核苷酸,能与靶蛋白结合,具有特异性高,亲和力强、低免疫原性等优势。目前,适体已被广泛应用于各种疾病诊断和治疗。此外,近期的研究发现,适体已广泛应用于TPD技术的设计和构建。
一、靶向蛋白降解( TPD )技术
近年来,靶向蛋白降解(targeted protein degradation, TPD)技术已经成为靶向“不可成药”靶点蛋白的有力工具,扩大了可成药靶点的范围。TPD技术利用靶蛋白配体进行特异性结合,并通过泛素蛋白酶体系统诱导目标蛋白发生不可逆降解(图1)。与基因技术和小分子抑制剂相比,TPD技术有诸多优势。首先,它可以迅速降解POI,阻止细胞适应和补偿逆转蛋白质敲除过程。其次,它允许关键位点突变的POI选择性降解,避免耐药性的产生。第三,一旦降解完成,TPD分子的降解剂可以重新参与到下一轮降解过程中,并循环利用,以更低的剂量获得更好的效果。
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二、真核生物的蛋白清理系统
真核细胞有两种主要的蛋白质水解途径:泛素-蛋白酶体系统(UPS)和溶酶体途径。UPS负责消除真核细胞中80%以上的蛋白质,主要是错误折叠的蛋白质、受损蛋白和一些短寿命蛋白,这些蛋白控制许多关键的细胞过程,包括细胞生长、分化和代谢等生理过程(图2)。依赖UPS的TPD技术包括分子胶、PROTACs、HaloTag和dTag技术等。
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溶酶体降解途径包括内体-溶酶体途径和自噬-溶酶体途径(图3)。自噬-溶酶体途径始于一个分离的膜结构,称为吞噬体,它可以吞噬细胞内的物质并将其运输到自噬体,然后与溶酶体融合形成自溶酶体,导致物质降解。自噬-溶酶体途径降解的靶标主要涉及长寿蛋白、不溶性蛋白聚集物和更大的细胞结构,如功能失调的细胞器。内吞体-溶酶体途径是物质内吞作用后的一系列过程。内化物质首先进入早期核内体,逐渐成熟为晚期核内体,最终在晚期核内体和溶酶体中降解。
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为了扩大可降解蛋白质的范围,基于溶酶体降解途径的TPD方法近年来得到了广泛的发展和应用。目前,基于溶酶体途径的TPD技术包括:LYTACs、基于共价纳米体的GlueTAC、AUTAC、 ATTEC(图4)。
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其中,LYTACs和GlueTAC是基于内体-溶酶体途径的TPD技术,AUTAC、 ATTEC和AUTOTAC是基于自噬-溶酶体途径的TPD技术(图5)。
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三、核酸适体 :TPD 技术的另一个方向
核酸适体作为一种新兴的分子识别工具,是通过指数富集SELEX技术在配体体外系统进化筛选出来的单链寡核苷酸,可用于识别和结合靶蛋白、活细胞或特定器官。通常,适体对其目标具有与抗体相当的高特异性和选择性。目前,适体已被发现,并广泛应用于各种疾病诊断和治疗。研究发现,一些适体可以通过膜蛋白识别特异性结合靶细胞,随后通过受体介导的胞吞作用或微胞饮作用进入细胞。因此,基于蛋白质识别和细胞内化的能力,适体可被应用于TPD的开发,有望消除脱靶限制,为TPD技术提供更多机会。并且,相比于传统的降解剂也有诸多优势。
3.1 扩大可降解 POI 的范围
大多数TPD技术不能降解细胞膜蛋白,但大量的适体可以结合细胞膜蛋白,具有较高的特异性和亲和力。这些适体有望为膜蛋白降解提供更多的可能性。在2021年,Miao等人通过连接两种不同的膜蛋白适体,能够同时结合细胞表面溶酶体穿梭受体胰岛素样生长因子II受体(IGFIIR)和POI,构建了双特异性适体嵌合体(图6)。开发的嵌合体可以通过溶酶体降解途径将POI转运到溶酶体中进行降解。
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2022年,谭蔚宏课题组开发了一种基于适体的PROTAC ZL216,它由核仁靶向适体AS1411作为靶向配体和E3连接酶VHL的小分子配体AHPC组成(图7)。基于核仁素在细胞表面的差异表达,ZL216可以特异性靶向乳腺癌细胞,诱导核仁素在乳腺癌细胞中的降解,抑制其增殖和迁移。
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研究表明,一些细胞内靶点蛋白没有明确的结合口袋,因此,对小分子配体或特异性抗体的TPD提出了挑战。这一限制有望通过引入具有特异性靶向能力的适体,从而设计基于核酸适体的降解剂来解决。RNA结合蛋白(RBPs)功能缺陷是许多疾病的根源,用传统药物靶向 RBPs 已被证明是困难的。RBPs 以动态、协调和序列选择性的方式与 RNA 结合,形成在 RNA 依赖过程中起关键作用的核糖核蛋白 (RNP) 复合物。某些疾病是由 RBP 的基因改变引起的,这些改变会影响它们与 RNA 的结合。2021年,Jonathan Hall课题组首次提出了基于RNA的PROTACs的设计理念,作者成功构建了靶向RBPs(RNA结合蛋白)的RNA-PROTACs。采用小 RNA 模拟物作为靶向基团,可与 RBPs 的 RNA 结合位点特异性结合,PROTACs通过对RBPs泛素化,进而使其被泛素蛋白酶体系统降解。作者对两种 RBPs(干细胞因子 LIN28 和剪接因子 RBFOX1)的降解进行了概念验证演示(图8),并展示了它们在癌细胞系中的用途。
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转录因子 (TFs) 是一类重要的治疗靶标,用于治疗包括癌症在内的疾病。由于TF s缺乏激酶或其他酶中通常存在的活性位点或变构位点,传统的小分子抑制剂很难与其结合,因此,转录因子曾一度被认为是 “undruggable” 靶标,是难以逾越的技术瓶颈。然而,基于寡核苷酸的PROTAC的开发已经实现了对TF的选择性降解。转录因子靶向嵌合体(TRAFTACs)是异双功能嵌合寡核苷酸,包括双链DNA结合TF,共价连接到Cas9 crispr结合RNA,而CRISPR-RNA结合到异位表达的dCas9-Halotag7融合蛋白。该融合蛋白将E3连接酶招募到目标TF附近,并通过蛋白酶体途径诱导目标降解(图9)。
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此外,哈佛大学魏文毅教授与西奈山伊坎医学院金坚教授报道了一种基于寡核苷酸链的 “TF-PROTAC”, TF-PROTAC 由DNA 寡核苷酸与 E3 连接酶配体通过点击反应连接构成(图3),可选择性地降解致病TFs。作者成功开发了两个系列的基于 VHL 的 TF-PROTAC:NF-κB-PROTAC(dNF-κB) 和 E2F-PROTAC (dE2F),可分别有效降解细胞中的内源性 p65 和 E2F1 蛋白,并显示出优异的抗细胞增殖作用(图10)。
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雌激素受体α (Estrogen receptor α, ERα)作为转录因子可调控靶基因表达,是乳腺癌治疗的重要靶点。通过不同E3配体修饰的DNA序列靶向ERα的DNA结合域,可以选择性地通过UPS降解ERα,这有可能克服乳腺癌治疗的耐药问题。研究表明,G4s是四链核酸结构,G4结合蛋白在许多生物过程中起着至关重要的作用。2021年,Patil等人开发了G4- PROTAC,将G4作为靶头与E3连接酶结合,靶向降解G4结合蛋白RHAU/DHX36(图11)。
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在这些基于寡核苷酸的TPD技术中,寡核苷酸发挥了特定的识别功能,拓展了TPD方法的应用范围。因此,以核酸适配体作为POI配体与不同蛋白质降解途径的结合可以扩大POI的可降解范围,为治疗相关疾病提供更多途径。
3.2 扩大 UPS 中可用的 E3 连接酶的范围
尽管已知的人类E3连接酶超过600个,但在PROTAC系统中通常使用的E3连接酶不到10个。最广泛使用的E3连接酶是CRBNVHL,以及凋亡抑IAPMDM2。然而,当E3连接酶发生突变,由于对特定E3连接酶的过度依赖,从而导致潜在的细胞耐药 。此外,CRBNMDM2配体介导的TPD方法都引起了其他非靶蛋白降解的毒性作用。这就要求开发其他具有足够安全性的E3配体。由于适体由天然核苷酸组成,快速代谢清除的特性使得适体安全且无长期毒性,已成为发现E3配体的候选对象。
2018年,Tucker等人筛选了一种名为C3A的DNA适体,它与E3连接酶WWP1结合并抑制其泛素化活性(图12)。适体C3A可以维持成骨细胞分化的重要调节因子Runx2的水平,并刺激细胞外基质沉积,为骨质疏松症提供了一种潜在的治疗策略。理论上,利用SELEX技术可以筛选出任何E3酶的适体。其他E3连接酶的特异性识别适体的发现,可以扩大可降解蛋白的范围,提高现有TPD技术的降解效率,实现细胞/组织特异性蛋白降解,进一步扩大了基于适体的TPD技术在未满足的临床需求中的应用。
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3.3 开发其他 TPD 方法
现有的TPD方法主要基于识别和调控蛋白质水解途径中的必需蛋白的原理,如UPS中的E3连接酶以及自噬途径中的LC3P62蛋白。已有研究表明,细胞中一些天然RNA,如环状RNA (circRNA)和长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA),可能介导两种蛋白质之间的相互作用,从而通过类似“分子胶”的机制诱导特定蛋白质降解。这些天然RNA通过促进蛋白质水解途径中“靶蛋白- RNA关键蛋白”三元复合体的形成来降解特定蛋白质。天然RNA与靶蛋白特异结合的方式与天然适体的能力相似。因此,通过参考这些核酸序列可以建立蛋白质筛选和预测模型,并找到可以结合靶蛋白的适体。从这些研究进展来看,有希望将自然的细胞内生物学功能扩展为一种由适体支持的多功能TPD技术。
3.4 提高 PROTAC 水溶性,实现靶向递送
PROTAC分子的分子量一般在700到1000 Da之间,导致了较差的水溶性和细胞摄取,从而降低了口服生物利用度,对临床应用提出了挑战。传统的PROTAC分子在体内应用时对组织分布和细胞类型没有选择性。正常细胞中的蛋白质也可能被降解,导致不可预测的潜在毒性风险。核酸适体是高度溶于水的寡核苷酸序列。因此,基于核酸适体的PROTAC有望提高PROTAC水溶性,并增加细胞摄取。
海军军医大学盛春泉课题组提出了核酸适配体-PROTAC偶联物(APC)设计理念,APC由可切割的连接链将靶向 BET蛋白的PROTAC 与核酸适体 AS1411 ( AS ) 偶联得到(图13)。其中,核酸适配体AS1411可以选择性靶向肿瘤细胞表面高表达的核仁素受体。谷胱甘肽在肿瘤细胞含量丰富,而二硫键可选择性地响应肿瘤微环境中过表达的谷胱甘肽,切割连接链后释放出活性的BET降解剂。此外,作者发现,将亲水适体整合到PROTACs中可以有效提高水溶性,同时也实现了PROTAC的靶向递送效果。
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<br> 四、小结
核酸药物近年来发展迅速,涉及代谢疾病神经系统疾病肿瘤、及抗病毒等广泛领域。尽管取得了很大进展,但体内稳定性差和细胞摄取效率低限制了核酸药物的疗效,包括适体、反义寡核苷酸(ASOs)、sirna、抗micrornas和mRNA等。因此,安全高效的体内递送策略可以克服这些应用挑战,拓宽应用前景。
在TPD领域,各种纳米系统,包括脂质体、聚合物纳米颗粒和无机纳米颗粒,已被研究用于递送PROTAC和分子胶。各种TPD技术正在迅速向临床评估发展。但现有TPD技术仍存在分子量大、水溶性差、脱靶效应等应用瓶颈。尽管基于适体的TPD表现出巨大潜力,但仍有许多问题需要解决:
1、核酸适体的稳定性差,易被核酸酶清除
2、适体的结合亲和力可能对环境条件敏感,如pH、温度和盐浓度等
3、适体需要从核内体逃逸到细胞质,才能与胞内靶蛋白结合
TPD技术正在蓬勃发展,许多技术正在涌现,以促进TPD领域的发展。目前,将适配体与TPD技术相结合正在兴起。此外,多项研究已经证明了适体在多种疾病的诊断和治疗中的价值和潜力。基于SELEX的高效率和可靠性,再加上适体在解决现有TPD技术局限性方面的出色表现,我们相信适体在TPD领域的前景也是无限的。
参考资料
1.Aptamer-Based Targeted Protein Degradation.https://doi.org/10.1021/acsnano.2c10379
2.The current state and future directions of RNAi-based therapeutics. Nat. Rev. Drug Discovery 2019,18, 421−446.
3.Drugging Undruggable Molecular Cancer Targets. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2016, 56, 23−40.
4.The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nat. Chem. Biol. 2018, 14, 431−441
5.TF-PROTACs Enable Targeted Degradation of Transcription Factors. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 8902−8910
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