Institute of Basic Medical Sciences

*仅供医学专业人士阅读参考代谢状态好，哪哪儿都好，人体整体是这个道理，作为人体一部分的CD8+T细胞当然也不例外，但各位想必也知道，在癌症来袭时想让CD8+T细胞保持正常的代谢状态可并非易事，敌我双方围绕着代谢的争斗之激烈，都快让奇点糕脑补出“历代大规模征战XX次”的台词了。从治疗干预的角度来说，要想帮CD8+T细胞一把，就得找到对维持它们代谢稳态有重要意义的靶点。而近日，中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院杜文静团队在Molecular Cell期刊上发表的最新研究成果，就证实了苹果酸酶2（Malic enzyme 2, ME2）正是对维持CD8+T细胞代谢稳态和抗肿瘤免疫功能有重要意义的关键酶[1]！该研究揭示，ME2缺失可阻断CD8+T细胞的三羧酸（TCA）循环，导致中间代谢产物富马酸（fumarate）在细胞内堆积，而富马酸会通过与ATP竞争性结合死亡关联蛋白激酶1（DAPK1），抑制DAPK1及其下游的TSC2-mTORC1通路活性，使CD8+T细胞的活化和抗肿瘤功能受损，因此ME2正常存在，才能让CD8+T细胞好好履行抗癌的职责。论文核心机制总结哺乳动物细胞内的苹果酸酶有ME1，ME2和ME3三种异构体，而ME2作为线粒体中主要存在的异构体，其功能是将TCA循环的中间产物苹果酸转化为丙酮酸（并伴随NADPH产生），对细胞代谢有重要影响，所以ME2也会影响细胞功能的方方面面。但此前围绕ME2与癌症关系开展的大量研究，基本都只在癌细胞上进行，CD8+T细胞有点被冷遇了。开展本次研究的杜文静教授团队，已经对ME2及苹果酸酶代谢途径的领域开展过大量探索[2-3]，这回就把焦点转到了CD8+T细胞身上，实验第一步是条件性敲除各类T细胞的ME2，这不影响T细胞正常的发育过程和外周T细胞稳态，但在结直肠癌模型小鼠身上，敲除ME2则会显著加速肿瘤生长、缩短小鼠生存时间，且浸润到肿瘤的T细胞数量明显减少。细分肿瘤中T细胞亚群的话，数量显著下降且功能减退的正是CD8+T细胞，细胞实验也明确证实，敲除ME2会使CD8+T细胞的增殖标志物Ki-67、激活标志物（CD25/44/69）和细胞因子表达减少；来自人类黑色素瘤患者的单细胞测序数据也显示，肿瘤浸润CD8+T细胞的ME2表达水平，与多个CD8+T细胞的细胞毒性功能相关基因表达正相关。以上的一系列实验和数据，足以证实ME2对维持CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫应答至关重要，原因肯定也和ME2参与影响的代谢功能有关，首先就是线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）速率的下降，同时ATP和NADH的生成减少；接下来借助代谢流分析，研究者们发现ME2缺失直接阻断了CD8+T细胞的TCA循环，导致上游代谢产物堆积、下游代谢产物减少。研究者们用水平有变的各种代谢产物处理CD8+T细胞，发现仅有上游代谢产物之一的富马酸，会起到类似敲除ME2一样全面抑制CD8+T细胞的作用；而富马酸的直接结合对象就是DAPK1，且属于与ATP的竞争性结合，由此抑制DAPK1的激酶活性，再影响下游的TSC2-mTORC1信号通路，导致CD8+T细胞的活化、效应功能和抗肿瘤活性全面受损。敲除ME2会导致TCA循环中断，积聚的富马酸则结合DAPK1来抑制CD8+T细胞研究者们表示，本次研究揭示的ME2、富马酸及DAPK1对CD8+T细胞功能的影响都是此前未知的，有助于更好地了解影响CD8+T细胞的代谢物质，看来代谢研究真是个大舞台，类似的惊喜可能还有很多，就等研究来~参考文献：[1]Zhang Z, Yang Y, Chen Y, et al. Malic enzyme 2 maintains metabolic state and anti-tumor immunity of CD8+ T cells[J]. Molecular Cell, 2024.[2]Zhao M, Yao P, Mao Y, et al. Malic enzyme 2 maintains protein stability of mutant p53 through 2-hydroxyglutarate[J]. Nature Metabolism, 2022, 4(2): 225-238.[3]Li W, Kou J, Zhang Z, et al. Cellular redox homeostasis maintained by malic enzyme 2 is essential for MYC-driven T cell lymphomagenesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2023, 120(23): e2217869120.本文作者丨谭硕

引言 三羧酸循环（TCA cycle）是糖类、脂类、氨基酸三大营养物质氧化分解的共同途径，也是糖、脂肪、 氨基酸代谢联系的枢纽，为机体提供能量和生物合成的前体分子。苹果酸酶（哺乳动物细胞内存在ME1，ME2 和ME3三种异构体，其中ME1和ME2是主要形式）将TCA循环的中间产物苹果酸转化为丙酮酸并伴随NAD(P)H产生，是三羧酸循环的重要补充反应，使细胞在能量、还原当量和生物合成前体需求之间保持一定的平衡，因此，苹果酸酶代谢是细胞内代谢途径的重要交汇途径。 为了系统揭示苹果酸酶代谢的生理病理功能，中国医学科学院基础医学研究所杜文静教授课题组近年来一直聚焦于不同环境和条件下苹果酸代谢的功能和调控机制研究。该组研究人员在2021年发表于Nature Metabolism的研究发现苹果酸酶代谢产生的NADPH直接结合并抑制HDAC3的活性，从而调控了细胞的表观遗传状态，该研究揭示了NADPH代谢非依赖的新功能【1】。在2022年发表于Nature Metabolism的研究工作发现苹果酸酶ME2通过调控细胞内2-羟基戊二酸（2-HG）的生成，维持突变体p53的蛋白稳定性，从而促进肿瘤细胞生长，该研究发现了ME2在细胞内的一种新的催化活性【2】。在2023年发表于PNAS的研究工作发现ME2作为MYC转录上调的靶基因，通过介导谷氨酰胺代谢维持细胞内的氧化还原平衡，在T细胞淋巴瘤的发生发展中具有重要作用。同年，发表在Cell Reports的研究工作发现ME2通过αKG介导的cyclin D1的转录来促进细胞周期的进展，该研究揭示了αKG在调节细胞周期基因转录中的新功能【4】。此外，该课题组于2024年1月发表在Nature Communications的研究工作发现ME2 的一个新形式——细胞质形式 ME2fl， AKT1 的激活通过细胞质ME2（ME2fl）的磷酸化诱导代谢从线粒体代谢转向糖酵解，从而有利于增强细胞的糖酵解表型，该研究揭示了AKT1 介导的 ME2 亚细胞转位转换在肿瘤细胞适应生长刺激的代谢过程中发挥了意想不到的作用【5】。 2024年8月15日，杜文静教授课题组在Molecular cell杂志发表了题为Malic Enzyme 2 maintains metabolic state and anti-tumor immunity of CD8+ T cells（苹果酸酶2维持CD8+ T细胞的代谢稳态和抗肿瘤免疫能力）的研究论文。 在该研究工作中，研究人员首先构建了苹果酸酶2（ME2） T细胞条件性基因敲除小鼠（CD4-Cre;ME2fl/fl mice），发现与野生型小鼠 （ME2 WT）相比，T细胞中缺失ME2表达的小鼠（ME2 KO）具有较弱的肿瘤抑制能力。通过CD4+ / CD8+ T细胞清除实验和细胞过继实验发现，ME2主要调控CD8+ T细胞（而非CD4+ T细胞）的效应性功能和抗肿瘤免疫能力。代谢组学和代谢流分析发现，ME2缺失阻断了CD8+ T细胞的三羧酸（TCA）循环，导致了TCA中间代谢产物fumarate在细胞内的堆积。详细的分子机制研究发现，fumarate能够直接结合DAPK1，并通过与ATP竞争结合来抑制DAPK1的激酶活性，从而抑制了其下游的TSC2-mTORC1信号通路，导致CD8+ T 细胞的活化、效应功能和抗肿瘤作用也相应降低。当DAPK1或mTORC1被抑制时，ME2失去了对CD8+ T细胞抗肿瘤功能的影响。相反，过表达持续活化的DAPK1几乎完全恢复了ME2缺失的CD8+ T细胞的抗肿瘤能力。这些结果表明，DAPK1是ME2赋予CD8+ T细胞效应功能和抗肿瘤作用的关键下游靶点，ME2 通过fumarate调控的 DAPK1-TSC2-mTORC1 信号轴调节 CD8+ T 细胞功能。 此外，与之前的研究一致，本研究也发现了fumarate抑制 CD8+ T 细胞的活化和抗肿瘤能力。然而，之前研究发现，fumarate对 T 细胞的抑制作用是通过可逆地抑制参与表观遗传信号转导的二氧酶【6】或通过蛋白质的琥珀酸化修饰实现的【7】。本研究发现fumarate是一种调节 CD8+ T 细胞中 DAPK1 活性的信号分子。fumarate直接与 DAPK1 的 ATP 口袋结合，并通过与 ATP 竞争来抑制 DAPK1 的活性。fumarate对 DAPK1 活性的抑制作用取决于fumarate/ATP 的比例，这表明fumarate可能作为 ATP 拮抗剂来调节 DAPK1 的活性。值得注意的是，先前的一项研究表明，DMF 通过琥珀酸化糖酵解代谢酶GAPDH抑制髓系和淋巴细胞的有氧糖酵解【8】。然而 ME2 的缺失对 CD8+ T 细胞的糖酵解通并没有影响，这表明 ME2缺失导致的fumarate积累不会影响糖酵解。因此，虽然fumarate对 T 细胞活化有类似的抑制作用，但其通过不同的机制发挥其功能，这很可能是条件依赖性的。例如，ME2 缺乏导致的fumarate积累水平可能不足以琥珀酸化 GAPDH 来抑制糖酵解，但它可以抑制 DAPK1 的活性，进而抑制 CD8+ T 细胞的活化。因此，该研究表明，DAPK1可能是fumarate的感受器，对细胞fumarate水平的变化更为敏感，从而控制CD8+ T细胞的命运。 模式图（Credit: Molecular cell） 综上所述，本研究发现了ME2 在 T 细胞中的作用，ME2 缺乏会导致fumarate在 CD8+ T 细胞中积累，进而通过抑制 DAPK1 来阻碍 mTORC1 信号传导，导致 CD8+ T 细胞的效应功能和抗肿瘤效果受损。值得注意的是，该课题组之前的研究表明，ME2的表达水平和酶活性在T细胞淋巴瘤中上调，对T细胞淋巴瘤的发生至关重要【3】，而本研究表明，ME2的生理功能是维持CD8+ T细胞新陈代谢所必需的。这些发现共同凸显了 ME2 在 T 细胞生理和病理过程中的重要性。 参考文献 1. Li, W., Kou, J., Qin, J., Li, L., Zhang, Z., Pan, Y., Xue, Y., and Du, W. (2021). NADPH levels affect cellular epigenetic state by inhibiting HDAC3-Ncor complex. Nat Metab 3, 75-89. 2. Zhao, M., Yao, P., Mao, Y., Wu, J., Wang, W., Geng, C., Cheng, J., Du, W., and Jiang, P. (2022). Malic enzyme 2 maintains protein stability of mutant p53 through 2-hydroxyglutarate. Nat Metab 4, 225-238. 3. Li, W., Kou, J., Zhang, Z., Li, H., Li, L., and Du, W. (2023). Cellular redox homeostasis maintained by malic enzyme 2 is essential for MYC-driven T cell lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 120, e2217869120. 4. Yang, Y., Zhang, Z., Li, W., Si, Y., Li, L., and Du, W. (2023). alphaKG-driven RNA polymerase II transcription of cyclin D1 licenses malic enzyme 2 to promote cell-cycle progression. Cell Rep 42, 112770. 5. Chen, T., Xie, S., Cheng, J., Zhao, Q., Wu, H., Jiang, P., and Du, W. (2024). AKT1 phosphorylation of cytoplasmic ME2 induces a metabolic switch to glycolysis for tumorigenesis. Nat Commun 15, 686. 6. Zhai, X., Liu, K., Fang, H., Zhang, Q., Gao, X., Liu, F., Zhou, S., Wang, X., Niu, Y., Hong, Y., et al. (2021). Mitochondrial C1qbp promotes differentiation of effector CD8(+) T cells via metabolic-epigenetic reprogramming. Sci Adv 7, eabk0490. 7. Cheng, J., Yan, J., Liu, Y., Shi, J., Wang, H., Zhou, H., Zhou, Y., Zhang, T., Zhao, L., Meng, X., et al. (2023). Cancer-cell-derived fumarate suppresses the anti-tumor capacity of CD8(+) T cells in the tumor microenvironment. Cell Metab 35, 961-978 e910. 8. Kornberg, M.D., Bhargava, P., Kim, P.M., Putluri, V., Snowman, A.M., Putluri, N., Calabresi, P.A., and Snyder, S.H. (2018). Dimethyl fumarate targets GAPDH and aerobic glycolysis to modulate immunity. Science 360, 449-453. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.07.021 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

导读：HPV（人乳头瘤病毒）是一组无包膜的小 DNA病毒，属乳头瘤病毒科，只感染人类，不对其他动物致病。HPV根据感染部位不同可分为嗜皮肤组和嗜黏膜组两大类。嗜黏膜组又根据感染后诱变的良恶性不同，可划分为：诱导上皮组织恶性增生的高危型HPV(例如，HPV16，HPV18等)和诱导上皮组织良性增生的低危型HPV(HPV6，HPV11等）。高危型HPV感染与颈部、肛门生殖器和口咽部恶性肿瘤有关。HPV16是迄今为止全球引起浸润性宫颈癌的主要类型。预防性HPV疫苗（例如 Gardasil 和 Cervarix）已被证明可有效预防 HPV感染，但对预先存在的HPV感染和相关病变没有任何治疗效果。当前对HPV相关的高级别癌前病变和早期癌症的治疗仅限于手术切除，同时存在许多并发症。对于晚期癌症，手术、放疗和化疗效果较差。因此，开发有效的HPV治疗性疫苗来抑制HPV相关癌症的进展变得非常迫切。 HPVE6 和E7是病毒癌蛋白，在HPV感染的癌前细胞和恶性细胞中组成型表达，是理想的肿瘤特异性抗原。最近，几种针对E6和E7的HPV治疗性DNA疫苗通过电穿孔给药可以诱导 CIN2/3 患者高级别宫颈病变的完全消退和病毒清除。这些试验表明，诱导全身性多功能CD8 + T细胞反应的程度是组织病理学消退和清除HPV感染的主要决定因素。 2009年，中国医学科学院基础医学研究所许雪梅团队编码修饰E7和人热休克蛋白 70 （mE7/HSP70）的HPV融合DNA疫苗诱导 E7 特异性 CD8+T 细胞反应。2024年5月13日，许雪梅团队在Research Square上传文章：Enhanced the immunity activity of HPV16 DNA vaccine by the combination CpG oligonucleotides adjuvant cloned into plasmid backbone and IL-28B gene adjuvant，他们采用多种策略，包括将CpG寡核苷酸（ODNs）插入疫苗载体骨架、选择细胞因子基因佐剂、将mE6/HSP70和mE7/HSP70的组合、电穿孔疫苗接种，以进一步提高HPV16 DNA疫苗的免疫效果。 01 DNA疫苗佐剂-细胞因子 为增强该HPV DNA疫苗的免疫活性，研究人员想采用细胞因子基因佐剂。先前已有研究证明L-12、IL-15、IL-28B、IFN-γ 和 GM-CSF 等细胞因子的佐剂活性。然而，在不同类型的疫苗或者不同的接种方式背景下，同一细胞因子的佐剂活性往往是不可预测的。IL-15基因佐剂可显著促进HIV DNA疫苗和克氏锥虫DNA疫苗的特异性CD8+T细胞反应。虽然IL-28B基因佐剂能显著增强HIV DNA疫苗、HSV DNA疫苗和流感疫苗的CD8+T细胞免疫反应，但对结核融合蛋白疫苗触发的免疫保护反应没有任何增强作用。GM-CSF基因佐剂显著增强了SARS-CoV-2 DNA疫苗、抗Lewis肺癌DNA疫苗和HPV16 E6/E7 DNA疫苗的免疫活性，但显著抑制了日本脑炎病毒DNA疫苗诱导的抗体水平和保护作用。 许雪梅团队曾经证实过IL-15质粒可增强HPV DNA疫苗触发的CD8+T细胞免疫反应，而在此次研究中首次采用使用IL-28B质粒作为HPV DNA疫苗的佐剂。将质粒 mE7/HSP70 与 IL-28B 质粒或 IL-15 质粒或生理盐水混合，采用电穿孔的方式注射到小鼠的股四头肌中，间隔10天，注射两次。最后一次注射后七天，分离脾细胞并用E749-57肽刺激 40 小时。 IFN-γ ELISpot 测定结果显示，加入 IL-28B 或 IL-15 能够显着增加 E7 特异性 IFN-γ 释放。与IL-15佐剂相比，加入IL-28B佐剂可诱导更高的IFN-γ释放。此外，通过实时荧光定量 PCR 分析特异性颗粒酶 B 的 mRNA 水平。同样，与加入 IL-15 佐剂相比，加入 IL-28B 佐剂导致颗粒酶 B 的 mRNA 水平显著升高。因此，在mE7/HSP70 DNA疫苗中，IL-28B质粒佐剂比IL-15质粒更有效。 02 DNA疫苗佐剂-CpG寡核苷酸 CpG ODN（寡聚核苷酸）是TLR9的激动剂，通过刺激人B细胞和浆细胞样树突状细胞来增强适应性免疫反应。质粒DNA的免疫原性可能因骨架中CpG基序或ODN的存在而受到调节和增强。在人类中，已经确定了四类合成CpG ODN，它们在结构和免疫活性上有所不同，它们是A-、B-、C- 和P型。与A型和B型基序相比，在炭疽DNA疫苗中插入 C 型基序可增强更高的细胞介导和保护性免疫反应，而接种C型 CpG修饰疫苗的小鼠可增强 Th1偏向性 T 细胞反应。 这些研究表明，CpG 基序适合用作 DNA 疫苗中的“内置”佐剂。此外，研究人员发现添加更多的 CpG 基序拷贝会产生更强的佐剂效果。研究人员合成了一个对人免疫细胞表现出良好刺激活性的B型CpG 基序（5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3），将12 个拷贝的串联序列插入 pVAX1EI 的骨架中，以获得 CpG 修饰的载体 pmVAX1EI。 研究人员以 pVAX1EI （无 CpG 基序）和pmVAX1EI（ 插入CpG 基序）分别为骨架，构建编码mE7/HSP70的两种质粒：pmVAX1EI-mE7/HSP70和pVAX1EI-mE7/HSP70。同时，还构建了编码IL-28B的两种质粒：pmVAX1EI-IL-28B和pVAX1EI-IL-28B两种质粒。用上述质粒采用mE7/HSP70+IL-28B组合免疫小鼠，分离脾细胞并用 E749-57肽刺激。与 pVAX1EI （无 CpG 基序）相比，CpG修饰的质粒诱导的E7特异性IFN-γ更高，分泌的特异性颗粒酶 B 的 mRNA 水平也更高。因此，在后续实验中使用了CpG修饰的载体pmVAX1EI。 03 HPV 16 E6/E7 DNA疫苗联合免疫 目前，针对E7或E6癌蛋白的HPV16治疗性疫苗已有报道，而同时针对E6和E7癌蛋白的DNA疫苗相对较少。研究人员想知道在 IL-28B 基因佐剂存在下，E6/E7联合免疫的效果。研究人员发现，与单独接种 mE7/HSP70 或 mE6/HSP70 相比，接种 mE7/HSP70 +mE6/HSP70 诱导的分泌特异性 IFN-γ 的CD8+T 细胞数量显著更高，分泌特异性 IFN-γ 的CD8+T 细胞数量是单独mE6/HSP70或者mE7/HSP70免疫的3.8倍。在联合免疫的基础上，加入IL-28B佐剂更进一步增强分泌特异性 IFN-γ 的CD8+T 细胞数量。从上述结果来看，在IL-28B基因佐剂存在下，接种编码mE7/HSP70+mE6/HSP70的CpG修饰质粒可以诱导最有效的细胞免疫反应。 04 DNA疫苗在小鼠模型中的预防效果 在存在或不存在 IL-28B 基因佐剂的情况下，通过电穿孔对 C57BL/6 小鼠进行 mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫，以仅接种IL-28B基因佐剂质粒作为对照。C57BL/6小鼠（每组6只）通过电穿孔用15μg/质粒肌内注射接种两次，间隔10天。最后一次接种一周后，在右侧皮下注射 7.5×104 个 TC-1 细胞，然后每周监测两次肿瘤生长。在攻毒试验中，不管是否接种L-28B基因佐剂质粒，只要mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫的小鼠体内均没有肿瘤生长。相比之下，仅接种IL-28B质粒的小鼠在TC-1注射后16 天开始出现肿瘤，到第60天肿瘤的平均大小约为387 ± 18 mm2。 05 DNA疫苗在小鼠肿瘤模型中的治疗效果 每只小鼠皮下注射 7.5×104 个 TC-1 细胞在右侧。3天后，如上所述用质粒对小鼠进行免疫。然后每周监测两次肿瘤生长。在TC-1细胞攻击后的第14天，不管是否接种L-28B基因佐剂质粒，50%的mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫的小鼠体内无肿瘤生长。第32天，在IL-28B基因佐剂存在下，mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫小鼠的无瘤率高达100%，而在没有IL-28B基因佐剂的情况下，mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫小鼠的为67%。到第60天，仅接种IL-28B质粒的小鼠全长出现肿瘤生长，肿瘤的平均大小约为433±27mm2。上述结果表明，在IL-28B基因佐剂存在下，mE6/HSP70 +mE7/HSP70 联合免疫对移植肿瘤表现出最强的免疫清除活性。 06 总结 DNA 疫苗在动物模型中已被证明是有效的，而 DNA 疫苗在人体临床研究中常常表现出没有够的免疫原性。因此，我们需要调节和增强DNA疫苗的免疫效果。有许多策略可以用来增加 DNA 疫苗的免疫原性，包括添加佐剂（细胞因子，CpG 基序，脂质体，脂多糖等），密码子优化，电穿孔及异源初免/加强免疫等。 在这项研究中，研究人员采用多种策略来提升HPV16 DNA疫苗的免疫治疗效果：将CpG基序插入质粒载体的骨架中，将mE7/HSP70质粒与mE6/HSP70质粒混合，结合IL-28B基因佐剂，电穿孔接种，可以显著增强CD8+T细胞特异性反应，从而根除C57BL/6小鼠已建立的移植肿瘤。 参考文献  [1] zhou Y, Zhang T, Wang Z, Xu X. Preprint from Research Square, 13 May 2024. https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-4338069/v1. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。