caspase 3

摘要：癌细胞对化疗药物的耐药性大大降低了癌症患者的治疗效果，化疗引起的毒副作用也严重影响了患者的生活质量。茶中主要活性成分表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）与顺铂、5-FU、多柔比星和紫杉醇的联合使用，增强了它们对肿瘤的增敏效果，并对抗了癌细胞的耐药性。这些效应似乎通过多种机制介导，包括对抗癌症干细胞介导的药物耐药性、增强药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡，以及阻断血管生成。此外，EGCG可以通过其抗炎和抗氧化作用，抑制化疗引起的一系列不良反应，如胃肠功能紊乱、肾毒性和心脏毒性，从而改善患者的生活质量。然而，EGCG的生物利用度低、脱靶效应以及与某些化疗药物的反应性限制了其临床应用。EGCG和化疗药物的纳米改性不仅增强了抗肿瘤活性，还延长了荷瘤小鼠的生存时间，并具有低毒性的优势。因此，本综述旨在讨论EGCG与化疗药物联合治疗癌症的现状和挑战。总体而言，EGCG是一个有前景的化疗辅助剂。 1.引言 恶性肿瘤的发病率和死亡率持续上升，已成为对人类生命健康的主要威胁。恶性肿瘤的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，其中化疗在恶性肿瘤治疗中发挥着关键作用。然而，肿瘤细胞常常产生耐药性，使得通过化疗彻底杀死所有肿瘤细胞变得困难，限制了治愈率。目前，现有的癌症化疗药物不仅价格昂贵，还会改变多个信号通路组分的表达水平，从而不可避免地带来不同程度的副作用。这些副作用的产生与化疗药物的剂量和个体对药物的敏感性有关。化疗药物在抑制或杀死肿瘤细胞的同时，也对其正常组织造成一定的损伤。化疗的常见副作用包括胃肠功能紊乱、心脏毒性、神经病变、血管毒性等。这些副作用严重影响了肿瘤治疗效果和患者的生活质量。一些植物化学物质被报道具有化疗增敏作用，并能减少化疗引起的毒性副作用的发展。表儿茶素没食子酸酯（EGCG）就是其中之一。 EGCG是绿茶中最重要的活性成分之一，约占儿茶素化合物的50-60%。EGCG清除自由基，减少氧化损伤，对正常细胞和组织无毒性，但对肿瘤预防和治疗有积极作用。此外，EGCG还被报道能够对抗癌细胞干细胞的耐药性，增强化疗药物的敏感性，从而减少药物用量，缓解胃肠道功能紊乱和肾毒性等副作用，并降低肿瘤引起的恶病质发生率和发展。 尽管EGCG在癌症预防和治疗方面显示出了强大的优势，但其疗效与一线化疗药物相比仍有一定差距，作为单一抗癌药物开发的可能性有限。然而，当EGCG作为辅助化疗药物用于治疗肿瘤时，它们表现出强烈的化疗增敏作用，并减轻化疗副作用（图1），因此有望作为化疗辅助药物使用。本文综述了EGCG与化疗药物联合增强抗癌效果的现状和挑战，并为包含EGCG的组合策略在肿瘤治疗中的发展提供了参考。 图1. EGCG 在辅助化疗中的优势 2.增强化疗效果  单独的EGCG具有强大的抗癌活性，当与化疗药物（5-氟尿嘧啶、塞来昔布、顺铂、多柔比星、他莫昔芬）联合使用时，其协同治疗效果得到放大。这些作用机制包括减少癌细胞干细胞的药物抗性、增强化疗药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡、抑制血管生成，以及诱导抗炎和促氧化效应（图2）。我们将在下面简要阐述这些机制。 图2. EGCG与化疗药物联合作用增强抗肿瘤效果的机制 2.1. 减少癌细胞干细胞的药物抗性 在肿瘤组织的细胞群中，癌细胞干细胞（CSCs）数量较少，但在肿瘤抗性和复发过程中起着重要作用。CSCs通过不对称分裂维持自我更新和多向分化潜能，导致肿瘤细胞继续增殖，并促进肿瘤异质性和多样性的形成。因此，靶向CSCs是预防癌症和克服药物抗性的重要策略。在针对CSCs的研究中，发现EGCG对CSCs药物抗性有积极影响。EGCG单独使用时已显示出对CSCs生长和干性的强烈抑制作用。当EGCG与其他化疗药物联合对抗CSCs时，联合的肿瘤抑制效果比单一作用效果更显著（图2）。这些效应主要是EGCG通过减少CSCs的干性和降低细胞内流出泵活性来降低CSCs对化疗药物的抗性。 集落和球状体形成能力被用作实验指标，以测试CSCs的干性能力。低浓度的EGCG（5μM）未能抑制胰腺导管腺癌的集落和球状体形成，但当与PDE3A抑制剂曲前列醇联合使用时，它降低了FOXO3和CD44蛋白水平，并上调了cGMP表达，导致CSCs形成集落和球状体的能力显著降低。肿瘤抗性通常由增加的细胞内药物流出介导，由膜转运蛋白介导。作为最大的细胞内转运蛋白基因家族，ABC超家族已被报道参与肿瘤的多药耐药性。EGCG可以通过抑制CSC膜上的转运蛋白（ABCC2和ABCG2等）的活性和表达，增加CSCs中的药物浓度，减少药物从细胞中泵出的量，并增强抗癌药物对CSCs的杀伤效果（图2）。在头颈癌、胆管癌和鼻咽癌等癌症的CSCs中发现了这一点。在胶质瘤CSCs中，尽管EGCG对ABCG2表达没有影响，但EGCG下调了另一种膜转运蛋白P-糖蛋白（P-gp），减少了肿瘤细胞的球状体形成和迁移能力，最终增强了化疗药物替莫唑胺对CSCs的杀伤。 除了影响膜转运蛋白的表达外，EGCG还可以通过调节miRNAs的表达来保护CSCs。5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的药物耐药性结直肠癌细胞比亲本细胞具有更强的球状体形成能力。低剂量EGCG与5-FU联合使用抑制了多个自我更新驱动途径，包括Notch和Bmi1、Ezh2和Suz12，通过上调关键肿瘤抑制miRNAs（miR-34a、miR-145和miR-200c）的表达，从而增强了耐药性结直肠癌细胞的凋亡并抑制了球状体形成。在动物实验中，EGCG与5-FU或顺铂的联合使用也可以减少小鼠中各种CSCs的肿瘤体积和重量，如结直肠癌、头颈癌和鼻咽癌。 2.2. 提高药物敏感性 EGCG与化疗药物的结合可以显著降低化疗药物的IC50值（表1），同时减少药物剂量也能显著增强效果。三氧化二砷（ATO）是治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）的有效化疗药物，长期使用可能导致严重的副作用和癌细胞耐药性。EGCG与ATO的结合有效降低了抑制APL HL-60细胞和U937细胞所需的ATO浓度。EGCG增强了三苯氧胺和顺铂在胶质瘤细胞中的增敏效果，并抑制了端粒酶的表达。它还可以通过抑制核酸修复酶ERCC1/XPF的活性，增强各种癌细胞对顺铂的敏感性。EGCG和吉西他滨的结合增强了胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性，促进了凋亡，并显著抑制了移植肿瘤的生长。 EGCG可以通过多种途径增强化疗药物的增敏效果，包括促进药物摄取相关蛋白的表达和抑制药物在细胞内的翻译或流出（图2）。铜转运蛋白1（CTR1）是一种跨膜溶质载体转运蛋白，之前已被证明可以增加顺铂的细胞摄取和敏感性。EGCG在卵巢和肺癌细胞中上调了CTR1的转录和翻译水平，并抑制了癌细胞中顺铂介导的CTR1降解。羰基还原酶1（CBR1）将抗肿瘤药物柔红霉素和阿霉素转化为柔红霉素醇（DNROL）和阿霉素醇（DOXOL），这些新产生的醇代谢产物不仅具有低抗肿瘤活性，还会引起心脏毒性和心肌细胞损伤。EGCG还直接结合肝脏中的CBR1，增加癌细胞中柔红霉素的积累，增强抗肿瘤活性，同时减少DNROL诱导的心脏毒性（图3）。EGCG和萝卜硫素的联合治疗通过时间和剂量依赖性地降低细胞活性并增强顺铂诱导的凋亡和G2/M期阻滞，增强了顺铂在顺铂敏感和顺铂耐药卵巢癌细胞中的疗效。 图3. EGCG 提高癌细胞对多柔比星的化疗敏感性。EGCG 通过抑制 CBR1 和 P-gp 的活性，减少柔红霉素和多柔比星的转化和外排，从而增强抗肿瘤活性并降低心脏毒性。 EGCG可以抑制结直肠癌和肺癌中多药耐药蛋白1（MRP1/MDR1）的活性，并抑制化疗药物从癌细胞中的流出，从而促进细胞内积累。EGCG下调MDR1及其蛋白产物P-gp，减少肝癌细胞中多柔比星（DOX）的流出泵活性（图3）。DOX和EGCG的结合使口腔癌细胞中的DOX浓度增加了51%，并与单独使用DOX相比，增加了肿瘤细胞的凋亡率。进一步研究表明，EGCG通过协同抑制MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路，抑制DOX诱导的P-gp过度表达。在EGCG-三苯氧胺联合测定中，P-gp和乳腺癌耐药蛋白显著受到抑制，增强了乳腺癌细胞对三苯氧胺的敏感性。 2.3. 诱导细胞周期停滞 EGCG和顺铂的联合治疗通过降低多种细胞周期相关基因（cyclin A2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E1）的mRNA表达水平，并增加细胞周期抑制因子p21和DR5的表达（图2），诱导细胞在G1期停滞，并增强胆道癌和非小细胞肺癌（NSCLC）中的凋亡。EGCG衍生物不仅可以增强EGCG的稳定性和生物利用度，还可以促进NSCLC细胞的凋亡，并在与顺铂联合使用时抑制小鼠肿瘤的生长。 EGCG和DOX的结合抑制了肿瘤中磷酸化NF-κB和MDM2的表达，并上调了p53，从而显著抑制了膀胱癌细胞（T24和SW780）的增殖，增强了DOX对癌细胞的凋亡诱导效果，并降低了膀胱癌细胞的迁移能力。EGCG和曲司他丁A的结合通过上调p16表达促进淋巴瘤细胞在G1期停滞，从而减少细胞增殖。与vorinostat单独使用相比，EGCG的联合治疗上调了p21、p27、caspases（3、7和9）和Bax，并抑制了cdk2、cdk4、cyclin A、NF-κB和Bcl2的活性，从而显著降低了黑色素瘤细胞的增殖并促进了它们的凋亡。 2.4. 诱导凋亡 EGCG和顺铂的结合抑制了头颈鳞状细胞癌的形成并增强了细胞凋亡。EGCG减轻了化疗药物吉非替尼诱导的CYP1A1/CYB1B1、EGFR、cyclin D1、p-Akt（Ser473）和survivin在转录和翻译水平上的表达增加，并增强了p-p53（Ser15）的表达（图2），从而增强了吉非替尼对苯并[a]芘诱导肺癌的治疗效果。EGCG还降低了EGFR的磷酸化水平，抑制了乳腺癌细胞中的AKT信号，并增强了雷洛昔芬诱导的癌细胞凋亡。此外，EGCG与三苯氧胺在小鼠中的结合通过抑制mTOR和EGFR的表达，减少了肿瘤体积71%和肿瘤重量80%。EGCG和博来霉素的结合显著促进了Mia Paca-2胰腺癌细胞的凋亡。EGCG和丁酸钠的结合也在结肠癌细胞中诱导了细胞周期停滞、凋亡和DNA损伤。 EGCG与紫杉醇（例如，紫杉醇和多西他赛）的结合上调了p53和caspase-3，增加了前列腺癌细胞的凋亡率，并使肿瘤携带小鼠的无病生存率提高到90%。EGCG与5-FU的结合可以通过抑制葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的表达来阻断5-FU的流出，激活NF-κB信号，增强miR-155-5p的表达水平，并进一步抑制靶基因MRP1的表达。5-FU的积累导致caspase-3和PARP激活，Bcl-2降低和Bad增加，最终导致结肠癌细胞的凋亡。EGCG和阿霉素的结合也下调了bcl-2并增加了bax和caspase-3的表达，从而促进了食管癌细胞的凋亡。EGCG结合GRP78并将其从活性单体转化为非活性二聚体和寡聚体，干扰了抗凋亡GRP78-caspase-7复合体的形成，导致依托泊苷、紫杉醇和长春新碱诱导的癌细胞凋亡增加。EGCG和ATO的结合显著诱导了HL-60细胞的线粒体依赖性凋亡，凋亡细胞占总死亡细胞的70%以上。 NS-398和化疗药物塞来昔布都是环氧化酶-2（COX-2）抑制剂，EGCG和NS-398的联合治疗促进了前列腺癌细胞（LNCaP、PC-3和CWR22Rnu1）中Bax、pro-caspase-6和pro-caspase-9以及裂解的PARP的表达，并降低了前列腺特异性抗原和IGF-I水平，从而诱导凋亡并抑制小鼠肿瘤的生长。单独的EGCG或塞来昔布都没有诱导PC-9肺癌细胞中DNA损伤基因GADD153的表达，而联合治疗通过ERK信号通路上调了GADD153，从而促进了肺癌细胞的凋亡。 肝源性生长因子（HDGF）是一种分泌的肝素结合生长因子，调节肿瘤侵袭和转移，并促进血管生成。EGCG和顺铂的结合可以破坏线粒体膜电位，并通过下调HDGF上调caspase-3和caspase-9，从而诱导NSCLC细胞凋亡（图2）。EGCG还通过下调Axl和Tyro 3的表达抑制顺铂耐药肺癌细胞的增殖。此外，EGCG可以通过抑制hsa-miR-98-5p的表达并进一步上调p53，增强顺铂对NSCLC细胞的治疗效果。 2.5. 抑制血管生成 EGCG显著抑制了semaxanib诱导的内皮素过度表达，并抑制了肿瘤血管生成，为解决对抗VEGF疗法的抗性提供了新策略。EGCG治疗导致微血管密度、微血管周细胞覆盖指数和胶原IV表达降低；血管灌注和通透性的短暂增加；间质液压力和缺氧降低。在顺铂诱导的血管正常化期间共同给予顺铂，显著降低了在肿瘤组织中诱导效果所需的顺铂药物浓度（1.8 μg/g组织对比0.8 μg/g组织，P < 0.01），并抑制了移植肺肿瘤的生长。使用聚乙二醇（PEG）偶联的EGCG（PEG-EGCG）作为载体制备的载药胶束纳米复合物（SU-MNC），也能特异性地抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖。 2.6. 抗炎和促氧化效应 EGCG与塞来昔布联合使用，降低了胰岛癌细胞（Colo357）中IL-6、IL-8、VEGF和MMP-2的表达，并减弱了塞来昔布诱导的COX-2表达增加，减少了细胞炎症水平。这种组合在偶氮甲烷加硫酸葡聚糖钠诱导的结肠癌发生模型中也显示出类似的抗炎效应。核因子E2相关因子2（Nrf2）是一个重要的细胞保护性转录因子，在抗氧化和解毒过程中发挥关键作用。激活Nrf2-Keap1通路诱导相II酶的表达，并通过ARE信号通路阻止癌症发展。EGCG和顺铂的组合通过上调Nrf2/HO-1表达增强了凋亡，从而抑制了宫颈癌和乳腺癌的发展。此外，EGCG和顺铂的组合可以促进各种卵巢癌细胞系中H2O2的表达，加剧氧化应激以放大顺铂的毒性，从而抑制卵巢癌细胞的生长。 3.减少化疗副作用  长期化疗药物的使用除了药物抗性外，还可能导致某些有毒副作用（如胃肠疾病、心脏毒性、肾毒性、耳毒性、神经毒性等），从而限制了药物的有效性和治疗效果。EGCG不仅作为出色的辅助化疗增强剂，而且在减少化疗药物用量和增强抗肿瘤治疗效果的同时，减轻了化疗药物引起的有毒副作用。 3.1. 胃肠疾病 化疗引起恶心、呕吐、食欲减退等副作用，主要是由于药物或辐射对胃肠道细胞的损伤，导致胃肠道粘膜炎症。EGCG通过减少氧化损伤，改善了小鼠中伊立替康引起的胃肠副作用。接受同期放疗的不可切除III期NSCLC患者经常发生食管炎，这可能导致治疗中断并影响肿瘤治疗。在一项包括24名AJCC IIIA（6名）和IIIB（18名）期患者的研究中，化疗（顺铂和依托泊苷）与放疗（中位剂量64 Gy）同时进行。经过EGCG治疗（平均治疗持续时间34.8天，建议EGCG浓度440 μmol/L），在24名患者中有22名观察到食管炎显著回归至0/1级。 3.2.心脏毒性 阿霉素诱导的活性氧物种产生是心肌病的主要原因，也是限制其临床使用的主要副作用[68,69]。EGCG可以通过靶向结合抑制CBR1活性，进一步减少DOX的乙醇代谢产物DOXOL的产生，并减少DOXOL在心肌细胞中的损伤。EGCG还通过清除活性氧（ROS）和增强心肌细胞中Ca2+瞬态的幅度来减轻DOX诱导的心脏毒性。EGCG和DOX的联合给药显著抑制了肿瘤生长，同时减少了心肌Ca2+超载和乳酸脱氢酶释放，减轻了心肌细胞凋亡，从而降低了DOX的心脏毒性。与DOX和EGCG共载的多离子复合胶束增强了联合药物的稳定性，胶束核心中的EGCG除了抑制P-gp表达和逆转癌细胞的多药耐药性外，还保护心肌细胞免受DOX介导的心脏毒性。 3.3.肾毒性 顺铂诱导的肾毒性与肾脏中氧化应激和炎症细胞因子的增加有关。Nrf2和HO-1表达水平降低，顺铂处理的大鼠中NF-κB和4-羟基壬醛水平显著增加。EGCG逆转了这些顺铂介导的变化，并增强了肾脏抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）和谷胱甘肽的活性，从而减少肾脏氧化应激和炎症反应，并改善顺铂诱导的肾毒性。另一方面，EGCG减轻了顺铂诱导的线粒体氧化/硝化应激、线粒体电子传递链活性和线粒体抗氧化防御酶活性的线粒体损伤，并减少了肾小管细胞中线粒体ROS的产生，而PAS染色显示EGCG改善了顺铂诱导的肾脏结构损伤，如小管扩张、小管形成、颗粒空泡变性和小管细胞坏死。EGCG和CoQ10的多剂量组合也通过改善肾脏氧化/硝化状态、炎症和凋亡减轻了顺铂介导的肾毒性的发展。 3.4.耳毒性 除了肾毒性外，耳毒性是限制顺铂在临床实践中进一步使用的另一种有毒副作用。顺铂的耳毒性基于对耳蜗外毛细胞、螺旋神经节和血管纹的损害，包括不仅由药物本身引起的内外部环境的变化，还包括其激活caspase途径引起的凋亡。在大鼠中口服EGCG减轻了顺铂诱导的听力损失，减少了耳蜗基底区外毛细胞的丢失，并减少了氧化应激和凋亡标志物。它还保护了与内毛细胞相关的血管纹和螺旋韧带中的Na+/K+腺苷三磷酸酶（ATPase）α1的丢失以及与丝带突触相关的。体外研究发现，顺铂通过ROS/MAPK途径激活STAT1，降低磷酸化STAT3水平并减少p-STAT3/p-STAT1水平，从而诱导耳蜗炎症和凋亡。相比之下，EGCG通过抑制STAT1表达和保护p-STAT3，增加p-STAT3/p-STAT1比例，并调节bcl-2等促生存因子的表达，促进耳蜗细胞存活。 3.5.神经毒性 神经毒性通常与使用基于铂的药物、长春碱和紫杉醇类药物有关。EGCG对大鼠顺铂诱导的神经毒性的保护机制包括下调炎症因子TNF-α和IL-6的表达以减少大脑皮层的炎症负荷；激活抗氧化Nrf2/HO-1通路以减少NF-κB表达；下调与凋亡相关的蛋白Bax和caspase-3并增加抗凋亡因子Bcl-2的表达以减少大脑皮层的凋亡；最后，上调脑源性神经营养因子和乙酰胆碱酯酶并抑制乙酰胆碱表达以保护大脑皮层免受顺铂诱导的神经化学紊乱。 3.6.肺纤维化 博来霉素是一种诱导DNA损伤的化疗药物，长期使用可能导致肺纤维化的发展。EGCG显著下调了博来霉素诱导的炎症因子NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达水平，增加了抗氧化调节因子Nrf2的表达，并促进了体内氧化还原动态平衡，同时减少羟脯氨酸和胶原蛋白的合成和积累，从而改善了博来霉素诱导的肺纤维化。另一方面，EGCG还促进了博来霉素诱导的糖结合物恢复正常水平，并增加了基质降解溶酶体酶的活性。电子显微镜的超微结构观察还发现EGCG促进了肺泡II型细胞的空泡化和核收缩，并减少了胶原蛋白沉积。 4.辅助化疗的限制  尽管EGCG已经显示出与化疗药物的强烈辅助作用，增强了化疗效果，但EGCG和某些化疗药物也存在一定的拮抗作用，降低了化疗效果。硼替佐米是一种用于治疗多发性骨髓瘤的临床蛋白酶体抑制剂。由于硼替佐米的硼酸成分可以与EGCG的儿茶酚反应形成环状硼酸酯（图4），EGCG与硼酸基抗癌药物如硼替佐米的组合可能导致药物失活。由于它们的共同特征，任何含有儿茶酚或间苯二酚结构的化合物都不应与硼酸基药物同时服用。在EGCG与舒尼替尼联合使用的研究中，口服EGCG也被发现降低了舒尼替尼的生物利用度。EGCG还被报道通过减少丁酸诱导的癌细胞分化，降低了丁酸对结肠癌细胞的治疗效果。因此，需要进一步研究EGCG与不同化疗药物之间的相互作用，并确定临床上合适的组合治疗策略。 图4. 硼替佐米与 EGCG 的相互作用。A). 硼替佐米和 EGCG 的化学结构。B). 硼替佐米与 EGCG 的结合模式。C). 在酸性条件下，硼替佐米、EGCG 和 Fe3+ 纳米材料可以重新释放。 EGCG的口服生物利用度低也是限制其进一步应用的原因之一。大多数细胞实验中使用的EGCG浓度为10-100 μM，而口服3克脱咖啡因绿茶后的最大血药浓度(Cmax)为0.7 μM，增加剂量至4.5克并未显著增加Cmax值，表明存在饱和现象。在大多数研究中，EGCG只有在动物或人类胃消化后达到20-100 μM或更高浓度时才有效。例如，在前列腺癌患者的临床试验中，患者在手术前3-6周服用EGCG（800毫克/天），结果显示组织中无法检测到EGCG的存在。因此，如果要在临床试验中观察到体外实验的结果，就需要考虑儿茶素的生物利用度。这是因为EGCG在口服给药能达到的低生理浓度下的生理效应将非常有限。特别重要的是提高EGCG的稳定性和生物利用度。 5.纳米改性增强化疗效果  近年来，微囊化和纳米囊化技术作为提高EGCG稳定性和生物利用度的技术手段受到了广泛关注[87]。EGCG与化疗药物结合，通过纳米材料包封的组合药物的缓慢释放和靶向研究已经相当深入（表2）。EGCG与化疗药物的纳米改性不仅发挥其自身的抗肿瘤效应，减轻化疗的有毒副作用，还通过引入纳米材料增强了组合物的稳定性，减缓释放，并增强了药物动力学参数。它还具有低毒性、肿瘤靶向和定位成像能力的优势（图5）。其中，EGCG与DOX的组合是研究最深入的儿茶素相关二元组合策略。 图5. 包裹化疗药物和 EGCG 的纳米材料的多重有益效应 5.1.聚合物纳米粒子 通过抗乳腺癌药物赫赛汀与EGCG和PEG的自组装形成的胶束纳米复合物Herceptin-MNC，在肿瘤中的积累比游离赫赛汀多2.3倍，赫赛汀-MNC的血液半衰期比后者高29倍，而赫赛汀-MNC在肝脏、肾脏和肺部的积累速率比游离赫赛汀低1倍，表明基于EGCG的组合疗法比单一化疗药物具有更好的抗癌效果。使用PEG偶联的EGCG（PEG-EGCG）作为载体形成SU-MNCs，与口服/静脉注射舒尼替尼相比，在人类肾细胞癌异种移植小鼠中产生了更强的抗癌效果（更强的抗血管生成、诱导凋亡和抑制肿瘤增殖效果）和更低的毒性（图5）。DOX和EGCG之间的高效相互作用在PEG-EGCG胶束纳米复合物中实现了DOX的88%药物载荷，提高了DOX的循环稳定性和肿瘤靶向性，同时减少了DOX剂量依赖性副作用。 海藻酸具有对P选择素的强亲和力，诱导凋亡并抑制癌细胞增殖；透明质酸（HA）通过范德华力和氢键与癌细胞膜表面糖蛋白CD44结合。d-α-生育酚PEG琥珀酸酯（TPGS）通过阻断ATP结合位点并防止P-gp ATPase水解ATP来抑制ATPase活性。使用上述三种组分装载EGCG和DOX的纳米药物靶向胃癌治疗，比EGCG/DOX组合疗法显示出更好的抗肿瘤效果。装载EGCG/DOX的NPs的IC50为200/4 mg/L，是EGCG/DOX组合溶液（400/8 mg/L）的一半，纳米药物中DOX的细胞摄取率为60.42% ± 1.56%，远大于裸药中Dox的摄取率（28.62% ± 0.97%）。然而，将EGCG和多西他赛封装在TPGS偶联的透明质酸和海藻酸基纳米粒子中，纳米粒子通过靶向识别CD44和P选择素配体内化进入前列腺癌细胞，诱导G2/M期细胞周期停滞。进一步研究表明，纳米粒子比EGCG和多西他赛的组合显著更多地抑制肿瘤生长（53%对比31%），并且对非靶向器官无毒性。由HA-EGCG/顺铂偶联制成的胶束纳米复合物，其中HA暴露在表面，有效地传递到过度表达CD44的癌细胞，增加了纳米复合物在卵巢癌中的积累并延长了血液循环时间。通过铂纳米粒子和EGCG的pH可逆硼酸酯反应制备的基于酚的肿瘤渗透纳米框架（EGPt-NF），不仅诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡和缓解肿瘤缺氧，还有效促进了树突细胞的成熟并下调癌细胞中的PD-L1，从而显著抑制了小鼠肿瘤的生长和转移。 光热疗法在控制药物释放、减少多药耐药和提高疗效方面具有很高的应用潜力，是抗癌治疗的有希望的策略。由叶酸（FA）、多巴胺（DPA）、DOX和EGCG开发的双重药物输送系统DOX-EGCG/DPA-FA NPs，在近红外光（NIR）组中DOX的细胞摄取率是游离DOX组和无NIR照射的对照组的三到六倍。DOX-EGCG/DPA-FA NPs通过抑制肿瘤生长和血管生成，增强乳腺癌细胞中的凋亡和坏死，提高了60%的乳腺癌小鼠存活70天以上，从而提高了治疗效果。由氧化铁、靛青绿和葡萄糖氧化酶合成的磁性光热剂（ICGOx@IO）装载了DOX和EGCG，最终开发了纳米药物ICGOx@IO-Dox-EGCG-PPP，结合化学-光热-饥饿疗法几乎消除了小鼠的肿瘤，并显著减少了Dox诱导的心脏毒性。 5.2.金属纳米粒子 甲氨蝶呤（MTX）和DOX与含有EGCG的花状金纳米簇通过半胱氨酸桥结合，形成了有效的药物输送系统（Au-Cys-MTX/DOX NCs），纳米复合物在体外和体内都显示出良好的抗肿瘤活性，因为MTX的引入为纳米药物提供了良好的靶向。由EGCG、铁离子和DOX自组装而成的纳米粒子与单独的DOX相比，肿瘤体积减少了66%，转移结节减少了73.7%，表明药物输送系统显著抑制了肿瘤的生长和转移，而铁离子作为磁共振成像（MRI）的优秀对比剂，为药物输送系统的准确定位提供了潜力。 使用Fe3+与多酚的配位将DOX和EGCG自组装成FDEP NPs，增加了药物在血液中的循环时间和其在肿瘤内的积累。FDEP NPs的循环半衰期是单独DOX的36倍以上。FDEP30 NPs对小鼠肿瘤形成的肿瘤生长抑制率为74.38%，显著高于DOX + EGCG（44.13%）。末端脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）对肿瘤切片的染色显示，FDEP30 NPs和DOX + EGCG的凋亡/坏死率分别为45.06%和27.9%。有趣的是，FDEP NPs在显著降低CBR1活性、减轻DOXOL产生和随后的心脏毒性的同时，抑制了肿瘤生长并促进了凋亡。 包括DOX、EGCG、Fe3+和HA的自组装纳米反应器，可以穿透血脑屏障靶向胶质母细胞瘤并抑制肿瘤生长，从而延长了携带肿瘤的小鼠的生存时间。尽管以前的研究报告称EGCG可以与硼替佐米复合以抵消后者的抗肿瘤效应，但最近的研究显示这种拮抗效应可以通过纳米技术逆转。由EGCG、硼替佐米和Fe3+组成的纳米药物可以促进纳米粒子在肿瘤部位的释放，由于肿瘤微环境的弱酸性，具有低毒性和肿瘤定位功能，并最终显著抑制了MDA-MB-231细胞携带肿瘤的小鼠的肿瘤生长（图4）。 由EGCG与5-羟基多巴胺修饰的顺铂(IV)前药(Pt–OH)、含多酚链段的嵌段共聚物(PEG-b-PPOH)复合制备的有机纳米治疗药物(PTCG NPs)，设计用于使纳米粒子聚乙二醇化，从而延长纳米粒子的循环时间，抑制蛋白吸附，并增强所获纳米药物在肿瘤中的积累（图5）。由于Fe3+与多酚基团之间的强配位作用，PTCG NPs中Pt–OH和EGCG的载药比例可以精确调节至治疗水平，从而实现协同效应。此外，纳米粒子可以掺杂钆离子(Gd3+)，借助MRI功能监测纳米药物的递送和释放行为，赋予纳米药物诊断能力。在低pH环境下，活性药物通过亚胺连接键的断裂和Pt–OH激活为顺铂，在HepG2细胞内化后有效释放。生成的顺铂通过级联反应提高细胞内H2O2水平，由Fe3+催化产生有毒的活性氧(ROS)，从而通过化学动力疗法增强疗效。 5.3.其他类型的纳米粒子 通过将生物相容性的介孔硅纳米粒子与天然多酚涂层结合，并装载抗肿瘤药物DOX，开发的给药系统MSN-Dox@EGCg-Apt，旨在在酸性环境或细胞内GSH的刺激下向肿瘤病灶释放药物；该系统允许实时荧光追踪，对正常细胞无毒，即使在500 μg/mL的高浓度下也不影响CEM、Ramos和K562细胞的活性。在PLGA-酪蛋白核壳中包裹紫杉醇与EGCG的纳米药物表现出比游离紫杉醇更长的循环时间、更好的可用性，并且没有器官毒性。该纳米药物降低了紫杉醇诱导的P-gp表达，增加了对紫杉醇耐药的MDA-MB-231细胞的紫杉醇敏感性，诱导凋亡，抑制NF-κB激活，并下调与血管生成、肿瘤转移和存活相关的关键基因。多酚胶体球(CSs)是由EGCG在水溶液中分子凝聚自组装而成，但在有机溶剂中分解并在水溶液中重新组装。重新组装的CSs/DOX的最大包封率和载药率达到90%和44%，该纳米药物可以逆转肿瘤细胞的耐药性，增强对乳腺癌的治疗效果。重要的是，单次生产运行产生了37.3克多酚CSs，为重组纳米药物的规模化应用奠定了基础。基于EGCG和熊果酸的纳米载体系统可以靶向EpCAM释放至肝细胞癌，可以增加CD4+和CD8+ T细胞的激活及其在肿瘤组织中的免疫浸润，从而产生显著的协同抗肿瘤治疗效果。 总之，EGCG和化疗药物的纳米化可以显著增强抗肿瘤治疗的效果，但在考虑EGCG和化疗药物的纳米组装时，需要精心设计纳米药物的形状、大小和靶向策略。形状和大小是纳米粒子的重要参数，球形颗粒最为常见。直径大于5 μm的颗粒在静脉注射后会引起肺部毛细血管栓塞。直径大于0.2 μm的颗粒不能通过过滤方法进行灭菌。网状内皮系统更快地清除大颗粒，并且不能通过血管外渗逃离血管系统。直径小于5 nm的颗粒可以被肾脏过滤迅速清除。纳米药物的靶向策略包括主动靶向和被动靶向。被动靶向在很大程度上依赖于肿瘤生物学(血管和渗漏性)和药物载体属性(循环时间、孔隙性和大小)。而主动靶向依赖于配体-受体结合，这提高了对目标部位的选择性积累。例如，可以向纳米粒子中添加HA或FA，以增强纳米药物的靶向，利用肿瘤细胞中CD44和叶酸受体的高表达。此外，向纳米粒子中添加金属离子(Fe3+, Gd3+)可以使纳米药物的递送和释放通过MRI检测。尽管基于EGCG和化疗药物的纳米药物很有前景，但目前还缺乏体内安全性研究，大多数现有研究集中在细胞和小鼠实验上。这些实验结果是否能够在临床环境中复制还有待进一步探索。纳米材料的质量稳定性和储存条件也需要进一步研究。 6.结论和未来展望  体外和体内实验表明，EGCG可以与多种化疗药物（如5-FU、顺铂、多柔比星、紫杉醇和他莫昔芬）联合使用，增强抗肿瘤治疗效果。这些作用机制包括减少CSCs的药物抗性、增强药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡、减少细胞自噬调节、阻断血管生成以抑制癌细胞侵袭和转移、抑制炎症和调节氧化应激。此外，EGCG可以减少化疗药物引起的胃肠疾病、心脏毒性、肾毒性、耳毒性、神经毒性和肺纤维化的发生率。但需要注意的是，EGCG可以与某些化疗药物（硼替佐米和舒尼替尼）结合，降低化疗效果。尽管EGCG可以通过多种方式增强化疗药物的治疗效应，但目前对EGCG的作用机制和进一步的药物学优化研究还不足。此外，由于基本上没有研究报告EGCG和化疗药物在临床治疗中一起使用，EGCG辅助化疗的概念应该在可能性/展望和临床验证方面得到更多关注。同时，考虑到EGCG的生物利用度低，我们探索了将纳米技术应用于EGCG化疗药物策略以增强化疗效果的可能性。共载EGCG和化疗药物的纳米粒子增强了药物的药代动力学和循环时间，增加了肿瘤细胞中药物的浓度，显著抑制了肿瘤的生长和转移，对非靶向器官表现出低毒性，并最终显著延长了小鼠的生存时间。总之，EGCG是化疗的良好辅助剂；利用纳米技术双重载药EGCG和化疗药物进行靶向肿瘤治疗，提高了EGCG的临床应用价值，突出了EGCG治疗策略作为有前景的研究方向。

摘要:凋亡是一种程序化和受控的细胞死亡形式，它占生物加工过程中细胞死亡的大多数。细胞死亡影响培养的寿命和产品质量；它是由生物反应器内细胞经历的多种压力引发的。了解导致凋亡的因素以及开发能够保护细胞的策略对于稳健的生物加工开发至关重要。本综述旨在：a) 从生物加工的角度探讨凋亡；b) 描述重要的凋亡机制，并将它们与生物反应器中遇到的最相关的压力联系起来；c) 讨论设计操作条件以避免细胞死亡；d) 聚焦于工业相关的细胞系；以及 e) 提出包括细胞工程和基于模型的生物加工优化在内的抗凋亡策略。此外，还强调了凋亡在从克隆筛选到生产规模的质量设计生物加工开发中的重要性。 1.引言 在快速增长和竞争激烈的生物制剂市场中，生物加工优化至关重要。一个优化的生物加工将涉及高产细胞培养和最小的凋亡压力。培养活性对于确定培养寿命至关重要，通常由活性截止点决定，超过该点产品质量将受到影响。存在三种主要的细胞死亡途径：坏死、自噬和凋亡。据报道，凋亡是所有工业相关细胞系中死亡的主要原因，在中华仓鼠卵巢（CHO）细胞中占细胞死亡的80%和TB/C3杂交瘤细胞培养中的90%。阐明凋亡及其构成机制对于提高培养寿命和产品滴度，同时保持高产品质量至关重要。本综述着重于与凋亡相关的生物加工开发挑战，通过：a) 介绍凋亡细胞死亡的主要机制；b) 检查各种生物加工变量和操作条件对凋亡压力的影响；c) 确定影响生物加工的压力；以及d) 讨论两种方法——细胞系工程和凋亡建模——作为传统基于实验的方法的替代，用于最佳操作设计（图1）。 图1. 凋亡的生物过程策略：a) 传统方法，基于实验优化培养条件，b) 细胞系工程方法，旨在产生抗凋亡细胞系，以及 c) 虚拟方法，将生物学机制整合到数学模型中，以实现基于模型的优化。 2.细胞死亡的生物学 2.1.凋亡的生物学 在凋亡中，内部和/或外部刺激引发一系列高度控制的反应，最终导致细胞死亡。参与凋亡的两组最重要的蛋白质，半胱天冬酶和Bcl-2（B细胞淋巴瘤2）家族蛋白，参与所有凋亡细胞死亡途径。半胱天冬酶是依赖半胱氨酸的内切蛋白酶，催化肽键的断裂。大多数半胱天冬酶以单体形式产生，活性很小或没有活性，通常称为前半胱天冬酶或酶原。激活后，它们同源二聚体形成生物活性蛋白。在小鼠或人类细胞中已报告有14种半胱天冬酶（编号1至14），对生物加工很重要。此外，还在小鼠或人类以外的哺乳动物细胞基因组中鉴定出四种其他半胱天冬酶（编号15至18），其中半胱天冬酶16是一个假基因（不翻译）。大多数半胱天冬酶可以根据其作用分为三组：a) 起始半胱天冬酶（半胱天冬酶8和9）；b) 执行者半胱天冬酶（半胱天冬酶3、6和7）；c) 参与炎症的半胱天冬酶（半胱天冬酶1、4、5、11和12L）。半胱天冬酶-2没有被分类，因为它与起始和执行者半胱天冬酶共享结构元素，是半胱天冬酶3和8的已知底物，也可以通过激活细胞色素C释放来触发凋亡体的形成。半胱天冬酶-2也可以被p53的下游靶标激活。半胱天冬酶-10的作用尚未完全阐明，它由半胱天冬酶-6激活，以及半胱天冬酶12S和14也仍未分类。半胱天冬酶级联反应一旦被触发，就会自我催化，如图2所示。 图2. 凋亡途径概述。已确定的五条主要途径包括：(1) 由外部刺激激活的外源性途径；(2) 由Bax通道促进的MOMP激活的内源性途径（Taylor等人，2008年）；(3) DNA损伤诱导的依赖caspase-2的途径；(4) 由Granzyme B诱导的途径，其中该分子作为caspase-3的诱导剂；以及 (5)由Granzyme A诱导的途径，其中不涉及任何caspases - Granzyme A诱导一种DNase，该酶诱导DNA片段化和细胞死亡。 Bcl-2家族蛋白（图2）在凋亡调节中起着重要作用，具有促进和抑制凋亡的活性，可以分为三个亚组。抗凋亡组包括Bcl-2、Bcl-xL（B细胞淋巴瘤超大）、Bcl-W（Bcl-2样蛋白2）、Mcl-1（诱导髓样白血病细胞分化蛋白）、Bcl2A1（Bcl-2相关蛋白A1）和Bcl-B（与Boo蛋白氨基酸序列相似的Bcl-2样蛋白）。这些蛋白有四个Bcl-2同源结构域（BH1、BH2、BH3和BH4）。除了Bcl2A1，所有其他成员都有跨膜结构域，通常与细胞、核或线粒体膜相关联。第二组由Bax（Bcl-2相关蛋白X）、Bak（Bcl-2同源拮抗剂杀手）和Bok（Bcl-2相关卵巢杀手）组成，缺乏BH4结构域。最后，第三组只有BH3结构域，由Bik（Bcl-2相互作用杀手）、Hrk（Harakiri）、Bim（Bcl-2样蛋白11）、Bad（Bcl-2相关死亡促进因子）、Bid（BH3相互作用域死亡激动剂）、PUMA（p53上调凋亡调节因子）、NOXA（Phorbol-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯诱导蛋白1）和Bmf（Bcl-2修饰因子）组成。BH4缺乏和仅有BH3结构域的蛋白在过表达时是促凋亡的。 已确定五种主要的凋亡途径，其中提出了多种途径。外源途径（通常称为类型I）由细胞外部刺激触发。死亡配体（如FasL或肿瘤坏死因子α，TNFα）与细胞膜上的受体结合，触发半胱天冬酶-8的激活，从而启动凋亡（图2）。内源途径（通常称为类型II或线粒体途径）由内部刺激（代谢或缺氧压力）激活，也可以由内质网应激触发。凋亡类型II触发的内部刺激促进半胱天冬酶和Bcl-2家族的促凋亡成员的激活（图2），通过Bax通道导致线粒体外膜通透性（MOMP）增加。Bax激活SMAC（线粒体来源的第二种半胱天冬酶激活剂），抑制XIAP（X连锁凋亡抑制蛋白）的抗凋亡活性。反过来，MOMP导致细胞色素C的释放，这诱导了凋亡体的形成，由七个半胱天冬酶-9单元组成的复合体。半胱天冬酶-9将触发一个执行者半胱天冬酶（3或7），确保过程的连续性。Bcl-2家族的抗凋亡成员（例如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1）能够通过抑制其促凋亡对应物的活性来抑制凋亡。在这个过程中，外源途径的激活也可以通过半胱天冬酶-8激活Bid发生。相反，外源途径作为内源途径的下游效应可能在p53激活CD95时发生。第三种途径依赖于半胱天冬酶-2的存在，它可以在持续DNA损伤时被肿瘤抑制基因p53激活。凋亡也可以通过Granzyme B直接激活半胱天冬酶-3触发。最后，由Granzyme A促进的DNA片段化也可以导致凋亡。对CHO细胞的蛋白质组学研究表明，内源途径是培养中最重要的凋亡驱动因素。它可以直接与生物反应器的操作条件联系起来，使其在生物加工中很重要，因为它可以被营养物质缺乏、过量蛋白质生产、温度或pH变化和高渗透压等触发。 凋亡的调节是通过蛋白质-蛋白质相互作用实现的，可能涉及第三个蛋白质作为介导。没有介导的蛋白质-蛋白质相互作用的例子包括Bax蛋白的BH3结构域产生四聚体，在线粒体膜上形成通道，或Bcl-2抑制Bax通道形成。相比之下，Bcl-2或Bcl-xL与半胱天冬酶-8之间的相互作用需要BAP31（Bcl-2相关蛋白31）的介导。内源途径导致由线粒体膜上的Bax通道或钙离子引起的线粒体外膜通透性（MOMP）。MOMP反过来会导致许多促凋亡分子的释放，如细胞色素C。如图2所示，半胱天冬酶-3在凋亡中起着重要作用，可以由起始半胱天冬酶8和9或Granzyme-B激活。一旦激活，它会反激活上游半胱天冬酶以确保过程的连续性。半胱天冬酶-3也是CAD（半胱天冬酶激活的DNase）的激活剂，它在增殖细胞中与其抑制剂形成复合体。当半胱天冬酶-3过表达时，该复合体会被切割，CAD降解染色体DNA，当聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）被半胱天冬酶-3（或7）抑制时也会发生这种情况。在晚期凋亡期间，半胱天冬酶-3作为细胞骨架重组和解聚诱导剂，导致凋亡小体的形成。尽管半胱天冬酶-3被认为是凋亡中必不可少的，但已经表明不表达半胱天冬酶-3的人类MCF-7乳腺癌细胞仍然可以经历凋亡。实际上，已经鉴定出一种由Granzyme A介导的半胱天冬酶独立途径，其中Granzyme A诱导DNA片段化导致细胞死亡。 在凋亡过程中，细胞的几种结构特征会发生变化：许多细胞骨架成分被降解导致膜泡形成；核层被破坏导致核膜塌陷、DNA片段化和染色质浓缩；形成含有完整细胞器的凋亡小体，随后被巨噬细胞降解；线粒体膨胀和伸长。尽管这些特征中的一些可以通过光学显微镜观察到，但这种技术不如流式细胞仪准确，流式细胞仪通常更受青睐用于凋亡监测。流式细胞仪已被用于分析DNA、RNA、线粒体膜电位和细胞膜完整性，两种染料的组合，荧光素-Annexin V和7-氨基放线菌素D（7AAD），已用于区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞。在某些条件下，凋亡可以逆转，如在多种细胞系中去除凋亡刺激后报道的那样。还有人提出DNA损伤诱导p53（一种肿瘤抑制基因），反过来同时诱导DNA修复、细胞周期停滞和凋亡停滞。此外，即使在由促凋亡蛋白诱导DNA损伤后，晚期凋亡也可能是可逆的。Anastasis（希腊语意为“复活”）被提议为细胞“复活”过程的名称。建议的逆转机制需要一组几种蛋白质，逆转凋亡后观察到一些遗传变化，包括染色体畸变和数量。 2.2.其他形式的细胞死亡 尽管凋亡是哺乳动物细胞培养中主要的细胞死亡形式，其他机制，特别是在细胞培养后期，也可能有所贡献。这些包括自噬和坏死性凋亡，下面简要描述（图3）。自噬是一种将细胞质物质运送到溶酶体进行降解的细胞死亡形式。尽管自噬被认为是一种细胞存活机制，但最近的研究表明自噬可以促进细胞死亡。在自噬过程中，隔离膜形成，通常位于线粒体/内质网接触区域。Beclin-1和液泡蛋白分选34（VPS34）促进隔离膜的成核；几个细胞器可能被招募到这种生长膜的内侧，包括线粒体、高尔基体和内质网。蛋白质轻链3（LC3）通过一组自噬相关蛋白（ATG）附着在隔离膜上。LC3将促进识别自噬体，然后与溶酶体融合以破坏细胞成分。这种细胞死亡形式最初由Hwang和Lee在葡萄糖和谷氨酰胺缺乏时在CHO细胞培养中观察到。自噬可能通过ATG5激活半胱天冬酶-8触发外源途径的凋亡。有趣的是，抗凋亡蛋白Bcl-2也是Beclin-1的抑制剂。虽然这种相互作用阻止了自噬，但它并不抑制Bcl-2的抗凋亡作用。BH3-only蛋白抑制Bcl-2/Beclin-1相互作用，从而促进自噬。一个例外是BIM，它将Beclin-1错误定位到动力蛋白轻链1（DLC1），阻止自噬。自噬也可能在凋亡的终末阶段通过Beclin-1切割被半胱天冬酶-3抑制，如图3A所述。另一种越来越受关注的细胞死亡形式是坏死性凋亡。当死亡受体被配体激活时，受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）被激活。这种蛋白反过来激活RIPK3，触发坏死性凋亡。由这些（RIPK1和RIPK3）和其他蛋白质形成的复合体称为坏死体，已知它能抑制糖原分解和谷氨酰胺分解，最终减少能量代谢。细胞内ATP总体减少导致坏死性凋亡死亡。这条途径不仅与半胱天冬酶无关，而且还受到半胱天冬酶的抑制；半胱天冬酶-8抑制RIPK1和RIPK3的相互作用，从而防止坏死性凋亡，如图3B所述。 图3. 其他细胞死亡机制。细胞培养中发生的其他形式的细胞死亡包括自噬（A）和坏死（B）。 总之，细胞死亡，特别是凋亡，在生物加工中具有显著影响，影响细胞活性、生产力和产品质量。上游工艺开发应考虑凋亡监测和尽可能避免凋亡的策略开发，而不是试图逆转它。这需要深入了解跨尺度的相关促凋亡压力以及如何最小化这些压力。这是下一节的范围。 3.生物加工开发过程中的凋亡压力 3.1.不同尺度上的凋亡 上游工艺开发的第一步是选择一个合适的克隆，通常基于生长和生产力。虽然克隆选择发生在微升级别，但在生物加工开发过程中，规模将逐渐增加到立方米级别的生物反应器。在这些步骤中，凋亡压力的性质不同，它们对生长和生产力的影响也不同。为了实现最佳操作条件，重要的是准确识别相关压力及其原因，理解细胞响应机制，并在生物加工开发的各个阶段消除/逆转凋亡（图4）。在摇瓶或微孔板尺度上，由于不进行搅拌，运输是由于扩散和轨道混合，凋亡压力主要由克隆选择中使用的有毒试剂所主导。两种广泛使用的试剂是无谷氨酰胺培养基用于谷氨酰胺合成酶（GS）基础选择和甲氨蝶呤（MTX），如果使用二氢叶酸（DHFR）系统。MTX也是一种已知的凋亡诱导剂，能刺激PUMA。当生长速率和生产力成为克隆选择的关键标准时，确保pH值、温度、营养物质耗竭和渗透压不抑制生长或触发凋亡变得至关重要。即使在小规模上，扩散足以确保均匀环境，由于计划维护/取样任务在孵化器外进行，除非采用自动化系统，否则可能会发生压力温度波动。随着规模的增加，扩散不再能够维持有效的物质运输，宏观环境变得越来越不均匀，需要混合系统，这是剪切应力的来源。与规模放大相关的另一个问题是提供足够的氧气。在大型生物反应器中，这通常是通过从底部通气来实现的，这可能会产生额外的剪切应力。相比之下，大规模的温度控制不是一个主要问题。由于生物加工开发包括不同的操作模式，必须注意考虑与规模相关的效应。为了最小化放大问题，从克隆选择阶段就使用微型搅拌罐系统。 图4. 不同尺度的凋亡应激。上游生物过程开发识别重要的流程和生物反应器参数以及各个生物过程尺度上的相关凋亡应激和途径。 3.2.生物反应器中的凋亡压力 本节讨论与生物反应器相关的压力，如缺氧、剪切、营养物质缺乏、温度、pH值、渗透压和蛋白质错误折叠，将与每种特定压力相关的细胞生物学联系到产品质量、生物加工变量和操作条件。重要的是要提到，不同压力的影响可能因使用的培养系统而异。灌注系统，例如，允许营养物质的供应和副产品的去除，减少代谢压力。然而，由于实现了更高的细胞密度，培养粘度的相应增加导致pH值、渗透压和剪切应力的增加，这些在分批培养中观察到的。 3.2.1.缺氧压力 氧气在哺乳动物细胞代谢中至关重要，是需氧能量代谢中的最终电子受体。在缺乏氧气的情况下，采用厌氧代谢进行能量生产，导致有毒代谢产物的产生，最终导致细胞周期停滞和凋亡。因此，能量消耗减少，分泌生存因子，如低氧诱导因子（HIFs），在调节细胞对缺氧的反应中起着关键作用。HIFs是具有α（O2-labile）和β（稳定）亚基的异二聚体蛋白。在正常氧水平下，α亚基通过脯氨酰羟化酶（PHDs）在两个保守的脯氨酸残基上羟化，标记HIFα进行蛋白酶体破坏。在缺氧条件下，PHDs活性降低，HIFα不被抑制，诱导缺氧反应基因。事实上，PHDs已被提议作为负责HIF对氧浓度反应的氧气传感器。对缺氧诱导的凋亡的反应可以根据线粒体感知的氧水平重新编程，导致产生活性氧（ROS），降低PHDs。确保氧气不是限制因素在生物反应器设计和放大中至关重要。氧传递系数（kL）和气泡表面积（a）的乘积，通常表示为kLa，用作衡量通气效率的指标。kLa与混合引起的能量耗散率成正比；确保高kLa和低剪切应力环境可能具有挑战性，特别是在哺乳动物细胞培养中实现的越来越高的细胞密度。关于氧气对哺乳动物细胞培养影响的文献综述见表1。 在摇瓶和控制生物反应器中的CHO细胞研究表明，与摇瓶培养不同，生物反应器培养没有经历缺氧，缺氧导致蛋白质表达减少。在50L生物反应器中也获得了类似的结果，其中溶解氧从60%降低到15%的空气饱和度导致寿命减少和蛋白质运输，从而影响生产力和滴度。尽管通过补充金属离子可以维持活力和生产水平，但这种策略对产品质量的影响没有报告。这将特别有趣，因为已经证明金属离子在糖基化中起着重要作用。尽管在CHO细胞生物学中起着重要作用，但缺氧本身不会导致死亡，除非氧分压降低到零或其他因素参与。即使当氧分压降低到2x10-4巴，细胞生长停止，也可能不会观察到细胞死亡。然而，当缺氧与pH值6-6.5结合时，会观察到时间和pH依赖的细胞毒性效应。在这些条件下，由于pH（独立于氧水平）导致的葡萄糖消耗和乳酸产生减少，并且在两种压力结合下ATP水平降低了85%，而单独任一压力对能量产生没有影响。在GS-NS0培养中观察到类似的效应，在缺氧12小时后，细胞周期在G2期（9小时）停止，随后是G1和S期的停止，并且mAb生产停止。报道了降低能量密集型过程（如DNA合成）和激活能量产生和氧气输送过程。这些研究表明，缺氧压力效应的某些方面在细胞系间是保守的。在产品质量方面，血清自由培养的CC9C10杂交瘤细胞中观察到缺氧的负面影响，其中观察到IgG1糖基化的不足。作者推测，糖基化不足可能是由于UDP-Gal核苷糖供体的可用性降低。还观察到增加的抗氧化酶活性，为活性氧提供了证据。总之，缺氧诱导的生长停滞似乎是细胞系独立的，对于低于1%的缺氧水平。需要更多的研究来完全阐明缺氧对产品质量的影响，这也将有助于在工艺开发过程中的质量设计。 3.2.2.剪切应力 剪切应力是由搅拌器和挡板产生的，它们被用来在生物反应器内实现均匀性，或者通过通气产生，这可能会产生剪切应力，直接导致细胞破裂，因为气泡在上升到气液界面时破裂。与通气相关的剪切应力随着气泡直径的减小而增加。使用表面活性剂，如Poloxamer F68，显著降低了细胞与气泡之间的表面张力，减少了剪切对培养活性的影响。然而，重要的是要确保消泡剂不影响细胞生长和产品质量，并且它们可以在下游处理中有效去除。剪切应力影响的其他培养参数包括单克隆抗体（mAb）生产、葡萄糖消耗和乳酸产生，这些参数以不受规模影响的方式受到影响。关于生物反应器内部剪切应力的流体动力学来源的详细概述，包括湍流、边界层和碰撞效应，见其他地方。一般来说，在大多数培养时间内，生物反应器内部经历的剪切应力水平低于诱导凋亡所需的水平。此外，抵抗力和可容忍的压力水平取决于细胞系、几何形状和操作条件。表2总结了剪切应力在工业相关细胞系中的影响。 CHO细胞可以耐受比Sp2/0细胞更高的剪切应力水平，然后才会观察到对生长或生产力的负面影响。随着工艺的放大，混合系统的设计必须确保细胞不会长时间暴露在高水平的压力下，据估计（在搅拌器周围经历的）仅发生在生物反应器体积的约5%或在良好混合反应器中的5%时间内。反应器的不均匀性和长时间暴露在高剪切下会以剂量和时间依赖性的方式影响细胞培养。在HDP1杂交瘤中，暴露于60 Pa（600 dyne/cm2）45分钟后观察到活性下降50%，而在20 Pa（200 dyne/cm2）下观察到类似的减少需要2小时。类似地，CRL-8018杂交瘤在暴露于50 dyne/cm2下10分钟后活性下降50%，在30分钟后下降80%。挡板是剪切应力的另一个来源，因为它们通过增加能量耗散率5倍。尽管从理论上讲，挡板可以被消除，但它们在防止涡流形成方面至关重要，涡流是剪切相关细胞死亡的主要原因。挡板的数量和位置体现了防止涡流和产生剪切应力之间的权衡。在设计混合系统时，应保持低能量耗散率；能量耗散率约为2-3x105 W/m3（>700 rpm）会在CHO细胞中诱导凋亡，而能量耗散率为1x108-1x109 W/m3会导致CHO细胞破裂。这些值在存在气相的情况下可能会改变，这将促进涡流、气泡夹带和气泡破裂，从而增强剪切应力，因此必须降低搅拌速率。事实上，当消除2L生物反应器中的气相空间时，CHO细胞在600 rpm下搅拌没有经历显著损伤，这与Mollet等人的估计一致。有趣的是，这些结果与高速搅拌下搅拌器设计和分布器位置无关，而在搅拌速率较慢时，分布器的位置起着更重要的作用。 已经假设细胞抵抗剪切应力的能力随着特定细胞系的培养历史而变化，而在T型瓶或低搅拌spinner flasks（低水平流体应力）中培养的杂交瘤比在高搅拌下培养的杂交瘤对剪切更敏感。然而，野生型和Bcl-2缺陷CHO细胞对剪切的抵抗力被发现与它们之前在T型瓶或悬浮培养中的培养无关。这一观察归因于细胞暴露于剪切时Bcl-2表达的丧失。还报告了基因表达损失，其中在5L生物反应器中培养的CHO细胞显示出较低的F-肌动蛋白表达水平，导致细胞骨架较弱。相反，Perani等人观察到Bcl-2确实在三个几何不同的系统中培养的NS1衍生的小鼠杂交瘤中提供了凋亡保护。这些不同的发现表明，剪切应力抵抗力是细胞系特定的。 3.2.3.营养物质/代谢物压力 限制生长的营养物质是细胞系和克隆特定的；确定它们对于设计合适的培养基和补充培养基进行分批和连续培养至关重要。几项研究已经检查了营养物质和代谢物对细胞生理学的影响，如表3所总结的。生长限制性营养物质的耗尽导致生长停滞，最终导致凋亡，这也由有毒代谢物的存在引起。葡萄糖作为重要的碳源，在调节凋亡方面至关重要，但其重要性可能更多的是调节性的而不是营养性的，这已通过使用GS-NS0细胞的研究建议，其中葡萄糖调节并延长了静止期，以及调节DNA修复和转录。此外，葡萄糖可以通过快速提供ATP来防止或延迟凋亡。除了主要的碳源（通常是哺乳动物细胞的葡萄糖），氨基酸非常重要，不仅作为蛋白质生产的构建块，还作为三羧酸（TCA）循环中间体的前体。 了解细胞系和克隆特定的氨基酸代谢使能够确定培养过程中必需营养物质的代谢转变，应避免这些转变，因为它们可能会影响生长、生产力和产品质量，导致制定适应所用细胞系/克隆特定需求的培养基和喂养策略。如果代谢发生变化，纠正措施可能不会产生预期的效果。在氨基酸中，谷氨酰胺已被证明与CHO培养中的乳酸代谢转变相关，从而也影响培养pH。包括任何代谢转变信息的详细代谢分析对于理解这些观察至关重要。 除了糖或氨基酸之外的其他必需营养物质包括蛋白质，如胰岛素和转铁蛋白，其撤除导致CHO细胞凋亡，以及磷，添加到高细胞密度NS0培养中成功防止活性损失，增加mAb滴度和抑制凋亡。另一组必需分子是脂质。当营养物质耗尽时，某些细胞系能够通过合成三酰甘油和形成脂滴来维持活性。目前对这种现象的了解不足，但已经表明在完全营养物质耗尽的情况下，CHO细胞能够通过β-氧化脂肪酸生存，这需要脂滴生物生成。 随着细胞的生长和营养物质的代谢，它们产生副产品，这些副产品变得有毒并导致凋亡。两个重要的有毒代谢物是乳酸和氨，分别是葡萄糖代谢和谷氨酰胺/天冬酰胺代谢的副产品。当葡萄糖从更高效的TCA循环转向更快的发酵途径时，会形成乳酸。如果氧气不可用，就不能进行氧化磷酸化，细胞将通过替代途径代谢葡萄糖，例如乳酸发酵，产生乳酸。乳酸产生速率取决于克隆，受培养基配方的强烈影响。乳酸积累最终可能导致代谢转向乳酸消耗，尽管如此，仍然会导致生长停止和活力下降。此外，当乳酸脱氢酶A（LdhA）和丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）1、2和3同时低表达时，CHO细胞中mAb产量增加，当丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）被化学抑制时也是如此。乳酸对哺乳动物细胞培养的影响已与乳酸积累导致的氧化磷酸化速率下降相关。尽管在几项研究中被识别，但并非所有CHO克隆都观察到乳酸代谢转变。即使在同一项研究中，这也是细胞系和克隆特异性属性。有趣的是，从培养基中摄取谷氨酰胺的细胞中可能发生的乳酸代谢转变与谷氨酰胺的存在相关，这表明谷氨酰胺分解可能促进乳酸产生。然而，由于乳酸存在时线粒体氧化途径活性降低，代谢并未恢复正常。乳酸消耗另一个重要作用是再生糖酵解所需的NAD+辅因子。表达丙酮酸羧化酶的CHO细胞的分批培养表明，尽管观察到乳酸代谢转变，但培养寿命仅延长了1天（从10天延长到11天），尽管达到了更高的细胞密度。值得一提的是，这一现象可能受温度影响。在33°C培养的HFN 7.1杂交瘤中，即使谷氨酰胺完全消耗，乳酸生产仍在继续导致细胞死亡。然而，当相同细胞在37°C培养时，谷氨酰胺耗尽时乳酸生产停止。作者团队的未发表结果显示，在无谷氨酰胺、化学定义的培养基中分批培养的GS-NS0细胞产生的乳酸很少（<4mM），这可以归因于这些细胞在无谷氨酰胺的培养基中生长，并且只会产生它们所需的谷氨酰胺量（来自谷氨酸）。然而，另一种在分批培养中消耗乳酸的GS-NS0细胞系直到谷氨酰胺（最初不出现）达到0.4mM才开始消耗乳酸。只要保持谷氨酰胺浓度低，乳酸浓度就保持稳定，当谷氨酰胺浓度仅增加时就会产生乳酸。对于可以将乳酸和谷氨酰胺代谢联系起来的细胞系，培养基设计的一个重要限制是确保将谷氨酰胺浓度保持在最低以避免乳酸产生。控制谷氨酰胺水平也很重要，以避免产生氨。氨是谷氨酰胺代谢的副产品，与乳酸相反，它将培养pH值转变为碱性值。氨在2.5mM、6mM和高达29mM的浓度下分别对杂交瘤、HEK 293和CHO细胞培养产生负面影响。此外，氨的产生可能是细胞系和克隆特异性的。使用GS-NS0细胞进行的工作报告了不同水平的氨，从低于1mM到接近6mM。 3.2.4.温度 哺乳动物细胞生长、蛋白质生产和生化反应由酶催化，其活性受温度影响。生物加工规模与哺乳动物细胞生物加工开发中的温度控制相互关联。在小规模，直到台式生物反应器，温度控制是在受控环境中实现的，例如在孵化器中，而随着规模的增加，需要冷却和/或加热系统来控制温度并避免温度曲线的显著偏差。关于温度对哺乳动物细胞培养影响的分子机制有大量文献。具体来说，与热休克诱导的凋亡相关的转录独立的p53、钙失调和Bax具有调节作用。热休克蛋白70（HSP70）通过几种可能的机制参与保护免受温度诱导的凋亡。 在CHO细胞中，HSP70很重要，因为它延迟了半胱天冬酶-3的表达。鉴定了200多种具有温度依赖性表达谱的蛋白质，其中118种上调，与生长、凋亡和糖蛋白质量控制直接相关的23种蛋白质与温度降低直接相关。几项研究表明，高于最佳温度（37°C）的培养温度会触发凋亡。在CHO细胞中，过表达HSP27和HSP70导致由于在37°C时延迟表达半胱天冬酶2、3、8和9而增加了寿命。尽管报告了产品滴度的增加，但未描述产品质量属性和遗传稳定性，也未证明这种策略是否会改善更高温度下的CHO培养。事实上，在39°C培养CHO细胞增加了生长速率，但导致G2/M期细胞周期停滞，活力和生产力下降，尽管整体产品滴度增加。在NS0细胞中，转染HSP70基因的克隆也导致对凋亡的抵抗力增加。野生型NS0细胞中缺乏HSP70表示细胞系对温度诱导凋亡的特异性反应。在产品质量方面，CHO细胞生产的Epo-Fc融合蛋白的唾液酸化在37和39°C之间没有显著差异。在几种杂交瘤中，37°C以上的培养温度对mAb生产不利。具体来说，这种效应在39°C和38°C的杂交瘤细胞培养中观察到。有人建议温度的效应可能是搅拌依赖的，因为非搅拌杂交瘤培养在38°C（与37°C相比）时具有更快的特定生长速率，产生mAb的速率相似；搅拌培养的情况正好相反，在38°C时生长较慢，产生mAb的速率较低。 低于最佳温度的温度也会影响培养寿命、细胞生长和生产力。在CHO培养中，单克隆抗体的聚集在33°C时比37°C高2到5倍。当生产双特异性抗体的CHO细胞的温度从36°C降低到32.5°C时，也观察到相同的效应。在这种情况下，重要的是确保细胞产生所需的双特异性mAb，而不是截短版本或完整的单特异性mAb。降低温度降低了生长，但促进了所需双特异性mAb结构的形成；尽管在较低温度下也观察到聚集，但总体上认为降低温度是有益的。建议采用两阶段培养策略，即在36°C进行生长，在32.5°C进行mAb生产，提高整体产品质量和下游处理产量。这些观察是细胞系和产品特异性的。在表达人类组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的CHO细胞中，将温度从37°C降低到30°C在指数生长期增加了细胞周期抑制剂2A（细胞周期停滞诱导剂）的表达，对DNA损伤响应基因没有影响，尽管相应的基因没有上调，但tPA生产率增加（未提供产品质量数据）。此外，与能量产生和凋亡保护相关的基因上调，葡萄糖和乳酸的代谢速率减慢，而谷氨酰胺消耗保持不变。 在低温（30°C）条件下，CHO细胞的代谢速度较慢与G0/G1期阻滞有关。Trummer等人报告了产品质量数据，并显示唾液酸化减少了40%。对NS0细胞的研究表明，将温度从37°C降低到34°C可以在不影响培养寿命的情况下略微提高单克隆抗体（mAb）的产量。进一步将温度降低到22°C则显示无增殖并诱导凋亡，同时细胞周期在G2/M期被阻滞。尽管有DNA微阵列证据表明，在低温条件下培养细胞会停止代谢并诱导凋亡，但据我们所知，还没有研究报告低温诱导凋亡的详细机制。 3.2.5.pH值 在哺乳动物细胞培养中，严格的pH控制至关重要，因为即使是微小的偏差也可能导致细胞死亡。此外，pH值影响生长、单克隆抗体（mAb）产量、多种氨基酸的摄取率以及产品质量，如表5所示。尽管pH值很重要，但其在凋亡中的作用机制尚未完全阐明。 尽管最佳pH值取决于细胞系，但在哺乳动物细胞生物加工中，接近7.0的pH值通常被认为是理想的。在pH 6.8下培养CHO细胞对培养寿命最有利，而最大细胞密度在pH 6.9下获得。在所有评估的pH条件下，主要碳源（葡萄糖）的耗尽导致显著的活性下降和代谢转向乳酸消耗。Brunner等人表明，即使是短期的pH扰动也会影响细胞生理，而Trummer等人则表明，尽管在pH 6.8下获得了最高的单克隆抗体滴度，但在pH 7.1下达到了最高的体积生产力。尽管Trummer等人没有观察到pH 6.8和7.1之间产品质量（Epo-Fc的唾液酸化）的显著差异，但Brunner等人报告了在pH 6.8、7.0和7.2下培养的mAbs的基本和酸性变体中的几种差异。在另一项研究中，CHO灌注培养中第9天将pH从7.15降至6.85，增加了细胞密度和寿命，并改善了单克隆抗体的糖基化和效力，同时保持了生产力。 对其他细胞系也观察到了类似的效果。在Sp2/0补料分批培养中，中性pH最理想，当pH从7.2降低到7.0时，活细胞的积分和滴度都有所增加，尽管没有报告产品质量数据。在F2N78细胞培养中，pH从6.8增加到7.4会减少寿命并加速代谢，导致副产品积累更多，pH 6.8被认为是最佳选择。Osman等人受到在添加碱/酸时对生物反应器进行pH扰动的调查的启发，将GS-NS0细胞在pH 7.3下培养，并研究了单一和多重pH扰动的影响。作者报告说，单一pH 8扰动没有显著的不利影响，但对pH 9扰动有时间和剂量依赖性的反应。因此，有效的搅拌和谨慎选择添加碱/酸的点对于避免生物反应器非均匀区域的凋亡很重要。 如上所述，有毒代谢物（如乳酸）的积累会降低培养pH值。虽然在某些研究中，酸化是早期凋亡的特征，与DNA损伤有关，但在其他研究中，酸化并未导致细胞死亡，也没有影响生长，Bcl-2和Mcl-1提供了保护。在NS0细胞培养中，凋亡可以独立于细胞内pH变化发生，在酸度下HL-60细胞中观察到增加的半胱天冬酶活性。事实上，Bax在pH 4.0时形成线粒体膜孔的能力是在pH 7.5时的8倍，而Bcl-2几乎可以完全抵消这种效果。由于氨的产生，培养基的碱化是一个已知的增殖过程特征。然而，其对细胞生理的影响机制仍需阐明。碱性环境可能会抑制半胱天冬酶-3，但如果之前已经激活，蛋白质在pH值增加后仍然保持活性。 3.2.6.渗透压 关于渗透压的研究评估了盐分和代谢物对生长和生产力的影响，如表6所总结。尽管高渗透压在CHO细胞中激活了半胱天冬酶3和7，导致DNA碎片化，在小鼠肾细胞中导致DNA双链断裂，但渗透压诱导凋亡的机制需要进一步研究。在生物反应器中，由于pH控制通常是通过碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂实现的，这需要CO2，因此很难将盐分和CO2的影响分开。一项使用低盐培养基配方的研究表明，高渗条件与凋亡强烈相关，而CO2分压单独对Sp2/0细胞培养的活性没有显著影响。相比之下，pCO2对CHO细胞的生长有显著影响，而高渗压（尽管在310至376 mOSm/kg的非常窄的范围内）没有。氯化钠（NaCl）通常用于渗透压研究，并且已经证明了其对CHO细胞生长的剂量依赖性影响。有趣的是，脯氨酸补充已被成功用于抵消由NaCl添加引起的高渗压力的影响。这些结果令人惊讶，因为添加溶质进一步增加了培养基的渗透压，表明对NaCl或氨基酸诱导的渗透压增加有不同的反应机制。事实上，向小鼠肾细胞培养中补充尿素至最终渗透压600 mOsm/kg对DNA的损伤程度与添加NaCl至最终渗透压300 mOsm/kg相同，证实了溶质特异性效应的假设。这在生物加工中特别相关，因为人们一直在努力使用氯化钠提高细胞对渗透压应激的抵抗力；然而，这样的研究可能并没有针对与渗透压相关的问题的真正原因。最近，通过使用“渗透压空间”成功地从培养基配方中去除了氯化钠（和其他成分），以增加营养物质浓度而不使细胞受到高渗压力。在蛋白质生产方面，高渗性效应是产品特异性的，导致EPO-Fc滴度降低但单克隆抗体滴度不变。 与CHO细胞不同，当渗透压从290增加到450 mOsm/kg时，NS0细胞培养实现了延长的寿命，尽管细胞密度较低。只有在高渗培养（450 mOsm/kg）的最后几天才观察到滴度差异，这归因于它们改善的寿命。然而，在高渗条件下，特定单克隆抗体（mAb）的生产力和特定增长率更高。有趣的是，另一项研究表明，将补料分批NS0培养的渗透压从平均276增加到平均326 mOsm/kg显著改善了生长和单克隆抗体滴度，而进一步增加到381 mOsm/kg则有轻微的负面影响。这些结果表明，渗透压对细胞生长的影响取决于细胞系，可能还特定于克隆，并且对生产力和滴度的影响是产品特异性的。 3.2.7.错误折叠蛋白引起内质网应激 为了实现高滴度培养，需要过度表达蛋白质。然而，过度表达蛋白质可能触发内质网（ER）应激，导致凋亡和产品质量下降，因为由于内质网无法应对高蛋白质浓度，不完全的产品被分泌出去。表7显示了有关内质网应激对相关生物加工细胞系影响的文献综述。 未折叠蛋白反应被描述为内质网和细胞核之间的相互作用。错误折叠或未折叠蛋白的聚集激活了ER应激受体，即atf6（激活转录因子6）和需要肌醇的酶1（IRE1）。这些事件，连同atf4的激活，导致内质网和细胞核之间的相互作用，目的是重新建立ER的折叠能力，并通过合成蛋白酶和分子伴侣来减少正在处理的蛋白质数量。严重的ER应激导致一系列不同的事件，包括CHOP（C/EBP同源蛋白，一种促凋亡转录因子）的表达阻断和JNK（c-Jun N端激酶）对Bcl-2的磷酸化。这些结果导致Bim激活，进而激活Bax通道在ER和线粒体膜上形成。因此，钙，细胞色素C和其他凋亡激活剂被释放，最终触发半胱天冬酶激活和凋亡细胞死亡。另一个关键的相互作用是ER和线粒体之间的串扰。ER是钙离子的主要内部储存库，它们介导几种信号传导途径，ATP产生和凋亡。肌醇三磷酸受体类型1（IP3R-1），是钙信号传导机制的关键因素，被认为是半胱天冬酶-3的底物，Bcl-2或BcL-xL可能与ER表面不同类型的IP3R（1、2或3）相互作用，以控制钙离子释放速率，这种相互作用被Bax阻止。删除IP3R1基因导致对凋亡的抵抗。这些发现证实了钙在ER应激诱导的凋亡中的重要作用。 来自同一亲本CHO克隆的高和低单克隆抗体生产克隆中ER应激的动态表明，重链mRNA的上调与每个克隆的生产水平相关，并且分子伴侣的浓度将在培养结束时增加，此时达到最大单克隆抗体滴度。然而，低生产者比高生产者晚2天进入凋亡，而凋亡率保持不变。在IgG生产的CHO细胞中，过度表达未折叠蛋白反应基因成功地产生了一个生产力更高的克隆，尽管没有评估产品质量。同样，在NS0培养的下降阶段，ER蛋白表达的增加与单克隆抗体产量的增加相关。这些结果表明，未折叠蛋白反应（UPR）基因是增加单克隆抗体生产的好目标。然而，也有研究表明高单克隆抗体生产与分子伴侣表达增加有关，但X盒结合蛋白1（XBP1）的表达没有变化，XBP1是UPR的标志，这表明未折叠蛋白反应途径在GS-NS0细胞中活性并不更高，这些细胞具有更高的单克隆抗体生产率。作者建议这一观察可能是特定于克隆的。 识别对ER敏感的克隆和ER报告基因可以帮助选择高产者并在凋亡发生之前的所有工艺开发阶段监控压力。基于ER的选择策略已应用于CHO细胞，采用GRP78（ER应激报告基因）的表达作为高表达的标志；类似的策略已应用于NS0细胞，使用GADD153基因，其在几个NS0克隆中的表达被修改。GADD153被认为是ER应激开始的良好报告基因，其过度表达本身并不是凋亡的原因。总之，ER应激应考虑在内，特别是在细胞系开发和克隆选择的早期工艺开发阶段。 4.系统方法  传统上，生物工艺优化是通过顺序实验进行的，因此仅限于筛选设计空间的一小部分区域。最近，高通量策略和“组学”技术使评估范围更广的设计空间成为可能，尽管它们既耗时又成本高昂。凋亡工程和凋亡建模是合理的“系统”方法，可以促进细胞生物工艺的优化，因为它们可以筛选整个设计空间，有可能减少时间和成本。下面回顾了这些策略，可以单独使用或结合使用（图1）。 4.1.凋亡工程 凋亡工程是一种针对细胞系工程的方法，目标是通过合理的基因表达修改，发展抗凋亡细胞系。可以过度表达抗凋亡蛋白和/或下调促凋亡蛋白。这些研究的总结见表8。 最常用的抗凋亡基因是Bcl-2，它在各种环境压力下都能提供抗凋亡能力。在杂交瘤细胞中过度表达Bcl-2延长了几种培养条件下的寿命。在NS0细胞中，过度表达Bcl-2导致相互矛盾的观察结果：一些研究报告了对细胞密度和单克隆抗体生产的积极影响，而其他报告则没有显著影响。在CHO细胞培养中，过度表达Bcl-2导致细胞密度增加，寿命改善和凋亡减少，但没有影响单克隆抗体生产。过度表达Bcl-xL或Mcl-1提供了有希望的结果的替代策略。一项关于CHO细胞中过度表达Bcl-xL和Bcl-2的比较研究得出结论，Bcl-xL是CHO细胞工程比Bcl-2更有希望的目标，因为后者可能会损害蛋白质生产。事实上，通过在CHO细胞中过度表达Bcl-xL实现了2.7倍的灌注蛋白生产增加，而另一个过度表达Mcl-1的CHO克隆报告了单克隆抗体滴度增加了40%，没有显著影响产品质量。有人建议Bcl-2和Bcl-xL的效果可能是功能上冗余的，这种可能性也在Sp2/0细胞的研究中被指出，其中Bcl-xL的表达显著改善了培养寿命。 在CHO细胞中的其他凋亡工程方法包括过度表达Aven（凋亡体抑制剂）和E1b-19k（BH3-only蛋白抑制剂），这可以延长培养寿命。另一种方法是消除促凋亡蛋白。具体来说，在CHO细胞中消除Bax和Bak增加了培养寿命，并产生了更高的单克隆抗体滴度，同时使细胞对凋亡更加抵抗（即使化学诱导的凋亡），在33和37°C下均如此。有关这些策略的详细评论，包括抑制其他基因和使用半胱天冬酶抑制剂，可以在其他地方找到。最后，据我们所知，尚未实施的凋亡工程的一个不同方法是直接针对凋亡逆转机制，通过过度表达凋亡可逆性基因（XIAP、PARP、HSPs等），这可能导致阻止凋亡事件并启动Anastasis，将凋亡群体恢复为活性。 尽管针对凋亡的细胞工程取得了有希望的结果，但关于产品质量和副作用（如代谢变化和遗传稳定性）的信息仍然不足。蛋白质生产要么没有报告，要么显示出微小的改进，这归因于生物能量学的下调。两个例外是使用NS0细胞进行的恒化器研究，其中实现了单克隆抗体产量的3倍增加，以及在CHO细胞中过度表达Bcl-xL的研究，实现了单克隆抗体产量的2倍增加。由于细胞将能量利用集中在基本功能上，因此非基本功能的能量减少。这突出了阐明细胞能量学、其在凋亡中的作用以及遗传操作引起的任何代谢变化的重要性。例如，一个潜在的有趣替代策略是通过氨基酸和葡萄糖喂养来提供凋亡保护。尽管理想情况下是互补的，但营养喂养和凋亡工程可能是不兼容的。在过度表达Bcl-xL的Sp2/0细胞克隆中，谷氨酰胺喂养后活性保持不变，而野生型在喂养后活性得到改善。细胞的遗传操作也引起了对过度表达抗凋亡蛋白的细胞系稳定性的担忧，不仅因为这些细胞中观察到异常，而且因为这些蛋白的表达可能在长期或在可能影响产品质量的特定应激条件下丢失。过度表达抗凋亡基因（Fadd、Faim、Alg-2和Requiem）的遗传工程CHO细胞不仅显示出增加的活细胞数量和γ-干扰素产量，而且还增加了唾液酸化。 4.2.凋亡的数学建模 如图2所示，凋亡是一个高度调节的过程，其中几种蛋白质的干预确保细胞以受控且无害的方式死亡。由于其在生物加工中的显著影响，凋亡的数学模型将有助于整合生物过程数据，并预测生物反应器几何形状和操作对细胞死亡的影响。然而，凋亡的生物学复杂性使建模具有挑战性。表9总结了各种有限的凋亡建模尝试。 详细数学描述参与不同凋亡途径的所有蛋白质和相互作用在（1）捕捉生物学，（2）获取验证模型预测所需的实验数据，以及（3）产生计算可追踪的预测模型方面提出了重大挑战，这些模型可用于基于模型的过程优化。因此，凋亡建模有两种先验选择。在生物学方面，需要仔细基于证据的决策，确定要建模的干预措施和相互作用，而在建模方面则决定模型结构。虽然一些研究人员选择了基于链反应的公式（启动、放大和执行）或模拟细胞群体在状态之间的转换（存活、凋亡和死亡），但大多数人选择了动力学/机制公式，由于其动态特性通常更受青睐（Kyriakopoulos等人，2018b年）。模型复杂性归因于通过建模少数相互作用以捕捉详细的动力学关联，或者通过考虑整个途径但仅考虑少数干预措施来建模。描述少数物种详细模型的例子包括（1）DNA损伤模型，（2）通过各种途径激活半胱天冬酶-3的模型，（3）Bax/Bcl-2相互作用模型，（4）包括双稳态研究的半胱天冬酶3和8相互作用模型，后来又与实验数据进行了比较，以及（5）UPR模型或自噬和凋亡之间相互作用的模型。复杂网络模型包括Fas信号模型，其中某些模拟与实验数据进行了比较，以及描述使用敏感性分析和实验验证的最小凋亡诱导配体/受体比例的CD95诱导凋亡途径模型。Bentele及其同事的工作提供了一个适合生物过程社区兴趣的模型特征示例，特别是在与生物过程优化相关的方面。在CHO细胞中使用代谢通量分析（MFA）对葡萄糖、乳酸、五种氨基酸和氨进行了代谢和凋亡的整合；然而，代谢物预测超出指数生长期与实验数据不符，未能捕捉代谢转变。尽管MFA提供了有关细胞平衡代谢状态的有价值信息，但它在动态过程中的应用有限。使用结合建模/实验方法分析了营养应激对GS-NS0细胞基因表达的影响，其中简化的动力学模型捕获了营养和代谢物剖面，并描述了批量模式下六个凋亡相关基因（半胱天冬酶3和8、atf5、bcl-2、bax和trp53bp2（p53结合蛋白2））的表达。这项工作的主要缺点是在补料分批模式下缺乏预测能力。 如前所述，跨尺度的凋亡诱导应激在生物过程开发中很重要（图4），需要在凋亡建模中纳入空间效应。例如，虽然细胞总体上可能不会经历高剪切应力环境，但有些细胞会物理上靠近搅拌器。同样，尽管pH可能得到了很好的控制，但在酸/碱添加点的局部扰动可能诱导暴露于扰动的细胞凋亡。同样，尽管气泡破裂在整体上不构成问题，但在气液界面附近可能是有害的。计算流体动力学（CFD）建模考虑了空间效应，集成CFD-动力学模型将为最佳反应器几何设计（尺寸、体积、挡板数量和搅拌器位置）、最佳操作条件（通气、O2水平、搅拌等）以及最佳培养基设计和补料策略提供有关生产力和产品质量优化的有价值信息。 5.结论和未来方向  生物反应器中的细胞死亡主要作为凋亡的结果，活力的降低可能会影响产品滴度和产品质量。为了实现最佳操作，了解引起凋亡的应激在生物过程开发中至关重要。对于各种工业相关的哺乳动物细胞系，仍然缺乏对凋亡的原因和效应的全面阐明，具体到细胞系和克隆。此外，建立稳健和快速的凋亡表征方法以及开发新方法，包括细胞工程和in silico建模，以对抗凋亡，将进一步改善生物过程优化。总之，生物过程开发和优化必须考虑细胞系和克隆特异性属性，并超越喂养策略、培养基配方和细胞工程，进行全生物过程设计，以减少/消除凋亡原因。上游改进将对下游加工产生积极影响，具有累加的有益影响。

摘要：抗体药物偶联物（ADC）通常由单克隆抗体（mAbs）通过化学连接臂共价连接到细胞毒素药物。它结合了高度特异性靶向能力和高效杀伤效果的优势，实现对癌细胞的精准和高效清除，已成为抗癌药物研发的热点之一。自第一个ADC药物Mylotarg®（吉妥珠单抗奥佐加霉素）在2000年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准以来，全球迄今已有14种ADC药物获得市场批准。此外，目前有100多个ADC候选药物正在临床阶段进行研究。这种被称为“生物导弹”的新型抗癌药物，正在引领靶向癌症治疗的新时代。在这里，我们对ADC的历史和作用机制进行了回顾，并简要讨论了ADC关键组成部分的分子方面以及这些关键因素如何影响ADCs的活性。此外，我们还回顾了已批准的ADCs和在III期临床试验中其他有前景的候选药物，并讨论了下一代开发当前的挑战和未来的展望，为使用ADCs研发新型癌症治疗方法提供了见解。 1.  引言 癌症已成为全球第二大健康威胁，2020年约有1000万人死于癌症。几十年来，基于细胞毒素剂的化疗一直是治疗广泛癌症的主要方法。这些细胞毒素剂包括DNA碱基类似物（5-氟尿嘧啶和8-氮鸟嘌呤）、DNA作用剂（顺铂和放线菌素D）、抗代谢物（氨基蝶呤和甲氨蝶呤）和微管抑制剂（紫杉醇和长春新碱衍生物）等。然而，这些化疗药物大多表现出较低的治疗指数，严重的副作用通常归因于非特异性药物暴露于非靶组织。为了解决这个问题，科学家一直在开发具有更高靶向能力的新型癌症治疗方法。 早在20世纪初，保罗·埃尔利希首次提出了“魔法子弹”的概念，并假设某些化合物可以直接作用于细胞中的某些期望靶标以治疗疾病。理论上，这些化合物应该能有效杀死癌细胞，但对正常细胞无害。一种可行的方法是识别一些在癌细胞上特异性高表达的抗原，以区分癌细胞和健康细胞，如乳腺癌上的HER2（人类表皮生长因子受体2）和B细胞淋巴瘤上的CD20（分化簇20）。这些抗原的特异性表达为通过单克隆抗体（mAbs）精确靶向肿瘤提供了可能性，自1975年杂交瘤技术发展以来，这一领域取得了巨大进步。近几十年来，越来越多的mAbs，如阿瓦斯汀、曲妥珠单抗、利妥昔单抗和小细胞肺癌，已在全球范围内获得批准，用于治疗各种实体瘤和血液癌症。 mAbs的出现通过精确靶向肿瘤表面抗原改变了癌症治疗的范式，然而，单独使用mAbs治疗通常是不够的，可能由于与化疗相比对癌细胞的致死性不够满意。因此，提出了一种新概念，即抗体-药物偶联物（ADC），以弥合mAb和细胞毒素药物之间的差距，提高治疗窗口。ADC由肿瘤靶向mAbs通过精心设计的化学连接臂与细胞毒素有效载荷共轭，实现了精确靶向和强大效果的双重能力。此外，由于连接到一个大的亲水性抗体，细胞毒素有效载荷在抗原阴性细胞中的非特异性摄取受到限制，有助于扩大治疗指数。 2000年，美国食品药品监督管理局（FDA）首次批准了ADC药物Mylotarg®（吉妥珠单抗奥佐加霉素），用于治疗成人急性髓细胞性白血病（AML），这标志着癌症靶向治疗ADC时代的开始。截至2021年12月，全球已有14种ADC药物获得批准，用于血液系统恶性肿瘤和实体瘤。此外，目前有100多个ADC候选药物处于不同的临床试验阶段。ADC药物从其起步阶段到成熟发展阶段在过去一百年中的里程碑事件如图1所示。随着靶标和适应症的不断扩大，ADC正在引领靶向癌症治疗的新时代，预计未来将取代传统的化疗。在这篇综述文章中，我们讨论了ADC的关键组成部分的分子方面和作用机制，并简要总结了ADC发展的进展。我们还回顾了已批准的ADCs和III期临床试验中的其他有前景的候选药物，并讨论了下一代ADC开发的当前挑战和未来展望。 图1 展示了自1910年Paul Ehrlich提出“魔法子弹”概念以来，过去一个世纪ADC药物开发和批准的重要事件时间线。ADC代表抗体药物偶联物；CEA代表癌胚抗原；ALL代表急性淋巴细胞性白血病；BR96是一种结合Lewis Y的抗体；DOX代表多柔比星；FDA代表美国食品药品监督管理局。 2.  ADC的关键组成部分 如图2所示，ADC由抗体、细胞毒素有效载荷和化学连接臂组成。一个理想的ADC药物在血液循环中保持稳定，准确到达治疗目标，并最终在目标附近（例如癌细胞）释放细胞毒素有效载荷。每个元素都可能影响ADC的最终疗效和安全性，通常ADC开发需要考虑所有这些关键组成部分，包括选择目标抗原、抗体、细胞毒素有效载荷、连接臂以及偶联方法。 图2 展示了ADC药物的结构和特点。核心组成部分包括目标抗原、抗体、连接体、细胞毒素药物以及它们的关键功能。 2.1.  目标抗原选择 肿瘤细胞上表达的目标抗原是ADC药物识别肿瘤细胞的导航方向，它还决定了将细胞毒素有效载荷输送到癌细胞的机制（例如内吞作用）。因此，适当的选择目标抗原是ADC设计的首要考虑因素。为了减少非靶组织的毒性，目标抗原首先应该在肿瘤细胞中特异性表达或占主导地位，在正常组织中很少或很低表达。理想情况下，抗原是表面（或细胞外）抗原，而不是细胞内抗原，以便被循环中的ADC识别。例如，某些肿瘤中HER2受体的表达量比正常细胞大约100倍，这为阿多珠单抗艾美曲辛、法姆珠单抗德鲁替康和迪司他珠单抗的发展成为坚实的基础。其次，目标抗原应该是非分泌性的，因为循环中的分泌性抗原会导致不希望的ADC在肿瘤外部位点的结合，导致肿瘤靶向性降低和安全性问题增加。第三，目标抗原理想情况下在与相应抗体结合后能够被内吞，以便ADC-抗原复合物进入癌细胞，随后通过适当的细胞内运输途径和有效释放细胞毒素有效载荷。 目前，如图3所示，已批准的ADC药物的目标抗原通常是癌细胞中特异性高表达的特定蛋白质，包括实体瘤中的HER2、Trop2、Nectin4和EGFR，以及血液系统恶性肿瘤中的CD19、CD22、CD33、CD30、BCMA和CD79b。在肿瘤学和免疫学基础研究的推动下，ADC目标抗原的选择已逐渐从传统的肿瘤细胞抗原扩展到肿瘤微环境中的目标，例如基质和血管。越来越多的证据表明，新血管系统的组成部分、亚内皮细胞外基质和肿瘤基质可能是ADC药物开发中有价值的目标抗原。例如，基质靶向ADC药物有潜力通过降低基质细胞产生的生长因子浓度来引起癌细胞死亡。由于癌细胞的生存依赖于血管生成和基质因子，ADCs可能通过靶向这些组织具有更广泛的疗效。此外，这些细胞的基因组比癌细胞更稳定，这可能为降低突变诱导的药物抗性提供了有希望的手段。 图3 展示了用于开发ADC的重要肿瘤细胞靶点抗原（过度表达和驱动基因）以及肿瘤微环境（血管和基质）。这些图像是使用BioRender.com创建的。 2.2.  抗体质点 肿瘤靶向抗体对于ADC与目标抗原之间的特异性结合至关重要。理想的抗体质点除了对目标抗原具有高亲和力外，还应促进有效的内吞作用，展示低免疫原性，并保持长的血浆半衰期。在ADC药物开发的早期阶段，主要使用小鼠来源的抗体，但由于严重的免疫原性相关的副作用，导致高失败率。随着重组技术的出现，小鼠抗体大多被嵌合抗体和人源化抗体所取代。目前，ADC越来越采用完全人源化的抗体，显著降低了免疫原性。在14种批准的ADC药物中，只有brentuximab vedotin使用嵌合抗体。 作为血清中免疫球蛋白的主要组成部分，目前ADC药物中使用的抗体大多是免疫球蛋白G（IgG）抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四个亚型。IgG1是ADC常用的亚型，因为IgG1在血清中含量最丰富，并且能够通过与Fc受体的高亲和力诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）等强效应器功能。这些Fc介导的效应功能在抗体药物的抗癌活性中起着至关重要的作用。IgG3很少用于ADC，因为其清除速率很快。与其他三种亚型的半衰期大约21天不同，IgG3在血清中的半衰期仅为大约7天。IgG2在体内通常倾向于形成二聚体和聚集体，导致ADC药物的浓度降低。IgG4可以诱导ADCP，然而，IgG4是一种具有Fab臂交换的异常动态抗体，导致效力降低和靶向效果不佳。 关于抗体-抗原复合物的内吞作用，效率主要取决于抗体与肿瘤细胞表面抗原之间的结合亲和力，其中更高的亲和力通常导致更快的内吞作用。然而，具有高抗原亲和力的抗体可能会减少进入实体瘤的渗透。实体瘤的治疗比血液瘤更复杂，因为实体瘤存在“结合位点屏障（BSB）”，极其强烈的抗体与抗原结合导致ADCs在从血管渗出后被困在血管附近，而较少渗透到远离血管的肿瘤细胞。因此，抗原与抗体之间的合理亲和力应该被优化，以平衡在目标细胞中的快速吸收和抗癌效力。除了结合亲和力外，影响肿瘤渗透的另一个因素是抗体的大小。IgG抗体（约150 kDa）的分子量大通常对通过血浆毛细血管和肿瘤基质的渗透构成挑战。因此，早期ADC主要针对血液系统恶性肿瘤。为了使ADC更好地适用于实体瘤治疗，研究人员尝试通过去除FC段来缩小抗体的大小。缩小的抗体不仅保持了高亲和力和特异性，而且还更容易通过血管渗透到实体瘤中，从而大大提高了对实体瘤的杀伤效果。然而，这样的变化也被发现会导致体内半衰期的减少。因此，在设计使用缩小抗体的ADC时，应考虑多种因素。 2.3.  连接臂 ADC中的连接臂连接抗体与细胞毒素药物。它是与ADC稳定性和有效载荷释放特性相关的关键因素之一，因此对ADC的最终治疗指数至关重要。理想的连接臂不应引起ADC聚集，预期限制血浆中有效载荷的过早释放，并促进在期望的目标部位释放活性药物。根据细胞内的代谢命运，可裂解和不可裂解连接臂在大多数ADC药物中得到应用。 可裂解连接臂利用系统循环和肿瘤细胞之间的环境差异来准确释放游离细胞毒素药物，它们可以进一步细分为化学裂解连接臂（腙键和二硫键）和酶裂解连接臂（葡萄糖苷酸键和肽键）。腙是一种典型的酸敏感（pH敏感）连接臂。腙连接的ADC通常在血液循环中稳定，但在内吞进入目标癌细胞后，在溶酶体（pH 4.8）和内质体（pH5.5–6.2）中水解，释放细胞毒素有效载荷。然而，腙键的水解并不完全局限于溶酶体，偶尔也会在血浆中发生，导致靶向效率降低和非靶向效应。迄今为止，含腙连接臂的ADC主要用于血液系统恶性肿瘤。例如，gemtuzumab ozogamicin和inotuzumab ozogamicin分别使用腙连接卡利奇霉素与mAbs治疗AML和急性淋巴细胞性白血病（ALL）。基于二硫键的连接臂是另一种化学敏感的可裂解连接臂，对还原性谷胱甘肽（GSH）敏感。GSH在维持细胞存活、增殖和分化以及维持细胞内氧化还原平衡方面发挥着至关重要的作用。血液中的GSH浓度远低于癌细胞内的浓度。因此，这种类型的连接臂可以保持在血液系统中稳定，同时在GSH水平升高的癌细胞中特异性释放活性有效载荷。 在酶敏感连接臂方面，基于肽的连接臂对溶酶体蛋白酶敏感，已在许多ADC中得到应用。溶酶体蛋白酶，如卡他蛋白B，在癌细胞中通常过度表达，使药物能够在肿瘤附近准确释放。此外，由于血液中存在蛋白酶抑制剂，连接臂通常在系统循环中稳定，降低了副作用的风险。在批准的ADC药物中，有9种使用基于肽的连接臂。例如，brentuximab vedotin使用缬氨酸-瓜氨酸连接臂。此外，β-葡萄糖苷酸连接臂是ADC中常用的另一种酶敏感连接臂。它可以通过β-葡萄糖苷酸酶在细胞内裂解，释放有效载荷，该酶在肿瘤区域的水平通常较高。 相比之下，不可裂解连接臂（例如硫醚或马来酰亚胺己酰基团）对体内的常见化学和酶环境无反应。不可裂解连接臂的最大优势是其低非靶向毒性，得益于血浆稳定性的提高。不可裂解连接臂依赖于ADC的抗体部分的酶促水解，最终释放与抗体降解产物中的氨基酸残基连接的“复合体”有效载荷。只有能够耐受化学修饰的小分子（例如，药效团远离偶联位点时）才适合基于硫醚的连接臂。ado-trastuzumab emtansine（T-DM1）展示了硫醚连接臂的成功应用。该偶联物是抗HER2单克隆抗体与DM1（美登木素）通过琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸盐（SMCC）连接臂链接的产物。连接臂使偶联物在血液中更稳定，并在癌细胞内经蛋白酶消化抗体部分后释放活性代谢物赖氨酸-MCC-DM1。 2.4.  细胞毒素有效载荷 细胞毒素有效载荷是ADC进入癌细胞后发挥细胞毒性的弹头。由于静脉注射后只有大约2%的ADC能够到达目标肿瘤部位，因此作为ADC中的有效载荷，化合物需要具有很高的效力（IC50在纳摩尔和皮摩尔范围内）。此外，这些化合物应在生理条件下保持稳定，并具有可用于与抗体偶联的官能团。目前，ADC中使用的主要细胞毒素有效载荷包括强效的微管抑制剂、DNA损伤剂和免疫调节剂（表1）。 微管是细胞骨架的主要成分，在细胞分裂中发挥重要作用，尤其是在肿瘤细胞的快速增殖中。微管抑制剂包括促进微管聚合和抑制微管聚合的药物，它们已成为抗癌药物研发的热点之一。微管聚合促进剂靶向微管二聚体的β亚基，干扰微管依赖的有丝分裂，其代表药物有auristatin衍生物单甲基auristatin E（MMAE）和单甲基auristatin F（MMAF）。在14种批准的ADC药物中，有5种使用MMAE/MMAF作为有效载荷。相比之下，微管聚合抑制剂阻断微管二聚体形成成熟的微管。典型的抑制剂包括maytansinoid衍生物DM1和DM4（ravtansine）。Ado-trastuzumab emtansine是2013年获得FDA批准的首个使用maytansinoid衍生物的ADC药物。此外，tubulysins（从粘细菌中分离出的四肽）是另一类微管聚合抑制剂，显示出有希望的抗癌活性。例如，EC1169是一种针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）的tubulysin B hydrazide偶联物，目前正在进行临床试验（NCT02202447）。 与微管抑制剂的纳摩尔级 IC50（半最大抑制浓度）相比，DNA损伤剂的IC50值能够达到皮摩尔级别，因此与DNA损伤剂结合的抗体药物偶联物（ADCs）有时更有效，并且可能独立于细胞周期工作（与主要在有丝分裂阶段工作的微管蛋白抑制剂相比），它们甚至可能对那些抗原表达较低的细胞也有效。DNA损伤剂所涉及的详细机制主要包括：（i）DNA双链断裂，如卡利切阿米辛；（ii）DNA烷基化，如二卡霉素；（iii）DNA插入，如拓扑异构酶I抑制剂；（iv）DNA交联，如吡咯并苯并二氮卓（PBD）。卡利切阿米辛是一种天然烯二炔抗生素，对DNA损伤极为有效。与DNA的小沟结合后，卡利切阿米辛产生自由基并引起链断裂，从而诱导细胞死亡。在卡利切阿米辛衍生物中，卡利切阿米辛γ1是最显著的，用于吉妥珠单抗奥佐加米辛和伊诺珠单抗奥佐加米辛。二卡霉素是另一类极为有效的抗肿瘤抗生素，它与DNA的小沟结合并烷基化核苷酸腺嘌呤。SN-38（7-乙基-10-羟基喜树碱）和DXd（exatecan衍生物）是两种主要的喜树碱衍生物，作为ADC药物的有效载荷，通过抑制DNA拓扑异构酶I。例如，萨西图珠单抗戈维特坎是一种针对Trop-2的首创ADC，将SN-38与萨西图珠单抗偶联，而泛曲妥珠单抗德鲁斯特坎由一个针对HER2的抗体与DXd通过肽链偶联组成。PBD是在1960年代早期发现的一类抗肿瘤抗生素。PBD作为二聚体与DNA的小沟结合。结合后，二聚体促进与DNA上的鸟嘌呤在N2位置的氨基交联，从而阻止DNA与转录因子的结合，导致细胞增殖停滞，最终导致细胞死亡。这种机制不依赖于特定的细胞复制周期，DNA损伤难以修复，导致强大的细胞毒性。隆卡替珠单抗特西林是目前唯一在临床上使用，采用PBD作为有效载荷的ADC。除了传统的细胞毒素，越来越多的具有新机制的有效载荷被纳入ADC设计。例如，最近开始应用于新型ADC药物开发的小分子免疫调节剂，也被称为免疫刺激抗体偶联物（ISACs）。ISACs结合了抗体导航靶向的精确性和基于小分子的先天和适应性免疫系统调节的力量。在多种肿瘤模型中记录了有希望的肿瘤退缩和长期抗肿瘤免疫。目前，新型有效载荷主要包括Toll样受体（TLR）激动剂和干扰素基因刺激剂（STING）激动剂。TLRs是先天免疫中一组关键的模式识别受体，在免疫-肿瘤界面中发挥重要作用。例如，TLR7和/或TLR8的激活可以诱导依赖于MyD88的信号通路，激活NF-κB以分泌细胞因子和趋化因子，允许抗肿瘤淋巴细胞的渗透。BDC-1001是一种Boltbody ISAC，目前正在临床开发中（第1/2阶段，NCT04278144）。它由一个针对HER2的抗体与TLR7/8激动剂链接，用于治疗HER2阳性实体瘤患者。Silverback Therapeutics还开发了ImmunoTAC平台，并设计了几种使用TLR8激动剂作为有效载荷的ISACs，如SBT6050、SBT6290和SBT8230。至于STING，它也是一个研究充分的先天免疫途径，STING激动剂能够诱导抗肿瘤免疫活性。武田的CRD5500和Mersana的XMT-2056是两个正在进行临床开发的领先的STING激动剂ADC项目。ISACs是一个相对较新的领域，但一些候选药物已经相继进入临床开发，其后续进展值得期待。 2.5.  偶联方法 除了选择抗体、连接体和有效载荷外，小分子部分（即连接体加有效载荷）与抗体连接的方法对于成功构建ADC也很重要。通常，抗体上的赖氨酸和半胱氨酸残基提供了可接近的反应位点用于偶联，早期的ADC药物通常利用预先存在的赖氨酸或半胱氨酸残基上的随机偶联通过适当的偶联反应。酰胺偶联可以说是最常用的方法，其中活性羧酸酯（当连接体中存在时）用于将有效载荷连接到抗体上的赖氨酸残基，如在吉妥珠单抗奥佐加米辛、T-DM1和伊诺珠单抗奥佐加米辛中所见。然而，一个抗体通常包含大约80-90个赖氨酸残基，其中40个赖氨酸残基通常是可修饰的。通过与赖氨酸残基的随机偶联，可能将不同数量（0-8）的小分子毒素附加到一个抗体上，导致广泛的药物-抗体比（DAR）分布。此外，由于赖氨酸残基分布在抗体的轻链和重链上，靠近抗体-抗原识别位点的偶联反应可能会降低ADC与目标的结合。基于半胱氨酸的反应提供了另一种偶联方式。还原后，二硫键可以转化为可接近偶联反应的半胱氨酸残基。通常，IgG1抗体既有链间二硫键也有链内二硫键。链间二硫键暴露在抗体的外部，容易被还原以暴露自由的半胱氨酸残基，为连接体-有效载荷与抗体的偶联提供了可用的位点。由于结合位点数量有限以及巯基团的独特反应性，使用半胱氨酸作为连接位点有助于减少ADC的异质性。根据还原比例，可以生成DAR为2、4、6和8的产品，与赖氨酸残基偶联的产品相比具有更好的均匀性。这是迄今为止商业产品中最常用的偶联方法。然而，值得注意的是，打开链间二硫键可能会破坏抗体的完整性。通常与基于赖氨酸和半胱氨酸残基的随机偶联相关的一些缺点。这种偶联的稳定性有时不足，导致过早的有效载荷释放，从而产生非靶向毒性。此外，很难保证有效载荷连接到抗体上的一致位点，也很难实现质量控制和临床使用所青睐的均匀DAR。为了减少ADCs的异质性，已经在新的ADCs中开发了几种位点特异性偶联策略（表2）。首先，引入工程化反应性半胱氨酸残基已成为位点特异性偶联的常用方法。由Genentech开发的ThioMab技术利用基因工程技术在曲妥珠单抗的轻链V110A和重链A114C的特定位置插入半胱氨酸残基，然后与半胱氨酸上的硫醇基团偶联MMAE，合成位点特异性抗MUC16 ADC。产生的ADC中DAR为2的比例高达92.1%。此外，ThioMab技术没有影响免疫球蛋白的折叠和组装或抗体与抗原的结合。另一方面，ThioMab技术的一个主要限制是硫醇基团引入步骤可能会导致两个Fab之间的错误二硫键形成，这仍然是一个需要解决的挑战。此外，尽管偶联效率低和链内错误桥接，二硫键重新桥接偶联也引起了关注。与传统的半胱氨酸偶联类似，偶联位点也是通过还原链间二硫键获得的。而不是随机偶联，二硫键重新桥接涉及与半胱氨酸选择性交联试剂的反应，如双磺酰基试剂，下一代马来酰亚胺（NGMs），和吡啶嗪二酮（PDs）。双反应试剂使抗体的多肽链重新连接以及在抗体上的有效载荷偶联成为可能。根据每个连接体上附加的有效载荷数量，可以产生DAR为4、8或16的ADCs。 位点特异性偶联的另一种方法是通过引入非天然氨基酸，包括N-乙酰-L苯丙氨酸、叠氮甲基-L苯丙氨酸和叠氮赖氨酸。这些非天然氨基酸中的特殊功能基团使位点特异性偶联成为可能。此外，偶联是可控的和定量的，以产生具有均匀DAR、高效率、良好稳定性和高安全性的ADCs。然而，有时很难生产修饰过的抗体，含有非天然氨基酸的抗体可能会引起免疫原性。 非天然氨基酸的疏水性也增加了抗体聚集的风险。酶辅助连接也是一种有效的位点特异性偶联策略。通过基因工程，人工诱导特定的氨基酸序列在抗体中表达，这些序列可以被某些酶识别，随后特定的氨基酸残基被酶修饰，从而实现位点特异性偶联。目前，常用的有甲酰甘氨酸生成酶（FGE）和转谷氨酰胺酶（TG）。然而，值得注意的是，氨基酸序列的修饰可能会诱导免疫原性。位点特异性ADCs也可以通过糖链重塑和糖基偶联来生成。在抗体的Fc片段中，每个重链CH2域的N297位置的N-糖链存在，使得通过糖基化与有效载荷偶联的反应位点成为可能。多糖与Fab区域之间的远距离定位可以最小化对抗原结合亲和力的损害。这可能是通过赖氨酸基础化学偶联构建ADC的一个缺陷。此外，最近开发了一种名为pClick技术的位点特异性偶联技术用于ADC。通过引入一种近距离激活的交联剂，带有叠氮基团的肽可以自发地与抗体上最近的赖氨酸残基反应。而叠氮基团为带有生物正交手柄修饰的有效载荷提供了点击化学的可用位点。由于不需要抗体工程和后反应处理，产量和抗体稳定性因此显著提高。pClick技术为ADC开发提供了一种更便捷、更有效的方式进行位点特异性偶联。 3.  ADC的作用机制 ADC协同发挥“特异性”靶向作用和对癌细胞的“高效”杀伤效果。这些药物就像是一个精确制导的“生物导弹”，能够准确摧毁癌细胞，提高治疗窗口，减少非靶向的副作用。ADC的主要作用机制如图4右上角所示。一旦ADC的mAb与癌细胞特异性表达的目标抗原结合，ADC就被细胞内吞/内化形成早期内体，随后成熟为晚期内体，并最终与溶酶体融合。细胞毒性有效载荷最终通过化学或酶介导在溶酶体中释放，导致细胞通过靶向DNA或微管凋亡或死亡。当释放的有效载荷是可渗透或跨膜的，它也可能诱导旁观者效应以增强ADC的疗效。此外，这些药物的旁观者效应还可能改变肿瘤微环境，进而进一步增强ADCs的杀伤效果。此外，ADC的抗癌活性还涉及ADCC、ADCP和CDC效应。一些ADC的Fab片段可以与病毒感染细胞或肿瘤细胞的抗原表位结合，而FC片段与杀伤细胞（NK细胞、巨噬细胞等）表面的FCR结合，从而介导直接杀伤效果（图4左下角）。此外，ADC的抗体部分可以特异性地结合到癌细胞的表位抗原，并抑制抗原受体的下游信号转导（图4右下角）。例如，T-DM1的曲妥珠单抗可以与癌细胞的HER2受体结合，阻断HER2与HER1、HER3或HER4形成异二聚体，抑制细胞存活和增殖的信号转导途径（如PI3K或MAPK），诱导细胞凋亡。 图4 概述了ADC通过不同途径杀死癌细胞的机制。右上角：ADC的主要核心作用机制；左下角：ADC的抗体部分与免疫效应细胞结合，引发包括CDC、ADCC和ADCP效应在内的抗肿瘤免疫；右下角：ADC的抗体部分保持其活性特征，因此可以干扰目标功能，减弱下游信号以抑制肿瘤生长。使用BioRender.com创建。 4.  ADC开发的进展 从药物组成和技术特点的角度来看，ADC药物的开发通常可以细分为三代（表3）。 4.1.  第一代ADCs 在早期，如BR96-doxorubincin等ADC，主要由常规化疗药物通过不可切割的连接体与小鼠来源的抗体偶联而成。这些ADC的效力并不优于游离的细胞毒素药物，而且免疫原性经常是一个问题。后来，使用更有效的细胞毒素药物与人类化mAbs结合，大大提高了疗效和安全性，从而获得了第一代ADCs的市场批准，包括吉妥珠单抗奥佐加米辛和伊诺珠单抗奥佐加米辛。在这两种产品中，使用了IgG4亚型的人类化mAbs，并通过酸敏感的连接体与强效的卡利切阿米辛偶联。然而，这个系统并不完美。例如，酸性条件可能在身体的其他部位出现，第一代ADC中的连接体也可以在系统循环中缓慢水解（pH 7.4，37°C），导致无法控制的有毒有效载荷释放和意外的非靶向毒性。其次，卡利切阿米辛是疏水性的，容易引发抗体聚集，这解释了一些缺陷的出现，如半衰期短、清除速度快和免疫原性。此外，第一代ADC的偶联是基于赖氨酸和半胱氨酸残基的随机偶联，导致高度异质的混合物，具有可变的DARs。DAR对ADC的效力至关重要。不一致的DAR影响ADC药物的药代动力学和药效学（PK/PD）参数和治疗指数。因此，第一代ADC展示了次优的治疗窗口，需要进一步改进。 4.2.  第二代ADCs 以brentuximab vedotin和ado-trastuzumab emtansine为代表的第二代ADC随后推出，对mAbs亚型、细胞毒素有效载荷以及连接体进行了优化。这两种ADC都基于IgG1亚型mAbs，与IgG4相比，更适合与小分子有效载荷进行生物偶联，并且具有更高的癌细胞靶向能力。第二代ADC的另一个重大突破是使用更有效的细胞毒素药物，如auristatins和mytansinoids，提高了水溶性和偶联效率。因此，可以在每个mAb上装载更多的有效载荷分子，而不会引起抗体聚集。除了与抗体载体和细胞毒素有效载荷相关的改进外，第二代ADC中的连接体也得到了改进，以实现更好的血浆稳定性和均匀的DAR分布。总的来说，这三个要素的改进使第二代ADC的临床疗效和安全性得到了提高。然而，仍存在一些未满足的需求，例如由于非靶向毒性导致的治疗窗口不足，以及在高DAR的ADC中聚集或快速清除。当DAR超过6时，ADC表现出高疏水性，并且由于体内更快的分布和清除，倾向于降低ADC的效力。在这种情况下，通过位点特异性偶联优化DAR，以及持续优化mAbs、连接体和有效载荷，成为第三代ADC成功开发的关键。 4.3.  第三代ADCs 以polatuzumab vedotin、enfortumab vedotin、fam-trastuzumab deruxtecan和后来批准的ADC为代表的第三代ADC。得益于位点特异性偶联技术的引入，生产出了具有良好特征DARs（2或4）和期望的细胞毒性的均匀ADCs。 具有一致DAR的ADCs表现出较少的非靶向毒性和更好的药代动力学效率。此外，第三代中使用完全人源化抗体而非嵌合抗体以减少免疫原性。此外，正在开发抗原结合片段（Fabs）以取代一些ADC候选中的完整mAbs，因为Fabs在系统循环中更稳定，可能更容易被癌细胞内化。此外，还开发了更有效的载荷，如PBD、tubulysin和具有新颖机制的免疫调节剂，与抗体偶联。尽管第三代中的连接体类型没有显示任何更新，但已经开发并使用了像Fleximer平台这样的一些新实体来偶联不同的载荷。为了避免干扰免疫系统并提高在血液循环中的保留时间，第三代ADC中采用了更多亲水性连接体调节，如PEGylation。亲水性连接体也在平衡某些细胞毒性载荷（如PBD）的高疏水性方面提供效用，考虑到含疏水性载荷的ADCs通常容易聚集。总的来说，第三代ADC具有更低的毒性、更高的抗癌活性以及更高的稳定性，允许患者接受更好的抗癌治疗。 5.  ADCs的临床开发 5.1.  获批的ADC药物 经过数十年的努力优化关键组成部分，目前有超过100个ADCs处于临床开发中，截至2021年12月，共有14种ADC药物在全球不同国家获得了市场批准。巧合的是，获批的ADC药物中有一半主要用于血液恶性肿瘤，其余的主要用于实体瘤。这些ADCs的概述，包括它们的分子设计、初步批准年份、市场公司、批准国家和批准适应症，如表4所示。 5.2.  血液恶性肿瘤 吉妥珠单抗奥佐加米辛（Mylotarg®，辉瑞）：吉妥珠单抗奥佐加米辛是世界上第一种获批用于临床的ADC治疗药物。它由一个工程化的人源化单克隆IgG4抗体组成，靶向CD33，并通过一个可切割的腙连接体连接一个细胞毒性的N-乙酰-γ-卡利切阿米辛。吉妥珠单抗奥佐加米辛的平均DAR为2-3。以26%的响应率，它最初被FDA批准用于治疗复发或难治性（r/r）CD33阳性AML患者，这些患者年龄超过60岁，不适合其他常规化疗。成人和儿童AML中大约85-90%为CD33阳性。在与CD33抗原结合并被癌细胞内化后，随后腙键水解释放卡利切阿米辛。卡利切阿米辛还可以扩散到附近的其他癌细胞，诱导那些抗原阴性癌细胞的旁观者杀伤效应。然而，吉妥珠单抗奥佐加米辛中的腙基连接体并不完全稳定，导致卡利切阿米辛在血浆中提前释放，增加非靶向毒性。来自SWOG S0106A研究的结果显示，与单独接受化疗（多柔比星和阿糖胞苷）的患者相比，接受联合治疗（吉妥珠单抗奥佐加米辛与标准多柔比星和阿糖胞苷化疗）的患者观察到更高的严重致命毒性发生率，但没有显著的临床益处反应。因此，辉瑞公司在2010年10月自愿将该产品撤出市场。之后，使用比2000年批准的（9 mg/m2）更低的推荐剂量（3 mg/m2）重新评估了吉妥珠单抗奥佐加米辛的疗效和安全性。吉妥珠单抗奥佐加米辛联合化疗在临床试验ALFA-0701中进行了研究，这是一项多中心、随机、开放标签的3期研究。共有271名（50-70岁）新诊断的AML患者随机分配接受包含（n = 135）或不包含（n = 136）吉妥珠单抗奥佐加米辛的诱导治疗，包括多柔比星（60 mg/m2）和阿糖胞苷（200 mg/m2）。无事件生存期（EFS）被用作主要终点，接受吉妥珠单抗奥佐加米辛联合化疗的患者比仅接受化疗的患者显示出更长的EFS，中位EFS分别为17.3个月和9.5个月（HR = 0.56 [95% CI：0.42–0.76]）。两组中发生的3级及以上不良事件（AEs）包括感染（47% vs 39%）、出血（18% vs 9%）和肝静脉闭塞性疾病（2% vs 0%）。此外，吉妥珠单抗奥佐加米辛作为单药治疗的安全性和有效性在AML-19和MyloFrance-1研究中进行了评估。在AML-19中，总生存期（OS）被用作评估疗效的指标。结果表明，接受吉妥珠单抗奥佐加米辛治疗的患者的中位OS为4.9个月，而接受最佳支持治疗的患者为3.6个月（HR = 0.69 [95% CI：0.53–0.90]）。3级以上不良事件在超过5%的患者中包括感染（35%）、发热性中性粒细胞减少症（18%）、出血（13%）、疲劳（12%）、肝脏（7%）和心脏（6%）。在MyloFrance-1中，观察到26%的完全缓解（CR）率。超过5%的患者中发生的3级及以上不良事件包括败血症（32%）、发热（16%）、皮疹（11%）、肺炎（7%）、出血（7%）。基于以上三项研究者主导的临床试验中取得的整体积极结果，Mylotarg®于2017年被FDA重新批准。最近，吉妥珠单抗奥佐加米辛获得了FDA的新适应症批准，用于治疗新诊断的CD33阳性AML，包括1个月及以上的儿童患者。从吉妥珠单抗奥佐加米辛的撤回和重新批准中获得的罕见上市经验为ADCs的开发和临床试验设计提供了重要的参考。 布伦图珠单抗维多汀（Adcetris®，Seagen）：布伦图珠单抗维多汀也称为SGN-35，是FDA于2011年批准的第二种ADC药物，用于治疗复发或难治性（r/r）CD30阳性霍奇金淋巴瘤（HL）和系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）。它由一个针对CD30的嵌合IgG1单克隆抗体brentuximab组成，一个马来酰亚胺连接基团，一个可切割的二肽连接体（马来酰亚胺-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲酰氧羰基或mc-VC-PABC），以及抗有丝分裂剂MMAE。布伦图珠单抗维多汀的平均DAR为4。通过选择性靶向HL和ALCL的特征性抗原CD30，布伦图珠单抗维多汀通过依赖于clathrin的机制内化，并转移到内体和溶酶体中，其中连接体被半胱氨酸蛋白酶（如B）水解。释放出的游离MMAE随后靶向微管蛋白，以抑制其聚合，导致细胞周期停滞和细胞凋亡。由于旁观者效应，布伦图珠单抗维多汀对那些抗原阴性的癌细胞也有效。与吉妥珠单抗奥佐加米辛中的肼连接体相比，布伦图珠单抗维多汀中的基于二肽的连接体在生理条件下显示出更好的稳定性，因此血浆中细胞毒性载荷的过早释放最小。此外，连接体对半胱氨酸蛋白酶敏感，可以促进有效载荷在癌细胞内的高效释放，以确保杀伤效果。布伦图珠单抗维多汀的另一个改进是使用了更强效的细胞毒性载荷，MMAE。它是天然产物Dolastatin 10的合成衍生物，作为一种超有效的抗有丝分裂剂，通过阻断微管蛋白聚合来诱导细胞周期停滞。155 它被广泛用作几种ADCs的有效载荷，如polatuzumab vedotin、enfortumab vedotin和disitamab vedotin。布伦图珠单抗维多汀对HL和sALCL的疗效在两项单臂2期试验中进行了研究，分别有73%和86%的患者实现了客观反应，因此FDA在2013年加速批准了Adcetris®用于r/r HL和sALCL。在一项关键的2期、单臂、多中心研究中，对102名接受过自体干细胞移植（SCT）的r/r HL患者进行了布伦图珠单抗维多汀对HL的疗效评估。 目标反应率（ORR）被用作主要终点。结果表明，在接受了brentuximab vedotin（1.8 mg/kg）治疗的患者中，有73%出现了完全反应（CR）或部分反应（PR），患者对治疗的平均反应时间为6.7个月。在至少5%的患者中出现的3级及以上不良事件（AEs）包括中性粒细胞减少症（20%）、周围感觉神经病变（8%）、血小板减少症（8%）和贫血（6%）。对于sALCL，它在58名复发或难治性sALCL（r/r sALCL）患者的2期、单臂、多中心研究中进行了评估。在接受brentuximab vedotin（1.8 mg/kg）治疗的患者中，有86%经历了完全或部分反应，并且平均反应时间为12.6个月。在sALCL患者中观察到的严重不良事件与接受干细胞治疗（SCT）的患者相似。2017年11月，基于3期研究（ALCANZA）的积极数据，brentuximab vedotin获得了额外的批准，用于治疗先前接受过系统治疗的原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤（pcALCL）或表达CD30的蕈状真菌病（MF）。在该研究中，brentuximab vedotin显示出至少持续四个月的ORR。此外，在2018年，brentuximab vedotin获得了另外两个临床适应症的批准，与化疗联合使用，包括治疗某些类型的外周T细胞淋巴瘤（PTCL）和先前未经治疗的III期或IV期经典霍奇金淋巴瘤（cHL）。伊诺珠单抗奥佐加米辛（Besponsa®，辉瑞）：伊诺珠单抗奥佐加米辛，也称CMC-544，由一个针对CD22的人源化mAb组成，连接到细胞毒性的N-乙酰-γ-卡利切阿米辛，平均DAR为5-7。CD22是大多数（60-90%）B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）中发现的细胞表面抗原。与CD22结合激活了ADC的一系列下游过程，包括内化、连接体水解和有效载荷释放，类似于吉妥珠单抗奥佐加米辛中所见。通过一项开放标签、随机、国际多中心3期研究（INO-VATE 1022），评估了伊诺珠单抗奥佐加米辛的安全性和有效性，与研究者选择的化疗方案进行了比较，研究对象为326名接受过一种或两种先前治疗的成人r/r B-ALL患者。所有入选的患者被随机分配接受伊诺珠单抗奥佐加米辛治疗或替代化疗方案，包括FLAG（氟达拉滨、阿糖胞苷和G-CSF）、HIDAC（高剂量阿糖胞苷）、阿糖胞苷和米托蒽醌的混合物。该研究中使用的主要指标是治疗后无疾病证据和血细胞计数完全恢复的患者百分比。结果显示，35.8%接受伊诺珠单抗奥佐加米辛治疗的患者实现了CR，而替代化疗组观察到17.4%。伊诺珠单抗奥佐加米辛组中出现的3级及以上不良事件包括中性粒细胞减少症（47%）、血小板减少症（41%）、白细胞减少症（27%）和发热性中性粒细胞减少症（27%）。基于这些积极结果，2017年8月，FDA批准Besponsa®上市，这是第一个也是迄今为止唯一一个针对CD22的ADC，用于治疗成人r/r B细胞前体ALL。 毛细胞白血病（HCL）是一种罕见的血液恶性肿瘤，其特征是脾肿大、出血和异常B淋巴细胞的积累。除了B-ALL，CD22也在HCL的B细胞中表达，因此被用作治疗靶点。moxetumomab pasudotox不是使用小分子有效载荷，而是由针对CD22的moxetumomab与假单胞菌外毒素A（PE38）的38kD片段偶联而成。171 CD22在成熟B细胞上表达，在100%的毛细胞上表达更为强烈，为HCL治疗提供了理想的治疗靶点。与CD22结合后，moxetumomab pasudotox被内化，裂解并释放外毒素的催化域进入癌细胞内，抑制蛋白质的翻译导致凋亡。moxetumomab pasudotox的3期临床研究（Study 1053）招募了80名组织学证实的HCL或HCL变异型患者，这些患者需要治疗，基于存在细胞减少症或脾肿大，并且之前接受过至少两种系统疗法（包括一种嘌呤核苷类似物）。患者接受moxetumomab pasudotox治疗（0.04 mg/kg），直到观察到CR、疾病进展或不可接受的毒性。在研究中，moxetumomab pasudotox单药治疗的ORR和CR率分别为75%（95% CI，64-84）和41%（95% CI，30-53）。此外，持久的CR率为30%（95% CI，20-41）。最常见的3-4级事件包括淋巴细胞减少（20%）、贫血（10%）和无症状低磷血症（10%）。2018年9月，FDA批准了AstraZeneca的Lumoxiti®用于治疗先前至少接受过两种系统疗法（包括嘌呤核苷类似物）失败的成人r/r HCL患者。这使得moxetumomab pasudotox成为过去20年来首个获批用于治疗HCL的新药，是HCL临床治疗中的一个重要里程碑。 Polatuzumab vedotin（Polivy®，罗氏）：Polatuzumab vedotin，也称DCDS4501，包含一个针对CD79b的人源化抗体，通过可被蛋白酶切割的二肽连接体（mc-VC-PABC）连接到微管破坏剂MMAE，平均DAR为3.5。CD79b是B细胞受体（BCR）的一个组成部分，超过90%的B细胞非霍奇金淋巴瘤（nHL）恶性肿瘤表达，并被视为一个有前景的抗体靶点。与brentuximab vedotin类似，给药后，polatuzumab vedotin选择性地结合到CD79b，随后内吞和蛋白水解裂解，释放MMAE，诱导细胞周期停滞和细胞死亡。2019年7月，Polivy®获得FDA批准，与苯达莫司汀加利妥昔单抗联合用于治疗至少接受过两种先前治疗的复发或难治性弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。这是首个获批用于治疗DLBCL的ADC，DLBCL是最常见的nHL类型。批准基于全球、随机的2期GO29365研究的积极结果，该研究包括80名至少接受过一种先前方案治疗的r/r DLBCL患者。入选的患者被随机分配接受polatuzumab vedotin（Pola，1.8 mg/kg，静脉注射）与苯达莫司汀（B，90 mg/m2静脉注射）和利妥昔单抗（R，375 mg/m2静脉注射）联合治疗，或单独BR，共6个21天周期。CR率和反应持续时间被确定为研究终点。结果显示，接受Pola+BR治疗的患者中有40%观察到CR，而单独接受BR治疗的患者中有18%。在接受Pola+BR治疗并有PR或CR的患者中，反应持续时间超过6个月和12个月的比例分别为64%和48%。Pola+BR组中出现的3-4级不良事件包括中性粒细胞减少症（46%）、血小板减少症（41%）、贫血（28%）、淋巴细胞减少症（12.8%）和发热性中性粒细胞减少症（10.3%）。 Belantamab mafodotin（Blenrep®，GSK）：Belantamab mafodotin，也称GSK2857916，是一种新型ADC，由一个针对BCMA的人源化FC修饰抗BCMA mAb组成，通过不可切割的马来酰亚胺缬氨酸（mc）连接体与细胞毒素MMAF偶联。Belantamab mafodotin的平均DAR为4。BCMA是一种跨膜糖蛋白，在多发性骨髓瘤（MM）细胞表面特异性过度表达。 与BCMA结合后，belantamab mafodotin被迅速内化，在溶酶体内降解，释放不渗透的MMAF进入多发性骨髓瘤（MM）细胞内。MMAF与MMAE类似，也是一种有丝分裂抑制剂。它可以通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂，导致细胞周期停滞并诱导依赖于caspase-3的凋亡。总的来说，belantamab mafodotin能够有效地引起过度表达BCMA的癌细胞死亡。2020年8月，FDA批准了Blenrep®用于治疗复发或难治性多发性骨髓瘤（r/r MM）。这是首个基于DREAMM-2临床试验结果获批的BCMA靶向治疗药物，DREAMM-2是一项双臂、开放标签、多中心的2期研究。 在这项研究中，共有221名（年龄≥18岁）接受过三线或以上治疗并且对免疫调节药物和蛋白酶抑制剂耐药，以及对CD38单抗抗药性或不耐受（或两者都有）的复发或难治性多发性骨髓瘤患者，且其东部肿瘤协作组（ECOG）的表现状态为0-2，被纳入并随机分配（1:1）接受两种不同剂量的belantamab mafodotin（分别为2.5 mg/kg和3.4 mg/kg）治疗，直至疾病进展或不可接受的毒性。有效性基于ORR和反应持续时间。结果显示，单独使用belantamab mafodotin治疗，2.5 mg/kg组和3.4 mg/kg组的ORR分别为32%和35%。在2.5 mg/kg组和3.4 mg/kg组中，分别有58%和66%的患者观察到有希望的部分反应（VGPR）。最常见的3-4级不良事件包括角膜炎（2.5 mg/kg组为27%，3.4 mg/kg组为21%）、血小板减少症（分别为20%和33%）和贫血（分别为20%和25%）。 Loncastuximab tesirine（Zynlonta®，ADC Therapeutics）：Loncastuximab tesirine，也称ADCT-402，由一个针对CD19的人源化mAb组成，通过可切割的（缬氨酸-丙氨酸二肽）马来酰亚胺型连接体与PBD二聚体偶联。Loncastuximab tesirine的平均DAR约为2.3。PBD二聚体是ADC开发中新一代的细胞毒性有效载荷。它与DNA不可逆地结合并引起强烈的链间交联，阻止DNA链分离，从而破坏必要的DNA代谢过程，最终导致细胞死亡。它不依赖于细胞分裂周期，损伤不易恢复，显示出更好的细胞毒性。2021年4月，Zynlonta®获得FDA加速批准，用于治疗接受过两线或以上系统治疗的成人复发或难治性大B细胞淋巴瘤，包括弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）未另行指明（NOS）、由低级别淋巴瘤发展而来的DLBCL和高级别B细胞淋巴瘤。Loncastuximab tesirine是首个也是目前唯一一个获批用于治疗复发或难治性DLBCL的CD19靶向ADC，作为单一药物。 Zynlonta®的批准基于LOTIS-2研究的数据，LOTIS-2是一项多中心、开放标签、单臂、2期试验。共有145名接受过至少两线系统治疗方案的成人复发或难治性DLBCL或高级别B细胞淋巴瘤患者被纳入并接受loncastuximab tesirine（0.15 mg/kg）治疗。总的ORR被用来评估loncastuximab tesirine的主要疗效。结果显示，接受loncastuximab tesirine治疗的患者，ORR达到了48.3%（95% CI：39.9–56.7），CR为24.1%（95% CI：17.4–31.9）。在平均7.3个月的随访后，中位反应持续时间为10.3个月（95% CI：6.9，NE）。在70名实现客观反应的患者中，36%在3个月前就被审查了反应持续时间。最常见的3级及以上不良事件包括中性粒细胞减少症（26%）、血小板减少症（18%）和γ-谷氨酰转移酶增加（17%）。 5.3.  实体瘤 Ado-trastuzumab emtansine（Kadcyla®，罗氏）：约15%-20%的乳腺癌患者表现出人类表皮生长因子受体2（HER2）阳性过度表达，具有更高的侵袭性。Ado-trastuzumab emtansine，也称T-DM1，是一种靶向HER2的ADC药物，也是首个获准用于实体瘤的ADC。它由一个针对HER2的人源化mAb组成，通过一个不可切割的连接体（丁二酰亚胺-4-（N-马来酰亚甲基）环己烷-1-羧酸酯，SMCC）连接到DM1，平均DAR为3.5。该连接体可以使偶联物在血浆循环中更稳定，但在HER2阳性癌细胞内吞后释放有效载荷。曲妥珠单抗在溶酶体中被蛋白酶完全消化，允许释放含有DM1的代谢产物，赖氨酸-MCC-DM1，其显示出与游离DM1相似的细胞毒性。此外，赖氨酸-MCC-DM1在生理pH下带电，不适用于发挥旁观者效应。因此，T-DM1只针对并导致抗原阳性癌细胞死亡。此外，T-DM1显示出与曲妥珠单抗类似的机制，它可以抑制HER2信号通路，诱导ADCC和CDC效应。 2013年，Kadcyla®获得FDA市场批准，作为单一药物用于治疗先前接受过Herceptin®（曲妥珠单抗）和紫杉醇化疗的HER2阳性转移性乳腺癌患者。批准基于3期研究（EMILIA）的积极结果。共有991名接受过曲妥珠单抗和紫杉醇治疗的HER2阳性不可切除、局部晚期或转移性乳腺癌成人患者被纳入并随机分配接受T-DM1（3.6 mg/kg）或拉帕替尼加卡培他滨。PFS和OS被用作主要终点。在最终描述性分析中，T-DM1组的中位PFS为9.6个月，而拉帕替尼加卡培他滨组为6.4个月（p < 0001）。T-DM1组和拉帕替尼加卡培他滨组的中位OS分别为30.9个月和25.1个月。T-DM1组中最常见的3级及以上不良事件包括：血小板减少症（12.9%）、AST增加（4.3%）和ALT增加（2.9%）。值得注意的是，由于观察到左心室射血分数（LVEF）降低，T-DM1有心脏毒性的警告标签。 此外，基于3期研究（KATHERINE）的积极结果，FDA在2019年5月扩大了Kadcyla®的批准，用于治疗接受过新辅助紫杉醇和基于曲妥珠单抗治疗后仍有残留浸润性疾病的HER2阳性早期乳腺癌（EBC）患者的辅助治疗。共有1486名符合标准的患者被纳入研究，并随机分配接受T-DM1或曲妥珠单抗治疗。作为该研究的主要终点，接受T-DM1治疗的组与接受曲妥珠单抗治疗的组相比，无浸润性疾病生存期（IDFS）显著提高了50%。在三年时，接受T-DM1治疗的患者中有88.3%没有复发，而接受曲妥珠单抗治疗的患者中有77.0%。 恩福妥昔单抗（Padcev®，Seagen）：恩福妥昔单抗也被称为ASG-22ME，已获FDA批准用于治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌的成年患者。它由一个全人源抗nectin-4 IgG1 kappa单克隆抗体（AGS-22C3）组成，通过可被蛋白酶切割的连接体（MC-VC-PABC）与MMAE相连，平均DAR约为3.8。Nectin-4是一种跨膜蛋白，属于nectin家族，对细胞增殖、迁移和粘附起着至关重要的作用。已发现它在多种恶性肿瘤中高度表达，尤其是在尿路上皮癌中。通过免疫组化分析，60%的膀胱肿瘤标本观察到强烈的染色，而正常组织中染色有限。因此，它已成为ADC新分子设计的一个引人注目的靶点。恩福妥昔单抗是目前唯一获得FDA批准的靶向nectin-4的ADC。2019年12月，FDA首次授予加速批准，随后在2021年9月基于一项开放标签、随机、多中心3期研究（EV-301）的结果进一步授予常规批准。在EV-301研究中，共有608名接受过PD-1或PD-L1抑制剂和基于铂的化疗的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者被纳入并随机平均分配，接受恩福妥昔单抗（1.25 mg/kg）或替代化疗（多西他赛、紫杉醇或长春瑞滨）治疗。OS和PFS分别用作评估疗效的主要终点和次要终点。与替代化疗相比，恩福妥昔单抗取得了显著的疗效，中位OS（12.9个月对9.0个月）和中位PFS（5.6个月对3.7个月）均显著延长。199,204 至少5%的患者中发生的3级及以上不良事件包括斑丘疹（7.4%）、疲劳（6.4%）和中性粒细胞计数下降（6.1%）。 Fam-trastuzumab deruxtecan（Enhertu®，第一三共）：Enhertu，也称DS-8201或T-DXd，是针对不可切除或转移性HER2阳性乳腺癌成年患者的HER2靶向ADC，这些患者在接受转移性治疗时已接受过两种或以上的抗HER2方案。它由一个人源化HER2抗体（曲妥珠单抗）组成，通过一种酶可切割的四肽连接体与一种新型拓扑异构酶I抑制剂（DXd）作为有效载荷偶联，平均DAR为7-8。DXd被报道比SN-38（伊立替康的活性形式）更强效，DXd的更高效力确保了其在ADC中作为有效载荷时的疗效。DS-8201的另一个改进是采用了新型四肽连接体技术，该连接体在血浆中更稳定，降低了系统毒性的风险。2019年12月，基于单臂、多中心、2期DESTINY-Breast01研究的积极结果，FDA批准了Enhertu®。共有184名接受过两种或以上抗HER2治疗的HER2阳性、不可切除和/或转移性乳腺癌（mBC）女性患者被纳入研究。主要终点是ORR和反应持续时间。结果显示，接受DS-8201（5.4 mg/kg）治疗的患者ORR为60.3%（95% CI：52.9, 67.4），CR率为4.3%，PR率为56%。中位反应持续时间为14.8个月，中位PFS持续时间为16.4个月。至少5%的患者中发生的3级及以上不良事件包括中性粒细胞计数下降（20.7%）、贫血（8.7%）、恶心（7.6%）、白细胞计数下降（6.5%）、淋巴细胞计数下降（6.5%）和疲劳（6.0%）。此外，DESTINY-Breast03的最新数据，这是一项全球性、头对头、随机、开放标签、关键3期试验，证明了DS-8201相比T-DM1具有显著优势。具体来说，共有524名接受过曲妥珠单抗和紫杉醇治疗的HER2+ mBC患者被纳入并随机分配（1:1）。主要终点是PFS，包括OS、ORR和反应持续时间的次要终点也被使用。结果显示，DS-8201的中位PFS未达到，而T-DM1为6.8个月。而且，接受DS-8201治疗的患者的中位反应持续时间为14.3个月，而接受T-DM1治疗的患者为6.9个月。此外，另一项头对头研究（DESTINY-Breast09）正在进行，比较DS-8201和曲妥珠单抗。DESTINY-Lung01研究还评估了DS-8201在携带HER2突变的转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者中的疗效和安全性。在91名入选患者中，55%在平均随访时间为13.1个月时确认有客观反应。中位PFS持续时间为8.2个月，中位OS持续时间为17.8个月。观察到46%的患者出现3级及以上不良事件，包括中性粒细胞减少症（19%）和贫血（10%）。该临床观察也对DS-8201潜在的肺部毒性提出了关注。值得注意的是，间质性肺病（ILD）在26%（91名患者中有23名）的患者中观察到，两名患者死于治疗相关的ILD。ILD是一组影响肺部间质的呼吸系统疾病，这将破坏我们身体的修复损伤过程，并阻止氧气参与血液循环。因此，在后续的临床试验中，需要更加谨慎地关注ILD，并适当培训临床医生识别和管理这种毒性效应。自从DS-8201推出以来，其临床潜力仍在不断扩大和深化。DS-8201用于胃癌的新适应症也已获得批准。乳腺癌的治疗线也在向前推进，不断为患者提供更好的治疗选择。 Sacituzumab govitecan（Trodelvy®，Immnomedics）：Sacituzumab govitecan，也称IMMU-132，是一种ADC，由一个针对Trop-2的人源化单克隆抗体组成，通过一个可水解的连接体（CL2A）与拓扑异构酶I抑制剂（SN-38）偶联，平均DAR约为7.6。Trop-2是一种40-kDa糖蛋白，作为细胞内钙信号传导的转导体。在大多数实体瘤中观察到Trop-2的过度表达，包括三阴性乳腺癌（TNBC）。从理论上讲，Trop-2蛋白的过度表达与强烈的侵袭性和不良预后有关，这使得Trop-2成为一个理想的广谱治疗靶点。在sacituzumab govitecan中，SN-38是伊立替康的活性形式，通过抑制DNA拓扑异构酶I引起频繁的DNA单链断裂，最终导致细胞死亡。73 就CL2A而言，它连接SN-38和Trop-2抗体，是sacituzumab govitecan作为第三代ADC的最突破性设计。这个设计良好的连接器提高了Trop-2抗体与SN-38的结合比率，在肿瘤中具有更高的毒性浓度，但在非靶标中的浓度更低，半衰期更短。通过优化连接体的稳定性，它不仅可以在目标肿瘤细胞中释放SN-38，而且还能实现旁观者效应，杀死难以靶向的邻近癌细胞。2020年4月，sacituzumab govitecan获得FDA加速批准，用于治疗接受过两种或以上系统治疗的不可切除局部晚期或转移性TNBC患者，至少一种用于转移性疾病。这是FDA批准用于转移性TNBC的第一个抗Trop-2 ADC。sacituzumab govitecan的临床益处在随后的多中心、开放标签、随机试验（ASCENT）中得到进一步确认，该试验促进了FDA的常规批准。ASCENT研究在529名接受过至少两种化疗后复发的不可切除局部晚期或mTNBC患者中进行，其中一种可能是在新辅助或辅助环境中，如果进展发生在12个月内。入选的患者被随机分为两组，分别接受sacituzumab govitecan（n = 267，10 mg/kg）和单一药物化疗（n = 262，卡培他滨、艾瑞布林、长春瑞滨或吉西他滨）。主要疗效终点是无脑转移患者的PFS。结果显示，接受sacituzumab govitecan治疗的患者的中位PFS为4.8个月，而接受化疗的患者为1.7个月。而且，中位OS分别为11.8个月（sacituzumab govitecan）和6.9个月（化疗）。 sacituzumab govitecan的3级及以上严重不良事件的发生率包括中性粒细胞减少症（51%）、白细胞减少症（10%）、腹泻（10%）、贫血（8%）和发热性中性粒细胞减少症（6%）。 Cetuximab sarotalocan（Akalux®，Rakuten Medical）：Cetuximab sarotalocan也被称为RM-1929，是一种新型ADC，由一个抗EGFR嵌合单克隆抗体cetuximab与近红外光敏染料IRDye® 700DX偶联而成。cetuximab sarotalocan的平均DAR在1.3-3.8范围内。EGFR在多种实体瘤表面高度表达，包括头颈鳞状细胞癌（HNSCC）、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和其他实体瘤。Cetuximab sarotalocan能够靶向EGFR，并在与癌细胞结合后由光纤释放的红激光局部激活，导致细胞死亡。它不仅利用抗体介导的靶向输送实现高肿瘤特异性，还采用激光激活的生物物理机制精确诱导癌细胞的快速死亡，而不损伤周围正常组织。 2019年9月，cetuximab sarotalocan获得日本药品和医疗器械管理局（PMDA）批准，用于治疗不可切除的局部晚期或复发性头颈鳞状细胞癌。批准是基于一项多中心、开放标签2a期试验的积极数据。共有30名无法通过手术、放疗或含铂化疗满意治疗的局部区域性头颈鳞状细胞癌患者被纳入研究。在给予RM1929 24小时后，使用非热红光照射肿瘤区域。结果显示，cetuximab sarotalocan治疗的ORR为28%，其中包括14%的CR，中位PFS和中位OS分别为5.7个月和9.1个月。最常见的3级及以上不良事件包括皮肤反应（18%）、甲沟炎（12%）和过敏反应（3.5%）。迄今为止，cetuximab sarotalocan尚未在日本以外获得批准，目前正在进行全球3期试验。 Disitamab vedotin（Aidixi®，RemeGen）：Disitamab vedotin也被称为RC48，是第三种上市的HER2靶向ADC，由一种新型人源化HER2抗体、可被组织蛋白酶切割的连接体（mc-VC-PABC）和细胞毒素MMAE组成。RC48的平均DAR约为4。Disitamab vedotin中使用的抗体对HER2具有更高的亲和力，在动物模型中显示出更强的抗肿瘤活性。2021年6月15日，disitamab vedotin获得中国国家药品监督管理局（NMPA）的有条件批准，用于治疗至少接受过2种系统化疗的局部晚期或转移性胃癌（包括胃食管结合部腺癌）患者。这是中国开发的首个获批上市的ADC药物。批准是基于RC48-C008研究的结果，该研究表明接受RC48治疗的患者具有临床意义的反应和生存益处。 RC48-C008研究是一项单臂、多中心、开放标签、2期临床试验，共有127名组织学证实的胃或胃食管结合部癌、HER2过度表达、接受过至少2种系统治疗的患者被纳入。在试验中，参与的患者接受disitamab vedotin（2.5 mg/kg）治疗，直到研究者评估的临床获益丧失或不可接受的毒性。ORR被用作主要结果，PFS和OS作为次要结果。数据显示，所有患者的ORR为18.1%（95% CI：11.8–25.9%）。亚组ORR分别为接受2线和≥3线治疗的患者的19.4%和16.9%。总体而言，接受至少2个周期治疗的111名患者的ORR为20.7%。对于所有127名患者，中位PFS为3.8个月，中位OS为7.6个月。3级或更高不良事件在40名患者（32.0%）中观察到，其中最常见的是中性粒细胞计数下降（14.4%）、WBC计数下降（14.4%）和贫血（5.6%）。 此外，disitamab vedotin还于2021年12月获得NMPA的有条件批准，用于接受过含铂化疗治疗失败的HER2阳性局部晚期或转移性尿路上皮癌患者的二线治疗。这得益于RC48-C005研究的结果，这是一项开放标签、多中心、单臂、非随机2期研究。64名HER2过度表达和局部晚期或转移性尿路上皮癌患者在接受顺铂、吉西他滨和紫杉醇治疗失败后被纳入并接受RC48（2 mg/kg）治疗。ORR被用作主要终点。截至2020年11月30日，接受1线、2线和≥3线治疗的患者的ORR分别为55.6%（5/9）、50.0%（21/20）和30.8%（4/13）。 Tisotumab vedotin（Tivdak®，Genmab/Seagen）：Tisotumab vedotin是最近获批的ADC药物，平均DAR为4，包含一个完全人源化的mAb，结合组织因子（TF），一个可切割的mc-VC-PABC连接体，和一个抗有丝分裂剂MMAE。TF在肿瘤生长、血管生成和转移中起着重要作用，并且在几种实体瘤中特异性过度表达。Tisotumab vedotin旨在靶向癌细胞上的TF抗原，并将细胞毒素MMAE直接输送到癌细胞内。此外，旁观者效应、ADCC和ADCP也被证明参与了tisotumab vedotin的作用机制。2021年9月，Tivdak®获得FDA批准，用于治疗复发或转移性宫颈癌的成年患者，这些患者在化疗后或化疗期间疾病进展，这是首个且唯一获批的TF靶向ADC治疗。 批准是基于innovaTV 204研究的发现，这是一项多中心、开放标签、单臂、2期试验。共有101名符合标准（复发或转移性宫颈癌患者，之前接受过不超过两种系统治疗方案，包括至少一种复发或转移性环境中的基于顺铂的化疗方案）的患者被纳入研究，接受每21天2 mg/kg的tisotumab vedotin治疗，直至疾病进展或不可接受的毒性发生。确认的ORR被用作主要疗效结果。结果显示，ORR为24%（95% CI：15.9%-33.3%），中位反应持续时间为8.3个月（95% CI：4.2，未达到）。3级或更高不良事件在28%的患者中观察到，包括中性粒细胞减少症（3%）、疲劳（2%）、溃疡性角膜炎（2%）和周围神经病变（2%）。 5.4.  晚期ADC候选药物 除了上述14种获批的ADC药物外，目前还有数百种采用更新技术和新颖靶点的ADC正在进行临床试验。本综述中讨论了三个代表的3期ADC候选药物，以提供概念性的快照。 Mirvetuximab soravtansine（ImmunoGen）。Mirvetuximab soravtansine（IMGN853）由一个针对叶酸受体α（FRα）的人源化mAb组成，通过一个可切割的连接体（sulfo-SPDB）与强效细胞毒素DM4偶联。它已获得FDA授予治疗卵巢癌的孤儿药指定。通过在二硫键的α位引入两个甲基基团以及一个磺酰基，提高了连接体的亲水性，克服了药物在血浆循环中过早释放的缺点。2015年12月，进行了一项开放标签、随机3期试验（NCT02631876），以研究IMGN853与选定的单一药物化疗在治疗对铂类药物耐药的FRα阳性晚期上皮性卵巢癌、原发性腹膜癌和/或输卵管癌的女性中的安全性和有效性。这是首个进入人体临床试验的FRα靶向ADC候选药物。共有366名患者随机（2:1）接受IMGN853（6 mg/kg）或单一药物化疗（聚乙二醇化脂质体多柔比星、拓扑替康或紫杉醇）。本研究的主要终点是PFS。 2019年初公布的结果显示，在主要终点PFS方面没有显著差异[HR, 0.98; 95% CI, 0.73–1.31; p = 0.897]，IMGN853组和化疗组的中位PFS分别为4.1个月和4.4个月。240 尽管没有达到主要终点，但在次要终点中观察到IMGN853在FRα过度表达的患者中表现更好，包括更好的ORR（24%对10%）和CA-125反应（53%对25%）。因此，FDA推荐进行额外的3期试验。2019年12月，Immunogen宣布了一项3期单臂试验，包括两项研究：SORAYA研究（NCT04296890）和MIRASOL研究（NCT04209855）。此外，另一项1b/2期临床试验（NCT02606305）调查了IMGN853（6 mg/kg）联合贝伐珠单抗（15 mg/kg）在对铂类药物耐药的晚期上皮性卵巢癌、原发性腹膜癌或输卵管癌患者中的应用。Immunogen在2021年ASCO年会上最近宣布了结果。在接受联合治疗的60名患者中，有28名观察到客观反应，确认的ORR为47%（95% CI, 34–60），在高FRα表达的患者中（n = 33），确认的ORR为64%（95% CI 45–80），这表明IMGN853与贝伐珠单抗联合治疗对高FRα复发性卵巢癌患者具有显著的治疗效果。最常见的不良事件包括腹泻、视力模糊、疲劳和恶心。 Datopotamab deruxtecan（DS-1062, Daiichi Sankyo/AstraZeneca）。DS-1062或Dato-DXd是第二种靶向Trop2的ADC，由一个拓扑异构酶I抑制剂（DXd）通过一个可切割的四肽连接体与人源化抗Trop2 IgG1 mAb偶联。平均DAR为4。目前，DS-1062正在进行临床试验，以单独或联合治疗的方式评估对乳腺癌和NSCLC等实体瘤的疗效。TROPION-PanTumor01的更新结果，这是一项正在进行的1期研究，研究对象为晚期/转移性NSCLC患者（NCT03401385），显示DS-1062（6 mg/kg）在接受治疗的患者中显示出有希望的安全性和有效性。在125名可评估反应的患者中，1%（1/125）有确认的CR，26%（32/125）有PR，并且有4个PR正在等待确认。在6个月时持续反应的概率超过80%，疾病控制率（CR + PR + SD）为79%。它目前也在一项随机、开放标签的3期研究（TROPION-Lung01）中进行研究，比较DS-1062与多西他赛治疗晚期/转移性NSCLC患者的效果，这些患者没有EGFR、ALK或其他可操作的基因变异。设计计划是将590名患者随机1:1分配接受DS-1062（6 mg/kg）或多西他赛（75 mg/m2）。双重主要终点PFS和OS被用作双重主要终点。 Tusamitamab ravtansine（SAR-408701, Sanofi）。SAR-408701是一种新型抗CEACAM5 ADC。它由一个人源化抗体组成，靶向CEACAM5，通过一个可切割的连接体N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) butyrate (SPDB)与细胞毒素maytansinoid DM4偶联。CEACAM5是一种在正常成人组织中很少表达，但在包括NSCLC在内的多种实体瘤中过度表达的糖蛋白。SAR-408701的前临床活性被研究，结果显示其为CEACAM5阳性癌症的有前途的治疗候选药物。SAR-408701的安全性和有效性在一项开放标签、剂量递增、剂量扩展的1期研究（NCT02187848）中进行了检查。在研究中，92名患者（28名CEACAM5中等表达者和64名高表达者）接受了SAR-408701（100 mg/m2），截至2020年1月，在接受SAR-408701治疗的中等表达者队列中观察到2个确认的PR（ORR 7.1%），而在接受治疗的高表达者队列中有13名患者确认PRs（ORR 20.3%）。27名（42.2%）患者病情稳定；在接受过抗PD1/PD-L1治疗的患者中观察到17.8%的ORR。目前，有几项SAR-408701的2期或3期临床试验正在进行中，采用单一药物或联合治疗NSCLC和其他实体瘤适应症（NCT04154956, NCT04659603, NCT04394624, NCT05071053, NCT04524689）。 6. ADCs的当前挑战和下一代 从前面部分列出的获批药物和在研候选药物中可以看出，与早期代相比，新一代ADCs正在展现出越来越优化的特异性和细胞毒性特征。然而，在开发和使用抗癌ADCs方面仍然存在许多挑战，包括药代动力学的复杂性、不足的肿瘤靶向和有效载荷释放，以及药物抗性。本节提供了这些挑战的概述，随后讨论了在新兴一代ADCs中可能的解决方案。 6.1.  主要挑战 复杂的药代动力学特征。在ADC（大多数通过静脉注射）给药后，系统循环中可能存在三种主要形式，即完整的ADC、裸抗体和游离的细胞毒素。由于目标结合、消除和解偶联，这三种形式的比例将动态变化。在ADC的典型药代动力学特征中，随着ADC的内吞作用和抗体清除，结合的ADC和裸抗体的浓度持续下降。影响抗体清除的因素包括单核吞噬细胞系统和新生儿Fc受体（FcRn）介导的循环。通过与内吞体空泡中的ADC结合，FcRn将ADC导出到细胞外部分进行循环。因此，包括结合的ADC和裸抗体在内的抗体通常比传统的小分子药物具有更长的半衰期。关于游离的细胞毒素，它主要在肝脏代谢，并通过肾脏（尿液）或粪便从体内排泄，这可能受到药物-药物相互作用和肝肾功能损害的影响。所有这些因素，再加上患者间变异性高，使得建立PK和PD模型来描述ADC的临床特征并协助设计新的ADCs变得具有挑战性。 不可避免的副作用。在获批的14种ADCs中，最常见的严重副作用（3级或更高）是血液毒性，包括中性粒细胞减少症、血小板减少症、白细胞减少症和贫血。血液毒性以及肝毒性和胃肠道反应可能与细胞毒素过早释放到血液循环中有关。这与主要影响快速增殖的健康细胞的传统化疗药物一致。此外，ADC的抗体部分引起的免疫反应可能导致二次损伤，导致肾毒性。根据最近的临床观察，ADC治疗期间潜在的肺部毒性效应，如间质性肺病（ILD），应引起注意，特别是在抗HER2 ADCs中。T-DM1和DS-8201的临床试验中报告了几例与ILD相关的死亡案例。然而，ILD的作用机制的详细情况仍不清楚。有猜测可能的原因之一可能与ADC在健康肺细胞中的不希望摄取和从ADC释放的游离有效载荷有关。由于血液流动最丰富且在肺部保留时间最长，不希望的ADC摄取和血液中的游离有效载荷最常发生的是在肺部，从而诱发ILD。因此，需要对下一代ADC进行相应的优化，以最小化副作用。在用药期间，应密切监测、预防或给予不良反应的支持性治疗。 肿瘤靶向和有效载荷释放。与传统的细胞毒素药物相比，ADC的分子量要大得多，药物穿透肿瘤的效率受到限制。当前研究表明，只有一小部分输入患者体内的ADC能够到达肿瘤细胞，因此在设计ADC时需要考虑有效载荷的效力。对于ADC药物，有效载荷的传递依赖于通过抗原依赖性内吞作用或抗原非依赖性胞饮作用内吞形成的ADC-抗原复合物。内吞后，ADC抗原复合物将被运输到内体或溶酶体释放有效载荷。当有效载荷通过酸可切割的连接体连接时，对于需要特定蛋白酶的ADCs，有效载荷可能在早期内体中释放。对于需要特定蛋白酶的ADCs，有效载荷的释放将发生在晚期内体或溶酶体中。无论有效载荷释放途径如何，一些ADCs具有“旁观者效应”，可以影响不表达目标抗原的周围癌细胞。对于内吞的ADC，它被认为是具有高异质性目标抗原表达的肿瘤活性ADC的一个重要因素。旁观者效应需要有效载荷穿过细胞膜，因此，通过可切割连接体释放的非极性有效载荷是首选，因为极性分子更有可能留在细胞内。 药物抗性。ADC开发的另一个挑战是药物抗性。酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的药物抗性通常涉及药物靶标的逃逸突变。然而，ADCs的药物抗性机制尚未得到充分阐明。由于ADCs的基本作用机制，它们可能更加复杂和多样化。目前的证据表明，肿瘤可以通过多种方式逃避ADC的活性，例如减少抗原表达水平、改变细胞内运输途径、对有效载荷的药物抗性。这些潜在机制已在体外和动物模型的临床前研究中得到验证，而确认这些机制的临床证据仍然有限。例如，长期暴露于靶向HER2的ADC，乳腺癌细胞系将减少HER2受体的表达，并减少溶酶体酸化以减慢蛋白质降解和代谢。一些ATP结合盒（ABC）转运蛋白被发现在抗癌药物的出口中很重要，使肿瘤产生抗性。在ADC中常用的有效载荷，如MMAE、MMAF和卡利奇霉素，可以被ABC转运蛋白从癌细胞中输出，这使得这些ADCs表现出药物抗性。 6.2.  未来一代ADCs ADC由单克隆抗体、连接体和有效载荷组成，因此替换这三个组件中的任何一个都可能影响ADC的效果。针对同一抗原的不同抗体可能具有不同的结合能力，并对受体二聚体化和抗原内吞作用产生不同的影响。当前研究表明，ADC的内吞作用和细胞内运输途径对ADC的细胞毒性活性有关键影响。与野生型蛋白相比，突变蛋白通常具有更高的泛素化水平，更容易被内吞和降解。这意味着，如果ADC用于靶向突变蛋白，它可能会带来显著的临床反应。可以想象，靶向携带致癌突变蛋白的ADCs（如某些EGFR突变体）可能最大化治疗的肿瘤特异性，并达到选择性TKI的水平。此外，双特异性抗体技术的进步为ADC创新带来了更多可能性。这些ADC设计可能提高抗体内吞作用并改善肿瘤特异性。目前正在开发的治疗方法一直在探索这些可能性。例如，靶向同一抗原上不同位点的双特异性ADC可以改善受体聚集并导致目标的快速内吞作用。此外，在临床前实验中，一种双靶向HER2和LAMP-3的双特异性ADC显示出更好的溶酶体聚集和载荷传递。类似地，可以开发使用两种不同细胞毒素药物作为有效载荷的双载荷ADC，以减少药物抗性。通过准确控制两种药物的比例，可以通过将两种协同有效载荷传递到癌细胞中来实现更强的疗效。并且随着两种具有不同机制的有效载荷的应用，药物抗性的发生率将显著降低。例如，一种含有MMAE和MMAF的均匀抗HER2 ADC被设计出来，在异种移植小鼠模型中比相应的单载荷ADCs的联合给药表现出更显著的抗肿瘤活性。 ADC开发的另一种策略是放弃传统mAb的结构，选择将有效载荷与分子量较小的多肽片段或单链可变区片段偶联。这些策略的主要目的是减少ADCs的分子量，从而提高穿透效率和有效载荷传递到肿瘤组织。例如，PEN-221是一种由DM-1与靶向生长抑素受体2的多肽链偶联而成的ADC。它的分子量仅为2 kDa，远低于传统ADC中150 kDa的IgG分子。这种ADCs的当前技术挑战是它们可能在血浆中被迅速清除。然而，如果我们能够克服这个障碍，它可能在治疗难以接触的肿瘤方面具有潜力，包括血管化不良和中枢神经系统肿瘤。传统上，需要高内吞能力的mAb来将有效载荷传递到癌细胞中。然而，由于抗原屏障，mAb通常很难扩散到实体肿瘤块中。因此，可以为ADC开发非内吞性抗体。它基于这样一个原理：有效载荷直接在肿瘤微环境中的还原条件下在细胞外释放，然后扩散到癌细胞内导致细胞死亡。 最后，在有效载荷选择方面仍然存在许多创新机会。目前，载荷的选择不再局限于标准细胞毒素药物，而是开始发现更多针对性药物和免疫药物。例如，mirzotamab clezutoclax是一种靶向B7-H3的ADC，它采用促进细胞凋亡的新型BCL-XL抑制剂作为有效载荷。目前正在早期临床试验中进行评估。 7.  结论 来自学术界和工业界的数十年努力已经成功地开发了多种ADC疗法，使成千上万的癌症患者受益。14种ADC药物的推出和其他ADC候选药物的激动人心的临床表现也吸引了更多人关注这个领域，这对于这个相对年轻但高度复杂的领域非常重要。幸运的是，大量研究为决定ADC最终行为的关键要素提供了见解。建立适当的方法对ADC的每个组分进行体外和体内评估至关重要。识别和验证新的抗原/抗体、开发具有最佳毒性的新有效载荷，以及设计新的连接体以平衡稳定性和有效载荷释放，对下一代ADCs至关重要。随着这些领域的研究人员的持续努力，不难想象未来的ADCs将在癌症的靶向治疗中带来更多惊喜。