GE Healthcare Holdings, Inc.

1.介绍 近几十年来，生物制药的制造有了显著增长。与小分子不同，生物制药提供更特定的目标相互作用，甚至是个性化的选择，因此需要日益复杂的制造过程。为了确保产品的质量和功效，在整个过程中对过程参数和关键质量属性（CQAs）进行分析测量。美国食品药品监督管理局（FDA）引入了过程分析技术（PAT）的概念，鼓励行业通过在线监测将产品质量纳入过程设计，这为质量由设计（QbD）奠定了基础 。 PAT 的目的是通过监测、分析和控制过程来提高制造过程的可重复性并确保产品质量。PAT 在不同阶段使用，如早期发现和开发，以更好地理解过程并在制造阶段实现更好的控制。在生物制造中，理想的 PAT 场景是端到端应用，从原材料、瓶解冻、种子培养扩增、纯化到包装和标记的药品实现实时产品释放。本综述将关注单克隆抗体（mAbs）和细胞及基因治疗产品制造过程中出现的 PAT。 由于 mAbs 使用的增加，人们越来越有兴趣为这些产品开发可靠和可扩展的制造过程。为了实现如此强大的过程并保证产品质量，越来越多的趋势是将 PAT 应用于制造过程。图 2.1 提供了在 mAbs 生产中使用的 PAT 的概览。监测技术是 PAT 工具的重要组成部分，因为它们在收集过程数据方面至关重要。这些信息可用于开发模型和算法。此外，传感器有助于设计有效的操作方法，以控制操作变量。这有助于提供预验证数据并缩短发布时间。 图 2.1 单克隆抗体生产过程中的过程分析技术（PATs）概述。对于上游过程，用于测量细胞物理化学条件的PATs包括溶解氧、pH值、溶解二氧化碳、渗透压、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸和乳酸，这些并不直接提供产品质量信息；用于测量生物量、细胞状态和产品质量的PATs包括活细胞密度、存活率、代谢状态、形态、单克隆抗体滴度、聚集体水平和糖基化。软传感器被开发出来，将过程参数的传感器读数与产品质量和细胞状态联系起来。对于下游过程，用于测量产品物理化学环境以确保其稳定性的PATs包括pH值和电导率；直接测量产品质量的PATs包括蛋白质浓度、聚集体和片段水平、粒径、电荷变体、去酰胺化异构体、DNA、宿主细胞蛋白（HCP）、肽序列和更高级别的蛋白质结构。同样，软传感器被开发出来，通过建模将过程参数与产品质量联系起来。 开发一个定义良好的制造过程不仅限于 mAbs 的制造。在不断发展的细胞和基因治疗领域，这也是一个关键概念。与哺乳动物细胞相比，干细胞的培养与更多挑战相关，细胞和基因治疗产品的制造过程直接影响产品质量。在维持这些细胞的质量和多能性的同时实现细胞的充分扩增，对于提供安全有效的产品至关重要。通过使用不同的生物反应器，制造过程正在实现自动化。尽管有可用的技术，但由于缺乏适当的监测系统，过程并未精确定义。具体来说，为了优化大规模生物反应器（大于 5 L）中诱导多能干细胞（iPSCs）的制造过程并控制干细胞的分化，需要新的监测技术。传感器对自体（患者接受的细胞来自他们自己）和同种异体（患者接受的细胞来自另一个人）治疗都有益。在必须对单个患者进行质量控制的自体治疗中，传感器的应用更为关键。FDA 的 PAT 倡议导致了许多探索新型传感和分析工具的努力。然而，行业在将它们纳入常规操作方面进展缓慢。 作为 PAT 使用的传感器和分析方法范围广泛，可以根据它们与产品质量的相关性进行分类。以下是常用于分类 PAT 的方法： 1.用于测量和监测单元操作的生理化学条件的最广泛使用的参数是 pH、温度、溶解氧（DO）、溶解二氧化碳（DCO2）和葡萄糖，这些对生物反应器至关重要。对于色谱和过滤步骤，最常用的参数是 pH 和电导率。这些分析工具提供有关产品或细胞环境的信息，而不是产品质量本身。传感器和控制装置到位，以确保细胞或产品在所需的生理化学条件下保持生产力或稳定性。 2.产品质量指示 PAT 包括用于测量目标产品浓度、纯度和杂质、细胞培养代谢物和细胞成像的技术。这些测量直接与中间或最终产品质量相关。 3.“软传感器”，也称为“软件传感器”，是另一类别。机器学习或机械建模被用来将过程参数（直接测量）与细胞代谢状态或 CQA 联系起来。 图 2.2 说明了上述类别中的 PAT。 图 2.2 展示了不同类别的过程分析技术（PATs）的示意图，包括单元操作中的监控系统、产品质量指示技术以及软传感器。 2.有关生物过程监测系统的术语 鉴于传感器的重要性，已开发了各种类型的监测系统。这些系统针对易于使用和成本效益进行了优化，同时能够检测不同的参数。每种技术都以特定模式使用。为了帮助构建本章，我们从以下段落开始讨论监测的不同模式： 在线或内联：监测方法提供生物过程的连续和最新信息。这些信息可以是实时的（在线方法）或近乎实时的（内联方法）。这些方法对生物反应器的连续控制很有用。 离线或旁线：方法不提供过程状态的实时信息。实际上，这种方法需要高度的劳动和样品与过程的物理分离。因此，这种方法对于控制目的并不理想，因为数据是断断续续获得的。 侵入性：监测系统的探针与细胞或细胞培养基直接接触。在这种方法中，传感器位于生物反应器内部，被称为内部传感器。图 2.3a 显示了内部传感器的图片。这些传感器的缺点包括增加污染风险和对培养基的不利影响。生物污染是这种监测系统的另一个问题，它们涂有生物相容材料。 图 2.3 传感器示意图：(a) 内部传感器 (b) 外部传感器 (c) 混合传感器 非侵入性：该方法从细胞培养过程中获取信息，而不与细胞培养环境直接接触。在这种方法中，传感器位于生物反应器外部，被称为外部传感器。图 2.3b 显示了外部传感器的图片。非侵入性方法的一个重要新应用是在传感器和生物反应器内容物之间引入一个可扩散的屏障，这消除了污染风险，并最大限度地减少了可提取物和浸出物进入培养基。此外，这些传感器可以在不中断过程的情况下更换或重新校准。 间接：监测方法使用自动化或手动采样技术从培养中抽取样品并在生物反应器外部进行分析。为此，使用混合传感器。这些传感器在生物反应器内外都有组件。图 2.3c 显示了一个混合传感器的图片。 破坏性：这些方法需要使用细胞进行分析。在这些技术中，细胞在分析后不能使用。因此，这些分析方法不适合可用细胞数量有限的自体治疗。 非破坏性：方法不涉及使用细胞进行分析。实际上，这些方法中的一些可以在分析完成后将取样的细胞返回生物反应器。 如前所述，在生物过程中实施可靠的控制系统将带来更高的过程可重复性和产品质量。在不同方法中，在线和内联监测技术是首选方法，以开发强大的控制系统。 随着对细胞培养中不同类型监测技术的更深入了解，我们现在将讨论最近开发的用于监测细胞治疗以及 mAbs 的开发和制造过程的监测工具。 3.最近开发的监测工具 在开发阶段使用不同类型的内联传感器，以尽可能多地收集过程理解并检测变异性的来源。根据传感器的工作原理，它们被定义为不同的类别如下： 3.1.电化学传感器 现有的生物过程主要使用电化学传感器在线监测 pH 和 DO。在这种技术中，检测并测量电极感测表面与分析物之间的相互作用，然后将数据转换为电信号。电化学传感器以其可靠性而闻名，在高氧浓度下具有更高的准确性。然而，它们的缺点是体积庞大，其监测方法完全是侵入性的。此外，传感器在每个灭菌周期后需要重新校准。 3.2.光学传感器 光学传感器通过测量与光相关的不同属性的变化，如吸光度、荧光信号发射和相位角，通过指示染料进行监测。测量值可以转换为分析物的浓度。这种类型的传感器通常用于监测 DO、DCO2 和 pH。光学传感器与细胞培养基的接触很少或没有，降低了污染风险。此外，它们是低体积过程中的最佳选择，因为无法使用大型传感器。然而，长期稳定性低和染料的毒性是使用光学传感器的担忧。 3.3.光谱传感器 这种类型的监测系统主要基于电磁波对分子中键的影响。在这种方法中，生物过程的光谱范围在紫外（UV）和中红外（MIR）之间。在不同类型的红外光谱中，MIR 和近红外（NIR）对生物处理应用更敏感。拉曼光谱因其便宜、更稳定且荧光干扰最小而获得了最广泛的普及。此外，拉曼光谱可以作为在线、内联、旁线或离线监测系统使用，因为它的采样方法灵活。 光谱传感器主要用于上游处理（USP）和下游处理（DSP）中生物质的测量。然而，可以使用这种类型的传感器监测细胞培养环境中的溶解化合物，如葡萄糖、乳酸和氨基酸。光谱传感器的另一个优点是测量是以非侵入性方式进行的，因为不需要采样。无需采样进行测量使拉曼光谱成为监测并行过程和降低成本的有利方法。拉曼光谱的主要缺点是反馈信号不频繁。因此，为了改进这种方法，进行了多种努力，例如构建具有外源输入模型的线性自回归。 色谱步骤主要使用 UV 吸光度（A280 nm）进行收集和合并标准，这假设蛋白质浓度与吸光度呈线性相关。这种方法适用于从基线设计的收集，但在区分目标蛋白和其同种型方面能力有限。如果色谱步骤旨在分离目标蛋白和其同种型，基于 UV 吸光度的收集并不理想，可以与其他形式的分析测试结合使用。实施了一个控制算法，以在检测到突破时终止柱装载，最低可达 0.5 mg/mL。Hakemeyer 等人报告了 CHO 文化上清液的 NIR 的旁线使用，光谱每天收集，计算出多变量过程指纹。数据集从 2.5 L 生物反应器到 1000 L 生物反应器，并分为校准集和验证集。从主成分分析（PCA）报告了包括产品滴度、葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、铵、细胞密度和活性在内的多个过程监测属性。与参考方法相比，准确性达到 15% 或更高。此外，通过将过程签名与历史数据库进行比较，可以开发过程性能评估。光谱传感器可以进行多参数监测，使它们作为 PAT 具有前景。一些作者报告了拉曼光谱的内联应用，以监测多个参数和属性，包括营养物质、代谢物和生物质（葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、铵和 VCD）。偏最小二乘（PLS）回归用于分析光谱以校准和训练模型。结合其非侵入性质，拉曼光谱为获取过程知识和建立过程控制提供了巨大潜力。 3.4.基于图像的监测系统 在生物过程中对各种参数进行基于图像的监测是一种高效的工具，用于直观分析细胞。这导致了用于原位成像的传感器的开发。差分干涉对比成像是一种实时成像技术，用于测量微载体上的细胞融合度、细胞密度和分布。这种方法可以提供来自培养的在线成像，并可以提供关于细胞大小、聚集水平和细胞密度的信息。然而，采样方法的侵入性和视野小是这种技术的主要缺点。此外，这种方法的结果依赖于手动分析，使其耗时且容易出错。 数字全息成像是另一种用于测量细胞数量、面积、厚度和体积的基于图像的方法。这是一种具有广阔视野的实时技术。这种方法的主要优点是非侵入性，主要缺点是仅适用于平面培养。 既然我们已经熟悉了不同类型的监测系统，值得一提，近红外光谱（NIR Spectroscopy）、中红外光谱（MIR Spectroscopy）和拉曼光谱（Raman spectroscopy）通常用于上游过程中的各种参数监测。上游过程指的是从瓶装解冻、种子扩增到生产生物反应器的细胞扩增过程，在这个过程中，细胞将扩增到所需的数量并产生目标蛋白。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系由于其哺乳动物特性和翻译后修饰的好处，被用作mAb生产的主力军。 目前在线过程分析技术（PATs）在上游过程中的应用仅限于pH、溶解氧（DO）和温度。电化学和光学传感器广泛用于pH和DO检测。对于培养基成分和代谢物的监测，如葡萄糖和乳酸，取样后基于高效液相色谱（HPLC）或酶-安培测量进行监测。活细胞密度和产品滴度也通过取样和离线测试进行监测。如前所述，取样可能导致潜在的污染并需要额外的劳动力。必须付出巨大努力以确保样本的代表性。另一个缺点是分析时间延长，使得实时处理决策变得不可能。例如，基于离线测量的葡萄糖进料策略可能会因取样和分析时间的不同而引入批次间高变异性。 下游过程通常指的是从过程和产品相关杂质中回收和纯化目标产品的过程，以及将缓冲液交换成稳定性配方缓冲液。在工业环境中，下游过程包括色谱和过滤（死端和切向流）单元操作。从下游开始，PATs的应用集中在测量蛋白质浓度、产品质量和杂质上。对于色谱步骤，常规PATs仅限于pH、电导率和紫外跟踪。而对于过滤步骤，仅监测如压力和流速等物理参数。 转向在线或近线应用的趋势已经显现，因为它可以（近）实时数据分析和过程控制。 在这里，我们将讨论监测系统中用于测量生物过程中关键参数的最新发展： 3.5.葡萄糖 葡萄糖是细胞最重要的能量来源。培养基中葡萄糖水平过高或过低都可能导致异常的细胞代谢。例如，研究表明，葡萄糖水平影响间充质干细胞（MSCs）在成骨过程中的矿物质沉积。因此，葡萄糖传感器可以帮助提供更多关于葡萄糖水平的信息，提高我们对培养条件的理解。监测此参数的系统可以基于（a）检测酶的光学特性和其他相关化合物（b）监测葡萄糖氧化酶的产物（c）应用硼酸（d）使用葡萄糖结合蛋白。 近红外光谱和中红外光谱是监测葡萄糖的可用方法。尽管有这些方法可用，但通过光谱学连续在线监测此参数是有限的，电化学传感器是用于葡萄糖监测的唯一常用方法。近红外光谱特别受欢迎，因为它是一种非破坏性和快速的方法。 最近的一项研究表明，近红外光谱系统在mAb生产过程的放大过程中用于监测葡萄糖。该系统通过10米长的光纤将光谱仪连接到BRUKER Matrix-F FT-NIR系统。每个光谱的规格为256次扫描，分辨率为8。在摇瓶中的细胞培养过程中，探头被插入细胞培养基中。使用OPUS 6.5控制该系统。对于生物反应器应用，探头通过光纤通过容器端口与系统耦合。使用基于近红外的方法创建了预测模型。与其他方法相比，这些模型在批培养中更准确，因为在进料批模式中观察到更高的误差。 最近的一项研究显示了一种光学传感器的开发，该传感器基于现有的氧气传感器，涂有含有一层酶的葡萄糖氧化酶。在葡萄糖和氧气的酶促转化后，氧气通过膜扩散并进入酶层。该传感器包括一个光学氧气传感器，用于测量酶层内的氧气消耗。监测的氧气分压与细胞培养中的葡萄糖浓度成反比。这种传感器是一次性的，适合悬浮细胞培养过程。 拉曼光谱已被许多人研究用于在线测量葡萄糖，并反馈控制以维持其水平用于（进料）批处理过程。最近，Graf等人报告了在灌注生物反应器的渗透侧包括一个拉曼光谱流动池，并将葡萄糖浓度读数与离线参考数据进行了验证。基于拉曼光谱葡萄糖读数设计了一个控制回路。 另一种基于葡萄糖结合蛋白（GBP）的葡萄糖测量方法。这种工程蛋白有一个单一的突变，使其能够采用对环境敏感的荧光团。该蛋白对配体的响应范围在微摩尔级别，可以在4°C下储存约5个月。在这种技术中，为了测量葡萄糖浓度，将GBP固定在Ni-NTA微珠上，限制在连接到荧光计的光纤尖端。在酵母和大肠杆菌发酵以及哺乳动物培养中测试了葡萄糖传感方法。在整个细胞培养过程中，透析管浸入细胞培养基中，通过该采样器扩散的葡萄糖被转移到微珠上。然后根据标记蛋白的荧光强度测量葡萄糖浓度。从这种技术获得的测量结果与YSI 2700 Chemistry Analyzer的测量结果进行了比较。结果表明，该方法成功地测量了不同浓度的葡萄糖。使用这个平台的另一个好处是，只需1μL的样本体积就足以测量葡萄糖，使其适合小规模培养。此外，这种技术对葡萄糖的高灵敏度使其成为高通量生物处理目的的理想选择。这种方法的唯一要求是样本的稀释。稀释步骤有助于减少自动荧光干扰，这是其他光学传感器中的常见问题。该技术还成功地用于经皮葡萄糖测量。使用适合细胞培养容器的采样器的类似方法可以用于整个培养过程中葡萄糖的非侵入性监测。 3.6.乳酸 乳酸是细胞培养过程中厌氧途径的最终产物，其浓度可以在典型的细胞培养过程中从几乎0增加到几毫摩尔。乳酸可以抑制许多细胞类型的细胞生长和生产力。因此，在整个培养过程中监测这个参数是很重要的。基于LED的2D荧光光谱法是新开发的用于在线监测CHO培养过程中的乳酸的方法。该设备由传感器和探头组成。传感器包括激发和检测部分。在过程中在线测量乳酸时，探头插入生物反应器，样品由探头内的光纤照亮。设备的寿命长且维护少，使其成为工业应用的理想方法，并且可以适应不同的应用。 最近报道的一项技术设计了一种纳米复合功能化的铂微电极，用于体外检测乳酸。这种技术基于一种无酶电化学工具，使用微针电极。微针被金纳米粒子和多巴胺纳米球修饰。这项研究的结果表明，在不同细胞系的细胞培养基中检测乳酸具有高灵敏度和选择性，并且在广泛的浓度范围内。 据报道，一种新的多参数传感设备能够实时监测包括乳酸在内的不同细胞培养参数。在这个平台上，电化学传感部分嵌入在流动室中。该平台使用Molex连接器进行电气连接。微流控部分也通过luer锁连接器连接到流动室。为了监测乳酸，使用安培酶传感器，测量发生在两个反应中：首先催化乳酸，产生过氧化氢。然后过氧化氢分子通过电极上的酶生物膜扩散并通过进一步还原。然后使用还原电流进行乳酸监测。 在另一种新开发的方法中，使用氧化石墨烯、碳纳米管和金纳米粒子的复合材料来修饰铂电极，并在常氧和低氧生物过程中检测乳酸。在这种方法中，乳酸氧化酶固定在电极上，催化乳酸产生过氧化氢。过氧化氢在产生电子方面发挥重要作用，从而产生安培信号。所提出的传感器具有高灵敏度、稳定性、可重复性和重复性。 3.7.pH 细胞培养基的pH值可以直接影响细胞内酶活性和细胞代谢。这在培养干细胞时特别重要，因为一些研究表明，人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的细胞培养基pH值的微小变化可以抑制成骨分化。因此，将此参数维持在6.8-7.4的最优范围内对于提高细胞活力和生产力至关重要。 pH通常通过在USP和DSP中使用pH电极来监测。因此，电化学传感器是测量生物过程中pH的常用工具。光学传感器是另一种类型的pH传感器。这些传感器基于固定在光纤上的染料。这种染料通过H+离子经历分子结构的变化，这些变化反映在吸收或反射等光谱现象中。GE Healthcare的Wavepod II-pHOPT、PreSens的iTube pH Bioreactor、Fitnesse的TurFluor pH和Sartorius的OptiSens pH是商业上可用的光学传感器。这些传感器中的大多数需要直接接触细胞培养环境。 最近开发了一种非接触式光学pH测量方法。该系统包括传感器盒、泵、支撑结构和流动池，样品被转移到LED盒中。通过样品从LED模块传输的光被传感器模块测量。这种方法具有更高的灵敏度、准确性和响应性。由于指示剂的快速化学平衡，测量进行得更快。该设置的最重要优点是它降低了污染的风险。 MIR和NIR是用于监测细胞培养基中pH的其他方法。开发了一种通过片上钌氧化物（RuOx）电极测量pH的新方法。这种传感器是电势性的，包括玻璃芯片、特氟龙芯片支架、pogo销连接器和Transwell插入物。使用这种方法监测细胞培养中的pH，细胞培养在膜的顶部。膜放置在距离使用特氟龙支架悬挂的玻璃芯片3毫米处。在这个传感器中，使用nafion 117溶液涂覆电极以避免生物污染。研究结果表明，RuOx电极是长期细胞培养过程中和复杂细胞培养基中pH测量的可靠工具。此外，传感器的灵敏度不会随着时间而受到影响。 另一种报道的技术是用于细胞培养过程的感测细胞培养瓶（SCCF）传感器芯片。在这种方法中，芯片嵌入在烧瓶的底部，包括安培法和工作电极（安培法和电势法电极）、参比电极和指示电极。电势传感器成功监测了乳腺癌（T-47D）细胞的细胞酸化。这种方法的缺点是该技术仅限于2D细胞培养过程；然而，它仍然提供了有关细胞培养系统中扩散细节的有价值信息。 3.8.氧气 氧气是细胞代谢的重要因素。研究表明，低水平的氧气可以增强干细胞的分化。此外，来自3D骨髓间充质干细胞培养的发现表明，氧气水平的变化不会显著影响培养结果。实际上，在这些类型的培养中，适当的氧气水平可以提高培养的质量。考虑到氧气的重要性，仔细监测并维持这个参数在适合培养条件的水平至关重要。为了监测气相中的氧气，通常使用半导体、电化学和顺磁性传感器等不同技术。对于测量液相中的氧气，电化学和光学传感器是可用的。电化学传感器，特别是Clark型电极，是测量溶解氧最常用的方法。然而，这些传感器比光学传感器更笨重。 最近开发了多种用于氧气测量的技术。其中一种技术涉及使用单一的片上传感器，在细胞培养过程中同时监测氧气和pH值。该传感器通过钌氧化物（RuOx）电极进行测量。传感器的基础在上一节“通过芯片测量pH的新方法”中有所描述。RuOx电极可用于细胞代谢研究。在整个培养过程中，溶解氧在电极表面减少，由此产生的电流与培养基中的氧气浓度成正比。减小电极尺寸可以提供更好的采样时间分辨率。然而，在当前传感器尺寸下，不可能以高于每小时一次的频率进行氧气测量。 前面描述的SCCF技术，作为一种pH测量技术，能够监测细胞培养基中的氧气。在这种方法中，使用安培氧气传感器来监测呼吸。另一项新研究报告开发了一种无线溶解氧传感器，通过将Clark型溶解氧传感器与BLE芯片组配对。溶解氧传感器具有三电极配置，可以量化氧气分压。系统包括电子模块、电化学溶解氧传感器和3D打印外壳。微控制器用于执行周期性的溶解氧测量。然后数据通过无线方式传输。此外，通过将氟化乙烯丙烯膜连接到传感器表面，创建了一个储层。该系统已在台式生物反应器中进行了测试，数据是通过设置和手机之间的蓝牙低能耗通信获得的。 3.9.二氧化碳 作为细胞呼吸的副产品，二氧化碳可以通过细胞膜并影响细胞内pH值，从而影响细胞的代谢和健康。为了监测细胞培养环境中的CO2水平并将其维持在可接受的水平，已经开发了不同的技术。电化学和光学传感器通常用于测量生物过程中的CO2。此外，离线分析器提供了一种无需直接接触细胞培养基即可监测DCO2的方法。与CO2探头相比，废气传感器便宜，长期过程中保持稳定，并且不直接接触细胞培养环境。然而，这种方法只能提供DCO2的平均值。YSI或Mettler Toledo等公司提供的商业化废气传感器用于监测生物过程中的DCO2。在用于监测细胞培养基中CO2的最新技术中，一种值得注意的方法是“信用卡”微系统，该系统整合了微流体学、气体扩散模块和光学流动池。该系统的采样率为每小时30个样本。在采样过程中，样品中的二氧化碳转移到对pH敏感的溴酞蓝溶液中，颜色变化通过光学测量。使用该系统的一个重要优点是成本低。然而，该方法的检测限为83 mg/L。另一种新颖的方法是基于CO2通过硅膜的初始扩散率来测量细胞培养基中的CO2水平。在这种方法中，将细胞培养容器的一小部分区域替换为对CO2可渗透的硅膜。因此，溶解在细胞培养基中的CO2通过附着在细胞培养容器上的膜扩散，然后转移到传感器进行测量。这种方法的主要优点是其非侵入性，因为采样是在不直接接触细胞培养基的情况下进行的。 3.10.氧化还原 细胞内氧化还原状态影响影响生物制品生产的途径。开发了不同的技术来测量这个参数，它们都有助于理解氧化还原对过程的影响，并提高产品产量和质量。膜压力传感器和氧化还原电极是测量USP和DSP中氧化还原电位的有效方法。氧化还原敏感的黄色荧光蛋白（rx YFP）和绿色荧光蛋白（GFP）（roGFPs）目前都被设计并用于在线监测硫醇氧化还原变化。蛋白质在β桶表面的半胱氨酸残基能够形成二硫键，导致蛋白质的荧光发生变化。 另一种方法是通过测量氧化还原水平在线监测细胞分化。例如，开发了一种基于氧化还原比值的新技术，用于确定间充质干细胞（MSCs）的分化状态。这种方法基于间充质干细胞在分化过程中光学氧化还原比值降低的观察。在这种方法中，将荧光寿命成像显微镜与双光子激发（TPE）荧光显微镜结合，通过测量NAD（P）H和FAD的光学氧化还原比值和荧光寿命来确定MSCs的分化状态。然而，目前还没有用于在线监测分化的监测系统。然而，为了开发这样的系统，必须设计一个探头与细胞直接接触并收集数据。另一种新开发的方法为在连续搅拌罐生物反应器中监测hiPSCs的聚集提供了有效方式。这个设备是一种原位显微成像工具。鉴于在整个过程中维持iPSCs的多能性的重要性，开发一种用于检测和评估培养过程中细胞多能性的工具是很重要的。 3.11.氨基酸 氨基酸在生物过程中尤其重要，特别是在CHO细胞培养过程中。为了设计有效的进料策略，了解细胞培养过程中的氨基酸谱是至关重要的。这一点尤其重要，因为限制性氨基酸在不同过程中会有所不同。最近的一项研究报告了一种基于HPLC的系统，用于监测CHO培养中的氨基酸。在这种提供在线监测系统的技术中，包括了一个HPLC自动进样器。通过抽取10μL水和30μL样品进行采样。采样每3小时进行一次，样品抽取后45分钟进行测量。使用这种方法可以提供18种不同氨基酸浓度的信息。该系统的主要优点之一是，与拉曼传感器相比，它提供了更高的测量频率。此外，这种传感器大大减少了测量误差，并且与基于光谱学的监测系统相比具有更高的准确性。 3.12.产品浓度、质量属性和杂质 已经设计了一种新的监测系统，使用中红外平台通过超滤和透析单元测量蛋白质和辅料的浓度。在这种方法中，两个中红外传感器探头放置在散装溶液和回流线中。在这一步中获取信号。然后自动将光谱传输到过程监测平台，以实时可视化辅料和蛋白质浓度。这种技术以图形和表格形式显示结果，有助于提高过程理解、故障排除，并最终加快开发过程。 检测蛋白质的传感器是基于单元操作和目标蛋白质的类型开发的。例如，在色谱中，基于UV吸收和荧光的传感器用于在线监测蛋白质和核酸。280纳米波长的UV吸收已被用于量化总蛋白质，基于芳香族氨基酸的吸收。UV光谱法具有高灵敏度，可以测试蛋白质浓度到mg/L范围。宿主细胞蛋白（HCP）已经通过劳动密集型的ELISA进行了量化。Capito等人报道使用傅里叶变换中红外光谱（FT-MIR）量化HCP，结果表明该方法适用于从20,000到200,000 ng/mL的不同HCP范围。FT-MIR是振动光谱法，需要化学计量学来建立校准预测模型。Cao等人将ZipChip接口与质谱连接，实现了基于CE-MS的原生完整分析和肽图映射。基于微流控的分析显示出与电荷变体的分离水平和表征结果的分辨率相当，显著减少了采样体积和运行时间。当前的产品发布和表征测定包括多种技术，如毛细管等电聚焦（cIEF）用于电荷变异，尺寸排除色谱（SEC），毛细管凝胶电泳（cGE）用于尺寸变异和酶联免疫吸附测定（ELISA）用于HCP表征。然而，即使结合这些测定，也不能提供分子水平的洞察。越来越多的趋势是使用与液相色谱（LC-MS）耦合的质谱进行基于肽图的分析。这可以提供广泛的属性表征，如翻译后修饰（PTM）和杂质。常规MS的序列包括样品准备、MS数据获取和处理。每个步骤都可能是劳动密集型和复杂的。Song等人展示了整个序列的自动化，并在3个不同的地点建立了自动化平台。在这种方法中，MAM被用作指导过程开发和稳定性监测的强大工具。已经报道了一系列应用，进一步展示了其揭示分子水平结构信息的能力。也有人对cGMP应用表示兴趣。Yigzaw Y等人报道了在深层过滤步骤中应用A410 nm监测HCP突破，以确定收集标准的终点。 为了报告产品质量属性，包括用于做出合并决策的聚集体水平，下游色谱步骤通过T型连接器使用超高效液相色谱（UPLC）。多角光散射（MLS）技术采用静态光散射技术，从多个角度测量光散射强度，提供对分子量和/或粒径的洞察。在Patel等人的研究中，讨论了将HIC纯化系统与在线MLS耦合作为监测和控制洗脱液中聚集体水平的手段。HIC步骤设计用于去除聚集体，其中具有更高疏水性的聚集体比单体有更长的停留时间。MLS强度与蛋白质浓度和重量平均分子量成正比。当与UV-Vis耦合时，根据分子量进行实时合并决策，以从产品流中去除聚集体。这消除了分数收集和离线SEC测试的需要。此外，已经开发了将SEC与MLS结合的协议，将SEC的分离能力与MLS的分析能力结合起来。 3.13.温度 温度是物理参数，在上游过程（USP）和下游过程（DSP）中使用温度计进行监测。热电偶通常用于温度的在线监测。 3.14.生物量 在上游过程中，阻抗传感器和荧光传感器分别用于监测生物量和细胞形态。 最近开发了一种基于流式细胞术的技术用于监测生物量。这种技术提供了对细胞生理学和形态学的深刻理解，这在其他在线和离线监测系统中是不可能的。该技术专门设计用于在高颗粒背景的培养基中进行测量。换句话说，与其他常规方法不同，这种方法可以从背景介质中区分出光学密度和活细胞。此外，通过使用荧光染色和形态学评估，可以在一次测量中获得活性和大小分布。 为了使用特定灌注率（CSPR）控制系统在生产过程中监测细胞活性，将电容探头插入细胞培养基中，并对通过它的细胞施加电场使其极化。活细胞具有完整的膜，因此会发生极化，导致其电容增加。这种增加被测量并转换为活细胞数量。该设备可以作为探头插入细胞培养基中使用。这种技术的唯一缺点是测量的侵入性。尽管如此，这些探头已被证明是坚固可靠的。因此，预计在不久的将来这种PAT的使用将呈上升趋势。 另一种评估贴壁干细胞中活细胞数量、融合度和分布的方法是通过使用基于光学的技术方法。无透镜成像（LFI）和数字全息成像（DHI）等2D成像技术是其他可用的技术。监测生物量的一种新方法是基于LED的荧光显微镜方法。该设备由传感器和探头组成。为了在生物过程中监测生物量，探头通过端口插入生物反应器并就地消毒。位于探头中间部分的检测光纤被280纳米激发光纤包围。由365纳米和455纳米光纤构成的外层包围内层光纤。光纤将均匀照亮样品，并与传感器检测部分中的LED相连。该部分由CCD光谱仪组成，并且能够获得光谱分辨率小于4纳米的光谱。这种2D荧光光谱法是一种区分活细胞、死细胞和溶解细胞的技术。 最近的一项研究报告了一种通过使用微流体芯片的滴度报告方法。在这种方法中，微流体毛细管电泳与质谱联用，用于基于电荷的样品分离。通过将采样后的轻链信号强度与重标记的mAb进行比较，获得滴度信息。这种方法快速简单，并且作为在线滴度监测分析工具的潜力很大，可以通过集成自动样品加载选项进一步改进。 Thakur等人实施了近红外光谱法，用于在高浓度产品的超滤步骤中实时量化mAb和辅料的浓度。NIR探头连接到回流路径，并且使用PLS模型将预测浓度与标准测试进行校准。通过实施Python控制算法，有效减轻了辅料漂移。PAT应用对于确保产品质量和稳定性至关重要。在类似的研究中，Wasalathanthri等人使用了另一种光谱方法——傅里叶变换红外光谱，达到了高水平的准确性。West等人探索了UPLC在类似应用中的使用。他们结合了一个自动采样器，并在超滤和透析过程中基于280纳米和214纳米处的吸收分别定量抗体（高分子量（HMW））和接受体（精氨酸和组氨酸）的浓度。 滴度是上游过程性能的重要指标，其测量对于进一步的下游操作至关重要。随着行业向连续模式转变，实时滴度报告变得越来越重要。传统的离线HPLC（亲和色谱）已被用于滴度量化。Chemmalil等人报告了使用超高效液相色谱（UPLC）在线/在线滴度报告，用于进料批和灌注生物反应器，并且为两种生物反应器都配备了改装的过程样品管理器（PSM）。根据预设时间表进行滴度测量。同一位作者后来发表了使用2D-LC报告抗体滴度和产品质量的工作，第一维是蛋白A色谱，用于纯化和定量细胞培养样品，第二维可以是SEC用于检测大小变体，或CEX用于电荷变体。采用了SegFlow自动进样器，以减少第二维LC的装载体积，从而减少进样体积并提高分辨率。拉曼光谱也可以用来预测进料批上清样品的滴度。Li等人报告了对37批CHO生产样品的拉曼光谱分析，从中预测了产品滴度。采用了竞争自适应重加权抽样（CoAdReS）和蚁群优化（ACO）变量选择方法，以简化光谱信息进行化学计量学分析。PLS回归用于将处理后的拉曼光谱与产品滴度相关联。两种变量选择方法都被证明比全谱分析提高了可预测性。 3.15.聚集体和片段 HP-SEC是行业中用于聚集体和片段检测的金标准。由于免疫原性问题，聚集体是最常监测的产品相关杂质之一，而片段则提供了对降解途径的洞察。HP-SEC具有简单的优点，并且在离线设置中广泛使用。然而，使用这种方法的主要障碍是其周转时间。通常，HP-SEC的采样、测试和分析需要大约30分钟。Rathore等人评估了在线HP-SEC在实时过程决策中的应用，通过将测试时间缩短到13.5分钟，增加处理步骤时间，使其足以用于过程决策。这种方法的优点是直接使用产品质量属性进行后续处理决策。 HP-SEC也有缺点，包括不同聚集体形式之间分辨率的缺乏，以及由于固定相和蛋白质之间的非特异性相互作用可能导致报告不准确。随着行业向连续操作转变以降低成本、提高生产力和减少占地面积，第一个要解决的挑战是连续装载到灌注生物反应器的捕获柱上，无需采样和离线测试滴度。Rudt等人应用PLS模型对负载洗脱液的UV/Vis光谱进行建模，以检测抗体突破。此外，基于折射率的传感器用于检测脂质和碳水化合物。 3.16.单次使用生物反应器的传感器 mAbs和细胞及基因治疗产品的制造商必须遵守FDA和EMA制定的法规。良好的生产规范（GMP）指南特别要求在整个过程中消除污染。这可以通过生物制造过程的不同阶段的不同灭菌过程来实现。然而，这些做法很耗时。使用一次性技术是降低污染风险和同时减少灭菌需求的好方法。这可以减少灭菌时间，加快生物制造过程并提高生产力。考虑到这些优势，一次性生物反应器技术现在越来越受欢迎。 一次性生物反应器配备了通过使用不同接口的传感器进行监测的系统，类似于传统生物反应器。这些系统为生物过程提供有价值的信息，并有助于改进细胞培养过程。常用的监测方法是使用离线传感器分析生物反应器中的液体样品。为了提供无细胞采样，使用微滤或透析膜进行在线过滤作为无菌屏障是一种有效的方法。一种离线监测方法是流动注射分析（FIA）。然而，这些系统的主要缺点是在频繁采样期间存在污染的风险。为了解决这个问题，采样容器被灭菌，然后连接到生物反应器并密封。 传统生物反应器中使用的任何类型的废气传感器都适用于一次性生物反应器。在离线监测系统中，无菌性不是限制因素，因为传感器可以放置在过滤器的非无菌侧。超声波或光谱传感器是用于一次性容器的适当类型的监测系统。场效应晶体管（FET）、电化学pH传感器、基于射频识别的传感器、化学和生物传感器是可用的原位监测系统的例子。具有非侵入性接口的传感器提供一次性使用生物反应器中过程的非侵入性监测。温度和重量是使用具有非侵入性接口的传感器测量的两个常见参数。该方法通过安装在生物反应器表面的组件来工作。光学传感器、阻抗谱、超声波传感器和自由浮动传感器是其他类型的非侵入性接口传感器。无线技术也是一次性容器的理想选择，因为它们不需要穿透反应器。 新开发的用于测量溶解在细胞培养基中的CO2的传感器是一种非侵入性监测技术。该方法基于CO2通过硅层的初始扩散率。这项技术的细节之前在用于监测CO2的可用方法中解释过。这项技术可以轻松集成到一次性容器中。监测系统包括连接到容器的采样器和放置在细胞培养环境外的传感器。采样器由廉价材料制成，使用生物反应器后可以丢弃，而系统的传感器部分可以与新的采样器和生物反应器一起重复使用。 在单次使用生物反应器中使用CSPR（细胞特异性灌注率）控制系统制造mAbs时测量细胞活性，将一块补丁焊接到生物反应器的薄膜中。测量基于与之前描述的活性探头类似的原则。射频识别（RFID）标签能够被动地询问反应器的头空间，已经证明可以监测一次性生物反应器内的温度和压力。关于一次性容器的另一个重要点是监测系统的成本，因为传感器在使用完生物反应器后与生物反应器一起丢弃。通过开发通信协议和标准接口，可以为过渡到使用新型传感器铺平道路，因为科学家们提高了监测系统的准确性、可重复性和耐用性。 4.用于监测高通量生物反应器的组学工具 组学工具的使用已被证明有助于提高我们对细胞内特征的理解，并监测在生物反应器中进行的生物过程。在这种方法中，不同的生物分子如基因、蛋白质和代谢物被量化和分析。最近，出现了将组学技术应用于干细胞培养领域的趋势。这种方法提供的信息在搅拌罐生物反应器中的许多细胞培养过程中至关重要，例如胚胎干细胞（ESC）培养。此外，它还提供了对iPSC培养过程中的生理和代谢变化的洞察，以及调查干细胞的多能性。尽管这种方法有优点，但还需要进一步改进，例如增强计算技术以将组学与表型联系起来。此外，必须注意生物标记物是细胞系特定的，需要开发组学来解决这个问题。 5.增强型生物处理建模 如前几节所讨论的，监测系统用于上游生物过程以监测整个过程中的关键过程参数（CPP），如pH、DCO2和DO。这些环境参数可能会影响生物过程的结果。例如，hiPSCs的多能性受到培养过程中微环境变化的影响。从过程监测中获得的信息可以用来生产具有理想CQAs的产品。基于模型的监测是一种将CPP与CQA联系起来的策略，应用一个模型。该方法可以与期望的输出趋势结合起来，开发基于模型的控制系统。在这个系统中，最佳的控制设置是基于测量数据和模型来预测的。基于模型的监测更常用于哺乳动物细胞培养，在干细胞培养中使用这种方法的研究很少。这种策略在具有异质性输入材料的过程中特别有益。然而，必须进行调整以满足这些培养的监管要求。 最近的一项研究报告了基于机器学习算法开发模型预测控制（MPC）系统。目的是提供最佳的进料以实现最高的细胞生长和代谢物生产。最初开发了一个线性回归模型。然后使用几个回归器训练神经网络模型。基于最佳模型设计MPC，并确定最佳进料策略以获得最大的活细胞密度。回归模型是基于培养变量和葡萄糖水平（GLC）之间的相关性设计的。使用质量平衡获得GLC和葡萄糖进料体积之间的关系。质量平衡和回归模型结果是一个混合模型，代表进料批处理过程。进行了实验研究以验证控制方法。结果显示在使用开发的控制方法后蛋白质产量提高了2%。 已经开发了其他技术，使用机器学习和深度学习算法进行非破坏性监测凋亡和细胞活性。最近开发了一个模型，用于实时计算CHO培养中的氧气摄取率和生物量。在这种方法中，KLa在培养过程中被表征以估计OUR，并且分段模型显示活生物量与OUR相关。这个模型是控制基础生物过程的强大技术。Wallocha等人使用废气氧气测量来确定氧气摄取率（OUR），并通过机械建模将其与一次性使用生物反应器（SUB）中的生物量相关联。生物量预测可以用于在稳态过程中自动控制细胞出血。除了多变量数据分析（MVDA），机器学习（ML）在过去5年中在制药工业中越来越受欢迎。 6.结论 如今，随着细胞和基因治疗产品以及单克隆抗体（mAbs）的日益普及，对开发稳健和一致的制造工艺的需求不断增长。传感器在整个过程中提供环境参数的数据，因此是更好地理解这些过程和开发可靠生物过程的有用工具。因此，在流程中采用监测技术至关重要。此外，通过将传感器数据与基于模型的技术相结合，可以高效地控制环境参数。基于模型的技术也可以帮助识别干细胞生物加工中的批次失败风险。鉴于所采用的方法和工具的多样性，越来越需要对各种传感器和仪器进行标准化和参考基准。 传感器和监测技术的进步正在改变生物制药行业的生产方式，使过程更加灵活、高效和可靠。随着一次性使用技术和实时监测系统的发展，生物反应器中的过程控制和优化达到了前所未有的水平。这些技术不仅提高了生产力和产品质量，还降低了生产成本和污染风险。 然而，尽管取得了这些进展，但在实施这些监测技术时仍然存在挑战。需要进一步的研究和开发来提高传感器的准确性、可重复性和耐用性。此外，需要制定标准和参考基准，以便在行业中一致地实施和校准这些技术。 未来的研究可能会集中在开发新型传感器和监测平台，这些平台可以无缝集成到现有的生物反应器系统中，并提供实时、高分辨率的数据。此外，机器学习和人工智能的进一步应用可能会使生物过程的预测和控制更加精确和自动化。 总之，传感器和监测技术在生物制药生产中发挥着至关重要的作用，并且随着技术的不断进步，它们在确保产品质量和提高生产效率方面的作用将变得更加重要。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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