Doxil®——首个FDA批准的纳米药物：经验与启示
摘要:Doxil® 是首个获美国FDA批准的纳米药物（1995年），其基础是三个互不相关的原理：(i) 使用PEG化纳米脂质体，延长药物循环时间并避免网状内皮系统（RES）捕获；(ii) 利用跨膜硫酸铵梯度驱动阿霉素实现高且稳定的远程装载，这也使得药物能在肿瘤部位释放；(iii) 使脂质体脂双层处于由高相变温度Tm（53°C）的磷脂酰胆碱和胆固醇组成的“液态有序”相。得益于增强的渗透和滞留（EPR）效应，Doxil能被“被动靶向”至肿瘤，其阿霉素通过迄今未知的方式释放并作用于肿瘤细胞。本综述总结了Doxil开发的历史与科学视角，以及从其开发和20年使用中获得的经验教训。它证明了对理化、纳米技术和生物学原理之间相互作用的理解是必不可少的。然而，尽管回报巨大，在Doxil相关专利到期约2年后，目前仍无FDA批准的通用型“Doxil”上市。
1. 是什么促成了Doxil®的开发：OLV-DOX
Doxil的开发始于约14年前的以色列和美国。当时，Gabizon和Barenholz的“首次人体”（FIM）临床试验表明，尽管最大耐受剂量（MTD）有所提高，但“第一代”脂质体阿霉素并未证明有进一步临床开发的价值（综述见[1]）。在该FIM试验中，我们使用了带负电荷、中等大小的寡层脂质体（OLV），其由两种低Tm（液态）磷脂[两性离子的卵来源磷脂酰胆碱（EPC）、带负电荷的卵来源磷脂酰甘油（EPG）]和胆固醇组成。在这些OLV中，阿霉素与脂质膜结合，并在脂质水合过程中被动装载。这种脂质体阿霉素被称为OLV-DOX（有关OLV-DOX制剂开发、表征、性能和临床经验的更多信息，参见[2-17]及综述[1]）。
在此次FIM试验中，我们还测定了患者血浆中阿霉素和磷脂酰甘油（PG）的药代动力学（PK）。PG是一种通常不存在于人血浆中的磷脂，因此被用作OLV-DOX的脂质体标记物。根据阿霉素PK与PG PK的比率，我们计算了阿霉素在人体血浆中的体内释放速率[14,15]。我们还通过成像¹¹¹In远程装载的OLV（¹¹¹In-OLV，[14]）测定了OLV的生物分布（BD）。这些研究清楚地表明，当以OLV-DOX形式递送时，阿霉素的清除是两种过程的复合结果：(i) 含阿霉素的脂质体被RES（主要是肝脏和脾脏，而非肝肿瘤）清除，这些OLV避免了肝肿瘤的摄取；(ii) 从血浆中脂质体快速释放出的游离阿霉素的清除。对总药物（阿霉素）、脂质体结合阿霉素和脂质体标记物（PG和¹¹¹In-OLV）的PK分析表明，这两种过程在患者体内均发挥作用，且患者肝功能等因素可能影响其相对贡献[14,15]。
这些PK、BD和成像数据表明，OLV-DOX临床毒性的降低源于游离药物峰浓度略有降低，以及脂质体组织分布可能发生的某些改变，即部分药物积累从其他组织转向RES。该研究揭示的、基于OLV-DOX的治疗策略的主要局限是显著的药物泄漏和优先被RES摄取。
这些缺点很可能是由下述基础配方理化特性的不足造成的。
(i) 药物位于脂质体双层中，而非包封在脂质体水相内部。与膜结合的药物在稀释时可能更容易释放到血浆中，并与血浆蛋白结合[10,11,15]。该过程由药物膜/介质分配系数决定，对于阿霉素而言，此系数不足以在OLV-DOX经静脉缓慢输注给人而经历的巨大稀释过程中保留药物[12,15,18,19]。我们证明了小鼠实验中成功的治疗效果与人体研究失败之间的差异，源于血浆容量的巨大差异（对比小鼠约1 mL与人类>3500 mL，以及小鼠与人类体型差异）。阿霉素与脂质体的结合与脂质体膜/水介质（血浆）分配系数（Kp）有关。因此，缓慢输注脂质体将导致每mL药液到达血浆时立即发生高达3500倍的稀释，相比之下，给小鼠静脉推注相同脂质体仅产生5倍稀释。游离药物从血浆中的快速清除使得这种巨大的稀释效应在整个输注期间持续存在[12,15,18-20]。注射后不久出现的药物突释放应（图4，[14]）与稀释释放效应相符。
(ii) 脂质体双层中存在高摩尔分数的PG可能加速RES的摄取[13]；也可能诱导补体激活[21-23]。
(iii) 脂质体尺寸过大，无法在外肝组织中实现外渗[24]，也无法利用首次由Matsumura和Maeda[25]描述并由Maeda等人[26]综述的增强渗透和滞留（EPR）效应。由于肿瘤（而非正常健康组织）富含多孔且对100纳米及更小颗粒可渗透的毛细血管，并且肿瘤组织淋巴引流不良，使得纳米颗粒能长时间滞留在该处，随后实现局部（肿瘤）药物释放和/或被肿瘤细胞摄取，因此该效应可使纳米颗粒在肿瘤中选择性积累。因此，在OLV-DOX与阿霉素（标准疗法）给药中观察到相同的剂量限制性骨髓毒性并不奇怪，这可归因于循环脂质体中药物快速泄漏的程度很大。
鉴于OLV-DOX在血浆中的快速药物释放以及组织分布和生物利用度的改变，尚不确定OLV-DOX耐受剂量（相对于游离、非脂质体阿霉素）的略有增加是否能带来抗肿瘤活性的增强。本临床研究中使用的脂质体被肝脏和脾脏的RES快速清除，骨髓摄取较少。这些人体研究表明，OLV-DOX的抗肿瘤活性机制复杂，可能源于肿瘤细胞暴露于从循环脂质体泄漏的药物以及从RES释放的药物。显然，循环脂质体的药物泄漏是不希望的，因为它导致了不必要的心脏毒性。关于药物从RES释放，最可能从此方法中受益的临床条件是有限的。此方法不应适用于治疗实体瘤，因为在大多数实体瘤中，药物暴露与剂量的关系可能不理想。预期OLV-DOX对RES/肝功能、肿瘤累及部位、肿瘤细胞与RES细胞邻近度等因素高度敏感。
这种用于人体的OLV-DOX的失败为我们带来了一些基本的“重要经验”，促使我们开发一种对人体毒性更低、疗效优于游离阿霉素的脂质体阿霉素制剂。OLV-DOX的失败是Doxil®开发的主要驱动力和基础。
我们在OLV-DOX上的失败支持了1980年代对脂质体作为广谱药物递送系统的整体低期望。这种失望在Poste等人在《Cancer Research》上发表的一篇几乎对脂质体医学应用“致命”的论文[27]中得到了总结，该论文明确断言：“脂质体无法从连续毛细血管逸出及其被循环和固定的吞噬细胞快速摄取，使得利用脂质体将药物‘靶向’到血管外组织细胞的可行性受到质疑。”
这篇论文以及Poste 1983年的论文[28]对脂质体的医学应用是“灾难性的”，因为它导致科学界以及主要资助机构、制药工业和风险投资界对该领域失去兴趣。该领域又花了10年时间和一些真正的临床成功才得以恢复，并重新获得一些信任，从而使得从1995年至今有超过十几种FDA批准的脂质体药物得以开发。
在规划我们先进的脂质体抗癌药物时，Liposome Technology Inc. （LTI）、Gabizon和我决定继续选择阿霉素作为癌症化疗药物，因为我们选择该药物的大多数考虑因素（医学、科学和实用）[1]仍然有效。阿霉素，像许多其他蒽环类药物一样，是由链霉菌属细菌之一（Streptomyces peucetius var. caesius）产生的。它于1960年代在亚得里亚海附近被发现，这也解释了其品牌名Adriamycin的来源，并且显示出显著的抗癌活性[29-31]。阿霉素通过两种主要作用机制作用于分裂细胞的核酸。首先，它通过嵌入DNA链的碱基对之间来抑制DNA和RNA合成，从而阻止快速生长的癌细胞中的复制和转录。该机制基于阿霉素分子的化学和物理特性（其带正电荷的甘露糖胺能有效结合带负电荷的核酸磷酸二酯基团，且其蒽醌平面环结构非常适合嵌入双链DNA）。总而言之，这些结构特征使得该药物以不依赖于细胞代谢的方式对双链核酸具有高亲和力。体内对DNA的高亲和力可以通过其与核DNA结合后荧光快速淬灭而容易地通过物理方法测量到。阿霉素的伯氨基团，结合其两亲性，使其成为适合远程装载到预制脂质体中的良好候选药物，这一特性使得Doxil的成功开发成为可能（见下文，综述见[32-34]）。其次，阿霉素抑制拓扑异构酶II，阻止超螺旋DNA的松弛，这是阻断DNA转录和复制的另一种方式。另一个主要的生物学效应是，阿霉素形成铁介导的自由基，对DNA、蛋白质和细胞膜脂质造成氧化损伤。由于线粒体膜含有高水平的带负电荷的磷脂双磷脂酰甘油（心磷脂），而阿霉素对其亲和力高于其他磷脂，因此线粒体膜对此效应特别敏感。这种对心磷脂的较高亲和力（类似于对DNA的亲和力）是Rahman及其同事[35-38]选择心磷脂作为其制剂中带负电荷脂质的基础。这种氧化诱导的损伤效应现在被认为是阿霉素毒性和副作用的主要原因之一。心肌富含线粒体的事实部分解释了该药物的高心脏毒性。传统阿霉素的标准治疗是通过静脉给予相对高剂量的药物，范围在10至50 mg/m²（综述见[39-42]）。
选择阿霉素作为化疗药物最重要的临床考虑是，该药物被认为是有史以来最有效的抗癌药物之一，因此几乎从发现之初就成为主要的“一线”抗癌药物之一，并持续至今。它对更多类型的癌症（包括白血病、淋巴瘤以及乳腺、子宫、卵巢和肺癌）有效，超过任何其他类别的化疗药物[39-41]。
然而，与大多数其他化疗药物一样，阿霉素的使用伴随着毒性和副作用。其最危险的毒性是累积剂量依赖性心脏毒性（不可逆的充血性心力衰竭），这极大地限制了药物的使用（允许的最高累积剂量为550 mg/m²）。其他副作用包括严重的骨髓抑制、恶心和呕吐、皮肤黏膜效应（口腔炎、脱发、严重的局部组织损伤以及用于药物注射的静脉表面皮肤色素沉着过度）[40,42-44]。
正是阿霉素临床用于如此广泛的肿瘤类型、接受治疗的极大量患者，加上其主要的剂量限制性和累积剂量限制性毒性的缺陷，使得它对我们（和许多人）极具吸引力，选择其作为通过脂质体递送的药物。
科学的支持性理由是，该药物的化学和理化性质以及药物稳定性[17,45]已得到充分确立，药物的ADME（吸收、分布、代谢和排泄）也是常识[46]。
我们选择阿霉素作为候选药物的实际原因包括其独特的光谱（吸光度和荧光）特性，这使得可以轻松准确地定量阿霉素水平、其化学降解、其聚集状态以及其局部环境（pH值和疏水性水平）的变化。阿霉素在486 nm处具有相当高的摩尔消光系数（12,500 OD/M），可通过分光光度法定量，结合二极管阵列HPLC可跟踪某些阿霉素降解产物。阿霉素的另一个主要实际优势是其长波长（>550 nm）和高量子产率的荧光发射。使用荧光检测可将检测限提高100倍以上。荧光激发和发射光谱彼此不同，且均对环境（pH、盐等）敏感。这使得能够在长时间内跟踪阿霉素的PK和BD[12,15,47-51]。
基于以上原因，我们并非唯一选择蒽环类药物作为抗癌药物的人。所有3家专注于脂质体的美国初创公司都在竞争开发3种不同的脂质体蒽环类制剂。位于加州帕萨迪纳的Vestar（后更名为NeXstar）开发了DaunoXome，该产品由Gilead Pharmaceutical销售，最近被Galen收购。位于新泽西州普林斯顿的The Liposome Company （TLC）开发了Myocet（现由Zenous Pharma Sopherion Therapeutics销售）。Gabizon和我与位于加州门洛帕克的Liposome Technology Inc. （LTI）开发了Doxil，该产品由美国俄亥俄州的Ben Venue合同生产组织（CMO）工厂生产，直至该生产点在2011年底经过FDA/EMA测试后关闭（详见下文第7节）。Doxil在美国由LTI销售，LTI于1996年更名为Sequis，后被ALZA收购。ALZA又被强生公司收购，强生在最近的短缺发生前一直在全球销售Doxil（=Caelyx）。
上述三家脂质体公司（NeXstar、TLC和LTI）均未幸存。目前，Doxil是这三者中最成功的产品。
到1987年，基于上述原因，我们清楚地认识到我们的OLV-DOX配方不会成为一个可行的产品。基于从这次临床试验失败中汲取的经验教训，我们提出了预期能克服OLV-DOX所表现出的大多数缺陷的指导原则（见上文）。200-500 nm的尺寸分布、带负电荷和“液态”脂质体的结合导致了这些脂质体被RES快速摄取；（即，无法避免RES）。同样重要的是，在肝脏中，脂质体未被肿瘤摄取，而是被RES巨噬细胞摄取[14]。最终，这些脂质体到达肝脏时药物含量极低，原因是静脉注射后药物快速释放[14,15]。如上所述，这种快速释放是由于在人体血浆中因快速稀释导致大部分药物负载释放所致。此外，如此大的脂质体无法利用纳米颗粒（具有长循环时间）通过肿瘤组织多孔血管进行外渗的特性。这种独特的微观解剖结构可以被用作癌组织的“阿喀琉斯之踵”，以实现大分子和纳米颗粒在肿瘤组织中的选择性积累（也称为被动肿瘤靶向）。后者独特的外渗首次由Matsumura和Maeda[25]描述，并被称为增强渗透和滞留（EPR）效应。
肿瘤血管的微观解剖学及其与肿瘤治疗的相关性也得到了Jain及其同事的广泛研究[52]，而Bassermann[53]描述了转移性生长不同阶段肿瘤及其周围组织血管模式的变化。Jain及其同事还指出肿瘤间质高压（健康组织则无），这减少了低分子量药物从血管向肿瘤的扩散，从而降低了化疗的治疗效果并增加了毒性[54]。
OLV-DOX开发和临床试验的积极方面是，我们受到鼓舞并确信，如果我们克服了临床试验中发现的主要障碍，开发可行的脂质体阿霉素制剂将是可行的。实际上，“胃口随着食物而来”，因为我们决定寻找一种完全替代的脂质体阿霉素配方，这种配方能够到达大多数转移性实体瘤，而不限于位于肝脏的肿瘤。
2. Doxil的开发
2.1. 脂质体阿霉素：期望的产品特性
我们决定，为了使脂质体阿霉素产品成为一种获FDA和EMA批准的抗癌药物，该产品应具备以下特征：
所使用的脂质体应处于纳米尺度（纳米脂质体），以便能够利用EPR效应并从肿瘤处的血管外渗到肿瘤组织中。这类脂质体可被视为一种“纳米药物”。 然而，实现纳米化带来了实现足够水平和稳定性的药物装载的重大挑战。这个问题与纳米脂质体非常小的（纳米）体积有关。对于阿霉素而言，这可能是特别难以克服的障碍，因为达到治疗效果需要高剂量（常规静脉阿霉素治疗为10至50 mg/m² [39-42,44]）。
此外，理化性质，特别是阿霉素的低溶解度，不利于实现足够的被动装载到100纳米脂质体的内水相中。因此，需要新的药物装载方法。 • 为了有效，脂质体应装载治疗所需足够高的药物量到达肿瘤。 • 药物PK和BD应由纳米脂质体控制，即脂质体药物应表现出高度延长的血浆循环时间，这由纳米脂质体载体的长循环时间决定，以便实现药物在肿瘤的积累。 • 药物应通过肿瘤部位的药物释放或装载药物的纳米脂质体被肿瘤细胞内化而作用于肿瘤细胞。
表1描述了我们认为实现治疗有效的、用于肿瘤治疗的被动靶向载药脂质体所必需的要求。
表1：实现对癌组织治疗有效的被动靶向载药脂质体的要求及满足这些要求的物理化学和生物物理解决方案。关于表1的相关参考文献见Barenholz [34]。
2.2. Doxil的开发方式与地点
为了实现以上所有目标并得到一个可行的脂质体阿霉素产品，LTI运用并融合了两项不同的新思路，这两项思路成熟为两项新技术，并形成了两个非常不同且独立的专利族。第一个涉及以符合上述所有需求的方式将药物装载到纳米脂质体中；第二个则实现了延长纳米脂质体血浆循环时间和避免RES摄取。这两项技术均未尝试过。
为了节省时间，表1中描述的4个方面在4个不同的地点同时进行研究：由LTI科学家在加州门洛帕克的LTI实验室；由Gabizon在加州大学旧金山分校（UCSF）的Papahadjopoulos实验室（后继续在耶路撒冷哈达萨大学医院的Gabizon实验室）；在加拿大阿尔伯塔大学Terry Allen的实验室；以及在耶路撒冷希伯来大学-哈达萨医学院我的实验室。
LTI、Terry Allen和Alberto Gabizon/Dimitri Papahadjopoulos致力于实现具有延长循环和避免RES的脂质体，由于其尺寸在纳米范围，可以利用EPR效应。EPR效应预期会导致纳米颗粒从肿瘤毛细血管选择性外渗到肿瘤组织。具有长循环时间和RES回避性的脂质体被LTI的Frank Martin博士称为“Stealth®（隐形）”脂质体，脂质体的这一独特性质被称为“隐形性”，意味着不被RES视为或识别为颗粒物。
与此同时，我和我的学生Gilad Haran（现为魏茨曼研究所教授）开发了一种新的远程稳定装载方法，用于将两亲性弱碱（如阿霉素）装载到纳米脂质体中。该方法满足了表1中描述的所有期望[48,55,56]，因为它使Doxil纳米脂质体能够装载足够水平的药物到达肿瘤部位，并实现人体治疗所需的药物释放[1,50,51]。这种装载允许肿瘤内药物释放，并非像“隐形顺铂”那样是“死胡同”，后者无法使药物对肿瘤细胞具有生物利用度（综述见[1,19,20,34,50,51]）。
2.3. 将阿霉素远程装载到nSSL中形成Doxil
2.3.1. 远程装载的必要性对于设计用于转移性肿瘤治疗的脂质体制剂，静脉（i.v.）给药是唯一选择。这需要使用纳米脂质体，对其而言，高且稳定（在储存和循环期间）的装载是必须的。这并非易事，因为需要结合纳米脂质体极小的纳米级水相体积和达到治疗所需的高剂量阿霉素（约50 mg/m²）。为了克服这些障碍，脂质体内药物浓度必须达到数百mM的范围。然而，由于药物溶解度差，通过被动装载无法达到此浓度。当装载效率低下时，药物/脂质比也会很低。这意味着要么无法达到治疗水平的药物剂量，要么治疗使用此类脂质体将需要给予非常大量的脂质。此外，当装载效率低下时，活性成分损失巨大，且需要去除未装载的药物。因此，使用脂质体作为载体既低效也不经济。
对当时（1986/1987年）现有装载方法的仔细分析清楚地表明，远程（主动）装载方法是实现可行配方的唯一选择，并且在许多情况下是实现所需脂质体内药物浓度（通常定义为药物与脂质摩尔比）的唯一途径[48]，综述见[1,19,20,34]。
Deamer及其同事[57,58]首次证明了通过pH梯度远程装载两亲性弱碱（如儿茶酚胺）。Cullis及其同事将这种方法广泛用于许多两亲性弱碱，包括阿霉素[59]。他们关于通过pH梯度将阿霉素远程装载入脂质体的研究促成了普林斯顿The Liposome Company （TLC）对Myocet的开发。
我们在耶路撒冷使用了另一种远程装载方法，该方法基于硫酸铵的跨膜梯度：[(NH₄)₂SO₄]脂质体 ≫ [(NH₄)₂SO₄]介质，作为将两亲性弱碱有效且稳定地远程装载到预制纳米脂质体中的驱动力[20,34,48,55,56]。这种药物装载方法基于构建具有跨膜（脂质体内高/外介质低）离子梯度的纳米脂质体的策略，该梯度作为远程装载两亲性弱碱药物的驱动力。两亲性弱酸可以通过类似方法远程装载，其驱动力是乙酸钙的跨膜梯度（综述见[32–33]）。
自1987/1988年将这种方法应用于Doxil以来[48,55,56,60]，我们用于装载两亲性弱碱或弱酸的远程装载方法已成功应用于其他药物[20,32–34,48,61,62]。跨膜离子梯度可以被描述为预先构建在脂质体中的纳米化学装载引擎，然后表现出所需的pH和/或离子梯度。这些纳米引擎是通过使用由弱碱（例如硫酸铵）或弱酸（例如乙酸）组成的盐来实现的。这些化合物的电离程度是pH依赖性的，它们的离子化形式（即铵离子和乙酸根离子）具有非常低的渗透系数和辛醇/缓冲液分配系数，因此它们不能或只能非常缓慢地穿过脂质体脂双层，而它们的非离子化形式（以氨气和乙酸为例）具有高渗透系数和辛醇/缓冲液分配系数，因此这些非离子化形式可以相对快速地扩散穿过脂双层到达脂质体内水相（综述见[20,32–34]）。这种离子在脂质体内高/外介质低的跨膜梯度的大小是远程装载的驱动力，因为它们可以与两亲性药物（弱酸与脂质体乙酸根离子，弱碱与脂质体铵离子）交换。梯度形成离子的抗衡离子（例如，铵离子的硫酸根或乙酸梯度的钙离子）可以被选择，以控制药物-抗衡离子盐在脂质体内水相中的聚集状态和沉淀/结晶，从而有助于控制远程装载的效率和稳定性，以及在不同温度下的药物释放速率[20,63,64]。
需要指出的是，这种纳米化学引擎的成功应用得益于纳米脂质体极小的截留水体积（例如，半径为37.5纳米的脂质体为2.209E+5 nm³），这支持了更快和更高的积累，以及药物-抗衡离子盐在脂质体内以结晶或非结晶（无定形）形式沉淀。
一个非常重要的问题是如何选择可以远程装载，特别是通过跨膜硫酸铵梯度远程装载的两亲性弱碱药物。回答这些问题需要对药物进行分类。
2.3.2. 药物分类：与药物递送系统（DDS）开发的相关性1986年，我们寻找一种简单的方法，根据药物的理化特征对其分类，使制剂研发人员能够预测它们最适合哪种DDS，以及应使用哪种药物装载方法将药物装载到DDS中[18,19]，并且在选择脂质体作为DDS的情况下，预测所需药物是否适合远程装载方法。当时，由于可用信息很少，我们提出了一种过度简化的方法，根据药物的油/缓冲液和辛醇/缓冲液分配系数（Kp）将所有药物分为3类。第I类，主要适合乳剂和微乳剂的油相，是具有高油/缓冲液Kp的分子，被认为是高度亲脂性的；这些分子不适合以脂质体作为载体。第II类分子，具有低油/缓冲液分配系数和中到高辛醇/缓冲液Kp；本质上是两亲性的。第III类分子，在两个分配系数上都具有非常低的值，根据定义，是水溶性的。对于一些分子，即那些是两亲性弱酸或弱碱的分子，第II类和第III类之间的分类是pH依赖性的，因为这些分子可以被电离并带电，或不被电离且不带电。只有在电离的pH下，这些分子才至少在一定程度上是水溶性的[18-20,32-34]。尽管使用辛醇/水分配系数来确定分子是否适合存在于脂双层中存在争议，但已明确它指示了分子的跨膜扩散速率和渗透系数（如Stein所讨论[65]），因此它与装载效率、装载稳定性和药物释放曲线相关[65,66]。
2.3.3. 远程装载的优化通过跨膜梯度进行脂质体远程装载是实现脂质体药物达到治疗效果所需的、每个脂质体足够高药物水平的最佳方法之一。这一“突破”使得纳米脂质体药物（如Doxil）的批准和临床使用成为可能，但尚未伴随着深入的工艺理解以预测药物的装载效率。在我们与希伯来大学药学院的Amiram Goldblum及其团队的合作中，我们一直在应用数据挖掘算法处理一个数据库，该数据库基于我们实验室超过20年的脂质体研究经验，涉及9种不同药物的远程装载，并结合了包括分配系数（logP和/或logD）在内的基本物理和理化描述符信息，以及目标分子的非极性和极性表面积（以及两者表面积之比）、其pKa、不同pH下的logD，以及所用脂质体膜的表征。所有这些数据使我们能够建立第一个将药物理化性质和装载条件与装载效率相关联的模型[32]。该研究是首次基于计算模型的尝试，旨在根据逻辑考虑实现候选分子的选择以进行远程装载，并优化装载条件。然而，我们“训练集”的规模较小（仅9个分子），迫使我们使用简化方法进行数据库分析，使用Weka 3.4软件中的J48决策树分类工具，并通过10%留组交叉验证进行验证[32]。在最近的一项研究[33]中，我们将训练集扩展到>60个分子，这些分子用于全球许多实验室进行的366次装载实验。这些扩展信息使我们能够开发脂质体远程装载药物的定量结构-性质关系（QSPR）模型。实验条件和计算化学描述符均被用作自变量，以预测实现高装载效率所需的初始药物/脂质比（D/L）。我们使用先进的“机器学习”方法和五折外部验证生成了二分类（区分高初始D/L与低初始D/L）和连续（预测真实D/L值）模型。二分类模型的外部预测准确率高达91–96%；对于连续模型，预测值与观测值之间回归的平均决定系数R²为0.76–0.79。我们建议QSPR模型可用于识别预期具有高远程装载能力的候选药物，同时优化配方实验的设计[33]。
此外，这种基于计算的方法和建模应有助于设计适合远程装载的前药。
2.3.4. 跨膜硫酸铵梯度驱动的阿霉素装载入nSSL对于将阿霉素远程装载到nSSL中，我们应用了跨膜硫酸铵梯度，条件是[(NH₄)₂SO₄]脂质体 ≫ [(NH₄)₂SO₄]介质（脂质体指nSSL，介质指脂质体外介质）。图1描述了该装载过程的整体机制。药物装载实质上是两亲性弱碱药物与铵离子的碱交换。对于阿霉素，获得了>90%的药物包封率。
图1：阿霉素远程装载入具有跨膜铵离子梯度的nSSL示意图。★代表药物装载过程中发生的过程，▲代表药物释放过程中发生的过程。
阿霉素在脂质体内水相中积累，其浓度达到装载介质中药物水平的>100倍（这解释了为什么我们称之为主动装载，因为它是“逆”着药物浓度梯度进行的）。基于包括X射线衍射在内的各种光谱分析[48,56,61,67]，几乎所有包封的阿霉素都位于脂质体内水相中，并且大部分以聚集或结晶的（阿霉素）₂SO₄盐形式存在。装载实际上是由跨膜铵离子梯度驱动的。
证明铵离子在两亲性弱碱装载中的关键和必需作用的最佳方法是使用离子载体nonactine[34]，它交换铵离子和钾离子（NH₄⁺ ⇌ K⁺）。Nonactine不作为质子离子载体，对与铵离子梯度无关的质子梯度没有影响，并且对质子梯度驱动的远程药物装载没有影响。在nonactine和钾离子存在的情况下，脂质体内水相中的NH₄⁺将被交换释放（外流），同时被摄取到脂质体中的K⁺交换（内流），因此铵离子梯度将崩溃，无论形成铵盐的抗衡阴离子是何种[是无机阴离子（即氯化物、硫酸盐、磷酸盐），还是有机低分子量阴离子（如柠檬酸盐或葡萄糖醛酸盐）[32,34,64]或聚合阴离子（如硫酸葡聚糖[68]、硫酸肝素或硫糖铝）]，两亲性弱碱的装载都将被阻止。
表2[34]表明，阿霉素的装载利用了65%至70%的铵梯度，装载过程释放了65%至70%的包封铵离子。残留的跨膜铵梯度对于装载稳定性至关重要。我们证明了nonactine只有在装载是由跨膜铵离子梯度驱动的情况下，才会诱导两亲性弱碱从纳米脂质体中释放（图1B）。如果远程装载是由不依赖于铵离子的pH梯度驱动的，nonactine将不会引起两亲性弱碱的释放（见表2）。因此，nonactine的作用不同于交换H⁺和K⁺的离子载体nigericin。Nigericin阻止两亲性弱碱装载到具有跨膜质子梯度和铵离子跨膜梯度的脂质体中（表2）。因此，离子载体是评估质子和离子梯度在远程装载中作用的重要分析工具[34]。离子载体也是证明药物-抗衡离子盐的沉淀不是死胡同、药物可以释放并具有生物利用度和有效性的重要工具，正如我们20年前对Doxil所证明的那样[69]。
表2：约100 nm nSSL在阿霉素远程装载前后的跨膜硫酸铵梯度与pH梯度表征[1]。
Doxil的装载稳定性是使用硫酸盐作为铵阳离子的抗衡离子、脂质体膜的脂质组成和温度三者结合的结果，这些因素影响了（阿霉素）₂SO₄沉淀的水平。
跨膜硫酸铵梯度驱动的药物装载与大多数其他远程装载方法不同，因为它既不需要在酸性pH下制备脂质体，也不需要碱化脂质体外水相。
Doxil是跨膜硫酸铵梯度远程装载的一个很好的例子，条件是[(NH₄)₂SO₄]脂质体 ≫ [(NH₄)₂SO₄]介质。图1描述了该装载过程的整体机制。更多细节见[20,32,34,48,55,56,60,61,63,67]。
通过此方法的装载效率及其稳定性取决于： (1) 中性氨（10⁻¹ cm/s）与SO₄²⁻阴离子（>10⁻¹² cm/s）渗透系数之间的巨大（约10¹¹倍）差异。 (2) 初始pH梯度为[H⁺]脂质体 > [H⁺]介质。 (3) （阿霉素）₂SO₄的低溶解度（<2 mM），这也最大限度地减少了脂质体内的渗透压，从而有助于保持脂质体的完整性。 (4) 阿霉素分配系数（Kp）的不对称性（Kp 脂质体膜/外介质 > Kp 脂质体膜/脂质体内介质）（Kp 辛醇/外介质 > Kp 辛醇/脂质体内介质）[18,20]。Kp是括号内定义的两相之间的分配系数；脂质体膜=脂质体膜，介质=水介质（外部或脂质体内），辛醇=本体辛醇相。
阿霉素Kp的不对称性意味着阿霉素在脂质体外介质中的Kp支持与硫酸铵梯度相反方向（即进入脂质体）的流入，而阿霉素在脂质体内水相中的Kp则起到减少分配到膜中的作用，从而降低解吸速率（koff）。阿霉素在脂质体内水相中Kp的降低是由阿霉素远程装载后残留在脂质体内水相中的硫酸铵驱动的。因此，硫酸铵似乎在远程装载和负载药物在脂质体中的保留中扮演多因素角色。对于Doxil，上述四点的相互作用，结合Doxil的膜组成和脂质体大小，决定了脂质体的性能。
中性氨（Pd = 0.12 cm/s）和硫酸根阴离子（Pd < 10⁻¹² cm/s）之间渗透系数（Pd）的巨大差异，结合阿霉素硫酸盐在脂质体内水相中的有效沉淀（凝胶化）、低辛醇/脂质体内水相分配系数以及上述阿霉素Kp的不对称性，都在Doxil的成功中发挥了重要作用。形成铵盐的抗衡阴离子的类型（低分子量无机或有机阴离子，或聚合阴离子）和化合价可用于控制脂质体远程装载的两亲性弱碱的释放速率[20,34,48,64]。
（阿霉素）₂SO₄长而纤维状的晶体在Doxil的冷冻透射电镜（cryo-TEM）中清晰可见（图2A）。当二价硫酸根抗衡离子被单价葡萄糖醛酸根抗衡离子取代时（DOXG，图2B），阿霉素在脂质体内的纳米结晶不会发生。（阿霉素）₂SO₄晶体的形成也得到了小角X射线散射（SAXS）测量的有力支持[67]。相应地，Doxil显示出在2.7 nm处的独特反射，这与在硫酸铵或硫酸钠（各250 mM）中30 mg/mL阿霉素溶液得到的结果相同。这表明这种独特的反射是（阿霉素）₂SO₄结晶的结果。在250 mM氯化铵中的30 mg/mL阿霉素溶液[67]或阿霉素葡萄糖醛酸盐溶液（[70]及图2B）中未观察到这种离散反射。计算表明，（阿霉素）₂SO₄凝胶呈一维棒状，与冷冻透射电镜结果一致。阿霉素的聚集也得到了550/470 nm吸光度比率增加的支持[48]。这种由跨膜铵离子远程装载引起的脂质体内结晶并非阿霉素独有，因为抗氧化剂氮氧自由基两亲性弱碱tempamine在硫酸盐作为抗衡离子时也显示出脂质体内沉淀，而在葡萄糖醛酸盐作为抗衡离子时则无沉淀发生。然而，并非所有两亲性弱碱都像阿霉素和tempamine那样；例如，以硫酸盐形式存在的两亲性弱碱局部麻醉剂布比卡因不会结晶或沉淀[71,72]。上述Doxil的冷冻透射电镜（图2A）显示（阿霉素）₂SO₄棒状物触及囊泡膜，从而迫使囊泡形状从球形变为非球形。DOXG纳米脂质体（图2B）不会发生这种形状变化，其不显示脂质体内药物晶体的存在，并保持球形。然而，尽管Doxil形状改变，Doxil脂质体膜足够坚固以保持脂质体的完整性，正如Doxil能够承受非常高离心力的能力所示[67]。Doxil的这种形状变化可能是导致Doxil激活补体的因素之一（见第3.3节和[22,23]）。关于阿霉素葡萄糖醛酸盐远程装载的PEG化纳米脂质体（DOXG），见第4节和[70]。
图2：比较 (A) 商业Doxil（硫酸阿霉素远程装载的聚乙二醇化纳米脂质体）和 (B) DOXG（葡萄糖醛酸阿霉素远程装载的聚乙二醇化纳米脂质体）的冷冻透射电镜图。两种情况下阿霉素浓度均为2 mg/mL。关于DOXG的更多细节见[70]。
另一个可能影响治疗效果但迄今为止被忽视的问题（尽管它可能与阿霉素等药物高度相关）是它们在低浓度下自聚集的趋势（综述见[17]），形成不同（主要是低）聚合度的寡聚体。只有在更高的阿霉素浓度下才能用肉眼观察到大规模沉淀。后者高度依赖于阿霉素的抗衡离子，从葡萄糖醛酸盐的>100 mM到硫酸盐的2 mM[34,70]。低阿霉素浓度下的寡聚化是由于蒽环类平面芳香环之间π电子相互作用导致的平面环堆叠所致。它发生在所有阿霉素盐中。这种自聚集随离子强度增加而促进。阿霉素二聚体在1 μM时即出现，且聚集体大小随阿霉素浓度增加而增大[17]。这种寡聚化对治疗效果的影响尚不清楚。然而，基于简单的几何考虑，显然非单体形式的阿霉素不能以与单体相同的方式与DNA相互作用，并且嵌入两个DNA链之间的确切位置也应不同（综述见[17]）。因此，药物被肿瘤细胞内化时的形式（单体与寡聚体）可能是影响药物治疗效果的重要因素，寡聚体效果较差。从完整Doxil释放的阿霉素将以其不带电的非质子化形式释放，但在血浆和组织间液中它将质子化并形成氯化物盐。由于巨大的稀释，它应主要是单体形式和/或低聚合度的聚集体，因此药物应保留接近完全的生物活性。然而，以完整Doxil形式被细胞摄取的阿霉素在体内的生物活性如何，这个问题仍未得到解答。
总而言之，虽然新型的、由跨膜硫酸铵梯度驱动的阿霉素远程（主动）装载技术无疑是一项突破，也是Doxil成功临床应用（及其在全球监管机构获得批准）的主要原因之一，但仍有一些关于这种装载方法的开放性问题有待解答。
2.4. 药物释放速率（koff）的作用
脂质体装载的结果，结合脂质体大小、结构、脂质组成和注射部位，将决定脂质体的生物命运以及在血浆和/或脂质体到达的组织中的药物释放速率[18,19]。例如，对于静脉给药的脂质体药物制剂，只有当药物释放速率（由koff决定）慢于脂质体清除速率（kc）时，脂质体才能控制药物的药代动力学和生物分布。当koff ≫ kc时，比率koff/kc是体内药物释放速率的度量。控制这个比率对于在血液或脂质体到达的组织中实现受控药物释放是必不可少的。因此，这个比率也影响脂质体药物的治疗效果。对于快速清除的药物，当koff ≫ kc时，使用脂质体进行药物递送的益处将仅限于药物增溶和分散，而在实现有益的分布和受控药物释放方面则很小或没有。在这种情况下，脂质体药物的性能将与游离药物相似。我们的第一代“失败”的OLV-DOX配方（见上文第1部分）就是一个例子。测试释放速率的一种有效且功能性的方法是功能性测试，例如在细胞培养（体外）中测量阿霉素的IC₅₀的细胞毒性测试。这在Horowitz等人的研究中得到了很好的证明[69]，该研究显示Doxil的IC₅₀（细胞毒性活性较低）比游离阿霉素高约2个数量级，而如上所述并在Barenholz的综述[1]中描述的，我们失败的OLV-DOX的IC₅₀值与游离阿霉素的低IC₅₀值相似。后者表明在体外测试发生的大稀释后药物快速释放。OLV-DOX和Doxil之间的比较表明，Doxil强大的药物保留能力是其高IC₅₀的原因[69]。
然而，就治疗效果而言，相反（非常低的koff）同样“糟糕”甚至更糟。也就是说，当koff太慢且目标细胞不摄取脂质体时，即使装载的脂质体能非常有效地到达并积累在目标组织中，也不会有治疗效果，因为目标组织中的游离（生物可利用）药物浓度将太低而无法产生治疗效果。隐形顺铂脂质体（Stealth cisplatin，不释放顺铂[20,73-75]）就是这种情况的很好例证。
满足纳米脂质体装载的所有要求本身不足以实现足够数量的这些纳米脂质体被动靶向到肿瘤部位。为了满足这一需求，LTI开发了PEG化脂质体（见下文）。使用阿霉素远程装载的PEG化纳米脂质体（Doxil®）使阿霉素在人体内的循环半衰期达到约90小时，并在人体循环中存在超过350小时[50,51]。导致PEG化脂质体开发的过程如下所述。
2.5. 延长纳米脂质体血浆循环时间
阿尔伯塔大学的Terry Allen首次描述了长循环脂质体制剂。她在脂质体中加入了GM1神经节苷脂，在小鼠中它充当“空间稳定剂”。这意味着在小鼠中，包含GM1能显著减少RES对脂质体的摄取，从而实现RES回避。这导致了脂质体的血浆循环时间延长[76,77]。1986年，LTI开始支持Terry Allen在这方面的研究。一年后，Alberto Gabizon（在加州大学旧金山分校Dmitri Papahadjopoulos的实验室）使用氢化磷脂酰肌醇（缩写为HPI）作为空间稳定剂脂质[13]。LTI的科学家尝试了另一种方法来实现长循环脂质体，其脂质组成与Allen和Gabizon研究的不同。他们合成并研究了与已确立的天然脂质种类不相似的新型脂质，而是使用了实际上是脂聚合物的PEG化磷脂[78-81]。所有这三个小组（均与LTI有关）并行研究不同脂质组成的纳米脂质体，重点是具有窄单峰尺寸分布、平均尺寸约100 nm的小单层脂质体。这些纳米脂质体是通过使用具有确定孔径的聚碳酸酯滤膜进行中等压力挤出制备的[82]，该技术由加州大学旧金山分校授权给LTI。这3个实验室使用不同的脂质组成来实现相同的目标：延长循环时间、RES回避和肿瘤内积累。Terry Allen通过包含鞘磷脂以硬化脂质体膜和GM1神经节苷脂作为空间稳定剂来实现。Alberto Gabizon使用氢化磷脂酰肌醇（HPI）作为空间稳定剂，将其包含在由“固态”高Tm脂质与胆固醇混合组成的纳米脂质体中[13]，而LTI科学家则开始使用DSPE-PEG；这是Annie Yau-Yang的想法，结合了Carl Redmann的化学合成[78,79]，综述见[80,81]。LTI并非唯一研究PEG-DSPE的团队；与此同时，Vladimir Torchilin和Leaf Huang及其团队也联合力量进行研究[83]，以及慕尼黑的Gregor Cevc实验室[84]。关于PEG化脂质体的全面综述见Dan Lasic和Frank Martin编辑的《Stealth Liposomes》一书中的许多论文[85]。
开始使用像PEG-DSPE这样的PEG化脂质的灵感和动力很可能来自1970年代Frank Davis、Abraham Abuchowski及其同事的开创性研究，他们预见了聚乙二醇（PEG）与蛋白质偶联的潜力[86]。Abuchowski创立了Enzon公司，该公司将三种PEG化药物推向市场。可以获得各种链长（350–500,000 Da）的PEG聚合物。低分子量药物也被PEG化。然而，迄今为止主要的PEG化产品是一些蛋白质和一种脂质体制剂，即Doxil®（本综述的主题）。对于肽和蛋白质（包括抗体片段），主要使用相对较大的>5000 Da的PEG聚合物。研究发现，PEG化有助于提高安全性和疗效，并降低许多治疗药物的免疫原性[87,88]。PEG化“起作用”的机制被认为是其改变了共价连接PEG残基的分子的理化性质。这可能包括水合水平、构象、静电结合以及疏水/亲水平衡的变化。增加共价连接的PEG的水合水平（每1个环氧乙烷氧原子结合3至4个水分子[89,90]）会诱导结构变化，导致PEG部分体积和膨松度增加。总而言之，这导致了“空间稳定化”，减少了非特异性蛋白质-蛋白质相互作用和非特异性蛋白质-细胞相互作用（图3）。这些物理和化学变化增加了治疗药物的系统滞留时间。同时，它们也会影响治疗部分与细胞受体的结合亲和力，并可能改变吸收和分布模式。PEG聚合物只有2个反应性OH基团（PEG分子的每一端一个），为了防止PEG诱导内部和间交联，其中一个羟基被甲基化，因此蛋白质和脂质是通过甲氧基-PEG（mPEG）进行PEG化的。
图3：（图中未提供具体图注描述，根据上下文推断应为展示聚乙二醇（PEG）空间稳定化作用机制的示意图）。
PEG化蛋白质的成功是推动Doxil®作为首个获FDA批准的脂质体药物和纳米药物（1995年11月17日）成功开发的驱动力。在脂质体中，尝试了350至15,000 Da的PEG链（相当于8至334个环氧乙烷单元），并根据诸如PEG化脂质的代谢和通过肾脏的分泌速率等各种考虑，决定为脂质PEG化选择哪种PEG长度，并优先选择了2000 Da的PEG残基。
2.6. 选择PEG化纳米脂质体作为Doxil的基础
上述每个研究长循环脂质体的实验室都有其关于其独特脂质体制剂的出版物和专利。在1990年代初期，由于各种科学和实际原因（可用性、成本、物种特异性等），基于GM1神经节苷脂的配方被排除在竞争之外[81,91]。在LTI，HPI和PEG-DSPE仍在竞争中。为了让LTI决定将使用这两种脂质中的哪一种用于人体，我们在1991年进行了一项关键的比较PK研究，对象是比格犬[92]。选择犬是因为其更大的血浆容量（约500 mL），在评估“稀释诱导的药物释放”[14,15]方面比血浆容量极小的小型啮齿动物更接近人类。
比格犬阿霉素PK研究清楚地证明了基于2000 Da PEG-DSPE作为空间稳定剂的Doxil的优越性，优于基于HPI作为空间稳定剂的类似纳米脂质体，尽管两种脂质体制剂都远优于游离阿霉素[92]。
使用小鼠腹腔巨噬细胞（从经巯基乙酸盐处理的小鼠腹水中获得）进行体外实验，Doxil脂质体仅表现出与尺寸分布和脂质组成相同但缺少5 mol% PEG-DSPE的脂质体相比40%的摄取[93]。脂质体摄取的减少与血浆循环时间的增加直接相关。PEG-DSPE摩尔百分比的增加可以进一步减少巨噬细胞摄取，并可能减少nSSL的循环时间[73,93,94]。有关PEG-DSPE对纳米脂质体理化效应的更多细节见[47,95]。
2.7. Doxil——每个组分都至关重要
在Doxil中，每个组分都至关重要（图4）并有助于优化性能！！！Doxil是展示脂质物理化学、脂质生物物理学和纳米技术在脂质体药物成功中必不可少作用的极好例子。
图4：Doxil®——聚乙二醇化纳米（<100 nm）单层脂质体结构示意图。基于冷冻透射电镜、SAXS、WAXS、DLS、压缩性以及阿霉素吸光度和荧光数据[48,61,67,90]。
基于Doxil组分的浓度和脂质体大小的计算显示，1 mL商业Doxil分散液包含2.3 × 10⁻¹⁴个脂质体，每个脂质体包含约10,000个阿霉素分子，其中超过95%处于结晶相。
3. Doxil在人体中的表现
3.1. 药代动力学与对肿瘤的被动靶向
在我们耶路撒冷1991-1994年的“首次人体Doxil临床试验”中，Doxil表现出高且选择性的肿瘤定位，该结果发表在《Cancer Research》上[50]。这些数据（如图5所示）是EPR效应在人体中通过被动靶向在肿瘤中诱导的第一个证据[50]。Gabizon及其同事通过对患者活检组织的直接荧光显微镜检查进一步支持了Doxil在人体肿瘤中的积累[96]。
图5：（文中提及但未提供具体图注描述，根据上下文推断应为展示Doxil在人体肿瘤中首次证明被动靶向（EPR效应）的药代动力学或成像数据图）。
上述引用的耶路撒冷初步研究包括53个疗程的Doxil治疗（平均每名患者3个疗程，间隔3至4周）。其目的是确定癌症患者静脉给予Doxil后的血浆药代动力学和阿霉素在恶性积液中的积累，并与当时被认为是“标准治疗”的游离（非脂质体）阿霉素进行比较。这项研究清楚地显示，与给予游离阿霉素后相比，给予Doxil后肿瘤细胞和肿瘤间质液中的阿霉素水平要高得多。使用阳离子交换剂Dowex-50 [97,98]，我们发现Doxil静脉给药后，超过98%的血浆阿霉素是与脂质体结合的。测定了25和50 mg/m²阿霉素剂量的药代动力学。Doxil的血浆消除时间遵循双指数曲线，半衰期中位值分别为2小时和45小时，大部分剂量在较长半衰期下从血浆中清除。还发现了分布容积的巨大差异（Doxil为4 L，而游离阿霉素为254 L）。同样，来自Doxil的阿霉素显示出慢得多的清除率（Doxil为0.1 L/h，游离阿霉素为45 L/h）。
Doxil阿霉素在患者尿液中产生的阿霉素代谢物种类与注射游离阿霉素的患者相同；然而，Doxil组的总每日尿排泄量显著减少。最令人鼓舞的是关于恶性积液中药物水平的结果，其比游离阿霉素给药后高4至16倍。此外，阿霉素给药后，肿瘤中的药物水平在给药后3至7天达到峰值，这意味着肿瘤细胞暴露于药物的时间更长、水平更高，远超过游离阿霉素给药后[50,51,99]。这些数据与我们的临床前研究非常吻合，表明将阿霉素稳定地远程装载到长循环纳米脂质体中很好地实现了阿霉素对肿瘤的被动靶向目标（综述见[99]）。
有关Doxil药代动力学（PK）性能优越性的更多信息，见[51]。该综述总结了在10至80 mg/m²剂量范围内人体中的PK特征。PK有一个或两个分布相：一个初始相，半衰期为1–3小时，以及一个负责大部分清除的第二相，半衰期为30–90小时。50 mg/m²剂量后的AUC大约是游离药物的300倍。清除率和分布容积急剧降低（分别至少降低250倍和60倍）。这些研究表明了利用聚乙二醇化纳米脂质体阿霉素独特的药代动力学参数进行剂量安排的重要性。
3.2. Doxil的生物归宿和作用机制
来自许多实验室的动物数据表明，Doxil以外渗形式作为完整的脂质体在具有“渗漏”血管的肿瘤中积累。对于纳米长循环颗粒，外渗可能是其在肿瘤组织中积累的限速步骤。在肿瘤组织内部，Doxil脂质体通过对流“移动”并在肿瘤中分布。这就是EPR效应[25,26,54,101]。另一方面，游离阿霉素分布到身体的所有组织，肿瘤间质高压减慢了游离药物从血管系统向肿瘤组织的扩散[101,102]。以Doxil形式给予阿霉素的总体效果是，肿瘤组织中的药物水平高于以游离药物形式给予的阿霉素。对于Doxil，几乎所有的血浆循环药物都被测量为脂质体结合药物，它也是以这种形式到达肿瘤。然而，如果在肿瘤部位没有足够的药物释放，尽管有优越的肿瘤定位和降低的毒性，也不会有效果。这一点在动物[49,75,103,104]和人体[105,106]中对隐形顺铂（其尺寸分布和脂质组成与Doxil脂质体相同，但顺铂是被动装载的[73,74]）的研究中得到了很好的证明。
然而，对于Doxil情况并非如此，许多肿瘤动物模型和人体中都显示了其显著的治疗效果（综述见[1,50,99,133]及其中的参考文献）。对于Doxil，可以通过使用HPLC测定阿霉素代谢物的存在和水平来评估阿霉素的释放[50]。原因是阿霉素仅在细胞内被代谢[107]，因此癌症组织中阿霉素代谢物的存在表明药物已从脂质体中释放并被细胞摄取和处理。早在我们在耶路撒冷1991年的Doxil FIM研究[50]中，我们就通过对人体血浆、尿液和肿瘤积液进行HPLC分析证明，虽然在血浆中代谢物水平非常低，几乎所有的药物都是脂质体结合的，但在尿液和肿瘤积液中情况并非如此，其中相对较大比例的药物已转化为阿霉素的正常代谢物[50]。然而，药物释放及其被肿瘤细胞内化的机制尚不清楚。可以提出两种不同的机制来解释Doxil的阿霉素在体内内化到肿瘤细胞中：(i) 完整的Doxil脂质体被细胞摄取，随后发生细胞内药物释放，或 (ii) 阿霉素在肿瘤间质液中释放，随后以游离药物形式被细胞摄取。完整Doxil被肿瘤细胞摄取的贡献必须很小，因为具有与Doxil相似脂质组成和尺寸分布的完整顺铂隐形纳米脂质体并未显示顺铂被肿瘤细胞摄取，因此缺乏治疗效果（见上文参考文献）。因此，我们只剩下第二种选择，即肿瘤细胞摄取在肿瘤间质中释放的药物。导致阿霉素从Doxil中释放的因素可能包括硫酸铵梯度的崩溃或部分崩溃，和/或磷脂酶水解脂质体磷脂导致Doxil脂质体去稳定化（见Mouritsen和Jørgensen的综述[108]），从而使阿霉素释放更快。
然而，对于后一种与磷脂酶相关的药物释放解释存在两个主要反对意见。第一个事实是，与Doxil大小和脂质组成相同的隐形顺铂在体内没有药物释放；第二个是脂质体膜中胆固醇的存在极大地抑制了磷脂酶的活性[108]。因此，我们剩下的默认假设是，硫酸铵梯度的崩溃在Doxil在体内释放阿霉素中扮演更重要的角色。然而，后一种假设尚未得到证实，其证明需要进一步的深入研究。
3.3. Doxil的耐受性
Working和Dayan总结了一份关于Doxil（Caelyx）临床前毒理学的详细报告[133]。在我们1994年发表在《Cancer Research》上的论文[50]中，我们证明了在人体中，Doxil总体耐受性良好，在大多数评估的副作用方面表现出明显优于“标准治疗”阿霉素的优越性。Solomon和Gabizon的综述[99]最近更新了这一点。总体而言，Doxil在很大程度上改善了患者的日常依从性，特别重要的是心脏毒性的大幅降低（与标准治疗相比），这使得可以增加累积剂量，从而延长治疗持续时间。最近在患者中发现了Doxil一种新的主要免疫调节效应。用标准一线铂类化疗治疗卵巢癌在治疗初期有非常高的疗效记录。然而，大多数晚期患者最终出现疾病复发的证据，然后接受卡铂双药治疗。再次治疗时，>15%的患者对卡铂治疗表现出严重的超敏反应（HSRs）。这些反应在一些病例中是致命的，并由针对铂的IgG介导，解释了一些与顺铂的交叉反应性，很少与奥沙利铂交叉。然而，当卡铂与Doxil一起给予时，未观察到这些反应[109]。此外，非常有趣的是，最近发表的一项随机试验发现，卡铂/紫杉醇（Taxol）双药组合比卡铂/Doxil（Caelyx）双药组合更常与卡铂反应相关[110]。也就是说，Doxil似乎具有免疫抑制作用，可预防/减少对卡铂的继发性（IgG介导的）超敏反应。
然而，尽管Doxil总体上比阿霉素耐受性更优，但仍观察到Doxil有两种非典型的副作用，这些副作用在游离药物标准治疗中不常见。第一个也是更主要的副作用导致2级或3级脱屑性皮炎，被称为掌跖红斑感觉迟钝（PPE）或“手足综合征”。PPE在我们的首次FIM研究中已有表现[50]，最近由Solomon和Gabizon综述[99]，表现为皮肤发红、压痛和脱皮。这种副作用的发生率限制了Doxil可给予的剂量，与相同治疗方案中的阿霉素相比。PPE的一个糟糕方面是其严重程度随剂量增加而增加，并且在治疗间隔为3周时比4周时更明显。到目前为止，除了上述增加治疗间隔外，还没有完全解决此效应的方法[99]。第二个副作用是与输注相关的反应，表现为潮红和呼吸急促；这是一种独特的免疫不良反应现象，Doxil像许多其他纳米系统一样可能引发。它实际上是补体激活相关假性过敏（CARPA）。CARPA是一种急性超敏反应或输注反应，之所以这样称呼是因为在其病理机制中起因果作用的是补体激活而非IgE结合[111]，综述见[22,23]。CARPA可以通过减慢输注速度和预先给药来减轻。更多关于Doxil耐受性的细节可在[50,99]、Doxil主页（www.doxil.com）和药物在线（www.drugs.com/pro/doxil.html）找到。很有可能减少这两种副作用，特别是减少或克服不良的PPE效应，可能会改善Doxil的整体性能并扩展其应用。
3.4. Doxil的治疗适应症
本综述将不详细讨论Doxil的临床表现，这个主题在许多出版物和报告中已有广泛覆盖。很好的起点是Solomon和Gabizon的综述[99]以及两个更新的高度相关的网站：Doxil主页（www.doxil.com）和药物在线（www.drugs.com/pro/doxil.html）。维基百科中题为“脂质体蒽环类药物的临床药理学：聚焦聚乙二醇化脂质体阿霉素”的Doxil条目也很有帮助。截至今天（2012年3月6日），Doxil在谷歌搜索显示501,000条结果，在谷歌学术搜索显示7590条，在PubMed搜索显示46,166条。
以下是美国FDA和/或欧洲药品管理局（EMA）批准的Doxil适应症总结，附批准年份。
·艾滋病相关的卡波西肉瘤：优于以前的常规疗法（1995年）。
·复发性卵巢癌：优于对照药物（拓扑替康）的疗效和改善的安全性（1998年），首次由Gordon等人证明[112]（图6）。
·转移性乳腺癌：与游离阿霉素等效的疗效和降低的心脏毒性（2003年）。
·多发性骨髓瘤：与游离阿霉素联合方案等效的疗效和改善的安全性。与硼替佐米联合优于单药硼替佐米（2007年）。
图6：Caelyx™ (=Doxil) 在卵巢癌中优于拓扑替康[1]。
此外，关于心脏功能，Doxil在所有测试环境中均显示与游离阿霉素相比心脏毒性显著降低（2000年）。
4. Doxil的重要经验与下一代Doxil样脂质体将是什么样子？
总之，抗癌纳米药物Doxil在多种肿瘤条件下显示出优于游离阿霉素（标准治疗）的临床表现，这得益于其独特的与EPR相关的药代动力学和生物分布，从而减少了副作用（尤其是心脏毒性的大幅降低至关重要）并改善了患者的整体依从性和生活质量。这些优势，结合阿霉素远程装载到长循环纳米脂质体的方式，在特定肿瘤（如卵巢癌）中提高了抗肿瘤治疗效果，优于传统阿霉素。这解释了为什么在>12种批准临床使用的脂质体药物中[113]，Doxil的临床使用最为广泛。
基于Doxil的成功，各种新的药物配方，包括改良的Doxil，或其他基于类似隐形脂质体并装载其他药物或药物组合的纳米药物，目前正处于不同的开发阶段。这些新型纳米药物配方应减少（或消除）Doxil的副作用，即PPE和急性输注反应。减少这些副作用的一种方法是用葡萄糖醛酸盐取代用于远程装载的铵离子的硫酸根抗衡离子，从而略微缩短脂质体阿霉素的半衰期。使用具有与硫酸盐相似渗透系数但不会诱导脂质体内药物沉淀的葡萄糖醛酸盐，会导致阿霉素循环时间略有缩短，但在荷瘤小鼠中不会损失治疗效果[34,70]。这种相对较小但明显的PK效应预计会减少阿霉素在皮肤中的积累，从而降低PPE的严重程度。其他扩展和改善基于纳米脂质体的抗癌治疗以及更好地控制药物释放的方法（综述见[34]）可以通过以下方式实现：(a) 使用外部手段，如热疗[114,115]或聚焦超声[75,103,116]；(b) 通过在一个脂质体中远程装载两种具有协同作用的药物进行药物组合[117,118]；以及 (c) 结合两种不同的治疗模式，例如Doxil和白细胞介素-2（IL-2），用于基于脂质体的免疫治疗[119]。激活宿主免疫机制以在化疗后摧毁残留肿瘤细胞的概念早已被提出。使用DOX-IL-2组合源于这样一个事实：当以Doxil形式给药时，阿霉素对免疫系统的毒性远低于游离药物，因此，在Doxil之后递送脂质体IL-2是高度有效的。这种化疗-免疫治疗组合背后的理念是，Doxil将处理大部分的肿瘤负荷，而由IL-2引发的免疫疗法将激活完整的免疫系统，使其能够杀死残留的肿瘤细胞[119]。使用脂质体IL-2可降低IL-2的毒性并延长IL-2的循环时间而不损失其效力[120,121]。
一个非常有前景的方法是最近Jain及其同事使用的方法[122]。据此，使用抑制胶原I合成的氯沙坦来改变肿瘤间质环境，导致Doxil（和其他纳米颗粒）在肿瘤中的积累增加，从而提高Doxil的治疗效果。更多已使用或提议用于改善Doxil性能的方案见Solomon和Gabizon[99]。
Doxil开发的故事传递了两个重要信息。第一个是Doxil的成功开发为肿瘤治疗的主要改进开辟了道路，并成为被称为纳米医学的新领域的黄金标准。第二个是开发如此复杂的药物系统需要一支高度多学科的团队，能够以整合的方式处理所需的专业知识[1,19,34,100,123]。同样重要的是要认识到，理解和优化利用理化原理对于成功开发此类复杂药物产品至关重要。
5. Doxil的历史视角
前Doxil时代（脂质体阿霉素被动靶向肝脏，即OLV-DOX）
6. Doxil的知识产权（IP）方面
需要指出的是，Doxil® 基于两个专利族。然而，并没有直接针对Doxil的专利。一个族涵盖了跨膜梯度驱动的两亲性弱碱（如阿霉素）的远程装载[55,56]，而第二个则涉及脂聚合物PEG-DSPE作为脂质体膜脂质成分对延长脂质体循环时间和RES回避的贡献[78]。
从1988/1989年提交这两个专利族的申请到1995年11月Doxil获得批准，大约花了7年半的时间。远程装载专利在美国延长至2010年3月9日，因此Doxil在美国享受了14年的专利保护。目前，在大多数国家没有保护Doxil®的知识产权。
7. 脂质体中的通用阿霉素（Doxil-like）
Doxil®在美国的专利保护已于2010年3月结束，而Doxil/Caelyx销售良好（每年超过6亿美元），那么为什么仍然没有FDA或EMA批准的通用型聚乙二醇化脂质体阿霉素（PLD）样产品呢？
除了FDA批准通用型Doxil的复杂性外，当前情况甚至更为复杂。Ben Venue Laboratories（唯一供应商）已停止Doxil的生产，原因是FDA指出其工厂存在GMP缺陷。自2011年夏季以来，Doxil一直短缺；据报道，11月份仅在美国就有约2700人在等待Doxil治疗。Ben Venue发言人Jason Kurtz表示，公司没有恢复生产的时间表（有关Doxil短缺的更多信息，请参见http://www.outsourcing-pharma.com/Contract-Manufacturing/Doxil-supplies-going-further-but-J-J-GMO-uncertainty-remains 以及许多其他网站）。这种短缺使得通用型Doxil的“回报”更具吸引力。
缺乏通用型Doxil的解释是，与简单的药物，甚至与抗体等生物制品相比，开发此类通用产品要困难得多，因为除了批准通用低分子量药物和生物制品所需的条件外，批准通用脂质体药物还需要满足额外的物理和理化要求。
Jiang等人[124]来自FDA仿制药办公室的一篇近期综述讨论了通用型Doxil批准的复杂性。最好逐字引用这篇论文的摘要（我完全同意其观点）：
“开发纳米颗粒药物递送系统的一个挑战是理解可能影响其体内性能的关键理化特性，并建立能够充分表征体外和体内特性的分析技术。Doxil®/Caelyx®（聚乙二醇化脂质体阿霉素）是领先的已批准用于癌症治疗的纳米颗粒产品之一。在本综述中，我们以PLD为例，说明关键体外和体内特征的识别。以下特征，包括脂质体组成、封装药物的状态、脂质体内环境、脂质体尺寸分布、层数、脂质体表面接枝的聚乙二醇、表面电位或电荷以及体外泄漏，被认为是证明PLD超分子结构和确保药物一致递送至癌组织的关键。讨论了相应的分析技术以确定这些脂质体特征。此外，PLD的体内稳定性可以通过血浆中游离和脂质体封装药物的药代动力学来确定。更好地理解关键的体外和体内脂质体特征，再加上分析技术的改进，将有助于实现通用脂质体产品。”
2010年2月，FDA发布了一项非约束性建议，涉及脂质体中的通用阿霉素（http://www.fda.gov）。
在本综述中，我将仅关注与Doxil理化性质及其性能相关的一些特殊方面。有关FDA通用型Doxil指南草案的详细信息，请参见FDA网站（http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM199635.pdf）。FDA文件中的引文采用斜体，我的评论采用常规（罗马）字体。
“表面结合的甲氧基聚乙二醇（MPEG）聚合物涂层保护脂质体免受单核吞噬细胞系统（MPS）的清除，并增加血液循环时间。已知PEG层厚度受热力学限制，估计在几个纳米的数量级。应测定PEG层厚度。”
PEG-DSPE的甲氧基PEG（2000 Da）残基可以呈现蘑菇状（在低PEG-DSPE摩尔分数时）或在较高摩尔分数时转变为刷状构象，这涉及PEG-PEG相互作用[47]。PEG层厚度的实际测量并不容易，因为PEG部分在冷冻透射电镜中不显示，其在SAXS测量中的对比度也较差，需要复杂的方法学和软件（更多细节见[118]，本期）。
“电气表面电位或电荷脂质体表面电荷会影响清除、组织分布和细胞摄取。应测量脂质体表面电荷。”
脂质体表面电位和ζ电位并不相同，因为它们是在距离脂质/水界面（磷脂头基）不同位置测量的。两者通过基于两种不同方法的方法测量。表面电位的位置固定在磷脂头基，而ζ电位可以在相对于磷脂头基的不同位置。例如，脂质体被PEG化脂质完全包被会将测量位置移至远离磷脂头基的地方，从而减小测量的脂质体ζ电位的幅度（电荷隐藏效应）。然而，PEG部分不影响表面电位。实际上，PEG-DSPE由于其磷酸二酯部分而引入了负的表面电位（更多细节见[90,95,125]）。
“多种条件下的体外泄漏应研究体外药物泄漏测试，以表征脂双层的物理状态和封装阿霉素，以支持在一系列生理条件下不存在不受控制的泄漏，并等效地将药物递送至肿瘤细胞。以下是一些建议条件的示例。”
测定Doxil和通用型Doxil的体外释放对于确定其在储存期间和长血浆循环时间内的化学和物理稳定性至关重要。
体外和体内药物释放曲线均依赖于膜脂组成和物理状态、膜脂的完整性以及残留跨膜硫酸铵梯度的稳定性。两者中任一降低都可能是破坏性的，因为它可能降低治疗效果，甚至可能是危险的，因为它可能导致药物大量释放到血浆中。虽然测量脂质完整性很简单，需要简单的分析跟踪脂质稳定性，主要使用带有合适ELSD或Corona检测器的HPLC或LCMS，然而，测量残留铵梯度的大小和稳定性则不那么直接。铵离子可以通过HPLC或特定电极（作为铵离子或氨气）测定[48]。硫酸根离子应通过HPLC测定。测定硫酸根与磷脂比率的变化是衡量Doxil脂质体膜完整性的良好指标，因为硫酸根的渗透系数非常低，远低于铵离子（低10⁵倍）或氨气（低10¹¹倍）[20]。值得注意的是，在长期储存期间或其在体温（37°C）下血液循环期间，氨气可能从Doxil中释放出来，导致铵梯度幅度减小。
“具有硫酸铵梯度的活性脂质体装载过程
为了满足组成等效性和其他等效性测试，ANDA申报者需要使用具有硫酸铵梯度的活性装载过程。主要步骤包括 1) 形成含有硫酸铵的脂质体，2) 减少脂质体尺寸，3) 创建硫酸铵梯度，以及 4) 活性药物装载。活性装载过程使用铵梯度。”
“内部环境（体积、pH、硫酸根和铵离子浓度）
这可以使用吖啶橙远程装载来测量[48,63]。
脂质体的内部环境，包括其体积、pH、硫酸根和铵浓度，维持着沉淀的阿霉素。脂质体组成部分描述的总浓度和游离浓度测量允许推断脂质体内部的浓度。”
FDA要求处理Doxil制备的所有4个步骤。如果所有这些步骤都顺利进行，预计超过95%的阿霉素将被脂质体包封。通过硫酸铵跨膜梯度进行的主动（远程）装载是装载过程的核心。它应能实现几乎完全且稳定的药物装载，同时在肿瘤处实现药物释放。铵梯度是远程装载的驱动力[19,20,32–34,48,64]。跨膜铵离子梯度可以通过铵和/或氨电极[48]专门测试，铵离子也可以通过HPLC测定。铵离子测量需要特别的注意事项。为了测定脂质体内铵浓度，需要测定截留水体积。考虑到制备过程中的损失，必须根据总脂质HSPC（通过HPLC测量）或总磷脂（通过磷测定法测量）的量来量化铵的量。有关这些质量控制测定的更多细节，请参见[16,134]。
“Doxil中的阿霉素主要以阿霉素硫酸盐沉淀的形式存在于脂质体内部。通用盐酸阿霉素脂质体必须在脂质体内部含有等价的阿霉素沉淀。”
应在分离未包封和包封药物后测定总的和Doxil包封的阿霉素。游离未包封的阿霉素可以通过凝胶渗透色谱法或Dowex阳离子交换剂与脂质体分离和去除[48,97,98]。然后应使用正确的HPLC程序测定阿霉素。
“硫酸根离子是重要的抗衡离子，用于微调装载稳定性（见[32,48,64]）。
硫酸根离子浓度可以通过带有合适检测器的HPLC测定（见上文）。”
满足这些要求需要以下步骤：通过HPLC测量硫酸根离子测定脂质体截留体积，或不太优选地，通过铵电极[48]或HPLC测定铵离子。在通过彻底透析和/或凝胶渗透色谱法去除非包封的硫酸铵后，应测定包封的硫酸铵水平，然后通过HPLC测定脂质体内硫酸根浓度。
“Doxil脂质体内pH应通过放射性甲胺的脂质体内外分配来测定（上表2和[34]）。也可以应用类似方法。然而，对于Doxil，使用生色团或荧光团进行此测定并不简单，因为阿霉素具有高背景吸光度和荧光[34]。”
“脂质体形态和层数
应测定脂质体形态和层数，因为药物装载、药物保留和药物从脂质体释放的速率受层数影响。”
*要求显示脂质体内阿霉素-硫酸盐沉淀/凝胶的等量和形状是重要的，因为这种沉淀/凝胶与储存期间和血液循环期间保持装载稳定性高度相关。可以通过冷冻透射电镜和SAXS测量[61,67]以及上图2进行半定量测定。*
硫酸盐作为铵抗衡离子的相关性在Mamida等人最近的出版物[126]中得到了很好的证明，他们在小鼠乳腺癌模型和无肿瘤猴子中比较了Doxil与6种不同的基于硫酸葡聚糖（DSAS）作为铵抗衡离子的聚乙二醇化脂质体阿霉素制剂的性能。抗衡离子的改变导致阿霉素血浆PK与Doxil非常相似。以肿瘤体积减小表示的治疗效果对于基于DSAS的配方略好一些，但代价是天冬氨酸转氨酶水平（肝毒性标志物）增加了3.2倍。此外，心肌肌钙蛋白I水平（心脏毒性标志物）增加了5.0倍，骨髓细胞减少（骨髓毒性标志物）增加，以及肾毒性增加[126]。这项研究很好地证明了我们上面所说的：对于Doxil，每一个细节都至关重要！！！
“脂双层相变
脂双层相变的等效性将有助于证明双层流动性和均匀性的等效性。脂质成分和脂质体的相变谱应与Doxil相当。”
HSPC是Doxil脂质体的主要膜成分，具有凝胶[固态有序（SO）]到液态[液态无序（LD）]的相变，Tm约为53°C[47]，并且此Tm受约5 mol%的PEG-DSPE影响不大。然而，在Doxil高摩尔百分比的胆固醇存在下，正如预期的那样，没有SO到LD的相变[95]。Doxil的热致行为可以通过各种方法测定，最直接和首选的方法是差示扫描量热法（DSC）[127]。
“脂质体尺寸分布
脂质体尺寸分布对于确保等效的被动靶向至关重要。ANDA申报者应选择最合适的粒度分析方法来确定测试产品和参考产品的粒度分布。研究的脂质体产品小瓶数量，对于测试产品和参考产品，应各自不少于30个（即，每三批中各不少于10个）。
Doxil尺寸分布是一个非常关键的问题，因为尺寸可能对脂质体PK和BD产生重大影响，从而影响治疗效果和毒性（见下文）。同样相关的是观察到游离药物的存在可能诱导脂质体聚集和/或药物聚集体的形成。这两种类型的聚集体都可能诱导补体激活[23,111]。
然而，尺寸分布测定并非易事，目前可用的方法中没有一种能提供完整和绝对的数值。目前使用的每种方法都有一些缺陷和/或无法看到全范围[128]及其列出的参考文献。对于Doxil预期尺寸范围内的脂质体，两种最常用的尺寸测定方法是动态光散射（DLS）和冷冻透射电镜（后者主要是一种支持性的确认方法）。通过DLS测定尺寸是基于测定纳米颗粒的扩散系数，该系数由自相关曲线的指数衰减计算得出，据此确定颗粒的半径。为了获得最佳结果，执行DLS测量的仪器必须获得测量溶液的温度、折射率和粘度信息。如果脂质体群体尺寸非常均匀，尺寸测定可能是一个完美的方法。但在大多数情况下并非如此，脂质体群体具有尺寸分布，因此有许多自相关曲线需要解卷积为其单独的成分。这种解卷积过程并不简单，需要应用数学模型。然而，可用的模型不止一种，每种模型可能使用不同的数学方法。即使对于同一模型，也没有唯一的解。通常尺寸测定读数以3种不同的方式呈现：(1) 根据光强度分析的平均值和分布（这更多地受较大颗粒影响，因为强度随其尺寸的6次方增加而增加）；(2) 根据体积的颗粒平均值和分布（这再次赋予较大颗粒更多权重）；或 (3) 根据颗粒数量的平均值和分布。只有当这三种类型的读数非常相似时，才能认为该群体在尺寸方面是均匀的。三种读数之间的差异越大，脂质体群体越不均匀。因此，当给出尺寸测定数据时，评估者必须知道分析是否针对温度、折射率和粘度进行了校正，并且同样重要的是，使用了三种读数中的哪一种（按强度、体积或数量）。最好在产品描述中包含这三种读数。
Cui等人评估了尺寸分布对Doxil样制剂的影响[129]。他们制备了比Doxil小的脂质体（75 nm，300 mM硫酸铵），其脂质组成与Doxil相同。这些脂质体在正常小鼠中显示出相同的PK参数，但75 nm脂质体的药物释放更快。在S-180肉瘤荷瘤小鼠中，Doxil脂质体具有比75 nm Doxil样脂质体更高的AUC和Cmax。75 nm脂质体在治疗上更有效，但毒性也更大（基于体重下降）。然而，在这篇具体的出版物[129]中，没有足够的信息来评估尺寸分布测定的质量和精确度。因此，不建议将此信息用作通过/不通过的变量。
8. 个人感悟
我无法在结束这篇关于Doxil的综述时不加入个人感悟。Doxil®的开发之路涵盖了我职业生涯的主要部分。自1979年以来，我一直在从事脂质体药物的开发。然而，如果没有我多年来在脂质生物化学和生物物理学领域基础研究方面的重大投入和努力，我无法完成所有这些应用性多学科工作。当我还是生物学二年级学生时，为了养家糊口，我开始在Shimon Gatt的实验室工作，研究磷脂和鞘脂酶学，后来我在他的指导下完成了研究生学业（硕士和博士论文）。我涉足脂质生物物理学是由于需要更好地理解脂质酶学。大多数脂质不溶于水，为了作为底物，需要借助洗涤剂（混合胶束[130]，综述见[131]）或以脂质体形式[132]将其分散在水相中。当我在Gatt实验室工作时，由Alec Bangham在1960年代中期引入的脂质体仍处于起步阶段。脂质酶学将我引入脂质生物物理学，因此我博士论文的很大一部分致力于脂质生物物理学的不同方面，在Rex Dawson和Peter Quinn（Dawson实验室的脂质单层膜）以及Alec Bangham实验室（脂质体）的指导下进行。这两个小组都是英国剑桥Babraham动物研究委员会研究所的一部分。确实，我在Babraham的研究对我的博士论文和之后的科学生涯产生了重要影响。我的博士论文于1971年提交并获得了耶路撒冷希伯来大学评议会批准。从那时起，我的独立研究就集中在脂质生物物理学和“脂质体学”的各个方面。我很幸运能够在弗吉尼亚大学（UVA）医学院生物化学系的Tom Thompson那里进行了首次长期的学术休假（1973–1975年），并与UVA团队（包括Tom Thompson、Chien Huang、Burt Litman、Dow Lichtenberg、Rodney Biltonen等其他人）保持多年的互动。在1970/1980年代，UVA是世界领先的膜生物物理学实验室之一。在UVA，脂质体通过许多物理方法进行表征（前所未有），几乎达到大分子的水平。
1979年，Alberto Gabizon（当时是一位来到哈达萨大学医院肿瘤科的年轻医学博士/哲学博士）和我开始致力于开发用于人体的脂质体阿霉素制剂（综述见[1,7]）。我的这一研究方向在1984年与加州大学旧金山分校（UCSF）的Dimitri Papahadjopoulos会面后得到了加强，他是我长期的“脂质体学”朋友和同事。自1973年我在UVA时起，我们就在各种科学会议上相识。UVA的膜研究团队与UCSF的团队竞争激烈，尽管两个团队的兴趣只是部分重叠。UVA小组主要关注脂质生物物理学和物理化学，而UCSF（Dimitri Papahadjopoulos）小组则更多地关注与生物学相关的主题，如融合、脂质体与细胞的相互作用等。每当Dimitri和我见面时，我们都会广泛谈论科学（主要是膜和脂质体研究），以及文化、艺术、历史、美食和美酒。Dimitri不断告诉我关于Liposome Technology Inc. （LTI）的情况，这是一家位于加州门洛帕克的初创公司，专注于脂质体为基础的诊断和医学应用的研发。Dimitri和他的前学生Frank Szoka是LTI的科学创始人和导师。Nick Arvanitidis被Dimitri说服担任LTI的首席执行官，Frank Martin，Dimitri的另一名学生，是LTI的第一位员工。Nick带来了Sally Davenport、Carl Grove和Kathy，他们曾在Nick之前的研发公司工作，来处理LTI的行政管理。Dimitri问我是否有兴趣在LTI度过一个学术休假。他告诉我这是一个巨大的挑战，在智力上非常有回报。他已经知道我们在药物递送领域的努力，并且我们即将进行脂质体阿霉素的“首次人体”实验，但他对我的脂质和脂质体生物物理学及物理化学知识和经验更感兴趣，因为他深知这是开发脂质体产品的核心所在。我犹豫了，因为到目前为止，我的大部分研究都是学术性质的。Dimitri建议我到他在UCSF的实验室，做一个研讨会，他会安排我访问LTI，以便我自己判断在LTI度过学术休假是否对我有吸引力。我还收到了LTI首席执行官Nick的正式邀请，访问LTI并待上一天。由于事情看起来很严肃，我咨询了我的妻子Hanna，她支持并鼓励我认真评估这个有趣的提议。我知道这对她来说并不容易，因为这意味着我将长时间离开家（在加利福尼亚），而她将独自照顾我们的四个女儿、狗和我们的家。在她的鼓励下，我接受了Dimitri和Nick的邀请去访问。我在Dimitri处和LTI的访问安排在1984年12月。我在Dimitri实验室的研讨会是关于鞘糖脂生物物理学的，随后与Dimitri实验室的人员进行了讨论。第二天，Dimitri开车送我到门洛帕克的LTI，那时那是一家约40人的初创公司，我在那里待了一整天，与公司的许多员工交谈。在与Nick和一些好酒共进晚餐后，我和Nick进行了一次长时间的交谈，Nick试图说服我在LTI度过我的学术休假。Nick是希腊人，因此他很好地理解了地中海的心态和思维方式，所以我们彼此很了解。在没有深入细节的情况下，可能是在Nick持续提供的好酒的帮助下，我同意认真考虑他的提议。Nick在那天晚上很晚的时候开车送我回旧金山的酒店。兴奋加上10小时的时差让我很难入睡。
回到以色列后，我与Hanna讨论了Nick的提议，在她的支持和鼓励下，我接受了。我告诉Dimitri和Nick，除非LTI支持我们在耶路撒冷的OLV-DOX项目，否则我不能去。没过多久，LTI董事会就决定接受我的要求。Frank Szoka、Dimitri和Nick在董事会会议后于以色列时间凌晨2点打电话给我，把我叫醒，告诉我LTI已经接受了我的请求。但他们的条件是我要保证持续参与他们相关的研究和研发项目。LTI的支持意味着在当时被认为是一笔大额的资金，这将使我们能够继续我们的OLV-DOX研究，特别是“首次人体”临床试验。所以，看起来我们达成了协议，具体的小细节仍有待最终确定。大约在那时，另一家美国公司与我接洽，提议从我们这里授权OLV-DOX技术和产品。他们的提议很有诱惑力，因为涉及我认为当时的一大笔预付款和合理的版税。然而，这家公司要求我们只作为顾问，不参与产品的研究和研发。我不喜欢这个想法，因为我们将该产品视为我们必须培育成熟的“孩子”。与另一家公司相比，我更倾向于LTI，因为我相信我们对该产品开发的日常参与对项目的成功至关重要。未来证明我是对的。所以我说服了耶路撒冷希伯来大学研发公司Yissum的首席执行官Moshe Vigdor接受LTI的提议。没过多久，Nick就来到以色列，完成了LTI与Yissum的第一份授权协议，这是一份持续了21年的总协议的基础。它始于Nick担任首席执行官的LTI，并一路延续到强生公司。在Doxil获得FDA批准后，LTI的管理层发生了变动，来自UCSF（曾参与Doxil临床开发）的顶级肿瘤学家Craig Henderson成为LTI的首席执行官。随后公司更名为Sequis。Craig等人将Sequis卖给了加州山景城的ALZA（一家主要的药物递送公司），Doxil（由于其日益增长的销售额）是这笔交易的主要原因之一。没过多久，ALZA就被强生公司收购，在此之前强生几乎不涉足药物递送系统。再次，Doxil是这笔交易的主要原因之一。其余的都成了历史！！！
在这48年精彩活跃研究的漫长旅程中，我遇到了许多迷人的人物，我与他们互动和/或合作，其中许多人成为了终生的朋友。我从事脂质体阿霉素研究的15年，其中50%致力于Doxil的开发，这是一段我永远不会忘记的独特经历。它使我能够参与一个非常复杂和错综复杂的药物开发过程，并见证其在全球获得批准。在满足感方面的回报是我其他任何成就都无法比拟的。我正在努力将我的经验（部分总结在本综述中）传授给全世界的许多学生和其他人。
