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PRESS RELEASE AB SCIENCE RECEIVES NOTICE OF ALLOWANCE FOR EUROPEAN PATENT COVERING MASITINIB UNTIL 2040 IN THE TREATMENT OF SICKLE CELL DISEASE THIS DECISION FURTHER STRENGTHENS MASITINIB’S INTELLECTUAL PROPERTY ADDING ONE MORE INDICATION WITH LONG TERM PROTECTION MASITINIB IS IN PHASE 2 IN SICKLE CELL DISEASE Paris, October 28, 2024, 5.45pm CET AB Science SA (Euronext - FR0010557264 - AB) today announced that the European Patent Office has issued a Notice of Allowance for a patent relating to methods of treating sickle cell disease (i.e. a medical use patent) with its lead compound masitinib, based on preclinical data. This new European patent provides intellectual property protection for masitinib in this indication until November 2040. Professor Olivier Hermine, President of the AB Science Scientific Committee and member of the French Academy of Sciences and Head of Hematology Department at Necker Hospital commented: “Masitinib represents a promising novel strategy for treating sickle cell disease and its serious complication of acute chest syndrome, which can lead to the development of chronic lung disease and is a common cause of hospitalization or even death. There is an increasing need in sickle cell disease with several new drugs being retrieved from market for lack of efficacy or toxicity; however, unlike masitinib, none of these drugs target mast cells”. Sickle cell disease (SCD) is a group of inherited red blood cell disorders, with masitinib being developed to treat the severest forms of the disease, accounting for about 65% of SCD. Severe SCD represents a major public health challenge and leads to early death. Treatment for SCD can be curative based on gene therapy (targets the HbS mutation), however, such an option remains extremely limited due to scarcity of donors, unresolved safety challenges, and very high costs. Standard treatment for SCD includes ​​red blood cell transfusions and treatment with hydroxyurea to manage complications, but significant unmet need remains. Mast cells, a major target for masitinib, appear to play a critical role for the severe forms of SCD and its complications, such as vaso-occlusive crises (VOC), acute chest syndrome (ACS), and pain [1-2]. Masitinib has demonstrated survival benefit in an SCD mouse model: all control SCD mice experienced VOC and 83% died in the first 3 hours, whereas SCD mice pretreated with masitinib for 4 days, experienced no VOCs and no death. Furthermore, lung histology and immune immunohistochemistry showed that masitinib protects from acute lung injuries and mast cell infiltration in an SCD mouse model. Masitinib clinical development in SCD is being conducted as part of the SICKMAST collaborative program, funded with 9.2 million euros [3], which aims to demonstrate in a phase 2 clinical trial the efficacy of masitinib in the treatment of acute and chronic complications of SCD in patients identified based on biomarkers. The Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) will be the promoter of these phase 2 studies. AB Science will mainly be involved in supplying masitinib and monitoring masitinib pharmacovigilance data. AB Science remains free to carry out, as it sees fit, any potential phase 3 development following the success of phase 2. Sickle cell disease Sickle cell disease (SCD) is an autosomal recessive disorder affecting millions of people worldwide. Although life expectancy has increased over the last 20 years, acute and chronic complications still result in comorbidities, high social burden and premature death at around 40 years. Approximately 1.1% of couples worldwide are at risk of having a child with a hemoglobin disorder (sickle cell disease or thalassemia), and 2.3 conceptions per 1,000 are affected by sickle cell disease. Estimates suggest that each year, around 300,000 children are born with sickle cell disease, and this number could reach 400,000 by 2050 [4]. Sickle cell disease affects over 100,000 children and adults in the United States. In France, approximately 26,000 patients are affected (50% children, 50% adults). Rationale for the use of masitinib in this indication Inflammation mediated by innate immune cells and promoting vaso-occlusion has recently been shown to play a major role in sickle cell disease. In particular, our clinical observations and experimental work in mice, have revealed the involvement of mast cells and basophils in complications associated with sickle cell disease: The degree of mast cell activation in patients with sickle cell disease may contribute to the heterogeneity of inflammation and chronic and acute complications.The potential role of basophils in sickle cell disease has not been studied, however, given their role in various diseases and their ability to release substance P and histamine, they could also play important roles in the pathophysiology of sickle cell disease. Masitinib is an inhibitor of KIT, LYN, and FYN, three major kinases involved in the activation of mast cells and basophils. Medical need The classic view of sickle cell disease pathophysiology involves polymerization of mutated hemoglobin (HbS) leading to red blood cell (RBC) sickling with subsequent hemolytic anemia, painful vaso-occlusive crisis (VOC) and acute chest syndrome (ACS). Current treatment options such as hydroxycarbamide, chronic transfusion or anti-P-selectin antibodies, do not fully prevent life-threatening acute and chronic complications of sickle cell disease. Allogeneic stem cell transplantation and gene therapy are available only for a minority of patients, are associated with toxicity and are very expensive, which limits their use. There is a significant medical need to prevent the acute and chronic complications of sickle cell disease. References [1] Allali S, Lionnet F, Mattioni S, et al. Br J Haematol. 2019;186(1):125-129. [2] Allali S, Maciel TT, Hermine O, de Montalembert M. Haematologica. 2020;105(2):273-283. [3] AB Science Press Release, 27th November 2023. https://www.ab-science.com/the-clinical-development-of-masitinib-in-sickle-cell-disease-is-among-the-19-winning-projects-under-the-sixth-call-for-hospital-inuversity-research-in-health-rhu/ [4] Piel FB, Steinberg MH, Rees DC. Sickle Cell Disease. N Engl J Med. 2017;376(16):1561-1573. About AB Science Founded in 2001, AB Science is a pharmaceutical company specializing in the research, development and commercialization of protein kinase inhibitors (PKIs), a class of targeted proteins whose action are key in signaling pathways within cells. Our programs target only diseases with high unmet medical needs, often lethal with short term survival or rare or refractory to previous line of treatment. AB Science has developed a proprietary portfolio of molecules and the Company’s lead compound, masitinib, has already been registered for veterinary medicine and is developed in human medicine in oncology, neurological diseases, inflammatory diseases and viral diseases. The company is headquartered in Paris, France, and listed on Euronext Paris (ticker: AB). Further information is available on AB Science’s website: www.ab-science.com. Forward-looking Statements - AB Science This press release contains forward-looking statements. These statements are not historical facts. These statements include projections and estimates as well as the assumptions on which they are based, statements based on projects, objectives, intentions and expectations regarding financial results, events, operations, future services, product development and their potential or future performance. These forward-looking statements can often be identified by the words "expect", "anticipate", "believe", "intend", "estimate" or "plan" as well as other similar terms. While AB Science believes these forward-looking statements are reasonable, investors are cautioned that these forward-looking statements are subject to numerous risks and uncertainties that are difficult to predict and generally beyond the control of AB Science and which may imply that results and actual events significantly differ from those expressed, induced or anticipated in the forward-looking information and statements. These risks and uncertainties include the uncertainties related to product development of the Company which may not be successful or to the marketing authorizations granted by competent authorities or, more generally, any factors that may affect marketing capacity of the products developed by AB Science, as well as those developed or identified in the public documents published by AB Science. AB Science disclaims any obligation or undertaking to update the forward-looking information and statements, subject to the applicable regulations, in particular articles 223-1 et seq. of the AMF General Regulations. For additional information, please contact: AB Science Financial Communication & Media Relations investors@ab-science.com Attachment Sickle Cell Patent EPO vENG VF

摘要：过继免疫治疗使用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞是一种新的治疗范式，它使用一类新的治疗“药物”在某些迄今为止难以治疗的B细胞恶性肿瘤患者中产生完全且持久的缓解。CAR T细胞源自患者自身的免疫细胞，这些细胞在体外通过基因工程改造，带有能够结合特定目标并在目标结合时传递激活信号的CAR。CAR激活细胞毒性T细胞以有效、重复和持久的方式破坏和消除识别的癌细胞。然而，各种障碍限制了CAR T细胞在其他类型的癌症或其他疾病中的广泛应用。目前的挑战包括设计最优的CAR、积极穿透肿瘤病变，并在不诱导对健康组织产生毒性的情况下维持T细胞的抗肿瘤激活。本章回顾了CAR的代际、增强CAR T细胞效力和选择性的策略，以及为日益增多的患者建立高效的制造流程。 1.原型嵌合抗原受体（CAR，T-Body，免疫受体） 在20世纪80年代中期，Steven A. Rosenberg（美国国立卫生研究院）将从黑色素瘤活检中分离并大量体外扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重新注入黑色素瘤患者体内时，患者T细胞识别和有效摧毁癌细胞的能力变得显而易见。这些以及随后的发展促使了采用自体免疫细胞治疗肿瘤患者的概念，这些免疫细胞有能力在大量患者中诱导肿瘤退缩和长期缓解。这些扩增的TILs被认为对特定肿瘤抗原具有特异性，并具有迁移能力以进入肿瘤病变；然而，抗原特异性大多仍然未知。 接下来的几年中，为了给患者的T细胞提供明确的靶向特异性，人们付出了巨大的努力；与T细胞受体（TCR）链或重组嵌合抗原受体（CAR）的遗传工程化，证明是成功的策略之一。与TCR不同，CAR是一个复合的、单多肽链跨膜受体，它在目标识别时提供靶向特异性和T细胞激活能力。原型CAR由四个主要结构域模块化组成：在细胞外末端是用于目标识别的单链可变区（scFv）抗体，一个连接到跨膜结构域的间隔区，以及主要来自TCR/CD3ζ或Fcε受体I（FcεRI）的细胞内信号传导结构域，有或没有连接的共刺激结构域（图1）。目标细胞表面的同源抗原的参与启动了CAR工程化免疫细胞的激活，导致持久的T细胞反应。每个CAR结构域都有独特的功能，并对重定向的T细胞激活产生影响；对于每个特定应用，CAR设计需要进行一些调整，以提供优化的靶向和T细胞激活，如下文详细描述。 图1 嵌合抗原受体（CARs）的世界在不断增长。第一代CAR在细胞外域（外域）中拥有抗原结合和间隔基团，在跨膜域中，在细胞内域（内域）中拥有来自CD3ζ或FcεRI γ链的激活基团。第二代CAR除了拥有一个共刺激域之外，第三代CAR在内域中拥有两个共刺激域。第四代CAR（“TRUCK”，“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”）由第二代或第三代CAR组成，该CAR在CAR信号传导后诱导转基因蛋白的表达。虽然在规范设计中描绘，但已经工程化了大量CAR变体，每种变体都针对不同的应用进行了优化。 原型CAR的基本设计最初由Zelig Eshhar及其同事（魏茨曼科学研究所）提出，他们展示了一个模块化复合受体，最初命名为“T-Body”或“免疫受体”，具有用于结合的抗体衍生结合域和用于T细胞激活的TCR信号域，为工程化T细胞提供了特异性识别和激活。在随后的几年中，引入了许多修改，允许靶向广泛的抗原，并通过各种细胞内结构域发送信号，以启动和重定向定义的免疫细胞功能（表1）。 表 1 CAR构建模块及其替代模块。 EMA（欧洲药品管理局）批准。其他使用其他宿主细胞和不同CAR设计的应用程序也在早期临床试验中越来越多地被研究。 规范的CAR由抗体衍生的结合域、间隔区、跨膜域和细胞内主要及共刺激信号域模块化组成。每个结构域可以通过不同的模块构建，这些模块影响不同的变量，并最终影响T细胞的激活和性能。 CAR工程化的细胞毒性T细胞重定向至癌细胞是该技术研究最多的应用；自体抗CD19 CAR T细胞的过继转移成为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个基因工程细胞疗法；随后，欧洲药品管理局（EMA）也批准了。使用其他宿主细胞和不同CAR设计的其他应用也越来越多地在早期临床试验中研究。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.1.结合域 抗原结合域传统上由来自小鼠或人类单克隆抗体的单链可变区（scFv）组成。通过短柔性连接子（通常是(Gly4Ser)3肽）将重链（H）和轻链（L）抗体链的可变（V）区域连接起来，形成VH-linker-VL或VL-linker-VH的顺序。甘氨酸残基提供了灵活性，以允许VH和VL正确折叠形成抗原结合口袋，而丝氨酸则为连接子提供了一些溶解性。VH和VL链的空间位置和相互作用可以显著影响亲和力、特异性和溶解性。足够高的结合亲和力对于诱导T细胞激活至关重要；然而，存在一个亲和力上限，超过该上限CAR介导的T细胞激活不会改善，但会导致激活诱导的细胞死亡（AICD）。在CAR的背景下，一些scFvs通过张力信号独立于抗原参与诱导AICD、耗竭和T细胞的终端分化。除了亲和力和细胞表面的抗原密度外，目标表位在抗原内的位置也很重要；通常，靶向膜近端表位比靶向膜远端表位诱导更强的T细胞激活。 通过使用抗体进行靶向，CAR介导的识别是MHC独立的。这在靶向MHC-肽处理和呈递机制有缺陷的肿瘤时是有益的。此外，通过抗体识别目标，还可以识别传统T细胞看不见的抗原，如碳水化合物、脂质或抗原的结构变体。规范的CAR识别目标细胞表面的抗原；也可以通过使用特异性针对定义的MHC-肽复合物的抗体，工程化MHC-肽识别CAR，使其能够感知由MHC呈递的细胞内抗原。例如，一个scFv识别HLA-A2背景下的NY-ESO-1肽的CAR提供了与相应TCR类似的TCR样识别目标。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.2.间隔区 原型CAR经常在抗原结合域和跨膜域之间包含一个“间隔区”，以便接近目标抗原；连接的铰链区提供了一定的灵活性。间隔区的类型和长度对于最佳目标结合和信号传递至关重要。间隔区并非必需，因为有些CAR在scFv直接融合到跨膜域时是活跃的，而其他CAR只有在具有一定长度的间隔区时才活跃。间隔区通常来源于IgG1或IgG4恒定域或来自细胞外CD28、CD4或CD8（图2）。一般的想法是，间隔区在工程化T细胞和相应目标细胞之间提供最佳距离，以允许与目标细胞形成有效的接触区。基于TCR-MHC相互作用的知识，人们普遍认为CAR-目标相互作用需要在T细胞和目标细胞之间创建约15纳米的距离，以最佳形成接触区。因此，针对膜近端表位需要较长的间隔区，而较小的间隔区对更远离膜的表位是最佳选择；通过使用不同长度的间隔区可以轻松调整距离。在这个背景下，IgG衍生的间隔区具有可以通过结合一个、两个或三个CH1-CH2-CH3部分来调整长度的优势。IgG1衍生的间隔区还有利于CAR分子的稳定；然而，它可能与髓系细胞上的Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，介导CAR T细胞和髓系细胞的“非肿瘤”激活。这可以通过删除间隔区内的IgG1 CH2域或通过删除IgG1 Fc受体结合部分内的Asn297糖基化位点来预防。类似的修改也可以引入到IgG4间隔区。 图 2 第二代CAR设计的变体。由于模块化组成，可以使用各种替代域来构建CAR，其中一些示例性地列出。各个组分的变化允许调节CAR的结合和信号传导，最终调节细胞功能、代谢和工程化T细胞的抗肿瘤活性。其他变体旨在提高结合亲和力、目标的可及性、信号强度和细胞膜上的持久性等。最后，安全预防措施导致CAR设计中进一步的修改。 2.3.跨膜区 典型CAR的跨膜区来源于如CD3ζ、CD4、CD8α、CD28或OX40等类型1跨膜蛋白，由20-23个疏水性氨基酸组成，富含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸（图2）。带有CD3ζ跨膜域的CAR似乎比其他CAR更有效地整合到TCR/CD3复合体中，因此在表达和信号传导方面更为稳健；带有CD28跨膜区域的CAR似乎同样稳定。另一方面，带有CD8α铰链和跨膜域的CAR不易于AICD；然而，它们通过减少促炎细胞因子的释放来介导较少的T细胞激活。 2.4.细胞内信号传导域 “第一代”CAR完全通过主要信号传导域（信号-1）进行信号传导。TCR/CD3ζ细胞内链含有三个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs），FcεRI γ链含有一个ITAM，这些在磷酸化后作为下游信号蛋白的特定适配器。因此，CAR利用内源性TCR信号机制来启动T细胞激活事件的级联。下游激酶如Lck或Fyn也可以作为CAR介导的T细胞激活的主要信号，等等（图2）。CAR信号传导域本身足以与下游激酶结合并启动有效的激活级联，因为CAR在TCR敲除细胞和非T细胞如NK细胞中也是功能性的。然而，仅有主要信号的CAR不足以激活以允许长期持久；这样的CAR T细胞迅速进入凋亡。根据“双信号假说”，静息T细胞还需要一个共刺激信号以持续激活。这就是将主要信号与共刺激信号（信号-2），如CD28或4-1BB（CD137），结合在“第二代”CAR中的理由。也在临床前和临床上探索带有替代共刺激域的CAR，如OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、CD2和CD244。为了方便下游激酶的接近，CD28通常位于膜近端位置，随后是远端位置的CD3ζ；OX40和4-1BB在膜远端和近端位置都活跃。与第一代CAR相比，第二代CAR T细胞在细胞因子释放、扩增和抗肿瘤活性方面显示出稳健和持久的反应。 CAR介导的共刺激以不同的方式影响T细胞效应功能、存活、持久性和代谢。例如，4-1BB CAR T细胞在患者血液中的持久性超过6个月，而CD28 CAR T细胞在3个月之后大多无法检测到。经过重复刺激后，CD28 CAR T细胞重新编程为CD45RO+ CCR7−效应记忆细胞，这些细胞随后需要OX40来延长持久性并避免快速耗竭；4-1BB CAR T细胞主要转化为CD45RO+ CCR7+中央记忆细胞，并在外围血液中长期持久。CD28 CAR信号激活PI3K/Akt/mTOR途径，刺激有氧糖酵解，增加葡萄糖摄取和ATP生成，而4-1BB CAR信号激活Wnt/β-catenin途径和脂肪酸氧化，增加代谢和线粒体呼吸链能力。典型的Wnt/β-catenin有利于中央记忆细胞的形成和T细胞的长期存活，而CD28诱导的PI3K/Akt信号维持效应细胞的即时响应。在高剂量下，CD28和4-1BB CAR T细胞都能在临床前模型中根除大型已建立的肿瘤；在低剂量下，CD28 CAR T细胞比4-1BB CAR T细胞表现出更大的耗竭程度，结果是4-1BB CAR T细胞在长期内更有效地根除大型肿瘤负荷。另一方面，带有4-1BB CAR的T细胞仍然对肿瘤介导的通过TGF-β的抑制敏感，这对CD28 CAR T细胞来说较少见。因此，选择CAR设计的标准取决于多个参数，包括T细胞持久性、抗抑制能力、共刺激和共抑制配体的模式、肿瘤细胞上的抗原密度、T细胞上的CAR密度等。 “第三代”CAR结合两个共刺激域以及主要激活信号。联合共刺激的好处只在少数情况下得到证明，例如，通过CAR提供CD28-OX40共刺激对T细胞在终端成熟中的进展有益。 3.TRUCK：“第四代”CAR T细胞 CAR T细胞可以用来按需将转基因蛋白输送到预定的、靶向的组织。因此，CAR T细胞被设计成带有CAR诱导表达盒的额外“有效载荷”。所谓的“第四代”CAR T细胞，即TRUCKs（“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”），旨在在靶向组织中沉积分泌型转基因蛋白，以实现治疗有效浓度（图3）。“有效载荷”的表达受NFAT6-IL-2最小启动子的控制，该启动子在CAR信号传导时被激活；有效载荷可以是转基因编码的任何蛋白或肽。这种策略特别有趣，因为它结合了重定向CAR T细胞攻击和局部沉积的生物活性蛋白的作用，同时避免了系统毒性。只要CAR T细胞保持激活状态，TRUCKs就会沉积转基因产物，例如，IL-12或IL-18作为转基因免疫调节剂，以特定方式塑造靶向肿瘤环境，而不引起系统毒性。累积的TRUCK产生的IL-12在CAR靶向的肿瘤组织中招募天然免疫细胞，如NK细胞和巨噬细胞，在那里反过来启动二次抗肿瘤免疫反应。IL-12 TRUCKs抵抗Treg细胞的抑制，并显示出增加的细胞因子释放和扩增。当快速进展的肿瘤积累抗原丢失的癌细胞，导致对CAR T细胞不可见的肿瘤复发时，这种策略特别有趣。释放IL-18的TRUCKs将CAR T细胞转化为T-bet高FoxO1低效应细胞，抵抗耗竭并显示出对大型已建立肿瘤的优越细胞毒性。IL-18 CAR T细胞治疗改变了整个肿瘤免疫细胞景观，特别是通过增加CD206− M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，减少抑制细胞如Tregs、抑制性CD103+ DCs和M2型巨噬细胞。其他例子包括释放过氧化氢酶以保护T细胞免受过氧化压力介导的抑制和释放肝素酶以改善T细胞通过肿瘤基质的穿透。 图 3 第四代CAR T细胞（“TRUCKs”）。在抗原结合时，第二代或第三代CAR诱导表达一种转基因蛋白，该蛋白在细胞内作用、整合到膜中或由CAR T细胞释放。释放的转基因蛋白旨在改变肿瘤环境、重塑肿瘤组织或吸引二次免疫反应。CAR T细胞被诱导仅在CAR与其靶标结合时释放蛋白质，从而将“有效载荷”在预定义的交付点作为“TRUCK”进行交付。这种CAR T细胞被理解为“活体工厂”，用于精确和持续地交付治疗性细胞产品。 所谓的“装甲CAR”通过产生4-1BB配体提供增加的共刺激通过刺激4-1BB途径。工程化的T细胞被设计为分泌Toll样受体（TLR）配体，可以刺激T细胞和抗原呈递细胞上的TLR途径，然后可以激活一组T细胞进行广泛的抗肿瘤攻击。靶向Muc16ecto（即黏蛋白-16（CA-125）的膜保留残余物）并分泌IL-12的CAR T细胞正在临床试验中评估（NCT02498912）。IL-15 TRUCK细胞显示出改善的扩增和抗肿瘤活性，但在未受控制的扩增情况下需要自杀基因，由于其白血病潜力。“装甲”CAR通过与CAR共表达IL-7受体-α链来恢复对IL-7的反应性，并促进Th1反应。类似地，在IL-4水平增加的前列腺癌中，共表达IL-4结合/IL-7信号传导受体提高了抗PSCA CAR T细胞的抗肿瘤活性。另一方面，CAR T细胞上共表达的显性负性TGF-β DNRII受体可以在TGF-β存在的情况下与TGF-β竞争，以改善T细胞的抗肿瘤活性。也可以设想提供细胞因子或细胞因子受体之外的应用，如输送可溶性HVEM外域，以靶向肿瘤血管，以维持肿瘤穿透。 4.具有双重特异性、组合抗原识别和条件性CAR的CAR T细胞 原型CAR通过一个scFv将特异性重定向到一个抗原；多种原因要求具有多重特异性的CAR：(1)肿瘤病变在可靶向抗原方面可能是异质的，或在肿瘤进展过程中丢失抗原；(2)靶向癌细胞和肿瘤基质或血管可能有益或需要增加治疗效果。将两种或更多CAR T细胞产品应用于癌症患者基本上是可行的，尽管需要在GMP条件下制造两种细胞产品。例如，通过顺序输注应用CD19和CD22 CAR T细胞目前正在评估治疗难治性B-ALL的试验中（NCT03620058）。或者，T细胞被设计为表达两个CAR，即所谓的双顺反子CAR，每个CAR针对不同的抗原（图4）。通过灵活的连接子将两个scFv相互连接，设计出具有双重特异性的CAR。这种串联排列的双特异性CAR（“串联CAR”，“Tan-CAR”）或环状结构，针对两种不同的抗原，并能够在结合任一抗原时提供T细胞激活（“或”门控）；具有其中一种相应抗原的目标细胞仍然被识别。除了两个连接的scFv外，双抗体、二合一抗体和双变量域抗体也可以用来设计具有两种特异性的CAR。三特异性CAR包含单价和/或多价CAR结构的组合，以针对三种抗原，进一步扩大靶向特异性。一个例子是设计了一种双特异性CAR，将针对CD20和CD19的scFv连接起来，旨在减轻在接受CD19 CAR T细胞治疗后经常发生的B细胞白血病/淋巴瘤的复发。CD19− CD20+白血病细胞的复发旨在通过CD20-CD19双特异性CAR T细胞得到控制。双特异性CAR中scFv的顺序取决于特定抗原中目标表位的空间可及性。CD20-CD19 CAR对CD19和CD20都具有相同的结合能力，并重定向T细胞激活，而CD19-CD20 CAR则效率要低得多。其他双特异性CAR的例子是针对CD19和CD123治疗B-ALL或CD19共靶向CD22、ROR1和免疫球蛋白κ轻链（Igκ）。多特异性CAR T细胞目前正在早期临床试验中评估。通过双顺反子表达盒设计了同时具有CD19和CD22 CAR的T细胞，正在进行治疗高风险B-ALL或干细胞移植后复发的试验（NCT03289455）。具有CD19和CD22特异性的双价CAR正在评估治疗B-ALL或B细胞淋巴瘤（NCT03241940, NCT03233854, NCT03330691, NCT03448393, NCT03019055）。目前正在进行的II期试验中评估了针对BCMA两个表位的双特异性CAR（NCT03758417）。 图4 基于逻辑门控的CAR介导的T细胞激活，以证明在肿瘤靶向中的选择性。共表达两种CAR，每种CAR在与相应的目标抗原结合时都能完全激活T细胞；双特异性CAR（串联CAR，Tan-CAR）也是如此。在这种情况下，通过表达抗原A或B或两者的细胞激活T细胞（"OR"门控）。为了仅通过同时表达A和B抗原的细胞激活CAR T细胞，识别A的CAR仅通过CD3ζ提供基本激活，这不足以实现完全和持续的激活，而识别B的CAR提供共刺激；通过两种CAR的同时信号传导诱导T细胞完全激活（"AND"门控）。识别抗原A的synNotch CAR驱动转录并表达第二种CAR，该CAR在识别抗原B时驱动T细胞完全激活。具有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR在其识别的抗原B结合时阻止通过激活CAR的信号传导。当抗原B不存在时，CAR可以在结合抗原A时激活T细胞（"A-not-B"门控）。 当结合两种抗原时，双特异性CAR比单特异性CAR具有更高的亲和力，理论上稳定了突触并改善了T细胞对低抗原水平目标细胞的反应。这种情况可以用来只将CAR T细胞重定向到表达两种抗原而不是一种的细胞（图4）。这种“与”门控的抗原模式旨在提高对癌细胞的靶向选择性，同时保留健康细胞。两个共表达的抗原被两个共表达的CAR识别，每个CAR识别特定的抗原，并分别提供主要或共刺激信号。这样，只有同时结合两种抗原才提供完全T细胞激活所需的两个信号；结合一种抗原是不足够的。组合抗原识别的例子是，通过CD3ζ CAR靶向ErbB2和通过CD28 CAR靶向Muc1，或通过CD3ζ CAR靶向间皮素和通过CD28 CAR靶向叶酸受体-α。靶向CD13和TIM3的双特异性和分裂CAR T细胞在临床前模型中根除患者衍生的急性髓性白血病细胞，减少了对骨髓和外周髓性细胞的毒性。 通过异二聚体化两个多肽链，可以加强两个CAR上的初级和共刺激信号的组合；一个链由细胞外和跨膜以及初级信号传导部分组成，第二个链提供共刺激信号传导部分，并通过添加“二聚体化剂”与第一个链相连。CAR在二聚体化剂允许异二聚体化和功能性CAR形成之前保持沉默。通过滴定二聚体化剂剂量可以微调T细胞活性；撤除二聚体化剂终止CAR信号。只有当每个CAR信号单独不足以驱动T细胞激活时，才能通过组合抗原识别实现清晰的“开-关”T细胞激活。由于预先激活的T细胞中的CD3ζ信号可能重新诱导T细胞反应，因此需要调整信号或降低结合亲和力以实现平衡的激活阈值。 可调CAR的另一种策略基于合成Notch（synNotch）受体。Notch由一个细胞外受体、一个跨膜域和一个细胞内转录调节器组成，激活后介导内部域的蛋白水解，释放细胞内转录调节器。这些特性用于控制与Notch受体不同特异性的真正CAR的转录。优点在于Notch受体的抗原识别基于逻辑“与”门控，并以空间定义的方式控制CAR T细胞功能。在CD19结合后，CD19特异性synNotch受体释放转录效应域Gal4-VP64或TetR-VP64以诱导抗间皮素CAR的表达。只有当在靶向组织中同时识别synNotch配体和CAR配体时，T细胞才被激活。另一个例子是通过CAR靶向ROR1和通过Notch受体靶向EpCAM或B7-H3。虽然CAR的“开开关”决定了靶向癌细胞的选择性，但这种策略可能受到诱导足够水平的CAR表达和在没有Notch信号进一步发生时衰减CAR所需的时间的限制。 工程化T细胞的TCR特异性也可以用来提供更复杂的识别轮廓。带有γδ TCR的T细胞识别肿瘤细胞特有的磷酸化抗原；转基因表达GD2特异性CAR和共刺激域只会在γδ TCR和CAR同时结合它们相应的抗原时提供完全的T细胞激活；由于缺乏γδ TCR激活，不会攻击GD2+的健康细胞。 虽然许多可靶向的抗原既表达于健康细胞也表达于癌细胞，但有些抗原仅由健康细胞表达，而癌细胞缺乏表达。在这种情况下，结合共同抗原“A”但在结合健康细胞上的抗原“B”时阻断，将阻止CAR T细胞激活对抗健康细胞（图4）。带有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR只要结合其相应的抗原“B”，就阻止通过激活性CAR的信号传导。结合缺乏抗原“B”的“A”癌细胞允许CAR T细胞激活，因为缺乏通过抑制性CAR的信号传导（“A非B”门控）。 5.具有植入多重抗原特异性的通用CAR 目前，原型CAR具有一个确定的抗原特异性；改变特异性需要用新的CAR工程化T细胞。在这种情况下，开发了一种“通用”CAR，它识别一种抗体，该抗体转而提供癌症特异性（图5）。例如，抗癌抗体的免疫球蛋白Fc区域被具有CD16作为结合域的CAR结合。CD16 CAR T细胞结合抗癌抗体，从而获得对癌细胞的特异性。或者，CAR结合至与抗癌靶向抗体相关联的蛋白质表位。具有荧光素异硫氰酸酯（FITC）特异性CAR的T细胞识别FITC标记的叶酸，该叶酸与叶酸受体阳性癌细胞结合。也可以设想将其他表位与桥接抗体相关联，如亲和素。同时添加不同特异性的抗体，允许将相同的CAR T细胞产品（“UniCAR”）重定向至多种抗原，无需重新制造CAR T细胞。该策略的优点是同时使用不同的抗体靶向广泛的抗原，同时只应用一种制造的CAR T细胞产品。实际的特异性由应用的抗体混合物在治疗足够浓度下定义。随着应用的抗体的短半衰期，此外，意外的不良事件在抗体撤除后很快就会有限。从机制上讲，有效的肿瘤控制需要CAR T细胞和连接抗体都渗透到肿瘤病变中；目前尚不清楚这是否适用于晚期实体瘤。也尚未解决“通用”CAR T细胞是否能够建立对癌症抗原的持久免疫记忆，这被认为是长期控制癌症所需的。 图 5 “通用”CAR的概念。T细胞表达一种特异性针对标签的CAR，该标签与连接分子相连，最好是天然抗体、单链抗体(scFv)或双特异性T细胞导向抗体(BiTE)，这些分子能够识别肿瘤细胞上的目标抗原。通过添加不同的连接分子，无需工程化新的CAR T细胞，就可以为T细胞配备不同的特异性。这被认为在将CAR T细胞应用于患者后也是可行的；注入针对不同肿瘤抗原的抗体，为CAR T细胞提供不同的特异性。 6.转换抑制信号为激活信号的Switch CAR 在肿瘤病变中，重定向的T细胞攻击通常以各种方式受到抑制；抑制性配体如程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）和PD-L2与激活的T细胞表达的程序性细胞死亡-1（PD-1）结合。一种结合这种抑制性配体但向工程化T细胞传递激活信号的CAR，不仅可以与抑制性受体竞争结合，还可以通过提供激活信号克服抑制（图6a）。理想情况下，PD-L1:CD28 “开关”CAR在工程化T细胞中克服PD-1介导的抑制信号。特别是，一个具有PD-1细胞外域结合PD-L1和CD28细胞内信号传导域的CAR，将抑制信号转换为激活信号，导致ERK磷酸化增加，促炎细胞因子释放，T细胞扩增和目标细胞的细胞溶解。由TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）的外域与CD28共刺激域融合而成的嵌合受体，在结合TIGIT配体CD155时增强T细胞功能。鉴于肿瘤组织提供的大量抑制信号，确定需要克服的“关键”抑制因素以维持有效的T细胞反应仍然是一个挑战。 图 6 开关CAR和抑制性CAR（iCAR）。(a) 开关CAR与生理性T细胞抑制性受体的配体结合，但为工程化T细胞提供激活信号。(b) 抑制性CAR在与抗原结合后，通过ITIM信号向工程化T细胞提供负信号。抑制信号压倒了通过TCR或共表达的激活CAR的激活。 7.抑制性CAR：iCARs 虽然原型CAR向工程化T细胞提供激活信号，但具有抑制信号的CAR旨在在结合健康细胞时抑制CAR T细胞激活。理想情况下，抑制性CAR通过在面对健康组织时覆盖激活CAR信号来减轻非肿瘤毒性。与激活性、肿瘤特异性CAR共表达的具有优势抑制信号的CAR，识别健康细胞；从而CAR T细胞只在结合癌细胞时激活，抑制性CAR不结合健康细胞（图6b）。这种抑制性CAR提供PD-1或CTLA-4信号，并覆盖癌症特异性CAR的激活信号。 8.异体CAR T细胞和CAR NK细胞 到目前为止，CAR T细胞治疗是一种通过体外制造患者自己的T细胞的个性化治疗。这不仅繁琐、成本密集和耗时，而且在患者晚期疾病无法提供足够或足够活跃的T细胞进行CAR工程化时通常也不适用。在这种情况下，异体“现成的”CAR T细胞将为广泛的患者群体带来好处。为了避免移植物抗宿主病（GvHD），需要删除内源性的αβ TCR和HLA分子，这可以通过锌指核酸酶或CRISPR/Cas技术实现。随后清除剩余的TCRαβ T细胞，通过污染的异体TCR+细胞降低GvHD风险。T细胞通过转录激活样效应核酸酶（TALENs）技术在TCRα和CD52位点进行基因编辑，用于治疗无法生产自体CAR T细胞的患者的儿童CD19+ ALL。CD52存在于患者的恶性B细胞上，需要从CAR T细胞中删除，以允许消除恶性淋巴细胞，同时保留注入的CD52阴性CAR T细胞。对于工程化异体CAR T细胞，CRISPR导向RNA和Cas9目前由病毒载体编码以实现组成性表达；当前的研究旨在短暂提供基因编辑工具，而不持久的载体，以最小化非目标编辑。 针对BCMA治疗多发性骨髓瘤的异体CAR T细胞，通过BCMA CAR和基因编辑技术进行了改造，以限制TCR介导的免疫反应。通过将CD20模拟表位整合到CAR的细胞外域，使CAR T细胞能够通过利妥昔单抗消除，从而提供了异体BCMA CAR T细胞的安全性。 关于使用异体效应细胞，NK细胞也可以用于诱导有效的抗肿瘤反应，因为它们具有细胞毒性潜力和分泌促炎细胞因子。除了使用异体细胞，使用NK细胞进行癌症的过继细胞治疗有很强的生物学理由；NK细胞表现出广泛的抑制性和激活性受体库，以识别外来、感染或恶性细胞。两种信号的平衡最终诱导或阻断细胞毒性CD56dim NK细胞释放细胞毒性颗粒以杀死目标细胞。虽然可能存在广泛的NK细胞亚群多样性，基于激活和抑制受体的库，但通过CAR工程化NK细胞将为特定癌细胞提供预定的特异性。原型CAR具有CD28-CD3ζ信号也在NK细胞中活跃；具有NK细胞2DS2和DAP12信号蛋白的CAR产生了更强的抗肿瘤活性。为NK细胞工程化的CAR通常包含DAP10或DAP12用于激活，单独或与CD3ζ一起。具有NKG2D作为结合物和DAP10-CD3ζ用于激活的CAR有效地激活了小鼠模型中针对骨肉瘤的原代NK细胞。CD3ζ在NK细胞中作为激活域优于DAP10，而DAP12优于CD3ζ。 9.制造CAR T细胞用于临床应用 对于临床应用，CAR T细胞产品是根据良好生产规范（GMP）规则，使用预期接受患者的自体T细胞制造的（图7）。在大多数情况下，通过白细胞分离术收集血液，分离T细胞，通过病毒感染或电穿孔进行基因工程改造，并扩增到临床相关的数量。大多数临床试验使用通过γ-逆转录病毒或慢病毒基因转移修饰的T细胞；基于转座子的载体，如Sleeping Beauty和PiggyBac，越来越多地应用于临床，其好处是避免了成本和时间密集型的病毒生产。病毒和转座子介导的基因转移程序旨在永久性地修改患者的T细胞以表达CAR；一些试验使用通过RNA电穿孔修饰的T细胞进行短暂的CAR表达。在永久性基因改造后，插入突变和随后成熟T细胞的致癌转化的风险似乎很低，到目前为止在这方面还没有报告致癌事件。一个需要注意的问题是，通过慢病毒转移，CAR基因插入到Tet2位点导致T细胞的克隆扩增，然而，它们自发地收缩了。然而，白细胞分离产品中污染的恶性细胞也可能意外地被CAR改造，存在重新输注给患者后通过CAR介导的肿瘤促进的风险。 图7 CAR T细胞制造和患者治疗时间表。(a) 通过白细胞分离术从患者体内收集T细胞，并在体外处理以获得最终的CAR T细胞产品，包括T细胞工程化以携带CAR、扩增至临床相关数量，以及最终的质量控制程序（QC）。在输注CAR T细胞产品之前，患者需接受非清髓性淋巴细胞减少（“预处理”），以促进CAR T细胞的植入和体内扩增。随后需要院内护理以管理潜在的副作用，如CRS或神经毒性。(b) 体外CAR T细胞制造过程通常从白细胞分离产品开始，并涉及多个后续生产步骤，包括T细胞分离和激活、基因工程、CAR T细胞扩增、制剂、CAR T细胞产品的冷冻保存，以及最终的质量控制以供释放。整个过程可以手动运行，或在监督下（半）自动化进行。 经过基因改造后，CAR T细胞在细胞因子存在的情况下在体外广泛扩增到临床相关的细胞数量；目前使用手动处理的摇动反应器或袋子以及完全自动化和监督处理设备。自动化的目标是允许以高再现性和质量进行生产，并从越来越多的患者中并行生产细胞，并缩短静脉到静脉的时间。 最适合CAR治疗的T细胞群体被认为是具有急性炎症特征的原始或年轻中央记忆细胞。在IL-2存在下扩增CAR T细胞优先触发效应T细胞，而IL-7或IL-2加IL-15扩增具有持续细胞因子释放和抗肿瘤活性能力的中央记忆T细胞。添加IL-21使CAR T细胞保持较少分化状态。刺激方式不仅决定了扩增CAR T细胞的产量，还决定了代谢依赖性；IL-15增加氧化代谢以及肉碱棕榈酰转移酶，这是脂肪酸氧化的限速步骤。IL-7通过STAT5和Akt激活增加Glut1，并诱导甘油运输和甘油三酯合成，从而改善T细胞持久性和存活。在体外扩增期间抑制Akt触发具有高水平脂肪酸氧化的中央记忆表型，最终改善CAR T细胞的抗肿瘤活性。CD45RO+ CD62L+记忆CAR T细胞比更高级分化阶段的效应T细胞提供更持久的抗肿瘤反应，使富含CD62L的CAR T细胞成为进一步探索的有吸引力的选择。 因此，中央记忆CAR T细胞在临床应用中似乎更优越，因为响应的患者没有累积具有早期记忆和耗竭特征的T细胞，而非响应的患者则累积了。最终产品中工程化细胞的活性可能影响治疗效果。然而，基于制造的细胞产品的活性对CAR T细胞治疗结果的首次回顾性分析表明，当患者接受70-80%活性的产品与至少80%活性的产品相比，CD19 CAR T细胞扩增或患者存活没有差异的证据。 制造T细胞产品是一种个性化方法，当前程序有一些显著的限制： 一些癌症患者淋巴细胞减少或具有低数量的原始T细胞，导致生产延迟或失败，如在为儿科患者生产时所经历的。 生产过程耗时，这对急性或晚期疾病的患者不利。 由于疾病，患者的T细胞可能功能失调，如CLL和一些实体瘤所报告的，导致产品反应率低。 在某些情况下，工程化异体T细胞可能是另一种策略。在接受造血干细胞移植的患者中，使用移植的异体T细胞制造CAR T细胞产品。这样的异体CD19特异性CAR T细胞诱导了部分和完全缓解；然而，一些患者遭受了GvHD。病毒抗原特异性、部分HLA匹配的供体T细胞缺乏异体反应性，并且通过CAR工程化，显示出抗淋巴瘤活性。NK细胞以其MHC独立活性也是第三方供体细胞CAR工程化的来源；然而，它们在患者中表现出较差的持久性。 10.通过CAR T细胞的过继治疗在血液学恶性肿瘤中诱导持久缓解 过继转移CAR T细胞的治疗效果取决于多个参数，包括CAR设计、CAR信号传导、结合亲和力、目标细胞上的抗原数量、目标抗原表位的空间可及性、T细胞的成熟阶段、CAR T细胞的持久性和扩增、患者免疫系统的预处理等。目前的努力旨在优化特定疾病的状况；一些治疗方案已在CAR T细胞治疗恶性疾病的方面证明成功，特别是B细胞白血病/淋巴瘤；少数试验旨在治疗实体癌。 在迄今为止难以治疗的B细胞白血病和淋巴瘤的治疗中，使用“第二代”抗CD19 CAR T细胞的早期临床试验实现了完全且持久的缓解；使用“第一代”CAR T细胞的治疗大多失败，因为CAR T细胞从循环中迅速清除。目前，近600项早期阶段的CAR T细胞试验正在进行临床探索，主要由学术中心进行（截至2020年初，中国有268项，美国有227项，欧洲有67项）。用于治疗儿童B-ALL（Kymriah™，tisagenlecleucel，诺华）和成人大B细胞淋巴瘤（Yescarta™，axicabtagene ciloleucel，Kite-Gilead）的抗CD19 CAR T细胞已获得FDA和EMA的批准；其他将很快跟进。 CAR T细胞治疗的标准程序从患者的白细胞分离开始，分离T细胞，体外基因工程改造相应的CAR，CAR T细胞扩增，以及在非清髓性淋巴细胞减少和IL-2支持后，通过静脉输注将最终的细胞产品重新给患者（图7）。由于CAR T细胞的持久性对临床效果至关重要，目前在试验中使用的CAR具有一个或两个共刺激内域，其中大多数提供CD28或4-1BB共刺激。在持久性方面，4-1BB共刺激的CAR T细胞似乎优于CD28 CAR T细胞，在循环中持续4年以上，而CD28 CAR T细胞持续30天。由于CD19 CAR T细胞不区分健康和恶性B细胞，只要CD19 CAR T细胞持续存在，患者就会经历持久的B细胞耗竭。尽管B细胞耗竭在临床上是可管理的，但这种情况要求在靶向恶性B细胞时更具选择性。最近，Fcμ（IgM）受体被确定为治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）时可能更具肿瘤选择性的目标，由于目标表达水平较低，因此大多数健康B细胞免于被淘汰。目前也在探索其他替代靶标。 在缓解期间，大多数接受4-1BB CAR T细胞治疗的白血病/淋巴瘤患者没有接受进一步的癌症特异性治疗；接受CD28 CAR治疗的患者经常接受异体干细胞移植，这似乎是有益的，因为CD28 CAR T细胞的持久性不如4-1BB CAR T细胞。需要进一步探索以确定长期内更成功的策略。 迄今为止，患有DLBCL、CLL、B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）和滤泡性淋巴瘤的患者已通过CD19 CAR T细胞成功治疗。值得注意的是，接受CD19 CAR T细胞治疗的多发性骨髓瘤患者也经历了缓解，尽管通过流式细胞术评估，骨髓瘤细胞是CD19low或CD19阴性。目前也在探索用于治疗B细胞恶性肿瘤的其他替代靶标，包括CD20、CD22、Igκ轻链、ROR-1和CD30。 由于缺乏标准化的试验设计、CAR组成、靶向抗原、预处理等方面，很难比较各种试验中CAR T细胞治疗的成功。然而，越来越明显的是，CAR T细胞剂量和淋巴细胞减少的程度或淋巴细胞减少方案对于允许广泛的T细胞扩增、持久性和最终治疗效果至关重要。应用后对CAR T细胞的重复再刺激可能改善它们在长期内的持久性和抗肿瘤效果。这是使用病毒特异性T细胞进行CAR植入的合理性，它们在接触病毒抗原时通过TCR重复再刺激；例如，Epstein-Barr病毒（EBV）特异性T细胞通过CAR工程化，并被EBV感染的细胞触发扩增。事实上，EBV特异性CAR T细胞的表现优于没有病毒特异性的CAR T细胞。 11.治疗实体癌的CAR T细胞面临的挑战 虽然血液学恶性肿瘤的治疗越来越成功，但实体癌的治疗仍然具有挑战性（表2）。作为“活药”的CAR T细胞基本上非常适合治疗实体癌，特别是由于T细胞固有的迁移和组织穿透能力，穿透血脑屏障，并在几乎所有组织中积累，包括睾丸和眼睛等特权组织，因此特别适合消除（微）转移。然而，大多数实体肿瘤具有大量策略，以非常有效的方式对抗CAR T细胞的迁移、渗透和激活。其中，改变的趋化因子环境损害了CAR T细胞向肿瘤的迁移；肿瘤内皮细胞上丢失了一些粘附因子，妨碍了T细胞的渗透。通过局部沉积TNF-α可以对抗后者，它增加了血管粘附分子，如血管细胞粘附蛋白-1和内皮细胞上的细胞间粘附分子-2。靶向血管内皮生长因子（VEGF）受体-2或阻断迁移抑制因子如内皮素B受体也改善了内皮细胞粘附和/或T细胞的跨内皮迁移。在T细胞上下调的趋化因子受体被重新表达，如CXCR2（CXCL1受体），以便于靶向黑色素瘤或CCR2b用于靶向神经母细胞瘤。 表 2 CAR T细胞疗法面临众多挑战。 为了绕过迁移障碍，CAR T细胞被瘤内植入或分别注入胸膜或腹膜以治疗间皮瘤和卵巢癌。通过内窥镜将抗CEA CAR T细胞应用于肝转移；抗c-Met CAR T细胞被注入乳腺癌转移。一旦进入肿瘤病变，CAR T细胞需要突破基质细胞和细胞外基质的障碍，才能接近癌细胞以执行它们的细胞毒性攻击。通过基因工程释放的肝素酶在基质中降解肝素硫酸蛋白多糖，改善T细胞的渗透；需要高水平的IFN-γ来消除基质细胞并根除大型已建立的肿瘤病变。通过直接针对基质细胞的CAR T细胞特异性针对成纤维细胞激活蛋白（FAP），一种参与细胞外基质重塑的丝氨酸蛋白酶，整体抗肿瘤活性得到改善。 许多过程使肿瘤病变对重定向的CAR T细胞产生敌意，使它们变成耗竭状态或进入凋亡。调节性T（Treg）细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关M2型巨噬细胞释放抑制性细胞因子，如IL-4、IL-10、白血病抑制因子（LIF）和TGF-β。MDSCs和巨噬细胞降低肿瘤内色氨酸水平；基质细胞释放吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和犬尿氨酸，抑制T细胞效应功能并剥夺组织中的葡萄糖和其他营养物质。严重的酸中毒也对抗肿瘤活性的CAR T细胞产生反作用。由于MDSCs释放的精氨酸酶，低精氨酸水平抑制CD3ζ表达和TCR信号传导。 12.CAR T细胞治疗与毒性相关 作为“活药”的CAR T细胞治疗在一些试验中取得了显著的治疗效果；然而，CAR T细胞在初始应用后的几天甚至几周内可能导致严重的副作用，需要重症监护干预，甚至可能致命。大多数毒性是由于CAR T细胞的特殊生物学特性，其他与CAR T细胞相关的毒性目前尚未完全理解。从机制上讲，主要毒性是(1)由于大量T细胞激活、细胞因子释放和肿瘤溶解引起的全身毒性，以及(2)由于CAR T细胞与健康组织相互作用引起的特异性毒性（“靶上非肿瘤”毒性）。 12.1.系统性毒性 细胞因子释放综合征（CRS）：大量CAR T细胞与目标细胞的结合导致大量细胞因子释放，血清中促炎细胞因子（包括IFN-γ和TNF-α、IL-10和IL-6）的水平异常高，这本身会导致其他免疫细胞的交叉激活，以及进一步的细胞因子释放，直至达到有毒水平。这些毒性被称为细胞因子释放综合征（CRS），临床上伴有高烧、不适、疲劳、肌肉痛、恶心、厌食、心动过速、低血压、毛细血管渗漏、心脏功能障碍、肾功能损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。CRS常与血管渗漏综合征（VLS）一起出现，与巨噬细胞激活综合征（MAS）和巨噬细胞激活密切相关，临床上类似于噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）。CRS的风险与T细胞激活和扩增有关，这可能与总体肿瘤负荷相关，但并非绝对。为了避免CRS，需要在肿瘤负荷高的患者中使用较低剂量的CAR T细胞，这是一个需要通过精确定义治疗窗口来解决的悖论，通过调整T细胞激活、细胞因子释放和抗肿瘤活性。 CRS的早期诊断和临床管理通过新建立的评分系统和治疗指南得到便利。C反应蛋白，即由肝细胞在IL-6水平增加时释放的蛋白质，目前作为CRS发作和严重程度的实验室标志物；成人的预测标志物还包括可溶性gp130（sgp130）、IFN-γ和IL-1Rα的增加，在儿科患者中，IFN-γ、IL-13和MIP1α的增加。目前CRS的治疗基于阻断IL-6/IL-6受体信号轴，通过阻断抗体如抗IL-6受体抗体tocilizumab或抗IL-6抗体siltuximab，这似乎不会干扰CAR T细胞的疗效。短期系统性皮质类固醇治疗也能迅速逆转CRS，且不影响最初的抗肿瘤反应；然而，它可能在长期内损害CAR T细胞反应。在CRS期间中和促炎细胞因子有助于减轻CRS的严重程度。在CRS期间，活化的单核细胞和/或巨噬细胞释放高水平的IL-1；通过IL-1受体拮抗剂中和可以改善临床模型中的CRS和神经毒性。通过给予lenzilumab抗体中和巨噬细胞-单核细胞激活细胞因子GM-CSF，降低了CRS的风险。通过阻断酪氨酸羟化酶减少儿茶酚胺，降低了小鼠模型中的细胞因子水平，暗示了临床干预的途径。 与CAR T细胞相关的HLH/MAS通常与CRS症状一起出现，伴有铁蛋白和肝酶血清水平升高、噬血细胞现象、细胞减少、肺水肿、脾肿大、肾功能衰竭和NK细胞丢失。治疗包括使用依托泊苷或阿糖胞苷进行系统性化疗，如果与神经毒性相关，也可以鞘内应用；在这种情况下，IL-6/IL-6R阻断大多无效。 神经毒性（ICANS）：CAR T细胞治疗相关的神经毒性现在被称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。神经系统效应包括失语症、幻觉、混乱、谵妄、表达性失语症、肌阵挛、谵妄、癫痫发作和脑水肿。这种神经毒性发生在大约40%的患者中，是可逆的，并且在CD19 CAR T细胞治疗期间频繁发生；其他CAR T细胞也可以引起神经毒性，指向由于活化CAR T细胞的浸润导致的弥漫性但暂时性脑病。神经毒性的机制尚不清楚，但与破坏血脑屏障和脑脊液中细胞因子水平增加有关。如果与CRS一起治疗，用IL-6阻断和类固醇治疗可以成功。 12.2.“靶上非肿瘤”毒性 由于大多数靶向抗原也由健康细胞表达，CAR T细胞治疗与攻击健康组织的风险相关，导致巨大的“靶上非肿瘤”毒性。治疗B细胞白血病的CD19靶向CAR T细胞也消除了健康的B细胞；持久的B细胞耗竭需要免疫球蛋白替代和抗生素及抗真菌保护，这在临床上是可管理的。当目标抗原由重要组织表达时，毒性更严重。在一项针对肾癌患者的碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞治疗试验中，患者由于胆管上皮细胞上碳酸酐酶IX水平较低而出现肝毒性；通过预先给予阻断抗体，可以减少“非肿瘤”毒性的严重程度。避免“靶上非肿瘤”毒性的策略目前旨在增加肿瘤选择性，并以空间和时间的方式限制CAR活性。T细胞给药的替代途径可能是避免通过血液系统分布大量CAR T细胞的选项。通过内窥镜或胸膜内或腹膜内应用局部CAR T细胞给药，在肿瘤部位提供高剂量的CAR T细胞，并在一定程度上避免了非肿瘤毒性。然而，这种应用是有限的，因为在大多数情况下，肿瘤病变无法接触或肿瘤广泛扩散。 12.3.“靶外非肿瘤”毒性 大多数过去工程化的CAR在细胞外部分包含IgG1 CH2CH3结构域作为间隔区，这可能会与Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，从而激活NK细胞和巨噬细胞等先天细胞。尽管到目前为止在临床上并不突出，但理论上可以通过删除IgG1 CH2结构域或突变FcγR结合位点内的Asn297来减少风险。替代间隔区包括IgG4 Fc结构域或细胞外CD8结构域。 第三代曲妥珠单抗衍生的CAR T细胞靶向ErB2导致可能由于急性呼吸窘迫综合征和CRS导致的致命的心肺衰竭。同样，在用EGFR变体3特异性CAR T细胞和CEA特异性CAR T细胞治疗时记录了肺水肿，而没有直接证据表明CAR T细胞攻击肺上皮。由于使用针对同一目标的不同表位或传递不同信号的CAR可能产生显著不同的毒性，因此毒性概况更加复杂，例如，使用来自FRP5抗体的第二代ErB2 CAR的T细胞在肉瘤患者中并未诱导靶外非肿瘤毒性。 12.4.改善CRS的策略 基本上，当CRS在临床上显著时，需要对CAR T细胞进行下调或去激活；瞬时CAR表达、“关闭开关”和“自杀开关”是常用工具。 当存在严重CAR T细胞相关毒性的重大风险时，瞬时CAR表达可能有益。RNA转移产生瞬时表达的CAR。CAR在T细胞表面存在数天，并在目标细胞结合时介导有效的T细胞激活，然而，随着RNA降解和T细胞扩增时RNA稀释，CAR表达会下降。这种RNA修饰的T细胞在试验中显示出一些虽短暂但有效的效果。然而，由于CAR T细胞迅速清除，其缺点是短期效果。 然而，永久性修改的CAR T细胞需要在毒性不受控制的情况下主动消除这些细胞的策略。大剂量脉冲治疗类固醇在应用碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞后停止了自身免疫。虽然这是非选择性地清除激活的T细胞，但可以通过特定靶向更有选择性地消除CAR T细胞。CAR结合域基本上也可以通过抗独特型抗体进行靶向，以诱导CAR T细胞的溶解性消除。通过给予识别细胞外CAR结构域中整合的表位的消耗性、FDA批准的抗体，也可以实现CAR T细胞的消耗。例子包括使用利妥昔单抗来消耗具有CD20表位或模拟表位的CAR T细胞，或使用西妥昔单抗来消耗具有EGFR表位的CAR T细胞。是否能够迅速实现足够的CAR T细胞清除以逆转正在进行的CRS，还有待在临床情况下证明。 诱导凋亡的CAR T细胞消除似乎是这种情况下更快速的解决方案。转基因脲酶-9（Cas9）与FKBP1A相连，在系统应用原本惰性的小分子AP1903后，会在工程化CAR T细胞中诱导凋亡，该分子促进二聚体化和激活诱导性Cas9（iCas9）。这种策略是有效的，因为供体T细胞介导的GvHD可以在实验系统中通过iCas9介导的T细胞凋亡在一小时内停止。 与其消除CAR T细胞，不如通过整合模块控制细胞表面的CAR。CAR被设计为融合蛋白，整合了一个自切割降解结构域，该结构域被可以被特定蛋白酶抑制剂特异性阻断的蛋白酶反向调节。在蛋白酶存在的情况下，产生的CAR融合蛋白从连接的降解结构域分离并表达在细胞表面；抑制蛋白酶导致CAR降解和缺乏表面表达。 CAR也可以通过添加酪氨酸激酶抑制剂dasatinib来降低其表达或调节其信号强度，该抑制剂可以迅速且可逆地阻断Lck激活；从而在小鼠模型中减少CRS的严重程度。该策略的好处是，只要存在dasatinib，CAR T细胞的信号强度就会减弱，但不会被清除；然而，该策略仍需临床验证。 需要进一步开发以降低细胞因子介导毒性风险的CAR。调节信号强度的一个关键是CAR共刺激。CD28-ζ CAR更快地诱导T细胞激活，并诱导更高的细胞因子释放、扩增和随后的耗竭，而4-1BB-ζ CAR则驱动较少的急性扩增，但具有较低的细胞因子水平，因此与严重CRS的风险较低。因此，4-1BB-ζ CAR可能更适用于肿瘤负荷和抗原密度高的患者，而CD28-ζ CAR可能需要用于肿瘤负荷低的情况。 降低CAR介导的T细胞激活的其他策略，例如，修改CD8跨膜和铰链区域，从而降低ICANS或高于1级CRS的风险。作为一种替代策略，“通用”CAR允许通过调整将CAR T细胞与目标细胞链接的适配器分子来动态控制T细胞激活。 13.CAR T细胞治疗的挑战 在过去的几年里，临床试验正致力于将CAR T细胞治疗确立为治疗几种类型的B细胞白血病和淋巴瘤；然而，在治疗其他恶性疾病的方面，仍然存在重大障碍。 13.1.如何选择最佳的肿瘤选择性抗原作为靶标？ 在CAR T细胞治疗中，肿瘤靶向的选择性对于长期兼容性至关重要。大多数可靶向的肿瘤相关抗原并不具有肿瘤选择性，这增加了CAR T细胞疗法中诱导靶上非肿瘤毒性的风险。肿瘤特异性的表面蛋白突变或肿瘤相关糖基化变体如Muc1或Muc16是罕见的。然而，有些抗原虽然由健康组织表达，但似乎是安全的靶标。例如，癌胚抗原（CEA，CD66e）严格表达在胃肠道和肺部健康上皮的腔面，而在癌细胞上以去极化方式表达。系统性应用CEA特异性CAR T细胞（NCT01212887, NCT02349724）和通过肝动脉输注局部给药的抗CEA CAR T细胞（NCT01373047）在减缓肿瘤进展的同时，并未诱发治疗相关结肠炎。其他如ErB2等抗原可能在高表达ErB2的肿瘤细胞被选择性靶向时是合适的靶标，同时保留中低表达的健康细胞。 为了增加肿瘤选择性，优先考虑靶向一组抗原模式而不是单一特定抗原。技术上，在同一T细胞中共表达两种具有不同特异性的CAR，以在两种CAR同时结合它们相应的抗原时仅诱导完全的T细胞激活；一种CAR提供主要信号，另一种CAR提供共刺激信号，从而仅在存在两种抗原的情况下补充完全T细胞激活所需的信号。该策略需要一个弱的主要信号，以避免在存在一种抗原的情况下进行一些基本的CAR T细胞激活，以及一个强的共刺激信号以驱动完全的T细胞激活。 为了在结合健康细胞时阻断CAR T细胞激活，与激活性CAR共表达具有细胞内PD-1或CTLA-4信号传导的抑制性CAR（iCAR）。iCAR识别健康细胞上存在但在癌细胞上不存在的抗原。因此，仅在结合缺乏iCAR识别的抗原的目标细胞时才发生CAR T细胞激活。 有些抗原在癌细胞上的表达水平高于健康细胞；“亲和力调节”CAR结合域可能有助于区分这两种组织。虽然在临床前模型中证明了可行性，但癌细胞可能通过下调相应抗原来逃避监视。亲和力调节的治疗窗口狭窄，因为增加亲和力可能导致识别健康细胞，如GD2特异性CAR在实验模型中诱发致命性脑炎。 13.2.如何优化CAR结构？ 目前临床评估中的大多数CAR基于近二十年前设计的原型CAR结构。临床前研究表明，对于每种抗原，特定CAR需要针对目标抗原表位、结合亲和力、间隔区长度以及信号传导和跨膜结构域等进行优化。由于各组分之间复杂的依赖性，目前无法预测特定抗原的最佳CAR组成。例如，结合亲和力和目标表位的位置为靶向高抗原负载的癌细胞同时保留低抗原负载的健康细胞提供了狭窄的亲和力窗口。 13.3.如何在CAR T细胞治疗后建立长期癌症控制？ 尽管在儿童B-ALL中可以高频率诱导完全缓解，但约40%的白血病患者在持续存在CAR T细胞的情况下仍然复发。多种原因导致复发频率高，包括整个CD19分子的丢失或表达缺乏目标外显子2的CD19异构体，从而使其对CAR T细胞不可见。在CD19 CAR治疗后，B-ALL的两个案例中通过转换为CD19阴性的髓系谱系丢失CD19。在这种情况下，靶向对癌细胞存活至关重要的抗原将是一个理想的策略。由于这样的抗原通常不可用，通过双特异性CAR共靶向第二种抗原（例如CD20或CD22）可能会增加对白血病细胞的治疗压力。在实体瘤中这种情况更为重要，因为它们在抗原表达上通常表现出深刻的异质性；在初始肿瘤消退后的早期肿瘤复发可能是由于选择抗原丢失的癌细胞。这些癌细胞可能以抗原非依赖性方式被先天免疫细胞反应识别和消除。为了吸引和激活先天细胞并启动更广泛的免疫反应，CAR T细胞在实验模型中被赋予了诱导释放转基因IL-12的能力，使抗肿瘤攻击更有效。有一些迹象表明，结合抗原依赖性和非依赖性免疫反应可能在长期内控制肿瘤。 13.4.哪种T细胞亚群提供长期肿瘤控制？ 临床前模型表明，具有增强扩增能力和长期持久性的原始或早期中央记忆T细胞是过继治疗最合适的细胞。沿着这条线，CD62L+记忆T细胞似乎表现出优越的性能。发现中央记忆干细胞（TSCMs），这是CD62L+中央记忆T细胞库的一部分，具有非凡的扩增潜力，激发了对这些细胞进行过继细胞治疗的探索。人们对识别和调节干细胞样T细胞形成和维持的因素和调控网络越来越感兴趣，因为这些细胞在过继转移到患者后似乎对长期治疗效果至关重要。另一种策略是基于预测性地诱导T细胞成熟。例如，4-1BB共刺激在年轻T细胞中启动中央记忆T细胞反应，这与CD28 CAR T细胞表现出更短暂的效应细胞反应形成对比。另一方面，更成熟的阶段的细胞在大多数肿瘤所在的外围显示出优先积累。然而，这些细胞需要不同的共刺激信号，即优先迁移到外围的CCR7− T细胞从联合CD28-OX40共刺激中受益。特定T细胞亚群的功能能力也可以通过与激酶抑制剂的联合治疗来调节；ibrutinib，一种布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，降低了PD-1和CAR T细胞的耗竭，从而增加了持久性和抗肿瘤活性。 13.5.如何使CAR T细胞制造适应日益增长的患者数量？ 目前，大多数CAR T细胞由专门的GMP设施生产，冷冻并运送到患者的医院。生产越来越多的细胞产品将使当前程序达到极限，特别是当及时需要数千个自体细胞产品时。在医院内（半）自动化、完全控制和完全封闭系统的分散制造是解决这种情况的首选概念之一。这也将需要在制造过程中高度标准化，并避免血液和细胞产品运输中的复杂物流。作为另一种概念，一个高度专业化的、集中的生产设施，具有多个并行的自动化制造过程，可能作为患者细胞产品的区域供应商。 另一个限制是由患者自体T细胞治疗的需要设定的；对于每位患者来说，“通用”供体将使治疗在多个方面更容易。一个包含不同工程化CAR的“通用”供体T细胞产品库将在临床应用中提供更大的灵活性，根据患者的具体情况。此外，扩大生产规模将使更多的患者能够使用CAR T细胞产品。正在努力生成可以应用于众多患者的这种“通用”T细胞。这需要使CAR T细胞对宿主免疫细胞“隐形”，缺乏对患者健康组织的异体反应性，同时保留CAR介导的抗肿瘤活性。在这种情况下，通过基因组编辑技术获得的MHC缺陷、CAR修饰的病毒特异性T细胞和TCRα敲除T细胞，目前正在开发作为“现成的”或“第三方”细胞产品，GvHD风险低。CAR基因插入TCRα位点一步实现CAR的遗传工程和TCR表达的废除。编辑MHC I类以防止宿主识别和排斥供体T细胞可能通过NK细胞诱导消除，并不防止MHC II类介导的排斥。然而，目前探索的所有基因编辑程序在某种程度上都容易受到非目标修饰的影响，因此与意外的突变风险相关。该领域发展迅速，首次使用异体CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤和实体瘤的试验已经启动。 13.6.如何平衡CAR T细胞的疗效和副作用？ 目前，一些CAR T细胞治疗与高风险的严重副作用相关，可能需要重症监护住院治疗。尽管各种CAR T细胞协议和治疗程序不同，并且没有在比较性的临床环境中进行评估，但一些临床管理规则变得明显。例如，CRS的早期诊断、分级和临床管理将标准化，建立共识的治疗方案。在毒性不受控制的情况下，可以通过各种手段选择性地和迅速地消除CAR T细胞。通过添加二聚体化剂AP1903二聚体化转基因诱导的脲酶-9（iCasp9），在30分钟内消除超过90%的T细胞。或者，通过给予针对CAR结构域或共表达表位的抗体，诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）清除循环中的CAR T细胞。免疫介导的CAR T细胞消除的缺陷仍然是，癌症患者的潜在功能障碍免疫系统可能通过ADCC消除CAR T细胞的能力有限。 13.7.我们是否需要针对每种癌症类型的特定预处理？ 在大多数试验中，患者在过继T细胞治疗前接受非清髓性淋巴细胞减少，使用氟达拉滨和环磷酰胺；这种预处理的理由是暂时提供“空间”和细胞因子，以实现转移的CAR T细胞在体内的充分扩增。淋巴细胞减少还通过免疫调节提供抗肿瘤效果，因为它耗尽抑制细胞，并在肿瘤破坏时释放肿瘤相关抗原到免疫系统。尽管目前的预处理方案基本上是有效的，但基本方案可能需要针对每种癌症实体进行调整。例如，用于治疗Her2+肿瘤的调节方案通过应用nab-紫杉醇来耗尽间质性基质，并促进Her2呈递，并通过应用环磷酰胺耗尽Treg和MDSC，用于胆道和胰腺癌的修改。另一方面，预处理在CAR T细胞治疗的背景下可能具有高度毒性，通过诱导脑水肿和神经系统毒性，特别是在最近的一项试验（NCT02535364）中观察到的氟达拉滨治疗后。 13.8.如何激活免疫网络以诱导广泛的炎症性抗肿瘤反应？ CAR T细胞作为“活药”，越来越成为在目标器官产生和释放生物活性化合物的“活工厂”。使用CAR T细胞作为工厂的合理性基于实验肿瘤模型的证据，即宿主免疫系统在肿瘤排斥中起着重要且必要的作用，这使得在目标肿瘤组织内产生免疫刺激性条件成为必要。释放IL-12的CAR T细胞（IL-12 TRUCKs）可以通过吸引和激活M1型巨噬细胞来在肿瘤组织中诱发免疫反应，这些巨噬细胞可以消除CAR T细胞未能识别的癌细胞。其他具有特定影响局部免疫环境的细胞因子也可以使用；释放IL-18的CAR T细胞增加了肿瘤相关CD206+ M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，并减少了如Treg细胞、CD103+树突细胞和M2型巨噬细胞等抑制细胞。目前正在试验中探索使用靶向PD-1的检查点阻断，以激活CAR T细胞和浸润性淋巴细胞（NCT02650999）；其他检查点的阻断或组合，以重新激活肿瘤内源性免疫细胞，同样值得进行临床探索。 14.CAR T细胞用于其他疾病的治疗 将T细胞激活重定向的CAR不仅限于靶向癌细胞，还可以用于靶向任何由目标抗原定义的细胞。通过抗Dsg3 CAR靶向记忆B细胞的CAR T细胞被设计用来消除导致天疱疮病理的细胞。通过识别MHC呈递的自身抗原的CAR T细胞靶向自反应性T细胞。CAR被工程化以靶向病毒感染的细胞，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒和HIV感染的细胞。源自Dectin-1的CAR T细胞被用于破坏真菌Aspergillus的发芽。实验模型暗示，CAR重定向的Treg细胞可用于促进自身免疫疾病如结肠炎、过敏性哮喘和移植物抗宿主病的免疫耐受治疗，通过靶向HLA。最近，通过识别心脏成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CAR T细胞靶向心脏纤维化，该蛋白在心肌损伤重塑时由心脏成纤维细胞高度表达。采用FAP特异性CAR的T细胞过继转移减少了心脏纤维化并恢复了小鼠的损伤后功能。该报告暗示CAR T细胞作为“活药”，在治疗目前疗法非常有限的心脏病中消除激活的心脏成纤维细胞。CAR T细胞用于治疗非恶性疾病其他应用的临床前开发正在进行中。 要点 采用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞的过继细胞治疗在某些血液学恶性肿瘤中取得了显著的治疗效果；然而，在其他疾病中的治疗效力仍然有限。 CAR是由结合域、跨膜域和细胞内信号传导域组成的模块化、重组的跨膜分子，用以激活工程化细胞。最佳分子设计需要通过变化组成域在每种情况下探索。 原型CAR设计可以通过使用各种靶向和信号传导元件进行修改，使CAR更加通用。此外，各种免疫细胞可以通过CAR重定向，提供方便的治疗细胞。 CAR T细胞治疗经常与毒性相关，这些毒性可以通过同时进行的治疗、改变CAR设计和靶向替代抗原来减少靶上非肿瘤毒性来减轻。 通过共同激活广泛的免疫反应、共同靶向肿瘤基质、癌症干细胞和其他与肿瘤相关的结构，可以提高CAR工程化免疫细胞的抗肿瘤效力。 生产CAR T细胞产品仍然具有挑战性，为所有患者提供个性化治疗；正在努力为广泛的患者群体制造异体细胞产品“现成”。 下章预告：抗体关键特性的改进 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 第八章：抗体偶联药物 第九章：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：通常，抗体-药物偶联物（ADCs）由人源化抗体和小分子药物通过化学连接物连接而成。ADCs将细胞毒性药物递送到特定部位并减少副作用的能力，在肿瘤学领域显示出了有希望的结果。迄今为止，已有十四种ADCs获得美国食品药品监督管理局的批准，大约297种ADCs处于肿瘤学领域的临床前/临床阶段。受到这些成果的启发，一些科学家探索了抗体-药物偶联物在非肿瘤学疾病中的潜力，例如关节炎、重症肌无力、免疫性疾病和肾衰竭。然而，关于抗体-药物偶联物在非肿瘤学应用方面的数据有限。本综述着重于抗体-药物偶联物在非肿瘤学应用，包括它们的发展研究、测试程序、体外评估和临床前测试。此外，还提供了ADCs在非肿瘤学应用中的限制、困难和前景的总结。 1.引言 抗体-药物偶联物（ADCs）通常用于治疗癌症，由单克隆抗体（mAb）通过合适的连接物与细胞毒性剂相连。它们结合了单克隆抗体和小分子的最佳特性，为靶标部位创造了一个高度选择性和有效性的部分。被称为“制导导弹”的ADCs有三个基本组成部分：一种优先结合目标组织抗原表面的mAb，一个活性治疗分子，以及一个连接物（可裂解或不可裂解）。ADCs最常见的载体是单克隆抗体，它们具有强烈的结合力和目标选择性。活性部分可能是癌症情况下的细胞毒性剂，或者是非肿瘤学应用中的其他小分子，如图1所示。ADCs的显著优势是减少了非靶标毒性效应，这使它们在肿瘤学中用于将细胞毒性有效载荷递送到特定部位变得方便。 图1.ADC的结构和作用机制 ADCs在肿瘤学的应用始于Mylotarg®（Gemtuzumab ozogamicin）获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于CD33+急性髓系白血病。辉瑞公司在2010年应美国FDA的请求，基于一项揭示安全问题且对患者没有临床优势的临床试验，将Mylotarg®从美国市场撤回。然而，日本药品和医疗器械管理局（PMDA）决定安全概况没有重大变化，并且该产品可以在日本销售。后来，在2017年，FDA重新批准了Mylotarg®用于不同的人群，并修改了剂量方案（之前一次剂量9 mg/m2改为三次剂量3 mg/m2），降低了最大血浆浓度并提高了安全性。Adcetris®（brentuximab vedotin），由CD30特异性mAb与单甲基奥瑞司他丁E（MMAE）偶联而成，是继2011年获得美国FDA批准后进入肿瘤学市场的第二种ADC。在美国、欧洲和日本，它被授权用于霍奇金淋巴瘤（HL）和系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）。Adcetris®通过MMAE与微管蛋白结合，破坏细胞的微管网络，导致细胞周期停滞和凋亡细胞死亡。Kadcyla®（ado-trastuzumab emtansine），是首个获准用于治疗实体瘤的ADC，由Genentech/Roche在2013年开发。它由抗HER2 IgG1抗体曲妥珠单抗，通过不可裂解的硫醚连接物连接到抗有丝分裂剂DM1（美登素衍生物）。它通过破坏微管网络导致细胞周期停滞和凋亡细胞死亡。它被批准作为辅助疗法（手术后）用于先前接受过曲妥珠单抗（赫赛汀®）和紫杉醇治疗的HER2+早期乳腺癌患者，无论是单独使用还是联合使用。这一批准标志着ADC研究的转折点，因为用这种疗法治疗实体瘤一直是一项艰巨的任务。这些ADCs因其成功故事在肿瘤学领域获得了更多关注。目前，已有十四种ADCs在全球范围内获得批准用于实体瘤和血液恶性肿瘤，还有更多的ADCs已经通过了不同的临床发展阶段。当在clinicaltrials.gov上搜索“antibody-drug conjugate”一词时（截至2023年6月19日），发现了235项临床试验研究。当时大约有122项研究正在进行并招募中，65项已完成，7项因各种原因撤回，28项已终止。它们绝大多数与癌症有关，有效载荷为损伤DNA或微管的化学物质。尽管ADCs在肿瘤学中显示出了卓越的潜力，但其在癌症以外的应用一直很少，但近年来一直在增长。Everts等人使用E-selectin导向的免疫偶联物将地塞米松递送到活化的内皮细胞，标志着ADCs在非肿瘤学应用的开始。从那时起，有一些尝试探索ADCs在各种非肿瘤学疾病中的效用，包括炎症性疾病（关节炎、动脉粥样硬化、肌肉疾病、重症肌无力、系统性硬化症和溃疡性结肠炎）、细菌感染、心血管疾病和肾衰竭。这些研究的大多数在体外细胞系或动物中检验了ADCs的潜力。表1提供了不同ADCs在临床前和临床阶段的概述，重点关注非肿瘤学领域。 抗体-药物偶联物的作用机制：下面讨论了ADCs进入体内后的基本作用机制。 循环：通过静脉注射途径给药的抗体-药物溶液进入血液。 结合：ADC的mAb部分与目标抗原结合。 内化：通过受体介导的内吞作用ADC发生内化。 循环：ADC的早期内体部分与FcRn受体结合。 释放：溶酶体与晚期内体融合并释放活性部分。 作用：细胞毒性药物与DNA/细胞微组装相互作用并诱导 细胞凋亡在癌症或其他情况下显示其报告的活性，如图1所示。 2.超越癌症治疗的ADCs 在非肿瘤学应用中，ADCs的显著增加，其中有效载荷可以改变特定的生物过程而不是直接杀死细胞。例如，作为有效载荷的抗生素可用于治疗细菌感染，而糖皮质激素可用于抑制免疫系统。 2.1.抗炎 炎症是身体的保护机制，其特征是触发免疫和非免疫细胞，保护宿主免受各种感染并促进组织修复和愈合。然而，由于身体条件的改变，慢性炎症会导致许多疾病，如高血压、心血管疾病、代谢疾病、关节炎、牛皮癣和癌症。糖皮质激素是市场上可用的许多抗炎剂之一，用于治疗哮喘、自身免疫性疾病、关节炎和炎症性肠病等炎症性疾病。 然而，由于它们的非靶标暴露，激素的长期使用会导致严重的副作用。一些研究人员评估了ADCs将这些皮质类固醇以最小的副作用传递的潜力。尽管当前讨论的主要焦点是糖皮质激素的位点特异性传递，但也讨论了像姜黄素这样的天然生物活性物质的传递。 2.1.1.抗E选择素地塞米松偶联物 Everts等人评估了ADCs利用E选择素导向的免疫偶联物将地塞米松（Dex）细胞内传递到活化的内皮细胞的能力。E选择素（CD62E）在内皮细胞中表达，并且通过转录调控被各种促炎化学物质上调，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1（IL-1）和LPS（脂多糖）。因此，选择了一种可以特异性结合过度表达的E选择素的抗E选择素抗体（Eab）（H18/7）。Dex通过琥珀酸连接物共价连接到抗体（H18/7）。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PGE）和高效液相色谱（HPLC）分别进行偶联的定性和定量分析。通过西方印迹分析的SDS-PGE分析确认了Dex与Eab的偶联，偶联效率为56%，DAR为2.3（每个抗体2.3个Dex分子）。此外，他们还发现增加Dex浓度会降低偶联物的溶解度和靶向E选择素的能力。使用表面等离子共振结合技术获得的感光图表明Dex-Eab偶联物与E选择素的结合。通过免疫组织化学和流式细胞术在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中评估了Dex ADCs的内皮细胞结合分析。mAb和偶联Dex的免疫组织化学分析显示了偶联物对rhTNF刺激的HUVEC的准确结合。偶联Dex结合到活化的内皮细胞而不是静止的内皮细胞，这一点通过流式细胞术得到确认。偶联和未偶联的抗体同样选择性地结合到活化的HUVEC。结合后，Dex应该从ADCs中释放出来以产生所需的药理作用。使用HUVEC刺激rhTNF-alpha的共焦激光扫描（CLMS）用于确定Dex抗体偶联物的内化和结合。基于染色模式，内皮细胞对偶联和未偶联抗体的内化被识别出来。在最初的10-20分钟内在表面上可见染色，随后在一小时内细胞内强度增加，表明最初在表面上的结合和偶联物的后期内化。在孵育18-24小时后细胞内强度的下降表明偶联物的分解，并通过对免疫透射电子显微镜分析得到确认。通过将Dex浓度与荧光素酶报告基因的增加相关联来研究偶联物中Dex的释放。结果证实，与未偶联的Dex相比，Dex-Eab偶联物以较慢的速率向细胞释放药物。最后，通过西方印迹分析评估释放的Dex对促炎IL-8 mRNA水平的影响。IL-8表达水平的降低证实了从偶联物中释放的Dex是活性的，并显示了预期的药理活性。基于所获得的结果，作者得出结论，合成的偶联物有潜力将Dex特异性地传递到活化的内皮细胞中。然而，必须进行进一步的体内研究以确认这一点。 2.1.2.抗CD163地塞米松偶联物 糖皮质激素通过抑制巨噬细胞释放促炎和组织坏死因子来发挥抗炎作用。然而，这些药物的使用受到严重的副作用的限制，如肌肉质量减少、骨动员、免疫抑制和代谢改变，这是由于糖皮质激素的非特异性定位。许多炎症性疾病，如动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和炎症性肠病，其特征是活化的巨噬细胞上血红蛋白清道夫受体CD163的升高。Graversen等人展示了针对炎症的糖皮质激素靶向传递的ADC的生产和表征。通过将地塞米松（Dex）与小鼠抗大鼠CD163 mAb偶联，合成了ADC。使用脂多糖诱导的炎症在体外和体内测试了抗炎潜力。抗CD163 mAb-Dex偶联物是第一个用于炎症性疾病的非肿瘤学抗体-药物偶联物。 抗CD163和Dex-半琥珀酸-NHS酯之间的反应导致形成抗CD163-Dex偶联物。最终配方由每个抗体四个Dex分子组成，自由Dex不到百分之一。结构完整性、反应性和特异性是抗体在偶联后应保留的主要特征，以保持其潜力。凝胶电泳和尺寸排除色谱通过注意没有任何聚集来确认完整性。使用表达大鼠重组CD163的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞通过西方印迹和流式细胞术分析，确认了偶联后抗体的反应性和特异性。使用125I标记的抗CD163显示，只有转染的细胞可以摄取ADCs，与未转染的细胞相比，这是一个特异性的指示。在CHO中2小时后自由125I的增加表明药物从偶联物中释放出来。这通过在共焦显微镜下观察CHO细胞中抗体和地塞米松在两小时后的局部共定位进一步得到证实。通过测量大鼠巨噬细胞在孵育抗CD163地塞米松、自由Dex、IgG-Dex（对照偶联物）、抗CD163和缓冲液15分钟后的LPS介导的TNF-alpha形成，评估了抗炎效果。除了抗CD163和载体对照外，所有其他三种偶联物通过抑制LPS介导的大鼠巨噬细胞刺激减少了TNF-α的产生。发现抗CD163 Dex在最初的15分钟内比自由Dex更有效，而在1小时后没有观察到差异。这可以通过自由Dex的缓慢被动扩散与偶联物的内吞作用来解释。在LPS注射的大鼠中评估了开发的ADC的体内抗炎活性。在诱导炎症后，将抗CD163 Dex（ADC）和自由Dex注射到大鼠体内，并测量血清TNF-α水平以评估抗炎活性。与Dex相比，抗CD163-Dex显示出优越的疗效。未偶联的抗CD163与抗CD163-Dex在确切剂量下显示出相同的消除半衰期。与接受自由Dex的大鼠相比，接受ADC的大鼠的胸腺、脾脏和总体重没有显著减少，这证实了ADCs中偶联药物的位点特异性传递。 2.1.3.抗-DR5抗体-姜黄素偶联物 肝脏纤维化的特征是严重的肝损伤和细胞外基质蛋白的积累。受损肝组织的再生与炎症相关的细胞损伤有关。肝纤维化主要由活化的肝星状细胞（HSCs）引起，它们提高了死亡受体5（DR5）的表达。促炎介质激活HSCs，促使巨噬细胞向促纤维化表型转变。这触发活化的HSCs转分化，从而增加胶原蛋白沉积。姜黄素是一种天然的酚类抗氧化化合物，具有抗炎和抗纤维化的潜力，因为它能够使HSCs失活。You等人开发了含有姜黄素的抗-DR5抗体偶联物，用于治疗肝纤维化并增强HSCs的清除。姜黄素ADC是通过四步反应合成的，其中在前三步中对姜黄素进行了修改，以包含丙烯酸己酯。在最后一步中，姜黄素的丙烯酰亚胺基团与抗-DR5抗体的硫醇基团偶联。制备后，每种化合物都通过1H-NMR质谱进行了表征。通过Nano-drop分光光度计测量，ADC中姜黄素与抗体的比例为3:1。Coomassie蓝蛋白分析证实了合成偶联物的稳定性，因为在磷酸盐缓冲液中孵育48小时后偶联物的重量没有显著变化。在共聚焦显微镜下，Flamma® 675标记的裸抗体和抗体-姜黄素偶联物摄取的比较分析显示，偶联物和裸抗体的摄取没有显著差异，表明偶联没有改变抗体的结合特性。在存在自由抗-DR5抗体的情况下，与没有抗体的活化LX-2细胞相比，活化的LX-2细胞中偶联物摄取减少。此外，与HepG2和RAW264.7细胞相比，LX-2活化细胞中的偶联物摄取显著更高。这表明摄取是由于活化HSCs中DR5的过度表达。MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基四氮唑溴化物）测定结果表明，裸抗体及其姜黄素偶联物对活化的LX-2细胞有毒，但对HepG2和未活化的LX-2细胞没有毒性。这证实了抗体-姜黄素偶联物仅在活化的HSCs中诱导凋亡。通过测定活化LX-2细胞中的活性氧（ROS）水平和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达，分别确定了抗体-姜黄素偶联物的抗氧化和抗炎活性。ROS和iNOS由活化的HSCs产生。特别是转化生长因子β（TGF-β1），刺激LX-2细胞，增加其细胞内的ROS水平。与纯姜黄素相比，抗体-姜黄素偶联物显著降低了LX-2细胞中的ROS水平，这在共聚焦显微镜下观察到，表明其具有更高的抗氧化效果。iNOS水平的类似结果也证实了合成的抗体-姜黄素偶联物在活化的HSCs中的有效性，与新生的HSCs相比。通过免疫细胞化学分析和流式细胞术测量活化LX-2细胞中的α-SMA水平，评估了抗体-姜黄素偶联物的抗纤维化潜力。结果得出结论，与纯姜黄素和裸抗体相比，抗体-姜黄素偶联物显著增强了抗纤维化效果，证实了合成偶联物中抗体和姜黄素组合的协同活性。在小鼠中评估了来自抗体偶联物的姜黄素的生物分布和药理活性。在向正常和肝纤维化诱导的动物注射Flamma® 675标记的抗体-姜黄素偶联物后，发现偶联物在纤维化肝脏中的分布高于正常肝脏，证实了体外观察到的靶向性。 2.2.抗体介导的siRNA偶联物 基于小干扰RNA（siRNA）的治疗因其效力而受到研究者的极大兴趣。然而，由于非靶标暴露导致的不良反应等问题限制了它们的应用。非共价杂交或将siRNA直接与抗体或其片段（Fab，scFv）的寡核苷酸偶联产生了抗体-siRNA偶联物（ARCs）。抗体-siRNA偶联物（ARCs）在体外和体内均显示出特异性地进入组织、病毒感染的细胞或癌细胞。细胞表面受体结合携带Fab和siRNA的ARCs，然后通过内吞体被细胞摄取（图2），siRNA被释放并逃逸到细胞质中。siRNA被加载到RISC（RNA诱导的沉默复合体）后，特定的mRNA被降解。当核酸被用作有效载荷时，就利用了这个概念。 图2. 与小干扰RNA（siRNA）偶联的抗体的作用机制。 由于ADCs具有位点特异性递送的特性，研究人员被吸引将抗体与siRNA结合，以实现有效的治疗潜力。在他们最近的文章中，Cao W等人讨论了将siRNA与抗体偶联的不同方法。他们解释了不同的偶联机制和用于将siRNA与抗体偶联的各种连接物。作者还提到了一些ADCs及其在多种疾病中的应用。其中一些在下面进行了讨论。 2.2.1.重症肌无力（MG） 重症肌无力（MG）是一种罕见的自身免疫性疾病，由于自身抗体破坏神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体（AChR），导致肌肉无力。在所有MG患者中，约有90%的人血液中会有抗AChR自身抗体。治疗MG的最常见方法是使用类固醇免疫抑制疗法和血浆置换。这些治疗有许多副作用，如降低免疫系统功能、引起感染和提高血压。因此，迫切需要新的更好的MG治疗方法。自身免疫病MG依赖于T细胞，并由B细胞介导。研究发现，介导MG自身免疫表现的受体位于B细胞中。 成熟B细胞的存活由核因子κB（NF-kB）介导的细胞信号维持，该信号由B细胞激活因子（BAFF）受体引起，主要表达在成熟B细胞中。除了B细胞的维持外，通过沉默仅在活化的B细胞中存在的特定基因表达，可以中断MG的发病机制。双特异性的，即针对特定受体和基因沉默，可能是MG的极好的治疗选择。Ibtehaj等人尝试使用抗原-抗体复合物来解决MG的主要问题。他们在重症肌无力（EAMG）小鼠模型中研究了BAFF受体特异性mAb与短干扰RNA偶联的治疗效应。首先，他们使用二甲基甲酰胺在偶联缓冲液中将鱼精蛋白连接物与抗体结合进行偶联。然后，通过静电反应将带有连接物的抗体与双链siRNA（约19个核苷酸）(1:1)偶联。使用电泳来确认偶联物的产生效果和偶联物的稳定性。 在BAFF受体特异性偶联后，作者通过转染Cy-3标记的非特异性siRNA至大鼠骨髓瘤Y3细胞系中，测试了偶联物进入细胞的内化能力。根据研究结果，大约80%的Y3细胞和70%的B细胞呈现红色荧光。在大鼠骨髓瘤Y3 B细胞和C57BL/6 EAMG小鼠模型中评估了偶联物降低成熟B细胞中BAFF受体表达的效果。带有BAFF受体特异性偶联物或siRNA-、IgG-、或IgG–siRNA对照的Y3细胞孵育了48小时。流式细胞术数据显示，与其他对照组相比，偶联物降低了大约50%的BAFF受体表达。在体外确认后，他们进一步评估了偶联物的体内抑制效果。对于体内效果，偶联物以三种剂量经腹腔注射（i.p.）给EAMG小鼠一次。使用的剂量如下：高剂量，每个mAb和siRNA 350微克；低剂量A，每个mAb和siRNA 125微克；低剂量B，每个偶联物组分50微克。与未经处理或牛IgG对照的外周血单核细胞（PBMCs）相比，偶联物在较高剂量或低剂量A下减少了更多的成熟B细胞（CD268+CD19+）。为了更好地了解BAFF受体偶联物如何影响脾脏和淋巴结中B细胞表型和存活，作者检查了这些细胞中Fas（CD95）的表达量。这种蛋白仅在细胞死亡被触发后才在生发中心B细胞中表达。令人惊讶的是，他们发现在仅给予高剂量偶联物的EAMG小鼠的淋巴结中有很多表达Fas的CD19+和B220+细胞，而不是脾脏中。 经BAFF受体偶联物处理的小鼠握力通过数字方式（使用测力计）在三、四、七和九周时测量。值得注意的是，与其他治疗/对照组的小鼠相比，这些小鼠的肌肉更为强壮。研究结果表明，BAFF受体偶联物是增强EAMG小鼠肌肉力量的极好方法。此外，他们还检查了小鼠淋巴细胞和PBMC细胞中I型干扰素γ（IFN）和血清细胞因子水平的表达。他们注意到高剂量偶联物组显示出高水平的IFN。 研究表明，BAFF受体特异性mAb–siRNA偶联物可以通过Fas依赖性和非依赖性机制在MG中诱导凋亡信号。剂量和配方方法的进一步改进可能有助于实现更好的结果。 2.2.2.肌肉疾病中的抗体–siRNA偶联物 针对骨骼和心肌的抗体–siRNA偶联物是治疗肌肉疾病的新方法。Sugo等人证明了通过次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）抗CD71 Fab偶联siRNA在肌肉器官中沉默效应的潜力。抗体和siRNA通过迈克尔反应通过马来酰亚胺连接物共价连接，HPLC和UV吸收光谱分析证实了偶联。进行了免疫吸附剂结合实验，以评估使用重组小鼠CD71蛋白的抗CD71 siHPRT的特异性和结合活性。研究表明，在纳摩尔浓度下，浓度依赖性结合CD71蛋白。与IgG–Fab偶联siHPRT相比，抗CD71 siHPRT与马来酰亚胺连接物连接在体外实验中显示出三倍的沉默效率，使用的是原代肝细胞。给予小鼠抗CD71 siHRPT（10 mg/kg）静脉剂量，观察到在24小时后给药显著沉默心脏和小腿肌肉中的HPRT。这种沉默随时间逐渐增加，注射后三天观察到最大活性。IgG siHPRT后缺乏沉默表明这种效应特定于CD71。 此外，为了研究给药途径对偶联物沉默能力的影响，通过皮下和腹腔途径给予抗CD71 siHPRT，并将沉默效率与静脉给药进行比较。根据结果，作者建议偶联物可以从任何给药部位到达目标。在这些实验成功之后，作者进一步探索了抗CD71–Fab偶联到肌肉抑素（抗CD71-siMSTN）在周围动脉疾病小鼠模型中的效率。结果还表明肌肉抑素mRNA的沉默。基于结果，作者得出结论，使用ADCs可能作为siRNA的传递平台，以获得更好的效果和活性。 2.3.抗生素-抗体偶联物 抗生素通常被视为现代医学的标志。几十年来，它们帮助防止了传染病的流行，并允许安全地进行侵入性手术。多重耐药的出现，加上新抗生素的发现和开发减少，导致了全球性危机，可能会产生灾难性的后果。ADCs在治疗癌症和自身免疫性疾病等具有挑战性的疾病方面的应用非常成功。一些研究人员尝试了类似的概念，并开发了抗生素-抗体偶联物（AACs），将抗体和抗生素的好处结合成一种混合结构，以解决与抗生素耐药性相关的限制。对所有β-内酰胺抗生素都具有耐药性的MRSA（甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌）在过去几十年中出现并迅速扩散，使S. aureus感染更具挑战性。Lehar等人证明，细胞内MRSA很难用标准抗生素（包括万古霉素、利奈唑胺和达普霉素）清除，这些抗生素用于对抗侵袭性MRSA感染。S. aureus可以侵入吞噬细胞，也可以侵入非吞噬细胞，这种细胞内S. aureus是许多疾病的罪魁祸首。清除细胞内MRSA对于提高临床成功率是必要的。 Lehar等人开发了一种在哺乳动物细胞中精确触发的抗生素-抗体偶联物（AAC），这些细胞被S. aureus保留。这种AAC由一种抗S. aureus抗体（THIOMAB）组成，该抗体通过一个可被组织蛋白酶裂解的连接物与一种最有效的抗生素共价连接，该连接物具有新的季铵盐。制备的AAC在与S. aureus浮游菌结合时没有任何抗菌效果，并且由于更大的抗体大小，不会进入哺乳动物细胞。然而，在宿主细胞消耗AAC-包被的细菌后，可裂解的连接物分离并释放抗生素。根据抗体的选择性，尽可能多的AAC将附着在细菌上，以在所需的作用部位提供足够的抗生素浓度。作者报告说，在筛选了来自S. aureus感染康复患者B细胞的约40种S. aureus抗体后，与壁-四肽聚糖（WTAs）的结合更高。由S. aureus产生的WTA由磷酸核糖醇的重复单元组成，可以通过糖转化由TarM或TarS糖基转移酶介导转化为α或β-O-连接的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）。利福霉素衍生物被用作抗生素，通过叔胺与抗体偶联。使用相同的抗体（抗β-WTA单克隆抗体）偶联染料的荧光共振能量转移（FRET）基础探针用于识别连接物的裂解。进一步的质谱分析也证实了与通过替换P1位置的氨基酸获得的不可裂解连接物相比，连接物与可裂解连接物的分离。 AAC有效地包被了MRSA，而用非可裂解β-WTA抗体-抗生素偶联物或单独mAb包被的相同细菌存活了下来。此外，与未偶联的利福平相比，AAC阻止细胞内靶向后细菌细胞间转移的效果提高了10倍。结果表明，与未偶联的抗生素相比，AAC显著降低了细菌的活性。 用细胞内MRSA感染的小鼠评估了AAC体内的效果。感染的小鼠被给予磷酸盐缓冲液、单独的万古霉素或一剂AAC。对万古霉素治疗有耐药性的细菌可以成功地用单一剂量的AAC根除，表明AAC可以消除从万古霉素逃逸的细菌。作者还发现，与未偶联的抗生素相比，AAC治疗更有效，抗生素从AAC中的释放对效果至关重要。这一结果表明了抗体-药物偶联物在肿瘤学之外使用的可能性。 Peck等人在I期单剂量递增研究中评估了AAC的安全性、耐受性、药代动力学和免疫原性。研究中使用的AAC（DSTA4637S）由一种新型抗生素4-二甲氨基哌啶基-羟基苯并噁嗪利福平（dmDNA31）和一个人免疫球蛋白G1（IgG1）抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体通过蛋白酶可裂解的缬氨酸-瓜氨酸（VC）连接物链接而成。平均药物-抗体比（DAR）为2。所选单克隆抗体对细菌壁有选择性结合，且在人体组织中没有靶向抗原，使AAC使用安全。在筛选了104名健康志愿者后，共招募了30名受试者。受试者的平均年龄为41.9岁，男女比例为（63.3%：33.3%）。受试者分别接受四个剂量（5、15、50、100和150 mg/kg，每组n=4）的AAC治疗和安慰剂（n=10）。除了治疗中出现的不良事件（TEAEs），研究期间没有发生死亡、不良事件或严重副作用。安慰剂组和AAC治疗组均出现了TEAEs，在AAC组中高百分位数（85%）。在AAC治疗组中，还有较高剂量组如100 mg/kg（16次TEAEs）和150 mg/kg（8次TEAEs）。所有TEAEs均可逆且可耐受。没有因TEAEs而报告的退出。AACs、纯抗体和未偶联抗生素之间的药代动力学特性比较显示，AACs具有更高的Cmax、更低的蛋白结合率和更好的药代动力学特性。作者得出结论，AAC有望成为针对金黄色葡萄球菌感染的新型递送系统，具有更好的耐受性、安全性和药代动力学特性。 Kajihara等人证明了抗体-抗生素偶联物能够递送具有不良药代动力学或毒性特性的抗生素。治疗传染病的一个困难是细菌的多重耐药性（MDR），这增加了死亡率。铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性菌，可导致一些肺部和血液相关的感染。对这些细菌的耐药性增加导致死亡率上升，并构成了一个严重的问题。最近，世界卫生组织将MDR铜绿假单胞菌感染指定为“严重威胁”病原体。作者在初步分析后选择mAb 26F8作为对铜绿假单胞菌具有更高特异性和结合力的单克隆抗体。后来，通过将抗生素（G2637）与修饰有六个未配对半胱氨酸的单克隆抗体偶联，生成了AAC。在溶酶体组织蛋白酶存在下，连接物环丁烷-1,1-二羧酰胺瓜氨酸分解以释放附着的抗生素。LC-MS/MS分析显示生成的AAC的DAR为6。在存在和不存在组织蛋白酶B的情况下，将AAC与铜绿假单胞菌孵育后，分析连接物的裂解和抗生素的释放。存在组织蛋白酶B的样本比缺乏组织蛋白酶B的样本抑制水平更高，表明抗生素释放是AAC发挥作用的先决条件。这一点通过将与铜绿假单胞菌PA14 WT孵育的AAC添加到RAW264.7巨噬细胞中后，量化游离抗生素进一步得到证实。在这里，含有可裂解连接物的AAC在巨噬细胞中显示出比含有不可裂解连接物的AAC更高的细胞内抗生素浓度。使用AAC表明，所需的抗生素浓度将比游离抗生素少两倍，表明AAC的效率。作者得出结论，使用AAC可以允许更大的细胞内抗生素浓度，从而与使用游离药物相比，具有更大的抗生素效力。 2.4.肾小球肾炎 当前治疗必须提高特异性并减少系统毒性，以减缓肾脏疾病的进展。Kvirkvelia等人假设一种针对3(IV)胶原的肾小球定位非胶原1域（NC1）的人单克隆抗体（F1.1）可能扮演精确药物递送载体的角色。由于在肾小球疾病期间其暴露增加，而在其他器官中表达较低，3(IV)NC1是递送疾病修饰药物的完美靶标。通过EDC（1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]羰二亚胺盐酸盐）零长度交联剂在Dex或PGE2的羧基和mAb的胺基之间形成的酰胺键，将纯化的人单克隆抗体与PGE2或Dex连接。由于它们在肾毒性肾炎中的活性和各自的抗炎特性，选择了PGE2和Dex。使用PGE2 ELISA试剂盒，他们确定了与抗体结合的PGE2量。通过流式细胞术测量它们与足细胞结合的能力来评估偶联物的功能。低结合的观察结果证实了偶联物在其他细胞系（如小鼠系膜细胞和肝细胞AML-12细胞）中的抗原特异性。它抑制了重组3(IV)引起的足细胞结合。为了确定制备的ADCs在肾炎诱导动物中的特异性和有效性，进行了动物研究。通过腹腔途径注射13.5微升/克体重来诱导肾炎。在第2天之后，将PEG2–F1.1、Dex–F1.1和人IgG–Dex以10 µg/g的等效剂量给予患病动物。通过定期测量尿液中的蛋白质和血尿素氮来确定疗效。经过7天治疗后，切除肾脏并通过光学显微镜或直接免疫荧光检查。在接受偶联物的小鼠的肾小球内发现了强烈和精确的荧光染色，使偶联物能够在患病小鼠的肾小球内被轻松识别。确认F1.1偶联物主要定位在肾脏，因为人IgG反应带仅在肾脏裂解物中观察到，而不是在心脏和肺部等其他器官的裂解物中。与未接受偶联物的NTN小鼠相比，治疗后疾病进展显著减少，血尿素水平（BUN）和组织学正常化。这些结果表明，将PGE2（逆转现有肾炎）和类固醇（Dex）（减少局部和全身炎症）结合起来，可能在与人类3(IV) mAb结合时以相当低的剂量改善现有肾炎的恢复。抗肾小球基底膜抗体针对相关表位，因为其表达限于肾脏、其他几个器官和肾小球以外的区域。 2.5. 类风湿性关节炎（RA） 滑膜炎症和骨退化是类风湿性关节炎的特征，这是一种严重的慢性炎症性疾病。关节液和血液中过量的促炎细胞因子带来RA中的自身免疫和组织损伤。类风湿性关节炎的病理生理学非常复杂，其具体机制尚未完全了解。然而，IL-6信号是炎症和RA症状的主要原因。巨噬细胞、破骨细胞、B细胞和T细胞等细胞具有IL-6并对IL-6信号作出反应，有助于RA中的免疫反应。在RA治疗中使用的细胞毒性药物的有效性受到非特异性靶向相关副作用的限制。因此，需要一种配方策略在目标部位具体发挥作用。在众所周知的靶向药物递送策略中，ADCs因其能够将偶联药物输送到特定细胞且几乎没有不良药物反应而最近受到广泛关注。 Lee等人研究了tocilizumab-阿仑膦酸盐(TCZ-ALD)偶联物在体外和体内模型中对RA的疗效。TCZ是一种人源化单克隆抗体，而小分子阿仑膦酸盐(ALD)分别通过阻断IL-6受体和巨噬细胞显示出抗炎活性。ALD通过可裂解的二硫键连接到TCZ的Fc部分，在不影响其抗原潜力的情况下，通过化学连接物连接。通过Purpald分析和质谱法确认了偶联。使用单独的TCZ和偶联物中的TCZ进行的ELISA分析显示，TCZ的结合能力没有显著差异，证实了TCZ偶联后抗原结合位点没有变化。在巨噬细胞RAW 264.7细胞上的活性分析显示，与生理盐水、IgG-ALD和TCZ组相比，接受ALD处理的细胞活性降低。TCZ+ALD混合物和TCZ-ALD偶联处理组的细胞活性没有显著差异，证实了ALD偶联后活性没有改变。 体外研究后，使用胶原蛋白诱导的关节炎DBA/1j小鼠在体内评估了偶联物的活性。在用佐剂免疫4周后，将ALD(0.2 µg/kg)、单独的TCZ(0.8 mg/kg)和ALD-TCZ偶联物分别注入关节炎诱导的踝关节。然后，使用微型CT、组织学和西方印迹分析观察动物8周的RA严重程度和骨退化。微型CT显示，除了接受TCZ-ALD偶联物治疗的组外，所有动物组都有显著的骨退化，尽管它是在低剂量下给予的。这可能是由于TCZ和ALD对破骨细胞骨吸收的协同效应以及由于与TCZ偶联而使ALD在细胞内传递。 组织学检查表明，接受ALD单独治疗的动物存在炎症和软骨破坏。这在接受TCZ治疗的动物中显著减少，而接受TCZ-ALD偶联物治疗的动物显示出清洁的软骨-骨接触，没有炎症细胞浸润，几乎与标准对照组一样。通过与其他组相比，IL-6和CD68水平的显著降低进一步证实了TCZ-ALD偶联物的有效性。作者得出结论，将ALD与特异性结合IL-6受体的TCZ偶联，延长了ALD在关节中的停留时间，并显示出增强的疗效。这种偶联物的成功可能为开发更多自身免疫性疾病治疗中的偶联物铺平了道路。 2.6.免疫抑制 Dasatinib临床上用于治疗BCR-ABL依赖的慢性髓性白血病。由于抑制Src家族激酶如Lck和Fyn，它也可能具有潜在的免疫抑制活性。然而，由于缺乏选择性，dasatinib具有严重的副作用，限制了其作为免疫抑制剂的临床应用。Wang等人开发了一种抗体-药物偶联物，用于将dasatinib特异性递送到T淋巴细胞以实现有效的免疫抑制。作者首先合成了一种特异性针对T细胞的抗体，然后在下一步将抗体与dasatinib偶联。最后，在体外评估了抗体-dasatinib偶联物的免疫抑制活性。在几种能够结合T细胞的抗体上进行了初步筛选，基于其高表达、更好的内化和更少的副作用，选择了CD184(CXCR4)。将CXCR4拮抗剂与牛抗体(BLV1H12)骨架结合，并进一步嫁接到曲妥珠单抗的CDR3H中，以产生更少的免疫原性人源化抗体(HLCX)。使用HEK 293F细胞表达HLCX。进一步使用蛋白G色谱纯化抗体，并通过电喷雾电离质谱法确认其质量。 流式细胞术分析中的峰移证实了HLCX与CXCR4的结合。将抗体与高表达CXCR4的细胞系(JurkatT细胞)和缺乏CXCR4的细胞系(MDA-MB435细胞)孵育。与Jurkat细胞孵育的样品清楚地显示了峰移(96.2%)，由于结合，而与MDA-MB435细胞孵育的样品由于缺乏结合，没有显示出任何显著的峰移。通过分析与不同CXCR4表达水平的不同细胞系孵育的样品，进一步证实了这一点。通过共聚焦显微镜确认了HLCX进入T细胞的内化能力。将Alexa Fluor 488(AF488)染料与HLCX偶联，以及未偶联的抗体，并与人类T淋巴细胞孵育。在37°C混合后30分钟内，在T细胞的细胞质中观察到绿色斑点，表明HLCX-AF488内化。这在4°C和未偶联的HLCX中没有观察到，证实了HLCX的位点特异性递送。在修饰dasatinib和抗体后，通过两步偶联过程合成了两种ADCs，即不可裂解的(HLCX-dasatinib)和可裂解的连接物(HLCX-SS-dasatinib)，因为它们都没有直接相互作用的基团。合成的ADCs纯度超过90%，药物-抗体比为3，通过SDS相分析得到证实。分子量在预期范围内，表明合成ADCs的结构完整性。 两种ADCs与活化的T细胞孵育，以产生更多的CD25和促炎细胞因子，包括IL-2、TNF-alpha和干扰素(IFN gamma)。两种ADCs和未偶联的HLCX与用抗CD3或抗CD28抗体激活的人类T细胞孵育，并通过流式细胞术和ELISA分析促炎细胞因子水平。流式细胞术和ELISA分析显示，两种ADCs在低浓度(8 nM)下阻断了CD69和CD25的表达，并阻止了细胞因子的释放。相比之下，未偶联的HLCX抗体观察到的最小效果。HLCX-SS-dasatinib在抑制细胞因子方面比HLCX-dasatinib有效两倍。这可能是由于药物释放、内化或停留时间的差异。两种dasatinib和ADCs在高达200 nM的剂量下，与未处理的细胞相比，通过CellTiter Glo测量，没有显著降低活化T细胞的活性。这排除了细胞毒性的可能性。使用西方印迹法检查TCR诱导的T细胞激活期间下游激酶的磷酸化。研究表明，与未偶联的抗体和曲妥珠单抗-SS-dasatinib相比，两种ADCs和dasatinib阻断了Lck信号。这清楚地表明，T细胞抑制取决于抗体和药物分子。基于结果，建议ADCs可能是提高激酶抑制剂在肿瘤学应用之外的活性的有价值的策略。 2.7.动脉粥样硬化 动脉粥样硬化是一种由胆固醇在动脉中沉积引起的疾病，约占美国死亡人数的35%。该过程涉及氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的发展，随后发生炎症反应和巨噬细胞的积累。巨噬细胞通过逆向胆固醇运输(RCT)将胆固醇转移到肝脏进行胆汁分泌，发挥其对动脉粥样硬化的保护作用。RCT由肝脏X受体(LXR-α和LXR-β)等触发。LXR激活通过抑制促炎细胞因子阻断巨噬细胞增殖和泡沫细胞形成。已经开发并测试了LXR激动剂(GW3965和T0901317)对动脉粥样硬化的活性。然而，这些衍生物也因LXR-α的过度表达而在肝脏中显示增加的甘油三酯。将LXR激动剂位点特异性递送到巨噬细胞可能减少这种风险并提高LXR激动剂的临床适用性。Lim等人描述了基于ADC的LXR激动剂递送到巨噬细胞。作者合成了一种类似于上述LXR激动剂的新化合物，该化合物在与带有氨基乙基磺胺替代的抗体偶联后可以保留其抗原特性。在筛选了带有二硫键、酸敏感的腙和蛋白酶可裂解的连接物的各种连接物后，发现蛋白酶可裂解的连接物是合适的。使用化学方法，他们合成了一种稳定的氨基氧-CatB-LXR激动剂，并使用液相色谱和质谱(LC-MS)确认了其在纯化的CatB酶存在下的可裂解潜力。作者选择CD11a作为在白细胞、单核细胞和巨噬细胞上表达但不在肝脏上表达的特定抗原。克隆人源化抗体Efalizumab并转染中国仓鼠卵巢(CHO)悬浮细胞后，获得了所需的抗体用于偶联，即抗-CD11a IgGX。这通过SDS-PAGE分析和电喷雾电离质谱法分别进行了纯化和质量分析。在进一步的实验中，还表达了两种抗体，即作为阴性对照的抗-Her2 IgGX和抗-Her2 FabX。 最后，连接到LXR激动剂的连接物通过共价键与抗CD11a IgGX偶联。在与人类THP-1单核细胞/巨噬细胞和人类HepG2肝细胞孵育后，将偶联物的结合与阴性对照进行了比较。进一步使用Fc阻断剂也用于确认结合是CD11a介导的。流式细胞术分析表明，抗CD11a IgGX-AF488与单核细胞和巨噬细胞结合，表现为流式细胞术分析中明显的峰移。它不与肝细胞结合，表现为峰移的缺失。同样，抗CD11a IgGX-AF488对单核细胞的结合在Fc阻断剂存在下存在，表明结合是CD11a介导的，而不是Fc控制的。阴性对照抗体偶联物在Fc阻断剂不存在时显示结合，阻断剂的存在并不确认它们与细胞的结合，因为它们是Fc依赖的。通过共聚焦显微镜观察，在孵育后，偶联物的内化通过在THP-1细胞的细胞质中识别偶联物(Alexa Fluor 488)-连接的染料来确定。 使用LXR转录激活分析来检查合成ADC的LXR激动活性，并与阳性对照和T0901317(LXR激动剂)和氨基氧-CatB-LXR激动剂进行比较。所有三种化合物都在10%人类AB血清的存在和不存在下与THP-1细胞和HEpG2细胞孵育，以阻断Fcγ受体。然后，用ONE-Glo处理细胞，并在Envision平板阅读器上记录发光。合成的偶联物(抗CD11a IgGX-AF488)在THP-1细胞中显示出强烈的激动作用，在HEPG2细胞中没有任何活性。阳性对照在两种细胞系中显示出等效的活性，氨基氧-CatB-LXR激动剂没有显示出激动活性。这表明抗CD11a IgGX-AF488对巨噬细胞具有特异性结合能力，效力高出三倍。 2.8.系统性硬化病 系统性硬化病(SSc)是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫系统失调，导致皮肤和内脏纤维化。目前还没有治疗这种疾病的方法，但在早期阶段治疗患者以逆转炎症可能提供缓解。最近的研究揭示了炎症标志物的显著增加，如CD28-CD80/86、CD19、CCL24、CD20、CD30、肿瘤坏死因子、转化生长因子β、B细胞激活因子、溶血磷脂酸受体1、可溶性鸟苷酸环化酶、Janus激酶和白细胞介素6在SSc患者血清中。增强的CD30可以使用Brentuximab(αCD30抗体)进行靶向。基于这一概念，启动了三项临床试验(clinicaltrials.gov于2023年6月19日访问，identifierNCT03222492、NCT03198689、NCT05149768)。NCT05149768试验是一项brentuximab vedotin剂量递增安全性研究，该药物-抗体偶联物已获准用于淋巴瘤治疗，靶向表达在活化免疫细胞中的CD30分子。有证据表明CD30在SSc中发挥作用。这项研究是评估brentuximab vedotin在SSc患者中的安全性和耐受性的第一步。NCT03198689旨在评估Brentuximab vedotin(Adcetris)的可行性、安全性和初步疗效。NCT05149768试验旨在作为当前治疗的48周延长，使治疗适用于那些在Brentuximab vedotin(24周治疗)中显著改善但在治疗终止后复发的SSc患者。这三项试验都处于II期，目前正在进行中。根据临床试验数据，预计前两项研究将在2023年完成，第三项将在2024年完成。clinicaltrials.gov上提出了一项临床试验(于2023年6月19日访问，identifier NCT01616680)，用于在类固醇抵抗性急性移植物抗宿主病中使用Adcetris，但在招募受试者之前被撤回。 3.抗体-药物偶联物的临床药理学考虑 2022年2月20日，美国食品药品监督管理局(FDA)发布了一份关于开发抗体-药物偶联物(ADC)的临床药理学考虑的指南草案。该指南规定了建议，以帮助行业和其他参与ADC开发的相关方，这些ADC具有各种有效载荷。这些建议报告了FDA对临床药理学挑战以及ADC开发计划的建议，包括生物分析方法、剂量和暴露-反应、内在因素、药物基因组学和QTc评估。这些研究必须与临床研究同时或单独计划，以确保安全性和有效性。美国FDA的相关指南文件可以作为执行研究的参考。正如指南所述，需要进行生物分析定量和剂量暴露研究，以检查ADC及其成分以及任何活性代谢物的安全性和有效性。必须使用器官损伤和药物基因组学程序研究内在变量对ADC药代动力学的影响。同样，应进行心电图(ECG)监测以进行QTc评估，检查免疫原性以检查安全性，研究药物-药物相互作用，以更好地了解ADC在接受多种药物治疗的患者中的效果。 4.结论和展望 当前的综述总结了各种研究，这些研究探讨了将ADCs的效用扩展到非肿瘤疾病状况的前景，如炎症、传染病、系统性硬化病、动脉粥样硬化和免疫抑制。尽管ADCs由于其位点特异性递送和减少脱靶效应而在肿瘤治疗中受到广泛关注，但在非肿瘤状况中ADCs的使用仅限于需要位点特异性递送来减少副作用的特定有效载荷。在这种情况下，ADCs对这些有效载荷的益处应与治疗的益处、治疗成本和这些有效载荷的替代选择相权衡。研究还需要关注监管方面，并考虑为满足监管要求而需要进行的各种研究。另一个需要关注的问题是使用针对过度表达抗原的特异性抗体。许多研究调查了在非肿瘤疾病中产生抗体的问题。未来的研究应考虑为成功开发ADCs治疗非肿瘤疾病而提出的关注点。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。