HLA-DR

1.引言 治疗性蛋白的免疫原性与超敏反应相关。第1型超敏反应涉及产生IgE亚型的抗药物抗体（ADA）。然而，IgE ADA和高滴度IgG ADA的产生可能对包括输液反应和/或过敏性休克在内的重大不良反应有贡献，尽管这些类型的不良反应并不常见。IgE ADA复合物可以与嗜碱细胞和肥大细胞上的Fcε受体结合并交叉连接它们，导致IgE介导的过敏性休克。此外，IgG ADA可以与治疗性蛋白复合，IgG ADA免疫复合物可以交叉连接中性粒细胞上的Fcγ受体，从而释放类似组胺的血小板活化因子。此外，未能从血液中清除的大型治疗性蛋白-ADA复合物在组织如肾脏、滑膜和脉络丛中沉淀，导致组织损伤和器官衰竭。当ADA与内源性蛋白同源物发生交叉反应时，会发生最严重的不良事件。例如，多年给患者使用重组促红细胞生成素（EPO）后意外地发展为纯红细胞再生障碍（PRCA），这一特征被归因于ADA的发展，而没有发展出任何先前的重大免疫原性问题。ADA导致EPO的配方和给药途径的修改。诺华公司开发的通用EPO的临床试验显示了PRCA的发生；在这种情况下，PRCA的发生被归因于药物产品中大量存在的钨微粒引起的产品聚集。ADA与内源性蛋白发生交叉反应的其他临床情况包括人类生长激素配方中存在的聚集物引起的中和ADA，以及重组治疗产品如因子VII中残留宿主细胞蛋白（HCP）引起的ADA。鉴于这些严重结果是由交叉反应性ADA引起的，已经开发了广泛的体外方法来测量ADA的存在。此外，目前也有用于识别单克隆抗体和HCP免疫反应驱动因素的方法。考虑到这些历史结果，监管机构建议生物治疗药物开发商使用结构化方法来测量免疫原性风险。例如，欧洲药品管理局（EMA）已经发布了关于生物技术衍生治疗蛋白免疫原性评估的指南，其中将影响治疗蛋白免疫原性的因素分类为有益的患者、疾病或产品相关类别。除了EMA指南外，美国食品药品监督管理局（FDA）最近对新药产品和现有产品的通用版本的指南也建议了免疫原性风险评估方法，例如，2014年FDA指南—治疗蛋白产品的免疫原性评估指南。这些指南强调了T细胞表位对免疫原性的贡献，并提到了调节性T细胞的免疫调节作用。此外，“关键质量属性”记录在FDA赞助的质量设计倡议中，侧重于制造“工艺开发”，指的是可能使治疗性蛋白具有免疫原性的因子。最近发布的合成肽药物指南继续遵循监管指南趋势，坚持T细胞反应的重要性。值得注意的是，FDA不将小于40个氨基酸的肽视为蛋白质，但免疫原性测试仍然是这些肽的考虑因素，类似于蛋白质的免疫原性测试。FDA建议免疫原性评估应进一步扩展到合成相关的杂质，并建议肽药物开发商确定与活性药物成分共纯化的杂质中T细胞表位的存在。对于基于肽或蛋白质的药物，主要氨基酸序列本身可能是免疫原潜力的强决定因素。除了主要氨基酸序列之外，机构指南指出可能使特定个体倾向于免疫反应的患者和疾病相关类别。一些例子包括免疫缺陷和伴随的免疫抑制治疗，如甲氨蝶呤，可能会降低免疫原性和自身免疫性，而自身免疫可能会增加由于ADA的风险。相比之下，产品相关因素，即最终药物产品本身固有的有助于免疫原性的因素，可能包括糖基化概况的修改，生物物理和生化属性，肽制造杂质和/或降解产物，或在配方准备期间引入的因素。显然，监管指南和更新的临床前免疫原性风险评估方法正在趋于共识，为这篇综述提供了动力。 2.专注于T细胞依赖性免疫原性评估和缓解 虽然免疫原性测试涉及ADA检测，但根本原因是T细胞依赖（Td）免疫反应，无论是由于聚集物、HCP、杂质、由于目标参与导致的免疫调节，还是药物序列本身。因此，Td免疫原性风险评估侧重于可能来自产品序列（蛋白质或肽）的已知肽段，称为T细胞表位。某些药物衍生的肽/表位可能与人类白细胞抗原（HLA）/主要组织相容性复合体（MHC）II类分子结合，然后肽-MHC在抗原呈递细胞（APC）表面呈递给T细胞。更具体地说，从药物物质处理和衍生的T细胞表位（T辅助细胞表位）对ADA的发展至关重要。T辅助细胞表位由HLA II类分子的一个子集（主要是HLA DR，还有DP或DQ）呈递给CD4+ T细胞，然后释放出B细胞成熟和增加ADA结合亲和力成熟所需的必需细胞因子。这些相互作用发生在淋巴器官的生发中心，树突状细胞和B细胞向T滤泡辅助细胞和T滤泡调节细胞呈递T细胞表位，调节体液免疫反应的成熟。正如识别T辅助表位对免疫原性风险评估至关重要一样，通过去免疫化去除T细胞表位是Td免疫原性风险缓解的关键。去免疫化过程现在完全集成到专注于缓解Td免疫原性风险的临床前计划中。降低免疫原性（调节性T细胞表位）的T细胞表位对于引发含有“人类”成分的蛋白药物的免疫反应同样重要，如人类来源的单克隆抗体、酶替代疗法和其他人类来源的生物治疗药物。循环调节性T细胞（Tregs），也称为自然Tregs（nTregs），有助于调节人类免疫反应，已知是表位特异性的。在IgG中发现调节性T细胞表位（Tregitopes）可以改善单克隆抗体的风险评估。 2.1.定义：生物治疗药物的T细胞依赖性免疫反应 生物治疗药物的免疫反应可以分为两大类。在第一类生物治疗药物中，对“外来”蛋白（对患者来说是外来因子）的免疫反应是典型的，类似于对病原体、疫苗或同种型抗原的反应。血液因子如凝血因子VIII就属于这一类，因为它们在完全没有或部分缺乏内源性对应物的个体中发展。对于像庞贝病的酸性α-葡萄糖苷酶这样的替代酶也是如此。在第二类生物治疗药物中，对自体蛋白（“自身”蛋白）的免疫原性表明B细胞和/或T细胞耐受性的破坏，类似于某些自身免疫疾病中对自体蛋白的反应。自身耐受性由循环调节性T细胞主动调节。这些T细胞对自身蛋白（如免疫球蛋白）中的表位序列做出反应（在HLA结合特征方面可能与非自身蛋白相同），但它们对激活其T细胞受体（TCR）的反应不同。例如，Franco和Sette在川崎病免疫球蛋白治疗患者中发现了分泌IL-10以响应IgG中HLA DR限制性T细胞表位的调节性T细胞。在英夫利昔单抗治疗患者中也记录了对源自英夫利昔单抗的特定T细胞表位的IL-10反应（可能是由于Treg激活）。鉴于许多自身蛋白如单克隆抗体含有调节性T细胞表位，破坏免疫耐受的机制尚不明确，类似于对外来蛋白的免疫反应机制，但可能包括表位模仿、T细胞交叉反应、存在微量先天免疫激活剂如Toll样受体激动剂的存在，和/或聚集蛋白。Toll样受体的遗传变异、共刺激分子的多态性以及细胞因子受体的修饰等可能涉及耐受性的破坏。患有自身免疫疾病的患者可能有这些遗传异常之一，并且可能被认为有更高的发展ADA的风险。 2.2.T细胞独立与T细胞依赖反应 除了T细胞反应的调节外，像ADA产生这样的体液免疫反应可能是胸腺独立（T细胞独立[Ti]）而不是Td起源的。例如，当结构模式如聚合物重复或碳水化合物分子通过B细胞受体（BCR）直接激活B细胞时，B细胞可能以Ti方式激活。Ti激活的B细胞可以从Td激活中区分出来。Ti激活产生的抗体在同型和亲和力方面都是有限的，如果产生了记忆B细胞，那么抗体反应就不是长期的。相比之下，Td激活的B细胞以类别转换（IgM到IgG）为特征，如果产生了记忆B细胞，那么抗体反应具有更高的亲和力，更强大，更持久。生物治疗药物给药后IgG抗体的发展通常表明治疗药物正在推动Td免疫反应。根据定义，Td反应取决于T细胞通过抗原处理和呈现蛋白来识别治疗蛋白衍生的表位。由于人类群体表达不同类型的HLA II类等位基因，抗原表位与HLA之间的相互作用可能在人类群体表达的HLA等位基因谱中表现出不同的结合稳定性。这种HLA遗传多态性及其对特定肽结合（HLA限制）的影响是患者遗传学（HLA单倍型）成为对特定蛋白治疗药物免疫反应的主要决定因素的主要机制。 2.3.先天免疫反应 先天免疫系统控制Td免疫的启动。当被称为APC的先天免疫细胞在外围被激活时，它们会迁移到局部淋巴结，在那里它们可以在适当的共刺激信号存在下将药物衍生的肽抗原呈递给抗原特异性T辅助细胞。与TCR和BCR的特异性不同，先天免疫系统的细胞表达胚系编码的不变受体，称为模式识别受体（PRR），它们识别常见的微生物模式（病原体相关分子模式）。PRR包括几个家族的受体，如Toll样受体、RIG-1螺旋酶和C型凝集素受体。PRR不仅识别微生物模式，还识别一类称为警报素或与危险相关的分子模式（DAMPs）的警报信号，这些信号由受压和死亡的细胞大量释放，以促进局部炎症反应。DAMPs有助于对抗病原体、组织损伤和DAMP介导的炎症期间的压力，这发生在治疗蛋白给药期间，并促进适应性免疫反应。此外，宿主细胞和过程衍生的杂质，称为先天免疫反应修饰杂质（IIRMIs），可以通过与PRR相互作用促进适应性免疫，刺激先天免疫系统。体外和体内研究表明，即使在微量水平，IIRMIs也可以破坏对治疗蛋白的耐受性，并促进不需要的免疫反应。对Td免疫原性的新理解包括疾病状态，例如，针对心血管疾病患者的治疗通常不太可能与增加ADA的产生相关，而自身免疫疾病患者可能表现出一系列可以导致对治疗反应增加倾向的免疫功能障碍。或者，一些患者群体可能有不寻常的HLA分布，这些分布与更大程度地呈现来自药物序列的T效应表位有关，导致更高或更低水平的免疫原性。最后，药物本身的作用机制可能会干扰或促进免疫系统的激活，导致免疫原性风险更高或更低。在100人中看到一两个人（每100人）具有比其他人更高的基线免疫反应并不少见；这些高风险个体也可能对传递载体有夸张的免疫反应。受试者的基线免疫状态（包括B细胞和T细胞库以及HLA单倍型）可以影响他们对生物制剂产生免疫反应的能力。此外，如上所述，生物治疗药物在自身免疫疾病患者中可能更具免疫原性，因为受体患者的免疫系统存在潜在的炎症状态。在过去的几年里，针对自身免疫疾病患者的特定药物包括抗TNF药物，在选定的患者群体中具有显著不同的免疫概况。自身免疫疾病患者中ADA滴度增加的解释各不相同；然而，这些患者可能有缺陷的调节性T细胞或缺乏功能性调节性T细胞细胞因子受体（白细胞介素[IL]-2和IL-10）。调节性T细胞或调节性细胞因子的功能受到干扰，这些细胞因子对Treg功能至关重要，可能会显著降低Treg对含有Tregitopes的药物的反应，包括许多用于治疗自身免疫疾病的单克隆抗体。像甲氨蝶呤和TNF抑制剂这样的药物可以恢复Treg功能，当药物达到治疗水平时，可能会降低ADA滴度。这是RA活跃、加重的患者ADA滴度高的一个潜在解释，这也可能会解释为什么在有效抗炎药物治疗后ADA可能会消失。 2.4.药物功能作为免疫原性的决定因素 针对免疫系统的生物治疗药物的出现已经明确表明，药物本身的作用也可以促进或调节免疫原性，并在抗TNF药物的活性中发挥重要作用，因为TNF对调节性T细胞的作用，如上所述。抗TNF治疗后Treg功能的改善可能会导致在临床过程中对抗TNF药物的ADA滴度降低。同样，IL-2，一种调节性T细胞所需的细胞因子，不仅可以诱导亲调节环境，还可以降低药物产生ADA的可能性。这种机制可能有助于低剂量IL-2治疗在自身免疫疾病中的有效性。相反，IL-2也可以增强效应T细胞反应的功能，并已在治疗病毒和肿瘤疾病中以高剂量使用。 2.5.药物靶标和免疫原性：检查点抑制剂 一些药物如检查点抑制剂（CPIs）增强免疫反应；因此，CPIs在治疗侵袭性癌症方面已证明成功。然而，一些CPIs比预期更具免疫原性，可能导致随着继续治疗而失去疗效。一个假设是，它们的作用降低了可能存在于CPIs序列中的自然Tregitopes的耐受作用和/或增强了效应T细胞对药物序列中外来表位的反应。 2.6.药物靶标和免疫原性：抑制抗炎细胞因子 与CPIs相反，某些抗细胞因子药物比预期的免疫原性要小得多。其中一种药物是托珠单抗，一种抗IL-6生物制剂，目前广泛用于治疗RA和其他自身免疫疾病。值得注意的是，由于IL-6是T细胞激活所必需的，干扰IL-6可能会减少T细胞参与，从而降低ADA滴度。利妥昔单抗是另一种可能直接干扰免疫原性的药物；这种药物靶向发育中的B细胞上的CD20，并减少抗体分泌浆细胞的形成，这可能解释了为什么在利妥昔单抗治疗期间通常检测不到ADA。 2.7.肽类药物 在过去几十年中，肽合成的重要进展促成了治疗性肽药物制造的重大转变，并扩大了进入临床管线的新型肽的数量。对于单克隆抗体、血液因子和重组酶，肽药物中存在的HLA结合序列可能会激活调节性或效应T细胞，因此，这些肽在临床使用中可能表现出免疫原性。从完全重组到合成肽药物的转变引起了监管机构对合成相关杂质可能诱导不需要的免疫反应（包括产生ADA）的担忧。监管机构对选定的通用肽的经验导致了FDA仿制药办公室最近引入的通用肽产品指南草案。肽类药物的免疫原性主要与肽合成方法有关，因为可能会引入可能难以从最终药物制剂中去除的肽杂质。这些杂质可能含有可能有助于T细胞激活（随后，ADA）的新T细胞表位。在某些情况下，杂质的存在与过敏性休克有关。在肽合成过程的每一步可能会无意中产生几类肽杂质，如氨基酸插入和删除、非对映异构氨基酸的合并以及氨基酸R基团的氧化。杂质也可能在储存过程中产生。相对于Td免疫原性，当无意的氨基酸序列修改导致含有新HLA结合配体或改变现有表位的TCR面向轮廓的杂质时，可能会引入新的T细胞表位。 2.8.计算机辅助筛选 当前的免疫原性筛选实践通常从计算机辅助筛选评估开始，然后根据需要进行HLA结合测定、T细胞测定和MHC相关肽组学（MAPPs）。一些团队从MAPPs开始，不使用计算机辅助工具；然而，MAPPs消耗资源且成本高昂。对可用计算机辅助工具的更多经验和熟悉可能会促进这些工具作为未来免疫原性评估的第一步的更大适应。本节简要介绍用于计算机辅助筛选的工具，并强调这些工具的改进。 2.9.T细胞表位预测 ADA介导的反应是由于适应性免疫反应，由T细胞对HLA结合在APC表面展示的线性肽表位的反应支持。对于通过常规途径（外源性的，即静脉内、皮下和局部）输送的生物治疗药物，通过II类途径向CD4+辅助T细胞的呈递最为相关；然而，如上所述，涉及CD8+ T细胞反应的生物治疗药物由病毒载体和细胞治疗输送是一个日益关注的问题。幸运的是，现在可以高度自信地预测T细胞表位。T细胞表位序列的核心残基（由九个氨基酸组成）定义了与HLA DR、DP和DQ等位基因的口袋的结合亲和力和稳定性。在几个公共和学术平台上，有多种方法可以评估完整蛋白的免疫原潜力，有时这些方法与基于假设结合亲和力和T细胞前体频率的数学模型或与MAPPs确定的肽组搭配。用于表位扫描的公共网站可能会出现和消失，并且可能会修改，通常不通知，这导致随时间变化的免疫原性解释的变化。出于这个原因，许多中到大型制药公司导入在线算法并在其防火墙内运行它们，以减少知识产权披露的风险。其他公司或机构使用像安全访问的商业级ISPRI工具包这样的基于网络的工具，或将免疫原性解释外包给商业研究组织。一些工具，如商业ISPRI平台，使用独特的算法和代码来识别单克隆抗体序列中的Treg表位，并对表位内容相对于随机预期进行统计评估，并针对自身性（即耐受潜力）进行调整。使用标准化的“免疫原性量表”，可以直接将新的生物药物产品与其他已知的非免疫原性和免疫原性产品进行排名。该工具包不仅具有寻找“类人”（见下一节）的表位的新算法，因此不太可能参与激活的T细胞，而且还具有直接进行计算机辅助分析的去免疫化和耐受化方法。 2.10.筛选自身性（耐受潜力） T细胞不仅识别肽序列，还识别与HLA分子裂隙中结合的肽复合物。在任何HLA配体中，某些氨基酸与HLA分子本身接触，而其他氨基酸对TCR可接近。如果来自特定表位的TCR面向残基在来自人类蛋白质组的多个HLA结合序列中保守，则该表位可能会激活特定于这些人类蛋白的T细胞。这可能导致由自然Tregs产生的调节性反应，或者由于T细胞在胸腺选择期间的无力或删除而导致的有限或无反应。对于许多HLA等位基因，HLA结合裂隙中的锚定肽位置是已知的，其他残基与TCR相互作用。可以采用诸如JanusMatrix之类的算法，将来自候选治疗药物的预测表位与人类蛋白质组进行筛选，以区分更类似于自身、因此可能被耐受的肽与那些人类交叉保护有限、因此更可能被人类免疫系统识别为“外来”的肽。治疗衍生的“外来”表位很可能是针对治疗性T细胞反应的目标。 2.11.筛选相关肽库 如果确定了T细胞表位，那么也可以确定表位是否已经在体外或体内进行了测试。免疫表位数据库（www.iedb.org），是美国国家过敏和传染病研究所的一个合同项目，现已整理了20,860篇期刊文章和直接提交的内容，编目了近622,105个肽表位。通过将新序列与此数据库筛选，研究人员可以确定开发产品中的表位是否已报告为MHC配体，以及是否已知T细胞反应的表型，这允许将已知序列与具有更大免疫风险的未知序列进行分类。此外，当识别到风险信号时，包含来自APCs的序列的蛋白质组学数据库可以揭示组织和疾病状态之间的重要关系，以通知临床研究期间的仔细监测。7.2.12 按免疫原潜力对生物制剂候选物进行排名 在所有其他因素都相等的情况下，给定蛋白质中包含的T细胞表位的负担越大，该蛋白质诱导免疫反应的可能性就越大。可以通过在ISPRI工具包上执行的操作来实现一种生物制剂与另一种生物制剂的比较，通过对HLA等位基因的表位含量得分进行标准化并根据序列长度进行调整。区域表位密度也可以驱动免疫反应。 3.评估免疫原性风险的体外方法 广泛的验证体外测定可能成本过高；因此，在当前的临床实践中，正在执行使用先进的计算机辅助工具进行的分析。计算机辅助分析后，可以进行HLA结合和T细胞测定，或外包给商业研究组织。这些测定可以应用于（i）药物开发的非常早期阶段，以设计预测免疫原性低的新治疗药物，（ii）在后期阶段，对在人体首次研究中表现出高免疫原性的临床资产进行去免疫化，或者（iii）在项目终止后回顾性地进行，以解释观察到的高临床免疫原性背后的机制和风险因素。显然，对于新的（以及旧的生物药物的通用版本）生物药物要成功，如果在开发阶段的临床前进行免疫原性风险评估，则最具成本效益。 3.1.人类白细胞抗原结合测定 产生T细胞反应的第一步是APC将肽抗原呈递在HLA II类/MHC II类分子上供T细胞识别。一旦通过计算机辅助分析鉴定出潜在表位，可以通过HLA结合测定来首先验证预测，按照Steere等人描述的方法进行，以评估肽与一个或多个HLA超型等位基因结合的能力。超型等位基因指的是共享表位结合基序的HLA-DR等位基因家族。利用这些超型家族，可以在覆盖全球超过95%的人口的同时，对相对较少的等位基因进行结合测定。产生有意义的结合测定数据的一个关键因素是设计要测试的肽序列和测试肽的来源。II类肽的核心结合区域包含九个氨基酸，位于HLA分子的肽结合槽中。这种相互作用由核心结合区域两侧的邻近残基稳定，并延伸到结合槽外面。在设计结合测定的肽时，重要的是要正确地将结合基序置于HLA结合测定中，并具有最佳肽设计。简而言之，感兴趣的肽与特定等位基因的标记追踪肽和可溶性HLA超型单体一起孵育至平衡。第二天，停止结合反应，将混合物转移到预先用pan抗HLA-DR抗体包被的测定板中，并孵育过夜。在此孵育后，进行显色，肽结合通过时间分辨荧光光谱间接测量。使用固定浓度的标记追踪肽和一系列浓度的测试肽，可以生成一个多点剂量范围曲线，从而计算出IC50值，该值不仅提供肽与HLA结合能力的信息（是/否），还提供肽对给定HLA-DR超型的相对亲和力。IC50值可以用来根据它们对给定HLA等位基因的亲和力将肽分类，如高、中等、低和非结合。随着新技术的出现和可访问性，研究结合反应的动力学将提供更多细节。肽纯度也会影响结合测定的结果。某些制造商的肽纯度可能低至60%，这是由于制造过程和原料的纯度。肽内的杂质可能导致假阳性结果，因此导致错误的结论。结合测定的肽应具有最低85%的纯度，并应作为净肽订购。错误的结果也可以归因于错误的合成。例如，非结合肽可能是在同一台机器上合成的，该机器用于早期合成HLA结合肽。这种污染可能会破坏药物开发计划；参考中提供了一个示例。 3.2.外周血单个核细胞测定 从全血中分离的外周血单个核细胞（PBMC）是用于体外细胞基础测定的免疫原性预测中最广泛使用的效应细胞来源。实验中使用的PBMC可以来自健康志愿者或受影响患者的样本中新鲜分离，或从未冷冻保存的库中解冻，可能覆盖适当的疾病相关或常见且有充分文献记录的HLA等位基因的代表性。由于高通量和易于执行，使用全血PBMC或CD8+ T细胞耗尽的PBMC的PBMC测定仍然是最常用的体外细胞基础测定，用于测量免疫原性潜力。 3.3.树突状细胞-T细胞测定 体外单核细胞衍生的树突状细胞（moDCs）和自体CD4+ T细胞的共培养越来越多地用于评估药物候选物和产品关键质量属性（CQAs）的免疫原性潜力。DC-T细胞或DC-PBMC方法将系统简化为细胞介导免疫的基本组成部分：CD4+ T细胞与APCs在相关细胞比例下相互作用，这提高了灵敏度，因为实验系统中潜在反应细胞的总数远大于整个PBMC方法。然而，这种方法耗时且需要分离和分化单核细胞为DCs，然后进行抗原装载/脉冲步骤，这可能依赖于试剂、操作员和材料。单核细胞可以从PBMCs开始，通过塑料粘附或使用磁珠分离方法进行分离。然后使用细胞因子或其他因素进行moDCs的分化和成熟，同时添加所需的生物治疗药物、肽片段或聚集体。成熟的、脉冲化的moDCs通常与自体纯化的CD4+ T细胞共培养，以允许抗原呈递和T细胞激活，这取决于免疫原性潜力。反应的测量方法与PBMC测定相同，如上所述。moDC-T细胞系统的高级变体是模块化免疫体外构建（MIMIC R）模型，它能够可靠地产生针对生物制剂如蛋白质、肽、单克隆抗体和包括核酸在内的新型方式的抗原特异性先天和适应性免疫反应，也已用于这些目的。 3.4.流式细胞术分析T细胞表型 流式细胞术已成为免疫原性测试的宝贵工具，允许对免疫反应进行单细胞水平的特征描述。随着使用更多激光和滤光片组合的更复杂仪器以及染色和检测方法的进步，可以从患者的血液样本中获得大量信息。T细胞表位具有免疫原性或耐受性的能力。虽然在细胞培养中测量Tregs的扩增可能具有挑战性，但可以通过在存在免疫原性肽的情况下与效应T细胞共培养来确认Treg表位的存在。在这个旁观者测定中，激活的Tregs抑制抗原特异性T效应细胞对免疫原性肽的反应。标准旁观者测定利用对抗原的免疫记忆，如破伤风毒素，大多数细胞群体通过疫苗接种或自然暴露已经接触过。PBMCs在存在灭活的破伤风类毒素和Tregitope的不同浓度下培养10天。细胞经过染色分析，然后通过流式细胞术计数（Teff细胞定义为CD3+CD4+CD25+FoxP3low，Treg细胞定义为CD3+CD4+CD127lowCD25+FoxP3hi）。然后可以通过CFSE稀释测量细胞增殖。在存在Tregitope和破伤风类毒素的情况下，与单独存在破伤风类毒素相比，T效应细胞的增殖减少。 3.5.主要组织相容性复合体相关肽组学测定 在1990年代初，首先描述了一种称为MAPPs的额外方法。这种测定在识别APCs表面呈递的相关HLA上的处理肽方面证明是有价值的。此外，这种方法提供了健康受试者和疾病患者的抗原处理变异性的详细信息，并且与HLA相关的肽的测序可以确认/验证使用算法识别的序列。液相色谱-质谱灵敏度和蛋白质组学分析的最新进展使得HLA结合映射测定可以在临床前用于映射生物治疗药物中存在的潜在抗原序列。并非所有潜在的HLA结合肽都被APCs处理和呈递，因为HLA结合的部分展开和天冬氨酰蛋白酶修剪的结合。此外，HLA DM和HLA DO的编辑功能进一步提高了要呈递的肽的选择性。在这些测定中，APCs在体外产生并与感兴趣的治疗蛋白孵育24小时，之后它们经历细胞因子/有丝分裂原诱导的成熟步骤以上调HLA表达。细胞溶解后，HLA受体-肽复合物进行免疫沉淀，其中复合物被分离，然后进行酸洗脱步骤，肽从HLA复合物中解离，然后通过液相色谱-质谱测定肽序列。使用蛋白质组学蛋白质数据库算法可以进行内源性肽的减法和肽到治疗的映射。这些测定可能会识别出可以针对去免疫蛋白工程的抗原肽。此外，来自疾病患者的全血分析可以提供呈递改变以及对重组替代治疗的耐受性方面的见解。算法、先天和适应阶段输出以及MAPPs，所有这些都在案例研究中使用，已应用于抗IL-21受体ATR-107。对一级序列的计算机辅助分析预测了重链互补决定区（CDR）2中的两个重叠的CD4+ T细胞表位，以及轻链CDR2中的一个单独表位。MAPPs确认了LC CDR2中的表位作为DCs呈递的主要肽。ATR-107诱导DC激活，这可以通过细胞表面激活标记的上调表达、细胞因子产生增加以及在共培养条件下自体CD4 T细胞的特定增殖来证明。使用MAPPs验证计算机辅助预测结果可以为开发商提供保证。然而，MAPPs测定中肽的洗脱并不确认肽是否推动Td免疫反应。T细胞反应可能因响应序列的T细胞表型而异。当MAPPs在没有额外工具探索响应洗脱肽的T细胞表型的情况下使用时，可能会过高预测免疫原性。个体表位驱动免疫原性的重要性在Cassotta等人最近的一项演示中得到了加强，他们对针对α4整合素的人源化抗体纳他珠单抗的免疫原性进行了MAPPs分析。利用计算机辅助和体外细胞测定的组合，如与患者外周血液中分离的B细胞进行的MAPPs测定，作者确定两名接受纳他珠单抗治疗的多发性硬化症患者发展出中和ADA，对位于轻链V区的CD4+ T细胞表位有T细胞反应。 4.通过去免疫化和耐受化减轻免疫原性 4.1.去免疫化 减轻免疫原性的理想起点是通过工程设计分子，使其在患者中引发不需要的免疫反应的风险较低。这可以通过结合去免疫化和耐受化过程来实现。在单克隆抗体的情况下，去免疫化过程包括两种非互斥方法：超人类化，即将小鼠CDRs移植到人类来源的抗体框架中，以及移除T细胞表位序列，这些序列是使用表位预测对数和体外确认测定的组合来识别的。将小鼠CDRs移植到人类V区域通常会导致亲和力下降或丧失，这可以通过在人类框架中对药物-靶标相互作用至关重要的位置引入小鼠氨基酸（所谓的“回变”）来恢复。这些回变可能会引入额外的T细胞表位；因此，需要应用迭代和及时的去免疫化策略，以在分子序列被优化以实现预期的预测效果时，耗尽去除表位的可能性。在这种情况下，增强的二元替代技术可能是一个有效的组合方法，但需要进一步探索。 4.2.耐受化 与去除有害的CD4+ T细胞表位互补的是引入T调节序列，这个过程被称为耐受化。耐受化在替代疗法中特别有趣，在替代疗法中去除T细胞表位可能会影响药物功能，或者在基因疗法中用来平衡由衣壳抗原决定基引起的细胞毒性反应的激活。事实上，预防性给药腺相关病毒AAV衍生的衣壳蛋白融合到Treg表位可以减少病毒衣壳特异性CD8+ T细胞反应，并伴随着Treg细胞计数的同时增加。迄今为止，预期减少去免疫化和/或耐受化分子的免疫原性的证明依赖于体外和体外测定或临床前模型。高度免疫原性的单克隆抗体的去免疫化形式尚未在临床环境中完全适用，因为生物治疗药物开发商专注于开发具有更长专利寿命和更大操作自由度的新型、免疫原性较低的分子。 4.3.治疗诱导的耐受性 减轻ADA发展风险的努力通常集中在降低治疗蛋白的内在免疫原性上，对于患有血友病A和B的患者，他们对重组凝血因子产生抑制分子，已经建立了免疫耐受诱导协议。针对基于单克隆抗体的药物的ADA反应也可能导致反应丧失和药物更换，即使是完全人源化的分子也是如此。在这种情况下，已经构想并审查了各种诱导对生物治疗药物免疫耐受的方法。对其他救命治疗蛋白的ADA反应，如酶替代疗法，已经损害了治疗效果，有时甚至导致死亡。对于基因疗法，对转基因和病毒载体的ADA发展仍然是成功治疗的主要障碍：对病毒衣壳有预先存在的中和抗体反应的患者没有资格接受治疗，发展出治疗诱导的体液免疫的患者将没有资格重新剂量。“去免疫化”指的是去除推动T辅助介导的免疫反应的T辅助表位可能会减少T辅助免疫反应，而“免疫工程”或“耐受化”指的是通过保留或引入Treg表位（Tregitopes）到蛋白质序列中来识别和增强Treg反应。这种计算机辅助方法使得引入调节性T细胞表位以减少免疫原性的潜力成为可能。或者，可以使用现有的药物制定与免疫耐受诱导相关的方案，这些药物针对与ADA发展相关的免疫瀑布的主要参与者，通过抑制有害的效应T细胞反应或激活耐受途径。前者可以通过干预与T细胞和B细胞激活相关的机制或通过使用免疫抑制剂如环磷酰胺或甲氨蝶呤、抗CD3或抗CD20抗体、蛋白酶体抑制剂或多种耗尽剂的组合来实现。已经应用了几种这样的方法，包括同时使用甲氨蝶呤来减少T细胞介导的免疫原性。在庞贝病和对FVIII疗法抑制剂的耐受性诱导中，目前使用的方案涉及多种药物的组合，如利妥昔单抗（消除抗体分泌B细胞）和静脉注射免疫球蛋白（结合并去除抗体或诱导耐受性）。庞贝病的方案中加入了甲氨蝶呤，这种修改后的方案已经成功地在患有高风险庞贝病的婴儿中建立了对阿糖苷酶α的耐受性。其他正在考虑的方法包括同时给予纳米粒子形式的雷帕霉素方案或与Tregitopes共同给予。在体外条件下，注入扩增的Tregs和Bregs并表达抗原特异性受体可以控制血友病A临床前模型中抑制物的发展。大多数免疫耐受诱导方法仍处于开发初期，这些干预措施的长期效果仍然未知。然而，已经达到临床环境的耐受性方案的价值是激励继续评估免疫耐受诱导作为减轻生物治疗药物不需要的免疫原性的手段。 4.4.抗药物抗体测定标准化 由于缺乏ADA测定的标准化和协调，跨临床研究比较治疗蛋白的免疫原性一直具有挑战性。对于给定的治疗蛋白，关键测定参数（如灵敏度和药物耐受性）的变异性可能导致各个实验室对临床发病率的不同估计。在这种情况下，由Innovative Medicines Initiative（IMI）资助的ABIRISK财团（针对生物制药免疫：预测和分析临床相关性以最小化风险）产生了单克隆抗体，用作ADA测定中的标准。这些通用标准可用于基准测定灵敏度和药物耐受性，常规监测测定性能，并验证生物仿制药ADA测定中的抗原性等效性。此外，基于这些标准的免疫原性评估可以帮助临床医生了解如果观察到效果丧失的剂量策略。针对利妥昔单抗、纳他珠单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗或干扰素β的各种同型和亲和力的单克隆中和抗体是从用相应的治疗蛋白免疫的患者中分离的B细胞产生的，如前述方法所述。生产规模扩大和进一步的表征分析使用ABIRISK验证ADA测定正在进行中。最终，所有抗体将在国家生物标准和控制研究所公开提供。 5.新方式和免疫原性风险评估 如在“新方式”部分所讨论的，新的治疗方式，如细胞和基因疗法，在临床环境中已显示出免疫原性。这些方式可以刺激免疫反应的机制是复杂的，因为高水平的工程、细胞内表达、引入工程基因产品和复杂的输送系统。主要为蛋白质治疗药物开发的修改免疫原性风险评估工具和测定可用于最小化这些新型治疗的免疫原性风险。 5.1.特定细胞系/可溶性T细胞受体 依赖于APCs展示处理肽段在HLA类I/II背景下与T细胞库相互作用的新体外测定方法，被证明对于进一步定义抗原特异性和免疫反应传播非常有用。此外，使用表达类I和类II HLA的工程B细胞系有助于高通量预测细胞内处理和呈现潜在抗原表位。例如，在竞争性方法中，使用可溶性TCRs识别HLA参考肽复合物，用于检测单等位基因APC系呈现潜在免疫原性表位（默克，未发表数据）。 5.2.建模 如上所述，可以在开发的早期阶段部署各种计算机辅助和体外工具，以指导蛋白质工程和设计预测免疫原性低的药物候选物。然而，这些工具可以用来评估与产品相关的风险，特别是基于序列的风险，但它们可能不会揭示与免疫原性相关的因素，如患者和治疗相关因素。免疫原性的总体风险依赖于不同风险因素的加权和整合，其中一些是经验性的或理论性的。免疫原性定量系统药理学（QSP）模拟器可以帮助简化和统一这种整合。它们结合生物治疗药物、生理学基础的药代动力学（PK）和免疫反应的机制模型，以模拟大规模临床试验并预测免疫原性的发生率。可以模拟关键变量如HLA基因型、联合疗法、剂量方案和给药途径对ADA发生率的影响，以及ADA对药物PK的影响。QSP模拟器仍在开发中，它们需要更多的经验输入数据和完善与免疫系统相关的参数，如抗体发展的动力学。验证后，QSP模拟器可以促进个性化管理和减轻免疫原性。 5.3.免疫原性重点组织 由于在准确进行免疫原性风险评估以及测量和确定ADA的临床相关性方面存在挑战，制药公司、生物技术研究所和合同研究组织联合起来，通过解决现有差距在该领域取得进展。创建了科学非营利协会，如欧洲免疫原性平台（www.e-i-p.eu/）。该平台旨在促进免疫原性专家之间的交流，鼓励和领导与监管机构的互动，以及与更广泛的科学界分享知识和免疫原性领域的最新进展，并提供关于免疫原性的实践和监管方面的培训课程。 ABIRISK财团是另一种协作方法，旨在促进免疫原性科学的进步。临床和基础研究学术中心与工业伙伴合作进行了为期6年的研究项目，并解决了与不需要的免疫原性相关的一些主要问题和实际障碍，如现有预测工具的价值、ADA测定、协调和标准化、检测到的ADA的临床相关性、患者风险因素的识别和预测标记。 这种广泛的跨实验室合作在欧洲、美国和以色列产生了一个衍生倡议。BIOPIA（https://ki.se/en/cns/biopia）是一个非营利性努力，由欧洲实验室组成，这些实验室在生物制药PK和许多疾病的免疫原性方面拥有专业知识，这一倡议旨在提高对免疫原性的意识，并倡导整合药物水平和ADA测试以改善患者管理。该网站提供有关ADA和药物水平测试的信息，主要是帮助临床医生实施免疫原性和药物水平的常规临床测试。在美国，也在进行类似的努力，作为AAPS（美国制药科学家协会）的治疗蛋白免疫原性社区的一部分。免疫原性风险评估和缓解工作组进行了一项调查，以表征性能和协调风险评估方法，包括通过成员调查的算法和体外测定。未来的重点是适应当前工具并开发创新测定，以回答有关新方式和下一代疗法的问题。 5.4.监管机构对免疫原性的看法 最近的FDA指南提出了一种基于风险的方法来评估治疗蛋白诱导的免疫反应及其对安全性和效力的影响。还建议在生物仿制药开发早期制定基于风险的策略，最好在人源化之后，并与其他开发能力努力并行。早期评估将使由于结构和序列而产生的负债有更强大的理解。通过药物开发的不同阶段持续评估风险，可以指导临床应用的生物分析策略，这在以下部分描述。风险评估包括由于与蛋白质表达和纯化以及配方/辅料诱导的聚集或降解相关的工艺变化而引起的翻译后修饰的风险。 5.5.将风险评估整合到临床前管线中 简而言之，免疫原性风险评估应考虑潜在的治疗益处，并将其与考虑患者人群类型和适应症以及治疗靶标的以往经验的免疫原性潜在影响进行权衡。 对生物制剂候选物的早期评估允许基于识别风险的最低概率进行排名。还有去免疫化/序列优化的空间，其中去除几个氨基酸以去除表位或插入调节性序列以驱动抑制性T细胞反应。此外，基于风险的策略应包括由于与蛋白质表达和纯化相关的工艺变化引起的翻译后修饰的负债，以及由于配方/辅料引起的聚集或降解。 在开发基于风险的策略期间，还应考虑治疗蛋白的早期药理学知识，包括靶标参与和随后激活免疫途径。临床前毒理学研究为生物仿制药的安全性提供了见解。 可以在不同阶段用于候选物选择以最小化免疫原性风险的工具和测定。例如，在计算机辅助筛选中，可以使用基于计算机的算法评估不仅氨基酸序列对潜在HLA类I和II结合和可能发生化学修饰的残基，还可以评估聚集体的蛋白质结构。可以进行体外测定以评估生物治疗药物在不同供体组中激活T细胞的潜力。这些测定可以与整个蛋白质一起进行，以可能包括靶标参与，或者与重叠肽一起进行，以排除靶标参与。MAPPs和HLA结合测定旨在识别分子内的抗原。当在药物开发过程中出现特定问题时，可以使用包含免疫系统额外部分的体外和体内模型。评估非序列生物物理参数影响的先天免疫系统激活测定可以用来优化工艺开发和配方或工艺变化。临床免疫原性数据和患者特征是验证、评估和改进与靶标和非靶标负债相关的临床工具和测定关联问题的有效性的关键组成部分，特别是当临床前和临床靶标具有同源性时。如果有先前的临床经验，基于风险的策略也可以成为优势，例如，已经处于商业阶段的类似靶标的蛋白质的临床经验。此外，如果对一种疾病适应症的治疗蛋白有足够的临床经验，那么与安全性和效力相关的研究结果也可以总结为正在为新IND开发的新药（IND）的应用。 6.五年展望 由于免疫原性风险评估方法的进步，以及针对产品（主要序列和配方）的去风险工作，以及对可能导致ADA发展的患者因素的理解的提高，大多数生物治疗药物开发商正在将评估整合到药代动力学/药效学（PK/PD）、安全性和临床效力结果中，以更好地了解新产品或生物仿制药的风险。在药物开发过程中（设计新序列、选择领先化合物、去风险识别的负债或比较生物仿制药优先级），应持续考虑使用新兴技术（新的计算机辅助、体外和体内测定）。这些方法还提供了风险估计，包括对临床免疫原性的个体风险（HLA类型）的先验知识。目前不推荐在动物模型中进行体内研究以进行免疫原性测试，因为动物模型中的HLA与人类HLA之间的差异。相反，体外测定更适用于评估细胞介导的免疫反应的风险。在从一种模型物种过渡到另一种模型物种或人类时，可以预期MHC相关免疫反应的变化。在小鼠、非人灵长类和其他模型物种中与MHC结合的T细胞表位通常与与人类MHC结合的表位不同。大多数生物制剂的临床前研究通过在体外条件下测试免疫原性来规避这一问题，其中选择人类PBMC样本以广泛覆盖人类MHC。 在未来5年内，预计大部分风险评估将首先在计算机辅助下进行，然后再转移到（有限的）体外和体内模型。这是因为大多数进行全面临床前开发的制药公司实际上为单一目标生成了数千个潜在候选物。计算机辅助分析是免疫原性的一个很好的初步方法，它允许在需要的地方使用体外方法详细检查某些分子特征。随着更多结果可供公众审查，计算工具的准确性将提高。机器对机器界面，使得可以集成和高通量筛选同一目标的多个候选物，将同时改善临床开发候选物的临床前选择。药物开发商应该熟悉可用的工具，因为预计要筛选的候选物化合物数量将使其无法在没有自动化的计算机辅助分析流程的情况下进行管理。未来，计算机辅助分析（和体外验证）的范围也可能包括HLA类I免疫原性评估和体外测定。这是由于引入了新的治疗方式和病毒载体，它们与MHC类I途径相互作用。 免疫原性风险评估领域已经成熟，并将在新的治疗方式进入临床环境时继续发展。 免疫原性或不良免疫反应被定义为治疗性生物制剂产生针对自身和相关蛋白的免疫反应的倾向，或诱导免疫学相关的非临床效应或不良临床事件。在治疗性生物制剂开发过程中有两种类型的免疫原性： • 期望的免疫原性通常与疫苗接种有关。注射抗原（疫苗）刺激针对病原体（病毒、细菌、癌细胞等）的免疫反应，目的是保护宿主。 • 不期望的治疗性生物制剂的免疫反应也可能中和它们的生物活性并诱导不良事件，不仅通过抑制治疗性生物制剂的效力，还通过与内源性蛋白对应物发生交叉反应，导致其生理功能丧失（例如，中和抗体对治疗性EPO导致PRCA，通过中和内源性蛋白）。这种免疫原性概述是治疗性生物制剂发现和开发中后者的不良免疫反应。 抗原处理由专业的APCs如DCs、巨噬细胞和B细胞执行。这个过程包括两个步骤：首先，抗原捕获，其中抗原被送至细胞抗原处理机制；其次，抗原处理和呈递，其中与MHC分子结合的抗原肽被产生以呈递给适应性免疫细胞。细胞外抗原通过吞噬作用、巨噬细胞吞噬作用和受体介导的内吞作用被APCs捕获。在内质网或溶酶体的酸性环境中，抗原被降解成许多含有T细胞表位的免疫原性肽。摄取抗原后，MHC类II分子首先在内质网中合成，然后通过高尔基体运输，与抗原肽结合形成肽-MHC II复合物，然后这些复合物被呈递到APCs表面。TCRs可以识别肽-MHC-II复合物以激活T细胞以启动免疫反应。抗原呈递的质量取决于肽-MHC复合物的亲和力，肽-MHC复合物稳定性与免疫反应之间存在直接关系。APCs与CD4+ T细胞的结合能力通过DC-T细胞测定来确定。 治疗性生物制剂的免疫反应可以显著影响治疗性生物制剂的效力和患者安全性。第一代治疗性单克隆抗体是小鼠来源的，基于这些抗体的药物在患者中引起高度不良的免疫反应，因为抗体；这些免疫原性反应在人源化单克隆抗体中大部分被抑制，但仍有一定的关注。 不良免疫反应导致ADA的产生，导致许多临床相关效应（表7.1），导致过敏性休克、细胞因子释放综合征和交叉反应中和内源性蛋白，这些蛋白介导关键功能。当ADA的存在得到确认后，除了滴度和分析抗体的中和能力外，进一步的特征化可能是有用的，例如，急性超敏反应的免疫球蛋白类别。也可以对临床重要的ADA进行进一步分型，或确定ADA的“阈值”水平，超过这个水平对药物效力和安全性有显著影响。 从根本上说，鉴于目前许多治疗性生物制剂正在开发中，关于免疫原性的最重要因素是它是PK的协变量；当针对治疗性生物制剂发生免疫原性时，它会增加药物从体内的清除并减少对治疗性药物的暴露。患者相关和产品相关因素可能会影响治疗性生物制剂的免疫原性。这些因素是免疫原性风险评估（表7.2）的关键元素，并需要在免疫原性测试协议中考虑。 7.免疫原性调查 应在目标人群中调查免疫原性，因为动物测试和体外模型并不总能预测人类的免疫反应。在生产变更后证明产品可比性以及在产品获批后生产过程变更的情况下，免疫原性发挥着重要作用。然而，该协议不适用于开发过程中对拟议的生物仿制药产品进行测试。即使是微小的差异也可能影响生物活性、效力或安全性，包括拟议生物仿制药的免疫原性。 评估治疗性生物制剂中的物理化学或配方属性，如杂质、异质性、聚集体形成、氧化和脱酰胺作用，可以指导免疫原性的预测和开发免疫原性较低的治疗剂。此外，预测治疗性生物制剂中潜在的免疫原性表位是提高药物安全性和效力的重要且有效的策略。在治疗性生物制剂开发过程中，有多种临床前免疫原性评估策略可用，如表7.3所示。 7.1.测定 生物仿制药开发商应在临床免疫原性评估中评估以下与抗体相关的参数： 滴度、特异性、相关亚型分布、药物开发的时间进程、持续性、消失、对PK的影响以及与临床后遗症的关联。 产品活性中和：对所有相关功能（例如，摄取和催化活性、酶替代治疗的中和）的中和能力。 开发商应在启动任何临床免疫原性评估之前与监管机构协商测定的充分性。 开发商应开发能够灵敏检测免疫反应的测定方法，即使在循环药物产品（拟议的生物仿制药产品和参考产品）中也是如此。应尽可能使用相同的测定方法和相同的患者血清来评估拟议的生物仿制药产品和参考产品。建议在生物仿制药开发的早期阶段开发和验证免疫原性测定，并应对拟议的生物仿制药产品和参考产品进行验证。 建议采用多层次测试方法，包括开发和验证筛选测定、确认测定、滴定测定和中和测定。筛选测定，也称为结合抗体测定，用于检测与治疗蛋白产品结合的抗体。确认测定建立ADA对治疗蛋白的特异性。滴定测定描述ADA反应的强度。中和测定评估ADA的中和活性。在测定中设定适当的截止点对于最小化假阴性结果的风险至关重要。 应同时开发独立ADA结合测定，包括拟议的生物仿制药产品或参考产品作为捕获配体。每个测定都应经过验证，并已证明能够在药物存在的情况下灵敏检测ADA。应使用两种测定方法测试两种治疗组的样本，以证明ADA对拟议的生物仿制药产品和参考产品的交叉反应性。偏离这种方法应有科学依据。 7.2.灵敏度 建议筛选和确认IgG和IgM ADA测定至少达到100 ng/mL的灵敏度，根据生物仿制药的风险和先前知识，灵敏度限制超过100 ng/mL可能是可接受的。 7.3.特异性 测定特异性的缺乏可能导致假阳性结果；在证明单克隆抗体、Fc融合蛋白和Ig融合蛋白的抗体反应特异性方面存在挑战，并就如何管理这些挑战提供指导。 7.4.选择性 测定结果可能会受到基质或船上治疗蛋白产品的干扰。未能建立测定选择性可能导致非特异性信号，掩盖阳性结果。 7.5.精确度 结果应在测定运行内部和之间可重复；测定精确度对于ADA评估至关重要，因为测定变异性是确定截止点和确保弱阳性样本被检测为阳性的基础。 7.6.可重复性 如果多个实验室在研究中运行一个测定，开发商应建立数据可比性，包括测定灵敏度、药物耐受性和测定精确度。 7.7.稳健性和样本稳定性 生物测定的复杂性使它们容易受到测定条件变化的影响。因此，评估和优化参数（如细胞通道数、孵育时间和培养基成分）至关重要。此外，需要制定短长期稳定性管理计划，以保持抗体反应性。 7.8.格式 开发商应考虑每种类型的测定格式的优缺点，包括通量、灵敏度、选择性、动态范围、检测各种Ig亚型的能力、检测快速解离抗体的能力以及试剂的可用性。应考虑洗涤次数和强度，这可能会影响测定灵敏度和表位暴露。 7.9.试剂 如果阳性对照抗体、阴性对照和系统适用性对照是专门为测定生成的，那么开发商应确保关键试剂的一致性测定性能。 7.10.报告结果 应评估测定方法的适当性，最常见的是定性测定。表7.4展示了常见的筛选测定，表7.5展示了抗体测试的测定方法。 7.11.生命周期管理 在没有观察到临床后遗症的情况下，拟议的生物仿制药产品和参考产品之间的免疫反应差异可能会引起关注。这样的测定可能需要进一步评估（例如，延长随访评估期）。随访评估的持续时间应基于以下因素决定：(1)免疫反应生成的时间进程（如中和抗体、细胞介导的免疫反应的发展）和预期的临床后遗症（由参考产品的经验提供信息），(2)免疫反应消失的时间进程和治疗停止后预期的临床后遗症，以及(3)产品的管理时间。例如，对于长期给药的剂，建议随访期为1年，除非可以根据支持生物相似性的证据总体科学地证明更短的持续期。 然后开发商应获得生命周期管理报告，随着产品经历各个阶段，报告应包括以下部分： 免疫原性风险评估：该评估应针对治疗蛋白，并包括产品质量和主观因素的信息。 分层生物分析策略和测定验证摘要：开发商应总结每个临床开发阶段的评估策略。 临床研究设计和详细的免疫原性采样计划：开发商应包括所有进行评估的临床研究的采样计划。 临床免疫原性数据分析：开发商应包括所有具有免疫原性组成部分的临床研究的免疫原性分析摘要。 结论、风险评估和缓解策略：开发商应讨论免疫原性如何影响患者群体的蛋白质产品的安全性和效力，包括产品如何在上市后阶段进行监测。 7.12.免疫原性测试方法 在没有质量水平相关性以及对临床效力（效力降低或丧失）和安全性没有负面影响的情况下，免疫原性的微小差异可能是可以接受的。评估观察到的免疫原性差异的临床影响可能具有挑战性，因为样本量和随访时间有限。如果观察到的差异的临床影响不确定，例如，由于潜在严重不良反应的罕见性或免疫反应的缓慢发展，则可能需要通过上市后监测或特定风险管理策略更新风险管理计划。 免疫原性研究旨在检测和表征对产品的免疫反应，并调查ADA与PK和PD以及效力和安全性的相关性。因此，应将免疫原性评估包括在关键临床研究的计划中，包括同步采样ADA和相关生物标记物（如果有的话），评估生物仿制药的效力和安全性。 7.12.1.人群 选择适合比较免疫原性的人群很重要。在选择适当人群时，应考虑免疫能力、免疫抑制治疗的先前或同时使用以及参考产品免疫原性的历史数据等因素。由于免疫原性测试通常是作为关键的比较安全性和效力研究的一部分进行的，因此在设计程序的临床部分以证明生物相似性时，必须考虑上述因素。 如果需要，应根据观察到的差异、给药途径、剂量-反应曲线、治疗窗口和潜在的临床影响来证明免疫原性研究的类型。效力、安全性和免疫原性测试的目标人群需要对免疫原性及其后果敏感，并代表产品指示的人群。在高风险情况下，应在批准后的基础上分析样本。 在几种情况下，如果药物治疗（先前或同时）可以抑制免疫反应，则健康人群将是首选；一个很好的例子是，优先在健康人群中评估非格司亭产品。 7.12.2.并行评估 比较免疫原性研究旨在排除拟议的生物仿制药产品和参考产品之间在免疫原性方面的临床意义差异。能够影响生物仿制药安全性和效力的抗体存在是非常令人关注的；例如，通过改变PK、诱发过敏性休克或中和产品及其内源性蛋白对应物，可以克服这个问题。对于每个治疗组，比较研究应描述ADA反应的发生率和强度、ADA发展的进程、ADA持续性以及ADA对生物仿制药安全性、效力和PK的影响。 在拟议的生物仿制药产品开发过程中需要进行并行比较免疫原性研究。如果初始的物理化学和体外测试表明差异，则更有可能检测到免疫原性差异，特别是在分子已知具有高度免疫原性的情况下。 免疫原性测试应与PK、安全性和效力测试相结合。在确认性结合测定中测试阳性的结合ADA患者样本也应测试其中和药物的能力，除非有不这样做的强有力的理由。选择适当的中和抗体测试格式至关重要，应考虑药物的作用机制。根据作用机制，竞争性配体结合测定或基于细胞的测定可能是适当的。 7.12.3.终点 选择与治疗蛋白产品免疫反应相关的临床免疫原性终点或PD措施（例如，抗体形成和细胞因子水平）时，应考虑参考产品报告的免疫原性问题。开发商应预先定义临床免疫反应标准（例如，显着临床事件的定义，如过敏性休克），在可能的情况下使用既定标准，并在研究开始前就这些标准与监管机构达成一致。 7.12.4.采样计划 采样频率以及分析的时机和程度将取决于特定药物的风险评估。采样计划应设计得能够区分暂时阳性的患者和已发展为持续抗体反应的患者。治疗后的采样期应足够长，以便对治疗蛋白触发的免疫反应的持续性得出结论，并发现被治疗蛋白本身抑制的免疫反应。治疗后样本收集的时机由蛋白质的半衰期和ADA测定的药物耐受性决定。在治疗的早期阶段需要更频繁的采样，此时患者通常处于ADA发展的最高风险。长期免疫原性的跟踪采用较少频率的采样，可以提供有关免疫原性的发生率和后果的额外信息。在持续长期治疗的情况下，通常应在授权前期间提供1年治疗的免疫原性数据，但如有适当的科学理由，可以进行较短的跟踪。 应系统地按计划对患者进行免疫原性测试，包括重复采样、症状驱动的方式，并在怀疑发生不希望的免疫反应时收集额外的样本。几种与产品相关的因素将影响对治疗蛋白的免疫反应的发展。因此，检测免疫反应的采样计划应适应并分别适用于每个产品，考虑其PK（例如，消除半衰期）和ADA测定的药物耐受性。始终应收集基线样本。 开发商在描述ADA反应的动力学和潜在免疫介导的不良效应时应使用普遍接受的术语，考虑可比产品的经验以及相关的监管和科学出版物。在治疗期间，应在给药前收集样本，因为样本中活性物质的残留水平可能干扰测定。 如果产品可以通过不同途径给药，则开发商应在上市许可申请中证明其对每种给药途径的免疫原性评估方法的合理性。 7.12.5.依赖于药代动力学 ADA可以影响PK，特别是消除阶段。非中和性“结合”抗体有时可能会调节而不是仅仅减少产品的效力，例如，通过延长半衰期。PK的变化可能是抗体形成的早期迹象。因此，鼓励开发商在所有重复剂量研究中同时进行PK和免疫原性采样。 7.13.安全性和效力关系 应根据免疫原性风险评估考虑间歇治疗相关的免疫原性，例如，来自其他类似产品的经验，潜在免疫原性的风险，增强效应，以及接触生物仿制药后抗体的持续性或出现。 ADA的存在可能或可能没有临床后果。因此，临床开发应基于潜在风险的分析以及检测和减轻这些风险的可能性。免疫介导的不良效应分析计划应基于风险分析，包括产品（类别）的先前经验，蛋白质中可能的免疫原性结构和患者群体类型。预先存在的ADA患者可能表现出不同的效力和安全性概况，应在可行时作为亚组进行分析。分析计划应定义与急性或延迟超敏性、自身免疫和效力丧失相关的症候群。潜在的免疫不良效应应在风险管理计划中得到解决。 7.13.1.免疫原性测试的管理 尽管开发商努力选择免疫原性潜力低的化合物，但对治疗蛋白的有害免疫反应并不总是可以避免的。在这种情况下，开发商应尽可能探索减少临床开发中观察到的免疫原性不良影响的可能性。在某些情况下，免疫抑制或抗炎共用药可能显著预防或减少不良免疫效应。在某些情况下，如凝血因子所观察到的，可能可以通过耐受化方案重新建立免疫耐受，例如，通过给予较大剂量的治疗蛋白。临床研究应记录这样的治疗方案。 7.14.示例研究 附录3提供了一些从EMA和FDA获得生物仿制药批准的研究协议的详细信息。 7.14.1.英夫利昔单抗 虽然主要效力分析表明，在第30周时，拟议的生物仿制药（Flixabi）和参考产品的等效ACR20反应率相同，但在个别测定时间点，拟议的生物仿制药队列中通过高灵敏度测定测量的ADA率大约高出5%-12%（在试验的任何时间点，拟议的生物仿制药队列中近50%的患者ADA阳性）。然而，由于主要终点在预定的可比性范围内，因此未观察到对任何分析的效力参数有任何有意义的影响。 7.14.2.依那西普 虽然产品（Benepali）通过了所有生物相似性测试，但在第24周观察到整体ADA形成有显著差异。ADA差异的临床效应似乎可以忽略不计，并且在治疗8周后差异大部分消失。PK研究通常比临床试验更敏感，能够检测潜在的产品相关差异，这可能解释了为何类似的效力发现不能推翻PK的差异。这可能被视为过于严格。然而，效力试验的结果不仅取决于药物暴露，还取决于生物物质在体内的有效药理作用。因此，这两种类型的研究目标是不同的。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）包含多种格式，能够同时结合多个表位，解锁了治疗以前难以治疗或不治之症的机制。早期评估候选抗体的开发潜力可以降低潜力低的抗体的等级，并提升最有前途的候选抗体进行进一步开发。基于蛋白质的治疗需要一套严格的开发潜力要求才能具有竞争力（例如高浓度配方和长半衰期），而这些要求的评估需要一套强大的方法工具箱，其中很少有经过验证用于询问bsAbs/msAbs。在评估bsAbs/msAbs的开发潜力时，需要考虑的重要因素包括它们的分子格式、免疫原性的可能性、特异性、稳定性和高产量生产的潜力。在这里，我们总结了开发潜力评估的关键方面，并提供了如何为给定的bsAb/msAb制定全面计划的指导。 1.介绍 抗体工程的进步已经发展出了多样化的生产和纯化流程，以推进各种大小和复杂性不同的分子格式。双特异性抗体（bsAb；具有两种不同结合特异性的抗体）和多特异性抗体（msAb；具有三种或更多不同结合特异性的抗体）允许在多种疾病领域进行新颖的治疗应用。然而，与传统单克隆抗体（mAb）开发相比，实现双特异性或多特异性所需的典型抗体流程和格式的偏差带来了额外的挑战，并且与开发潜力评估的最佳实践相关的信息很少。本综述总结了bsAbs/msAbs开发潜力的关键考虑因素，这些因素在药物开发过程中集体评估时有助于最大化技术成功的可能性。 通过不变簇分化3（CD3）与靶向肿瘤相关抗原（TAA）的相互作用，招募T细胞来识别T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC），已有几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了免疫细胞重定向，双特异性和多特异性还被用于增加对细胞亚型（例如，用于治疗转移性非小细胞肺癌的volrustomig）的特异性和克服常见的抗性途径（例如，用于治疗EGFR外显子20插入突变的非小细胞肺癌的amivantamab）。 单克隆抗体（mAbs）作为治疗多种疾病和条件的治疗选择的引入，为患者提供了许多以前未满足的医疗需求的解决方案，或者提供了比早期护理标准更有效和/或更安全的治疗。尽管mAbs的治疗成功是不可否认的，但仍有许多未满足的医疗需求。 bsAbs/msAbs是一类能够同时结合多个靶标的大分子，从而解锁了传统mAbs无法提供的新颖作用机制（MOA）和生理特性。bsAbs已被用于肿瘤学中，通过同时结合所需的免疫细胞和肿瘤细胞本身，有效地治疗多种癌症。bsAb T细胞接合器（TCEs）绕过了通过招募T细胞来识别肿瘤相关抗原的T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC）的需要。几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子已经获得了FDA的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了在肿瘤学中的应用，bsAbs在2017年通过emicizumab（Hemlibra®）的批准中展示了成功，这是一种bsAb，能够识别酶因子IXa和底物因子X[凝血因子IXa（FIXa）×FX]，用于治疗血友病。 尽管FDA尚未批准任何msAbs，但在临床前和早期临床开发中已经披露了几个有前景的分子。随着我们对疾病病因学的理解的进步，bsAbs/msAbs有望通过多因素靶向潜在生物学或通过增强药代动力学（PK）和药效学（PD）属性来进一步改善结果。 虽然同时结合多个靶标的能力是bsAbs/msAbs的优势，但将多个异质结合基团整合到单个分子中也存在风险，需要在开发潜力计划中通过仔细的临床前评估、选择和修改来考虑和最小化。例如，虽然CD3 TCE bsAbs/msAbs可以有效地将T细胞与TAA结合起来，但微量杂质的存在或稳定性差可能导致异常的T细胞激活，这可能导致患者的不良反应。此外，开发潜力可能取决于上下文，如在静脉注射抗体不导致免疫原性的情况下，皮下注射相同疗法却导致免疫原性的情况，正如Janssen在voxalatamab（JNJ-63898081）中的经验，这是他们的前列腺特异性膜抗原（PSMA）×CD3 bsAb。 早期、有目的、主动的抗体开发潜力评估和修改对于最小化后期开发中昂贵且耗时的挫折以及高效地识别具有成为安全、有效和可制造治疗潜力最大的分子至关重要。 任何格式的基于抗体的治疗药物的开发路径都是漫长而复杂的，需要大量的财务和人力资源。因此，开发潜力应在药物开发过程的早期进行评估，并减轻风险，以最大化整体成功的可能性。可接受的开发潜力，此处定义为分子对药物开发和给药过程中的测试、制造、储存和给药要求的适应性，因此是任何药物开发计划成功的关键标准。与mAbs相比，bsAbs/msAbs的开发带来了额外的独特挑战，因为它们固有的结构复杂性。虽然每种bsAb/msAb格式都会呈现不同的挑战，但有广泛适用于它们开发的总体方法，可以作为起点，并在需要时在方法上进行偏差。 潜在抗体治疗的开发潜力评估是多因素的，有越来越多的工具和流程可用于协助预测低风险分子。需要考虑的重要开发潜力因素包括了解给定bsAb/msAb的分子格式，以及评估它们的免疫原性、特异性、稳定性和可制造性的策略和方法。 2.抗体格式 在人类中，天然抗体由四个多肽链组成，组织成两个相同的轻链和两个相同的重链。抗原识别是通过两个相同的可变抗原结合（Fab）区域进行的。蛋白质和抗体工程的进步带来了各种不同的bsAb/msAb格式，这些格式从免疫球蛋白（Ig）样格式变化到高度工程化的分子，这些分子与传统IgG的相似性最小，这些主题有无数的变化（图1）。这些不同的bsAb/msAb格式与传统mAbs相比具有独特的属性，并有可能实现精确的功能性属性以治疗一系列疾病。Wilkinson和Hale最近发表的一篇出版物中对抗体设计的多样性进行了深入调查。 图1. 常见的单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）配置。a. 标准免疫球蛋白G抗体；b. 对称IgG样双特异性抗体；c. 含有scFv和sdAb的双特异性抗体；d. 多价双特异性抗体；e. 多特异性抗体。 基于IgG的bsAb/msAb格式通常保留天然蛋白质的可结晶片段（Fc）区域，通常可以细分为对称或不对称格式。这些bsAbs/msAbs通常依赖于有目的的突变来增强链配对效率，以及修改Fc介导的功能或半衰期延长。 基于片段的分子，如单链可变片段（scFv）或驼类重链可变域（VHH），通常不包含Fc区域，保留抗原结合的最小要求，允许连接不同的结合片段。通常引入不同长度的连接子来连接具有独特功能属性的不同部分。虽然这些偏离传统IgG格式的变化是必要的，以便启用或改善功能性活动，但它们也影响了其开发潜力。 确保bsAbs/msAbs的适当开发潜力和可制造性需要特别考虑抗体格式。一般起点是确定正在评估的新型格式与“IgG样”的相似程度，与天然蛋白质的偏差越大，需要越来越严格的审查。例如，为了推动bsAb的轻链和重链的正确组装而应用的有目的的突变，可能会降低稳定性，增加免疫原性，和/或改变Fc功能。 同样，虽然缺乏Fc的格式，如scFvs，可能提供更好的生物分布和更高的效力，它们通常容易高度聚集，并可能导致分子没有所需的溶解度和稳定性水平的最终治疗。此外，通常需要双特异性格式或多特异性格式的连接子，这些格式附加了额外的scFv或Fab到IgG框架，这些连接子本身可能会引入免疫原性或显著改变药代动力学（PK）属性。 一旦传统的IgG骨架被修改以允许双特异性或多特异性，就需要定制的制造过程，以获得足够数量的高纯度bsAb/msAb。一个主要考虑因素是，每种独特的格式通常需要不同的纯化策略。例如，由于许多基于片段的抗体缺乏Fc，它们需要偏离用于典型IgG的基于蛋白A亲和色谱的纯化策略。由此产生的bsAbs/msAbs通常具有缩短的半衰期，需要在配方中进行额外考虑，如持续静脉内输注或修改，如与聚乙二醇或人血清白蛋白融合，以延长半衰期，实现更有利的PK特性。 此外，许多双特异性和多特异性格式可以引入多种格式特定的杂质，这些杂质对许多分析和纯化方法提出了独特的挑战。这些格式特定的杂质在生物物理属性（如分子量和等电点（pI））上可能与所需的双特异性产品几乎相同，需要开发定制的分析测定和/或纯化方法。 对双特异性和多特异性格式的修改也可能影响蛋白质表达水平，因此可能不适合高通量生产和开发潜力调查。因此，必须仔细考虑不同格式及其产生足够产量和产品质量以进行高通量开发潜力测定的能力。综合考虑，正在开发中的格式与所需的治疗候选属性应指导开发潜力评估策略。 2.1.格式考虑 虽然这里没有回顾bsAb/msAb工程策略的细节，但了解为什么做出某些工程选择以及分子格式的修改如何影响功能是重要的，这使得一个知情的过程能够从功能和开发潜力的角度权衡候选分子的相对风险。就与目标结合相关的功能而言，bsAb/msAb格式可以在两个一般类别中相互偏离：结合价（即，任何目标的结合基团数量）和结合几何学（即，组装分子中靶向基团的相对方向）。 这些两个维度的变化如何产生改善活性的例子包括zanidatamab，这是一种HER2靶向双特异性抗体，它采用了scFv和Fab，从而改善了受体聚集和补体依赖性细胞毒性，以及BiTE（双特异性T细胞接合器）格式，这是两个scFv分子的融合，是第一个商业批准的TCE。这种格式虽然容易聚集，但在目标肿瘤细胞和T细胞之间实现了短的细胞间距离，这可以导致与更IgG样的bsAbs相比显著增强的细胞毒性效力。 BiTE格式的演变是双亲和性重定向抗体格式，它包括一个经过工程改造的二硫键，连接了两个可变域（Fv）的重链可变域（VH）和轻链可变域（VL）的交叉融合。分子格式对活性和开发潜力的耦合影响是过去二十年的积极研究领域。 Loh等人比较了八种不同的HER2 × CD3“结-孔”Fc基础bsAb格式在稳定转染池中的表达、纯化容易性、热稳定性、抗原结合和功能表征。在这项研究中，几何学和价的变化没有影响表达水平或热稳定性，但增加scFv的数量导致了更高的异质性和聚集倾向。Madsen 等人进行的一项类似研究通过使用带有10个氨基酸连接子的单域抗体（sdAb）与IgG融合，生成了针对PD-L1 × HER2的不同几何结构的双特异性抗体（bsAbs），并评估了它们的生产、稳定性、抗原结合以及CD16a结合特性。将sdAbs融合到重链的N-或C-末端通常可以提高产量，但某些融合分子导致分子组装不良，高价分子显示出胶体稳定性低的迹象。 此外，与bsAbs/多特异性抗体（msAbs）格式相关，翻译后修饰、片段和格式相关杂质（如错配物种和半抗体）对功能性活动的影响应在定义关键质量属性（CQAs）时考虑。Lippold 等人报道了一种开发2 × 1TCE的优雅方法，该方法使用功能性CD3亲和色谱结合质谱（MS）来定义CQAs，这可能是一种广泛可定制的方法，用于分析化学稳定性风险及其对功能性活动的影响。总之，格式优化是调节bsAbs/msAbs活性的强大方式，但必须与适当选择的开发性检测一起进行。 2.2.生成bsAb/msAb分子的共同组成部分 尽管许多bsAb/msAb格式尝试主要使用来自典型人类IgG的分子组分，但这些分子的复杂性需要偏离。如下所述，多肽连接元件和VHH部分特别是非IgG元素，在bsAb/msAb分子的工程中常用。 多肽连接子可以分为刚性、柔性和体内可裂解连接子。它们不仅用于将不同的蛋白质结构域连接在一起，还可以有其他效果，例如增加活性、调节药代动力学(PK)特性、在体内释放蛋白质结构域，或将治疗剂定向到特定的组织或器官。多肽融合到Fc结构域、转铁蛋白或人血清白蛋白通常用于延长抗体的半衰期，通常需要使用连接子。此外，多肽连接子通常用于构建单链靶向结构域，如单链可变片段(scFvs)，以及将这些结构域与其他蛋白质组分融合，以修改结合价数，并实现不同的双特异性和多特异性几何结构，而不引入额外的链配对复杂性。通常，在这些应用中使用多甘氨酸-丝氨酸(G4S)n连接子的变体，其中整体长度被优化以最小化聚集倾向，同时保持位点可及性。连接子长度和组成的优化是格式设计的关键组成部分，正如在CD19 × CD3双特异性串联二价体的优化中所展示的，连接子的变化被证明影响折叠效率、稳定性和活性。已经展示了几种稳定多肽连接子的策略，例如通过点突变减少蛋白酶敏感性，从而改变裂解基序，应用稳定框架突变，修改融合几何结构和连接子锚点，引入二硫键，变化连接子长度，以及添加谷氨酸和赖氨酸残基以提高溶解性。VHHs，也称为Nanobodies®，是由骆驼科动物自然产生的只有重链的单变量域抗体。它们缺乏传统抗体中与VL结构域配对所需的疏水界面，因此具有高溶解性和小尺寸(15 kDa)等特征。它们的热稳定性可能有所不同，但许多VHHs具有独特的能力，在热暴露后重新折叠并恢复抗原结合， 因此，与传统的靶向单元如Fab或scFv相比，它们表现出额外的稳定性特征，后者在热暴露后通常显示出不可逆的聚集。VHHs通常具有更长的、高度可变的互补决定区(CDR)3环，这些环补偿了缺失的VL结构域。这些扩展的CDR3环实现了高亲和力和特异性结合，并有助于通过形成折叠覆盖结构来屏蔽否则暴露的疏水残基。与传统的scFv相比，scFv由最小的IgG结合域VH和VL通过多肽连接子连接而成，并且由于它们的“呼吸”界面容易聚集，VHHs是有趣的替代品，作为靶向单元，以实现额外的抗原结合能力和价数在双特异性抗体/多特异性抗体上，具有优越的开发性属性，并避免许多IgG样双特异性格式中常见的链配对复杂性。首个VHH衍生抗体caplacizumab(Cablivi®)在2019年的批准为VHH在双特异性抗体/多特异性抗体中的增加使用奠定了基础。在双特异性抗体/多特异性抗体中使用VHHs已被证明用于靶向FcγRIII，在TNF × F4/80双特异性抗体中，Vδ2-TCE，在双特异性和三特异性VH在CD1d × Vγ9H SEED结构体中，等等。以及在一种增强对HIV株特异性中和能力的双特异性抗体中。 3.免疫原性 生物治疗剂可能具有免疫原性，即在患者体内引起对治疗剂本身的不需要的免疫反应，通常通过产生结合治疗剂的抗体，可能影响安全性和/或有效性。免疫原性可能导致治疗抗体在临床开发过程中的药物失败，导致资本、时间和资源的大量损失。抗药物抗体(ADA)是免疫原反应的标志。ADAs可以降低治疗效果，引起不良反应，甚至导致严重的副作用。T细胞通过反应治疗抗体中的特定序列在决定免疫反应中发挥关键作用，这些序列由抗原呈递细胞(APCs)在人类白细胞抗原(HLAs)中呈递。由于缺乏完整的临床研究来审查双特异性抗体/多特异性抗体，这些替代格式的免疫原性风险的数据很少。最近批准的双特异性抗体/多特异性抗体的报告，或目前在临床开发中的那些，表明不同抗体模式的ADA发病率和这些ADAs的临床结果各不相同，包括TCEs、双免疫检查点抑制剂和各种肿瘤相关抗原(TAAs)的双结合物。这些不同的结果突出了需要从早期临床前阶段到临床阶段开发全面的免疫原性风险评估策略，以促进选择、设计和开发具有降低患者免疫原潜力的最优双特异性抗体/多特异性抗体。下面提供了一个概述，说明可以有助于塑造对双特异性抗体/多特异性抗体治疗剂的免疫反应的多种因素，包括与产品相关的因素、与患者相关的因素和与疾病相关的因素。此外，我们简要讨论了目前可用于预测、监测和减轻双特异性抗体/多特异性抗体在临床前开发阶段的免疫原性的工具和进展。 3.1.基于序列的风险 与所有蛋白质治疗剂一样，对双特异性抗体/多特异性抗体产生免疫反应的主要风险决定因素之一是原始氨基酸序列。双特异性抗体/多特异性抗体通常包含大量工程化序列元素，这些元素使得不同的功能域能够非自然地连接到一个分子中。此外，这种双特异性抗体/多特异性抗体特有的工程通常与额外的抗体工程方法结合，如人源化突变(将小鼠CDRs移植到人抗体框架中)和Fc效应子修饰(要么调节Fc受体介导的效应子功能，要么通过修改与新生儿Fc受体(FcRn)的结合来延长半衰期)。这些新颖的工程序列可能通过引入新抗原或暴露可以被APCs处理和呈递的隐蔽表位来增加免疫原性，从而激活T细胞反应。因此，免疫原性风险评估和减轻策略最好从双特异性抗体/多特异性抗体的工程阶段开始，并在整个表征和筛选过程中使用越来越彻底的方法。通过设计低风险抗体结构使用脱免疫和耐受化(introduction of T regulatory cell epitopes)方法，由计算预测工具和可用的体外/离体确认试验的组合指导，可以实现降低免疫原性。 3.2.计算机模拟免疫原性风险评估 在抗体发现阶段早期，通常会首先应用计算机模拟(in silico)的T细胞表位筛选和预测工具。有多种商业、公共和学术平台可用于筛选抗体序列中的T细胞表位（通常是9到15个氨基酸的序列），以预测可能与HLA分子结合的序列。这些预测工具仅基于抗体的主要序列来识别潜在的T细胞表位。更复杂的计算方法能够使用同源建模和分子动力学模拟等技术生成抗体结构的三维模型。这些方法允许评估可能影响免疫原性的结构特征，如溶剂暴露的环、翻译后修饰和构象灵活性。 计算机模拟预测工具有助于在bsAb/msAb的早期开发过程中识别潜在的免疫原性区域，并允许选择潜在的免疫原性较低的分子或应用进一步的蛋白质工程技术来降低候选分子的风险。这些计算机模拟方法具有高通量和相对较低成本的优势。然而，这些计算工具通常存在一些局限性，例如倾向于过度预测，同时未能充分反映人类群体中发现的重要HLA II类多态性。 因此，建议使用各种体外和离体方法，包括免疫测定和基于细胞的测定，对这些假定的T细胞表位进行进一步的检测。 3.3.体外HLA I类和II类结合测定 HLA结合测定评估肽段在体外与不同HLA等位基因结合的能力，并补充计算机模拟预测工具。纯化的HLA-II肽段（通常是重叠的15个氨基酸的肽段）在一系列浓度下与单体HLA-II分子共同孵化。使用多种方法，包括荧光光谱、生化测定（例如，酶联免疫吸附测定）或表面等离子共振（SPR）来量化结合亲和力和动力学。通常，这些测定以高通量规模进行，能够快速筛选大量的肽库。这些结合测定的一个固有困难是全球人群中各种HLA-II等位基因的正常分布的代表性有限。为了克服这一局限性，HLA-II结合测定通常使用共享表位结合基序的HLA-DR等位基因组，也称为超类型等位基因，能够代表全球超过95%的人类HLA分布。 由于HLA-I分子的高度多态性和结构/构象对结合亲和力的影响，HLA-I结合测定的使用较少，尽管已经描述了几种测定和方法，包括基于荧光激活细胞排序（FACS）的MHC稳定化测定、竞争测定、分型B细胞系或使用HLA的基于细胞的测定。 虽然HLA结合测定可以提供有关特定HLA等位基因结合的有意义的信息，但由于它们依赖于感兴趣的肽段的最佳设计和纯度，因此存在一些局限性。这种依赖性可以直接影响肽-HLA相互作用的结合和稳定，并导致假阴性结果。此外，虽然从HLA结合测定获得的数据可能表明特定肽基序可能与HLA等位基因结合，但这些数据并没有考虑到这种肽基序是否能够在APC表面的HLA分子上被处理和呈递。 3.4.MHC相关肽蛋白质组学 MHC相关肽蛋白质组学（MAPPs）方法在识别存在于APC表面相关HLA分子上的已处理肽段方面被证明是有价值的，特别是鉴于液相色谱/质谱（LC/MS）灵敏度和蛋白质组分析工具的最新进展。在这种方法中，完整的bsAb/msAb分子被装载到体外生成和成熟的单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）上，以使DCs摄取和处理抗体，然后细胞裂解和分离肽-MHC复合物，这些复合物稍后被解离并通过MS测序进行测序。 MAPP测定的通量相对较低，主要是由于DC生成的限制。因此，MAPPs通常在临床前开发过程的后期阶段使用，并用于有限数量的开发候选物。从MAPPs获得的数据可以帮助识别可能被工程化以降低免疫原性的主导抗原肽序列。当这些个体的DCs被包括在分析中时，这种方法还可以揭示健康和疾病个体之间在抗原处理和呈递方面的差异。 尽管从MAPP测定中收集到的有价值的信息，但仔细解释至关重要。当评估bsAbs/msAbs与APCs（如DCs）的潜在直接或间接相互作用时，bsAbs/msAbs增加了一层复杂性。在使用MAPPs测定针对DCs表达的靶标或对DC功能重要的途径（如CD40×CD11c或LAG-3×PD-L1 bsAbs）的bsAbs/msAbs时，应考虑这种相互作用。 这些靶标的结合可能会干扰这些细胞中的抗原呈递机制，这反过来可能会影响该测定识别真实主导抗原序列的能力。在使用MAPPs测定之前，可以使用DC结合测定和评估DC成熟、激活和细胞因子测量的测定来了解bsAb/msAb对DCs的影响。 此外，评估bsAbs/msAbs对内源性蛋白的已知表位呈递的影响也可以提供对抗体与MAPP测定潜在干扰的洞察。 通过MAPPs识别的主导抗原序列表明这些序列可能通过抗原呈递机制被处理和呈递；但这并不一定意味着这些序列会转化为T细胞反应。因此，建议进行进一步的确证性体外T细胞激活和增殖实验，特别是当对感兴趣的序列进行进一步重设计可能会对抗体的效力或特异性产生重大影响时。 3.5.T细胞激活和增殖实验 各种体外T细胞激活和增殖实验已经开发出来，并越来越多地被用来评估治疗性抗体候选物的免疫原性。这些实验大多数使用新鲜分离或冷冻保存的健康或疾病个体的外周血单个核细胞（PBMCs）、去除CD8 T细胞的PBMCs，或与单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）共培养的分离CD4 T细胞。PBMCs可以被整个抗体刺激，允许抗原呈递细胞（APCs）摄取、处理和呈递肽序列给原始T细胞，导致T细胞激活、增殖和细胞因子分泌。流式细胞术通常用于评估通过标记PBMCs与细胞示踪染料来评估抗原特异性T细胞增殖。此外，使用特定的T细胞激活标志物如CD25、CD69、HLA-DR、CD134和/或CD137通常与增殖评估结合使用，以了解T细胞的激活状态和对刺激的反应程度。 激活的T细胞产生的细胞因子也可以通过流式细胞术进行细胞内细胞因子染色或通过酶联免疫吸附点（ELISpot）或多重荧光斑点（FluoroSpot）实验进行评估。 尽管基于PBMC的实验被认为是最简单且接近体外模拟复杂抗原呈递和T细胞激活过程的设置，但它们受到能够响应特定抗原刺激的前体原始T细胞数量相对较低的限制，导致实验灵敏度降低。DC-T细胞实验提供了一个替代方案，克服了这一限制，作为一个较不复杂的体外系统，允许免疫反应的基本组成部分之间的抗原特异性相互作用，即DCs和T辅助细胞。 虽然这些实验越来越被接受，但它们与bsAbs/msAbs的兼容性需要确认。bsAbs/msAbs通常针对T细胞或其他免疫细胞表达的受体或配体。在这些例子中，使用完整的抗体进行刺激可能不合适，因为免疫反应可能主要由抗体的MOA和与免疫细胞的直接结合驱动，而不是由抗原刺激驱动。这可以通过使用来自抗体序列的重叠肽段库而不是完整的抗体来克服。然而，使用肽段库有自己的局限性，包括更高的成本和可能识别出不一定在体内由APCs处理或呈递的肽段的风险。因此，使用MAPPs实验数据来指导设计和生产感兴趣的序列以在这些体外实验中进行测试可能是有益的。此外，bsAbs/msAbs由于抗体在所需格式中的错配组装，携带更高的杂质风险，导致产生其他不想要的错配格式，这可能会影响体外实验的性能，并导致对免疫原性风险的潜在误解。 因此，使用高纯度的测试文章准备这些实验至关重要。 3.6.B细胞表位和体外B细胞实验 虽然CD4 T细胞在导致ADA产生的免疫反应中起着关键作用，但B细胞也直接识别、结合、内化、处理和呈递治疗性抗体的表位给T辅助细胞，导致原始B细胞分化为记忆和产生高亲和力（IgG）ADAs的浆细胞。然而，体外B细胞实验受到在体外诱导B细胞反应的生物学复杂性的限制。已经描述并商业化了几种评估B细胞在体外刺激后分泌IgG/IgM的比色和荧光B细胞ELISpot实验，这些ELISpot实验主要关注评估记忆B细胞反应。目前尚无强大的实验可用于测量原始B细胞对体外刺激的IgG产生，主要是由于从IgM到IgG产生过程中涉及的免疫过程的复杂性。 在缺乏强大的体外B细胞实验的情况下，已经开发了几种用于预测B细胞表位的计算工具，如免疫表位数据库和分析资源SEPIA。 许多这些预测方法使用序列衍生特征，包括氨基酸组成、亲水性、表面可及性、β-转角和主链柔韧性来提高B细胞表位预测性能，这通常相对于现有的T细胞表位预测工具是有限的。 3.7.与产品关键质量属性相关的风险因素 CQAs是在适当的限制、范围或分布内存在的物理、化学、生物学或微生物学属性或特征，以确保所需的产品质量。 CQA相关的免疫原性风险因素是在治疗性抗体开发过程中的重要考虑因素。 由于分子设计的相对复杂性，bsAbs/msAbs通常与许多制造挑战相关，如增加的聚集、降低的稳定性和由于存在不想要的错配抗体格式而导致的产品相关杂质，这些都影响bsAb/msAb的免疫风险、与先天免疫细胞上的模式识别受体的相互作用以及意外佐剂效应导致打破耐受。 PBMC和全血实验是经常用来评估CQA相关免疫原性风险的工具。 这些实验能够广泛代表特定人群，通常被认为比其他基于细胞系的实验格式更具临床相关性。这些实验中通过与抗体孵化后分泌的细胞因子和趋化因子水平的量化来测量免疫原性反应。这些类型的实验面临的挑战包括从大量供体（通常>25）中获取足够数量的PBMC和新鲜全血样本，以及高供体间变异性。 重要的是，必须考虑特定bsAb/msAb的作用机制（MOA）来解释这些实验获得的数据。通常首先进行全血或PBMC实验以获得更广泛的风险评估，然后进行其他体外实验以进一步进行机制性特征描述。 3.8.与患者相关的风险因素 预先存在的反应性是随着基于抗体治疗领域，特别是bsAbs/msAbs的快速增长而日益受到关注的问题，尽管其对药物安全性和有效性的影响尚不清楚。最近有关bsAb/msAb免疫原性的报告表明，在临床药物开发阶段考虑实施对药物未接触受试者预先存在反应性的筛选和特征化策略是必要的。 许多正在开发的bsAb/msAb模式针对的目标已经使用其他生物治疗药物进行了探索，包括mAbs和抗体药物偶联物。在某些情况下，bsAbs/msAbs可能使用以前开发或批准的抗体的抗体臂，如上文提到的JNJ-61178104（以前称为COVA322）bsAb，它建立在阿达木单抗的骨架上。 在这些情况下，针对先前生物治疗的ADA反应可能导致由于快速记忆回忆反应而对bsAb/msAb的免疫原性反应增强。因此，应考虑对患者进行预先存在的反应性筛选，特别是在有生物治疗药物治疗史的患者中。此外，这种预先筛选可能有助于在预期出现显著免疫原性反应和相关不良事件时定义潜在的患者排除标准。 虽然目前主要在临床环境中使用筛查或治疗前时间点的患者样本来评估预先存在的ADA，但预先存在的ADA的高流行率表明，在临床前开发阶段早期使用健康或药物未接触的捐赠者的人类血清进行更严格的评估是有必要的。用bsAb给药的受试者中出现的治疗性ADA与在健康捐赠者中检测到的预先存在的ADA相关，并且预先存在的ADA的表位特异性能够预测临床ADA的表位偏好。 在评估LY3415244的安全性和免疫原性的1期试验中也有类似的观察结果，其中所有12名入组的患者都对至少一个bsAb臂产生了治疗性ADA。针对anti-TIM-3臂的ADA被发现更早出现，并对大多数患者的可溶性TIM-3目标参与产生负面影响。在最近的一项调查中，评估了60个正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA反应性，分析同样发现，正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA免疫原性主要针对TIM-3 CDRs。 3.9.治疗相关风险因素 包括给药途径、药物剂量和给药方案以及使用免疫调节共治疗药物，都是影响生物制剂免疫原性风险的因素，包括bsAbs/msAbs。大多数治疗性抗体通过静脉注射或皮下注射给药。尽管普遍接受的观点是皮下注射治疗性抗体与更高的免疫原性风险相关，但目前临床批准的抗体的数据并不支持这一假设。然而，与皮下注射相关的独特的免疫原性挑战可能对bsAbs/msAbs特别重要。皮下注射通常需要相对于静脉注射的高浓度给药。因此，与增加的bsAb/msAb聚集体以及其他产品属性相关的挑战可能在通过皮下途径产生更高的免疫反应中发挥重要作用。这一假设得到了pasotuxizumab这一例子的支持，这是一种PSMA × CD3 bsAb TCE，在1期研究中评估了静脉和皮下给药。 虽然静脉组的患者中没有检测到任何ADA，但所有接受皮下治疗的患者都发展出非短暂的ADA。此外，在这些患者中超过93%的人发现中和性ADA，并且没有人对局部糖皮质激素治疗有反应。当JNJ-63898081，另一种PSMA × CD3 bsAb TCE，通过静脉和皮下给药给试验参与者时，也报告了类似的结果。 药物剂量和给药方案也可能强调bsAbs/msAbs的免疫反应风险，因为由于细胞因子释放综合征等毒性，给药通常限于相对于mAbs的较低剂量。与msAb/msAb的较低剂量可能潜在地导致ADA介导的药物清除增加和次优的PK和PD性能。此外，治疗持续时间也是一个需要考虑的重要因素，尽管其与免疫刺激性bsAbs/msAbs在肿瘤学中的相关性可能不清楚，因为这些方案不需要长期治疗。此外，可能需要长期治疗的bsAbs/msAbs，如那些用于自身免疫性疾病的，可能从其自身的免疫抑制MOA中受益，导致免疫原性降低。最后，与抗炎药物或化疗的联合治疗也可能影响bsAbs/msAbs的免疫潜力。 3.10.作用机制风险因素 最近批准的bsAbs/msAbs的数据，以及其他在临床开发中的bsAbs/msAbs，表明这些bsAbs/msAbs的作用机制在它们在患者中的免疫潜力中起着关键作用。根据分子的不同，可以增加或减少免疫原性。例如，批准用于B细胞恶性肿瘤的bsAb TCEs，如CD19 × CD3 blinatumomab和BCMA × CD3 teclistamab，显示出最小的ADA发病率（<2%），可能由于它们的B细胞耗竭MOA。另一方面，针对B细胞上共刺激分子的bsAbs/msAbs，ABBV-428，一种间皮素-CD40 bsAb，在1期临床试验中显示出高ADA发病率（63%），可能由于其对B细胞的CD40激动效应和对药物PK的影响。非B细胞耗竭TCEs也可能由于其MOA涉及广泛的T细胞激活而带来更高的免疫原性风险，如AMG 211，一种CEA × CD3双特异性T细胞-引导剂，它在所有接受>3.2 mg高剂量治疗的患者中诱导了ADA，并在高滴度下暴露量下降，导致停药。 免疫调节性bsAbs/msAbs通过激活共刺激通路或拮抗抑制通路（如CTLA-4 × PD-1和CTLA-4 × OX-40双特异性抗体）可能会对患者造成更高的免疫原性风险，导致ADA发生率增加，因为它们相对于针对相同靶点的单抗单药治疗能够释放更强的免疫细胞激活。这一概念得到了抗PD-1和抗CTLA-4单抗的单药治疗和联合治疗报告的支持。当nivolumab与ipilimumab联合使用时，ADA发生率较单药治疗（11%）显著提高，报告为26-38%。 类似地，当抗PD-L1抗体durvalumab与化疗联合使用时，ADA发生率极低（<1%），而与抗CTLA-4抗体tremelimumab和化疗联合使用时，ADA发生率则较高。 与这些观察结果一致，LY3415244，一种针对TIM-3和PD-L1的bsAb，也被报告在所有给药的患者中诱导ADA。最近，在针对HER2和4-1BB的bsAb PRS-343的1期研究中也报告了类似的观察，PRS-343的给药导致ADA发生率为28%。 尽管存在这些趋势，免疫原性仍然难以预测，因为并非所有这些机制总是导致免疫原性增加。 另一个与作用机制相关的风险因素是抗体与其可溶性或膜寡聚靶标形成免疫复合物的能力。由于bsAbs/msAbs能够结合多个靶点，免疫复合物形成的风险可能更高。大型免疫复合物被广泛认为通过增加APCs的摄取以及通过交联和激活B细胞受体的T细胞非依赖性激活B细胞来增强免疫反应。针对炎症细胞因子TNF和IL-17A的bsAb JNJ-61178104支持这一概念，因为其给药已被证明在所有患者中诱导ADA。 尽管目前对免疫调节性bsAbs/msAbs的临床免疫原性数据有限，但现有证据表明它们与增加的免疫原性风险和更高的ADA发生率相关。因此，作用机制的考虑应成为bsAb/msAb开发过程中全面免疫原性风险评估策略的重要组成部分。重要的是，这些考虑也应适用于上述讨论的各种体外和体外工具的兼容性，考虑到正在开发的抗体的作用机制，以及这对这些实验数据解释的影响。 总之，随着bsAbs/msAbs领域的快速发展，以及关于与这一类抗体相关的免疫原性和安全风险的知识逐渐可用，开发全面的免疫原性风险评估策略对于实现最佳抗体开发至关重要。这些免疫原性风险评估策略可以在临床前阶段涉及各种计算工具以及体外和体外实验，同时关注与bsAb/msAb开发相关的重要药物、患者和治疗相关风险考虑。 4.特异性 在双特异性抗体（bsAbs）和多特异性抗体（msAbs）的开发中，多特异性（在蛋白质组中对靶点外的结合）和多反应性（对带电或疏水蛋白、膜或其他生理表面的非特异性结合）都是不希望出现的属性，它们可以改变疗效、清除率和组织分布。这些不需要的效果可能导致靶点外毒性、免疫原性和生产上的挑战。 多特异性可以由几种机制引起，例如与不相关靶标的分子模拟或CDRs中的可塑性，这些特征可能因在同一抗体上具有多个互补决定区而加剧。多反应性归因于不希望的抗体表面属性，例如电正性、电负性和疏水性表面斑块或Fv和Fc的电荷不平衡。在bsAbs/msAbs中，与从亲本分子行为预期的相比，多特异性和多反应性都可以被调节。这些差异可以归因于结合价的改变和/或复杂的互补决定区间相互作用。然而，尽早识别可能产生靶点外效应的抗体至关重要，建议在将亲本分子重新格式化为bsAbs/msAbs之前对其进行评估。 4.1.计算机预测 众多的计算机模拟工具已被开发出来，用于评估抗体特征以预测多反应性。抗体的特性，如序列组成、互补决定区（CDR）的长度和表面特性（即电荷和疏水性），通常从同源模型中得出，已被用来创建多反应性的预测模型。 具有大量电荷在其CDR上的抗体或高疏水性可能具有加速的清除率，对他们的治疗有效性产生负面影响。这种加速清除被认为是由于抗体表面的正电荷可能与负电荷的细胞膜或细胞外基质相互作用，导致 增加的组织吸收和血液清除。几个小组已经评估了使用许多可用的在硅片上的工具来探索抗体开发能力，但这些工具的广泛适用性对bsAbs/msAbs的探索较少。Jain等人。系统地评估了在硅片上派生的特征和体外指标之间的关系， 评估了许多开发能力方面。 虽然预测体外测定结果的能力大于那些仅从计算派生指标派生出来的，总体正电荷被发现对多特异性有害，更大的负电荷区域似乎有益，其他基于序列的趋势对氨基酸组成和位置在CDRs中证实了其他研究，这些研究正在调查多反应性。此外，许多在硅片上的指标的数量下降超出了确定的可接受分布（通常称为标志或违规行为）随着临床路径的进展（即，批准的抗体具有最少的在硅片上的标志）。同样，Zhang等人。生成了用于识别潜在多特异性的物理化学 规则，通过评估序列和结构特征与测定之间的相关性来探测自关联和结合到各种多特异性试剂在137个临床阶段抗体上。最近对1000个mAbs的生物信息学分析系统地 确定了多反应性和非多反应性抗体之间的关键差异，目标是扩展对属性的理解推动多反应性超出疏水性，电荷和CDR环灵活性。多反应性抗体往往有CDRs，平均产生轻微的亲水性，中性电荷的结合表面，可能潜在地允许与广泛的配体进行弱相互作用。这些数据被用来构建一个计算框架，可以识别多反应性抗体，准确率为75%。最近开发的机器学习方法已被用来预测纳米抗体和scFv中的多反应性。这些可变域格式是bsAbs/msAbs中越来越常见的组成部分，因为它们不需要非轻链的共价配对，因此产生较少的格式特异性错配物种。哈维等人。使用一个合成库，旨在模仿一个天真的骆驼库并将其排序到结合池到多特异性试剂（PSR）使用FACS。结果被用来训练逻辑回归和神经网络模型来分类纳米体多反应性。有几个预测特征为多反应性例如，存在精氨酸和色氨酸；然而，它们被位置强烈混淆。值得注意的是，他们的模型能够建议突变以减少估计的多反应性。Lim等人，通过训练四种监督式机器学习方法，利用这些数据计算了19,426个已知多反应性档案的scFv的基于序列和基于结构模型的特征，并得出结论，表现最好的模型具有与多个不同的CDR和全局抗体特征相关的特征，包括CDRH3中的色氨酸数量、等电点（pI）和径向旋转半径。然后，这些模型与基于自然语言的模型描述符相结合，以从scFv特征中提取额外的信息。表现最佳的集成模型在识别多反应性scFv方面的精确度和准确率超过75%。可用于特异性预测的在硅片上工具的数量和可变性可能会令人生畏，而且很少有模型专门针对bsAbs/msAbs的独特属性进行了设计。因此，建议主要使用这些方法作为在开发过程的早期对几个候选分子进行初步评估，以识别抗体和相关的在硅片上指标，这些指标落在任何一个预测的极端。这些数据可以作为进一步实验探究策略的有用指南。 4.2.体外特异性测定 评估PK属性是与特异性相关的主要开发能力属性。事实上，mAbs的长消除半衰期是这类治疗药物的主要优势。调节清除率的最重要元素是Fc中含有的分子在内质网隔室中依赖pH的特定FcRn结合。BsAbs/msAbs通常通过扰动或移除Fc-常驻FcRn相互作用来大幅度改变这一档案。分析FcRn亲和液相色谱使用从pH 5.5到8.8的线性pH梯度来分离IgG异构体、降解产物和工程抗体，如bsAbs/msAbs，基于它们在不同pH下对FcRn的亲和力。与野生型IgG相比，突变体的洗脱峰档案和保留时间的变化与FcRn转基因小鼠中的PK档案相关。尽管普遍认为Fc在FcRn介导的循环中起主导作用，但还表明，可变域的净电荷也影响与FcRn的结合，正如brakinumab所示，其Fv净电荷较高，但与ustekinumab相比具有类似的pI。FcRn有一个扩展的负电荷表面补丁和增加的brakinumab结合，阻止了在生理pH下与FcRn的有效解离，并减少了其终端半衰期。在中性pH下从FcRn的缓慢释放已被证明对两个具有类似pI和生物物理属性的bsAbs的PK产生不同的影响。 除了FcRn独立特性如单克隆抗体（mAbs）的Fv电荷、目标结合和定位、多特异性和多反应性或糖基化变化可能导致不期望的增加清除率，影响mAbs的药代动力学（PK），这些特性对于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）的开发同样重要。特别值得注意的是，针对CD3的bsAb TCEs通常具有与不良PK相关的多反应性标志，部分原因是许多针对CD3的抗体结合到CD3 epsilon极端N-末端的电负性线性表位，并且具有较高的等电点（pI）值。基于结构的方法和使用基于酵母的检测平台的抗体工程已被证明可以纠正这种多反应性行为，同时增加对CD3的亲和力。 测试更广泛的多反应性和多特异性，这与药代动力学不佳、制造困难和耐受性问题有关，由于人类蛋白质组和其他生理表面呈现的巨大潜在非目标空间，这是一项挑战。人类细胞微阵列技术可以在体外分析人类蛋白质组，以减少体内非目标毒性和加速清除的风险。 筛选多特异性性还可以包括结合由CHO、HEK或Sf9细胞提取物制成的PSRs，其中包含溶解的膜蛋白。这种方法可以作为基于展示的方法的反筛选，如针对SARS-CoV-2的基于纳米抗体的四价bsAb所示。 如上所述，局部正电荷可以导致通过增强FcRn结合、防止FcRn-抗体解离和有效回收来加速清除率。虽然可以从序列或通过毛细管等电聚焦等直接方法估算抗体的pI，但它是多反应性的一个差指标，因为它不显示电荷斑块或局部不平衡，通常更倾向于使用结构衍生方法，如Fv电荷对称性和空间电荷图（SCM）。 除了静电相互作用外，抗体的疏水性是多特异性以及潜在胶体稳定性问题的可靠指标。可以通过分析疏水相互作用色谱上的保留时间和洗脱曲线来评估抗体的疏水性。某些抗体germlines，如VH1–69，由于它们的重链CDR2更疏水，更可能产生疏水性较高的抗体，但这种倾向可以通过工程方法和生物物理评估来最小化。 在bsAbs/msAbs的临床前阶段进行特异性测试，应考虑作为降低开发和制造风险的两阶段方法。应评估每个亲本抗体，并仅选择低风险的亲本抗体或结合域进行重组成bsAbs/msAbs。重组成后，应在衍生的bsAb/msAb上重复相应的特异性测定，以确认所应用的设计和格式没有显著改变每个亲本抗体或结合域的特性。选择具有良好特异性特性的低风险亲本序列是有效生成可开发bsAbs/msAbs的先决条件。 5.稳定性 抗体的稳定性包括许多分子内在和药物相关的外在组成部分，包括热稳定性、胶体稳定性、耐蛋白水解性和血液中的化学稳定性。这些领域的缺陷可能导致制造过程中的困难、影响货架期以及改变抗体的免疫原性和活性。 5.1.热稳定性 热稳定性是承受热应用时蛋白质展开和降解的能力。成功开发的抗体的一个关键特性是它们良好的热稳定性，这主要由mAbs中的Fab区域决定，但对于bsAbs/msAbs可能不那么明显。就稳定性而言，Fv区域具有最高程度的变异性，因为其主要序列因每种抗体而异。 低热稳定性可能使抗体更容易聚集，限制了它们作为治疗性抗体的潜力。抗体热稳定性的一个有用估计值是其熔化温度（Tm），定义为抗体在其展开状态的浓度等于其在折叠状态的浓度的温度。抗体包含几个区域，包括可变Fv区域和恒定CL、CH1、CH2和CH3区域。这些区域中的每一个都是伪独立的，因此在不同区域之间通常观察到不协同的展开。众所周知，IgG1 CH2区域的Tm约为70°C，CH3区域的Tm约为82°C。 一项研究发现，当通过异二聚体CH3界面构建bsAbs时，所得抗体的CH3热稳定性显著降低，与K409突变相关的Tm降低约为12°C。 Fv、CH1和CL区域倾向于协同展开，其Tm可以根据可变区域序列跨越大范围。差示扫描量热法（DSC）用于建立不同区域的热稳定性和热力学特性。 差示扫描量热法（DSC）特别适合于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs），因为它可以通过额外的信息，如展开焓变，来识别不同区域的展开事件，但由于仪器限制和样品需求，通常相对低通量。相比之下，差示扫描荧光法（DSF），也称为热移测定，基于色氨酸和酪氨酸在展开时的内在荧光或添加荧光染料，通常高通量。这种技术在高通量环境中的一个典型用例是识别低稳定性抗体进行优先级降低，这些抗体的Tm接近或低于CH2热展开温度。 除了热展开外，许多DSF仪器还能够检测由热展开引起的聚集体形成，这导致光散射增加。这种聚集的起始温度通常用于筛选各种配方对聚集倾向的影响。 bsAbs/msAbs的形式对热稳定性有若干重要影响。一般来说，bsAb/mAb设计策略很少相对于亲本mAbs增加热稳定性。因此，建议在开发过程早期评估亲本抗体的热稳定性，并且理想情况下应降低热稳定性低的mAbs的优先级。在bsAb/msAb工程之后，通常一个或多个重组成的可变区域会失去热稳定性。设计可能如何影响亲本抗体不同区域的热稳定性，理想情况下应通过DSC进行评估，DSC非常适合解耦大多数mAb和bsAb格式中存在的众多展开事件。使用不需要突变Fv区域的bsAb/msAb格式，如VHH域，可能完全避免基于重组成的热稳定性下降的不可预测性。 已经开发和优化了几个bsAb平台和结合域的工程解决方案，以避免热稳定性的损失。对于目标域，包括在Fabs的VH-VL和CH1-CL界面、scFvs的可变域之间、scFvs的连接和可变域之间引入二硫键，或在scFvs的连接和可变域之间引入二硫键。后一种方法被证明可以将二硫键固定的scFvs的热稳定性提高约10°C。用于保持热稳定性的其他方法包括合理工程或随机突变方法的组合、人源化到更稳定的框架、或将稳定框架残基转移到不太稳定的框架上。 5.2.化学稳定性 化学稳定性指的是抗体一级序列中共价键的完整性以及重链-重链或重链-轻链之间。基于抗体的治疗药物的化学稳定性可能受到多种不同的降解途径的影响，包括脱酰胺作用、异构化、氧化、二硫键交换、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切、片段化和糖基化。 根据这些降解事件的位置与亲和位点和恒定域的关系，抗体的活性或半衰期可能会受到影响。一个众所周知的例子是曲妥珠单抗，其中LC-Asn30的脱酰胺对效力有轻微影响，而HC-Asp102的异构化显著降低了其效力。由于氧化应激，蛋氨酸氧化为蛋氨酸亚砜可能会对抗体产生几种影响，如报告的单克隆小鼠抗体OKT3。在Fc区域的M428/M252处蛋氨酸氧化可能会影响与FcRn的结合，从而影响抗体的回收，这会减少抗体的半衰期。任何影响亲和位点活性或Fc效应功能的化学降解都是有害的。因此，选择化学稳定的靶向单元以限制项目失败的风险非常重要。bsAb/msAb格式及相关的连接子或突变应用于生成bsAbs/msAbs也可能影响化学稳定性。化学稳定的靶向单元在重组成bsAbs/msAbs时可能会遇到不可预见的化学稳定性问题；因此，仔细评估亲本和衍生的bsAbs/msAbs都很重要。如果检测到降解事件，它们有时可以通过适当的配方条件来减轻。但重要的是要注意，强大的化学稳定性对于体内给药后的稳定性很重要，因此工程方法通常比配方筛选更可取。导致抗体降解的常见事件包括脱酰胺作用、异构化和片段化。脱酰胺作用是抗体中普遍存在的修饰，它发生在生产、储存或体内，并且更容易影响天冬酰胺残基，以及在较小程度上影响谷氨酰胺残基。脱酰胺作用是通过主链酰胺氮对侧链酰胺的羰基碳的亲核攻击和随后氨的丢失，导致通过天冬酰-琥珀酰亚胺（Asu）中间体形成天冬氨酸，通常在中性或碱性pH下加速。 相反，天冬氨酸通过Asu中间体的水解异构化通常在酸性pH下加速，并导致异天冬氨酸或天冬氨酸的形成（在中性条件下的比例为3:1）。异构化不依赖于水的存在，因此也可能发生在冻干的抗体配方中。 识别化学降解风险最直接的方法是通过对一级氨基酸的简单基序分析。然而，任何给定基序的降解倾向高度可变，并且取决于额外的结构因素，如溶剂可及性和二级结构构象，以及诸如pH、温度、辅料等外在因素。因此，基序方法仅作为化学责任风险的初步评估，任何情况都应通过额外的分析来确认。最近，基于结构和同源模型的方法已被开发出来，以更好地评估这些降解事件的可能性，某些位置和溶剂暴露的CDR环中的序列基序被识别为脱酰胺、异构化和氧化的热点。 虽然从开发的角度来看，Fv区域的降解通常是最具问题的，但这些修饰也常位于IgG的恒定区域。 化学稳定性问题可以通过强制降解研究来识别，这些研究通过故意将治疗性抗体暴露于应力条件下，在其整个生命周期中进行调查。这些研究可以包括长时间暴露于高温、低/高pH值、冻融循环、搅拌、糖基化、光照和生理或氧化应激。这些研究通常结合实验方法来检测和定量任何化学修饰，如离子交换和疏水相互作用色谱、标记和HPLC-UV-Vis、通过质谱的肽图、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或毛细管电泳和等电聚焦。 这些研究劳动密集、耗时且耗费材料，通常在发现过程的后期阶段对较少数量的抗体进行，通常在细胞系开发前。根据检测到的任何化学责任的位置，这些研究的样本通常也通过结合和活性测定来表征，以评估任何化学降解事件是否影响对目标的结合亲和力或抗体的活性和回收。抗体治疗中化学稳定性受损的另一种表现是片段化，可以分为非酶促和酶促片段化。非酶促片段化在抗体中经常观察到，主要在恒定区域，最有可能在上铰链区域，由于其动态环结构，可能性最高。 在上铰链区域的非酶促片段化发生在蛋白质主链中，通过诸如β-消除、直接水解、介导的裂解或自由基催化等化学反应，这取决于溶剂条件，如碱性或酸性pH值、温度以及自由基或金属的存在。非酶促片段化也可能伴随着二级、三级和四级结构以及构象灵活性发生，将序列空间中相距甚远的侧链带到局部环境中。非酶促片段化事件经常发生在天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺残基上，其中除了甘氨酸外，其他残基都可以通过它们的侧链介导片段化事件。CH1恒定区域的K(133)STSGGT环可能是一个常见的裂解位点，产生两个约35和15千道尔顿的片段，CH2区域（G236-G237，D270-P271）的其他位点也被发现可以迅速裂解。酶促片段化通常由蛋白酶裂解介导，这发生在mAbs和bsAbs/msAbs的生产和纯化过程中，铰链区域是酶促裂解最常见的位点。在所有情况下，片段化主要通过如天然尺寸排除色谱或SDS-PAGE等分离方法检测。与任何已识别的化学稳定性问题一样，需要根据裂解位点在Fv或恒定区域的位置评估其对抗体活性的影响。检测bsAbs/msAbs中片段化的工作与mAbs相同，但由于存在两个或更多的靶向区域，事件的复杂性和分配裂解基序的难度可能会增加。 此外，双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）可能会经历一个更为严格的纯化过程，包括额外的色谱步骤来去除与格式相关的杂质，因此任何化学稳定性的缺陷在制造过程中可能变得更加明显或累积。 焦谷氨酸的形成通常出现在抗体重链和轻链的N-末端，特别是当N-末端残基是谷氨酰胺时，对于谷氨酸来说则较少见。焦谷氨酸的形成可以通过非酶促的自发环化在体外通过亲核攻击N-末端主链酰胺氮对侧链酰胺形成稳定的五元环与H2O离去基团，或在体内由谷氨酰胺环化酶催化，这是一种在人类、动物和植物中发现的酶。如果控制不当，焦谷氨酸的形成可能导致抗体异质性，并可能影响制造过程中关键质量属性（CQAs）的维持。对于bsAbs来说也是如此，由于所有链的N-末端在某些双特异性格式中可能不同，检测和控制焦谷氨酸形成的复杂性增加了。 主要发生在赖氨酸侧链胺基和较小程度上的N-末端胺基和精氨酸的糖基化是一种非酶促的糖基化修饰，可以改变对抗原的亲和力，影响抗体的效力，并增加聚集。这种现象在治疗性抗体中很常见，并已在bsAbs中得到证实。这种糖基化事件通常由细胞培养中的发酵过程或储存期间引起，当含有蔗糖的配方水解导致非还原糖时，这会通过低pH和高温度加速。因此，制造过程需要严格控制，以通过适当的生产和配方条件满足CQAs。糖基化可以通过硼酸盐或离子交换色谱、毛细管等电聚焦、LC/MS方法和比色法检测。 5.3.胶体稳定性和粘度 胶体稳定性指的是折叠蛋白通过自相关沉淀在溶液中的倾向，由电荷不平衡、疏水斑块、融合蛋白界面解离和结合以及与离子的相互作用介导。 粘度是描述给定抗体配方流动阻力的相关属性，由不希望的分子间蛋白-蛋白相互作用引起，这些相互作用由胶体和构象浓度依赖行为介导。这些相互作用可能源于与部分原子电荷分布、等电点和偶极矩相关的变量域的静电属性，或导致自相关的疏水属性和形状互补性。对于高浓度的治疗性bsAbs/msAbs配方，胶体稳定性和粘度是重要的属性。通常通过盐或PEG诱导沉淀、静态光散射、多角度光散射和动态光散射（DLS）来评估蛋白质治疗剂的胶体稳定性。DLS可以在高通量设置中确定扩散相互作用参数（kD），特别适合评估配方条件及其在搅拌等应激条件下对胶体稳定性的影响。胶体稳定性通常在含有scFv域的bsAbs/msAbs中受损，由于VH-VL界面的柔韧性增加，这种柔韧性通过可逆解离和结合形成寡聚体，这一过程取决于蛋白质浓度，并可能受到pH值、离子强度和其他辅料的影响。Majumder等人证明，一个易于聚集的scFv-bsAb在组氨酸和谷氨酸的等摩尔缓冲液组合中具有改善的胶体稳定性，展示了配方对改善胶体稳定性的潜力。 自相互作用测定评估抗体在高浓度（>100 mg/mL）下配制用于治疗管理时的胶体稳定性风险。由于bsAbs中靶向臂的价数通常减少，mAbs中自相互作用测定观察到的趋势在bsAbs/msAbs中可能减弱，但不太可能完全消失。此外，任何bsAbs/msAbs平台的设计突变以强制正确的重-重和重-轻界面组装，如引入电荷对和疏水界面工程，如果突变部分或完全暴露或引起构象变化影响抗体表面属性，可能带来自相关风险。因此，重要的是只考虑低风险的靶向单元进行重组成bsAbs/msAbs，并通过自相互作用测定再次评估重组成分子对不希望的自相互作用的倾向。评估自相互作用的方法包括动态光散射（DLS）、亲和捕获自相互作用光谱（AC-SINS）、电荷稳定自相互作用光谱（CS-SINS）和生物层干涉测量（CSI-BLI）。DLS是一种广泛使用的评估抗体自相关性的技术，可以在微孔板格式中进行，使用少量抗体评估数百个样本。DLS测量增加的水动力半径作为蛋白质浓度的函数。从在相对较低的抗体浓度（1-20 mg/mL）下进行此分析得出的kD与高达175 mg/mL浓度的29种不同mAbs的粘度测量结果相关性良好。在AC-SINS中，抗体被吸附到金纳米颗粒上，产生高局部蛋白质浓度，模拟浓缩的抗体溶液。吸引的自相互作用减少固定抗体之间的粒子间距离，导致最大吸收波长（等离子体波长，λp）的红移。AC-SINS在高通量板格式中识别具有高自相关风险的抗体，同时在稀薄浓度（<50 μg/mL）下使用极少量的样本。这种方法通常用于筛选临床前阶段的抗体胶体稳定性风险。这种方法进一步发展为通过聚赖氨酸涂层通过电荷稳定（CS-SINS）筛选某些配方条件和弱酸性缓冲条件。虽然bsAb重组成可能导致衍生的bsAb与亲本mAb相比AC-SINS得分降低，但由于bsAbs AC-SINS得分与粘度风险之间关系不太明确，因此必须选择低风险的mAb进行重组成。 在生物层干涉测量（CSI-BLI）中，抗体通过其Fc区域装载到生物层干涉测量生物传感器上，以测量自结合反应。Fab可用于通过氢键配对、离子相互作用或疏水相互作用进行结合，该测定可以在低样品量（15μg）的高通量格式下进行。 抗体候选物和配方的粘度风险通常通过使用粘度计直接测量。由于高浓度配方需要大量样品，通常在开发过程的相对后期进行此实验。将单克隆抗体重组成bsAbs/msAbs可能会导致粘度增加，因为在存在两个靶向单元时会出现新的相互作用，特别是如果这些单元具有相反的静电属性。混合两种低粘度mAbs（pI分别为6.3和9.3）的粘度数据与相关bsAb的高粘度相关。新型几何结构导致的更大的bsAbs/msAbs也可能导致粘度问题，如一项研究中所示，一种双变量域免疫球蛋白bsAb比亲本mAb更粘稠，粘度的增加归因于bsAb的整体大小。有几种策略可以预防适用于mAbs和bsAbs/msAbs的粘度问题。首先选择对其预期给药途径具有有利的低粘度行为的bsAbs/msAbs非常重要。选择低粘度亲本抗体进行双特异性IgG重组可能无法预测具有有利粘度的bsAb/msAb，正如Tilegenova等人所证明的，用一个抗IL-13/IL-17双特异性IgG4抗体进行的研究发现，怀疑引起阳离子-π和/或π-π相互作用的芳香族点突变降低了双特异性的粘度，并且对一个在150 mg/mL时粘度高的单特异性抗GCGR IgG1抗体也成功。从蛋白质序列或结构计算的Fv净电荷可以表明潜在的粘度风险。Fv电荷<2的抗体被认为是高风险，因为它们可能有负电荷斑块，可能驱动与恒定域中的正电荷斑块自相关。此外，Fv电荷对称参数，即VH和VL的净电荷乘积，也可以表明由于自相关引起的粘度风险。 总之，稳定性评估是非常多维的，并且是全面开发性评估的关键要素。在目标给药途径和粗略配方的背景下最好评估稳定性。有大量的测定可用于这些测量，这些测定在实施的难易程度、通量和预测能力上有所不同，一个结构良好的评估策略应该在开发过程中利用多种测定。5.4.体内稳定性 治疗性抗体在给药后数天和数周内的体内物理化学稳定性可能对药物效力、清除和免疫原性有影响。与mAbs一样，IgG样的bsAbs/msAbs最好具有提供长半衰期的药代动力学（PK）特性。由于它们的半衰期较长，因此可以减少给药频率并改善患者依从性。与mAbs一样，bsAbs/msAbs的体内稳定性可以通过检测其在体内的浓度随时间的变化来评估，这通常通过ELISA或基于质谱的检测来完成。体内稳定性的测定对于预测药物效力和评估长期给药方案的可行性至关重要。 由于它们在循环中的半衰期大约为3周，内源性和重组抗体可以经历与治疗性抗体在制造和储存过程中类似的体内生物转化事件，包括异构化、氧化、糖基化、二硫键修饰、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切和蛋白水解裂解。在体内对抗体药物的生物转化事件的检测和定量是治疗性抗体开发中一个相对较新且日益增长的领域，这一领域面临着一些技术挑战。 血清是血液的一个亚室，含有富含白蛋白、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、同型半胱氨酸和其他小硫醇的异质环境，这可能导致抗体二硫键的重新排列，特别是对于IgG和IgG4。根据局部环境和溶剂暴露，这种混乱可能与使用工程二硫键以增强热和胶体稳定性的bsAb/msAb格式相关。 在啮齿动物和非人灵长类动物中进行的血清稳定性研究和药代动力学（PK）评估有助于评估bsAbs/msAbs的稳定性，并在开发性评估的早期识别潜在的责任。PK与抗原结合能力之间的关系可以用来识别体内不稳定的开发候选物。例如，体内脱酰胺作用可能导致抗原结合的丧失，影响效力，并可能引起潜在的关注。 IgG1、IgG2和IgG4亚类的的治疗性抗体可能容易受到木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和链球菌免疫球蛋白降解酶的重组蛋白酶裂解，不同的酶特异性和裂解效率主要基于它们各自的铰链序列。此外，IgG1可以被肿瘤微环境中的蛋白酶如基质金属蛋白酶裂解，或者在循环中，而IgG2则较不易受到裂解。IgG1两个重链的下铰链的裂解可能对Fc效应功能产生负面影响，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性，因为裂解位点靠近Fcy受体和C1q的结合位点，可能与自身炎症性疾病中mAbs的治疗抵抗性有关。蛋白酶裂解事件可能以类似的方式影响IgG型bsAbs/msAbs格式的铰链区域，具有潜在的意想不到的裂解敏感性、特异性和效率。因此，应在临床前开发阶段监测这些裂解事件。许多bsAb格式使用甘氨酸-丝氨酸的扩展连接序列来系上额外的模态并增加价数，这些可能容易受到体内蛋白水解裂解的影响。 相反，最近已经利用在实体瘤的肿瘤微环境中优先表达的某些蛋白酶的存在来激活被蛋白酶可裂解的域或肽段掩盖的bsAb TCEs，以限制它们在循环中的靶向毒性。在另一个例子中，蛋白酶敏感的连接子被用来将两个域抗体系成一个bsAb分子，用于治疗性口服治疗炎症性肠病。 6.可制造性 可制造性是分子开发性评估的一个组成部分。通过可制造性评估，可以更深入地了解分子行为，从而设计出既注重质量又注重数量的制造过程和控制策略。这种评估最好在代表性材料上进行，评估与产品质量、可扩展性和工艺产量相关的大规模生产过程的技术可行性。通常，可制造性评估分子适应平台流程和方法，以支持简化的开发工作。及早识别CQAs（关键质量属性）和工艺及分析开发的风险，可以减轻开发挑战，并允许优先分配工艺开发资源。开发候选物的可制造性是实现供应高质量、纯化和配方化的抗体以推进毒理学研究、临床研究和商业化的关键考虑因素。执行严格和全面的临床计划以及满足商业化视角下的供应链目标所需的抗体数量，突出了建立强大和可扩展制造工艺的基本需求。 6.1.双特异性抗体/多特异性抗体的制造考虑 从可制造性的角度来看，单克隆抗体（mAbs）已经通过发表的报告和行业指导文件得到了很好的表征。自1986年首个单克隆抗体商业化以来，已经开发了许多可制造性工具，并对潜在的责任进行了表征，降低了将单克隆抗体治疗推进到制造过程中的相关风险和挑战。 尽管双特异性抗体/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）作为一类治疗药物取得了进展和势头，但与单克隆抗体相比，支持其开发到制造的资源相对较少，这主要是因为它们在临床和商业制造方面的历史相对有限。此外，bsAbs/msAbs的结构异质性除了必须克服的单克隆抗体工艺障碍外，还提出了几个可制造性挑战。 6.2.工艺考虑 上游工艺考虑 在开发稳定表达bsAb/msAb的细胞系时，上游处理考虑不仅必须评估典型的开发标准，如蛋白质滴度、细胞系稳定性、群体倍增时间、翻译后修饰以及在预测设备、材料、培养基和饲料背景下的可制造性，而且还必须额外评估完整bsAb/msAb分子正确组装的可能性。 开发bsAb/msAb上游工艺可能非常具有挑战性，因为几个变量可能影响正确与错误组装分子的比例，以及错误组装物种的身份和相对丰度。载体和序列设计、选择克隆性和正确组装分子产量的过程，以及细胞培养和蛋白质表达的多因素性质（如上所述），都是需要考虑的关键因素。使用导向突变，如knob-into-hole突变，结合细胞系开发选择和上游工艺开发考虑，通常用于努力优化粗提物中正确配对目标分子的浓度。 尽管在细胞系开发和上游处理方面取得了进展，但在细胞培养上清液中存在错配的bsAb/msAb并不罕见，制造过程中还需要在下游成功纯化此类产品相关杂质的方法。 下游工艺考虑 在下游处理中，上游bsAb/msAb制造过程中产生的错配变体是不受欢迎的，它们作为工艺杂质，给纯化过程带来额外负担。在典型的单克隆抗体制造过程中，半抗体和抗体片段是常见的杂质，但具有显著结构和生化特性差异的变体更容易使用依赖分子电荷差异的色谱方法分离。这对bsAbs/msAbs的可制造性提出了特别的挑战，因为潜在的错误组装分子，如几个四链bsAb分子中的那些，可能表现出难以用制造中常用的分离方法区分的生物物理特性。不同质量的产品相关杂质也可能影响纯化和表征方法，包括由于bsAb/msAb变体的聚集倾向增加而产生的重大制造挑战。因此，在开发bsAb/msAb候选物时及早评估可制造性是非常有利的，以确定由于链错配而产生的结构变体之间的分子属性差异是否提供了足够的分辨率，以实现大规模成功纯化。变体之间的pI差异是主要关注点，因为在大规模制造中广泛使用了pH和/或电导依赖的色谱过程。 也可以利用其他纯化方法从其他属性中分离产品相关变体，包括利用疏水相互作用色谱针对变体之间的疏水性差异，或依靠独特的属性组合通过多模式色谱方法实现分离。虽然结合多种纯化方法可以增加成功分离配对的bsAbs/msAbs与错配变体的可能性，但涉及的额外时间和成本通常是不受欢迎的。在制造过程中，定制与建立可靠的平台流程相反，突出了开发需要有限工艺定制的bsAbs/msAbs的价值。 使用适当的分析方法对于生产中双特异性抗体/多特异性抗体（bsAb/msAb）的特性描述至关重要。除了典型的与产品相关的、宿主细胞相关的以及其他与工艺相关的杂质外，建立一个足够灵敏的分析方法以区分正确和错误组装的抗体产品非常重要。在开发过程中，区分这些变体的可制造性和工艺开发至关重要。此外，这种材料可能用于临床前研究，强调了其质量的重要性。当考虑制造规范时，批量放行标准推动目标分子的最终浓度以及任何指定杂质在可接受的范围内。液相色谱/质谱（LC/MS）方法，包括去糖基化完整质谱，通常能够区分错配变体，识别包含错配的重链（HC）和/或轻链（LC）组合的分子，以及正确配对的bsAbs/msAbs。随着bsAb/msAb药物开发向商业化发展，另一个关键的分析挑战是生物测定法的开发。bsAb/msAb的生物测定法必须准确且可重复地反映分子的双重作用机制和潜在的机制协同作用。将这些组合到单一测定中可能证明是一个重大挑战，评估是否需要开发两个单独的生物测定法是建立适当分析策略时的一个重要因素。7.结论 首个基于bsAb和msAb的药物开发涉及大量投资，用于制造和评估这些新兴分子，以满足现代治疗药物所期望的严格的安全性和有效性标准。治疗性双特异性抗体的开发有着悠久且研究深入的历史，始于20世纪60年代双特异性F(ab)2分子的形成，并于2018年首个双特异性药物blindumomab获得FDA批准。随后，用于生成这些复杂分子的蛋白工程方法以及高效评估其功能和开发性属性所需的技术和知识都有了显著改进。这些努力的结果是，过去几年有数百个bsAb/msAb分子进入临床研究，为临床上评估这些令人兴奋的分子提供了独特的治疗潜力。同时在体内对多个靶标采取行动的能力为药物开发提供了组合机会，并有望改变许多疾病的治疗格局。因此，用于工程化和评估这些独特分子的方法必须继续发展，以满足这一机会并为患者提供价值。 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IL-2最早用于肿瘤免疫治疗，虽经不断努力，但依旧停滞不前。后来，开始转向自免（可参考之前文章：IL-2再战自免，Sanofi、Moderna抢先入局）。 最近，苏黎世大学Onur Boyman, MD等发表了一项2期临床研究数据，使用低剂量IL-2治疗SLE，可以对此类研究提供一些参考。（临床注册信息：NCT03312335，研究者发起的单臂非安慰剂对照2期临床试验）。 病人：12例女性SLE患者 药物：150万国际单位aldesleukin/每次，连续5天，间隔16天。总计治疗四个Cycle。（具体如下图） 低剂量IL-2对Treg的影响 数据表明：IL-2免疫治疗SLE，导致Treg细胞显著扩增，与临床评分和血清生物标志物改善测量的临床反应相一致。 低剂量IL-2免疫治疗扩大了外周组织，即皮肤中的Treg细胞，而不影响CD4+ Tconv或CD8+ T细胞。 在机制上，IL-2免疫治疗并没有诱导皮肤中驻留的Treg细胞的大量增殖；相反，它诱导了表达CLA（cutaneous lymphocyte-associated antigen）的皮肤归巢Treg细胞的增殖，并随后浸润到皮肤中。 HLA-DR+、CD38+、HLA-DR+CD38+双阳Treg对IL-2治疗敏感，扩增明显。 CD38+Treg表达肠道归巢相关受体，HLA-DR+Treg表达皮肤归巢相关受体。这些阳性细胞高表达CXCR3，可归巢急性炎症部位。 免疫指标变化与临床评分变化的相关性 简评：研究者进行的小规模临床研究，细致的研究了IL-2治疗自免的免疫指标变化。相比Treg，NK细胞增殖更明显，此外Breg也增加了，具体临床意义，还有待进一步探讨。 参考文献 Raeber et al., Interleukin-2 immunotherapy reveals human regulatory T cell subsets with distinct functional and tissue-homing characteristics，Immunity 2024,57, 2232–2250 本周好文推荐 如需转载请联系佰傲谷并在醒目位置注明出处 · · · · · · · ·