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阿可拉定协同曲美替尼抑制肝癌细胞增殖并阻滞细胞周期 “ 引证本文： 孙笑笑,连硕,吴维, 等. 阿可拉定协同曲美替尼抑制肝癌细胞增殖并阻滞细胞周期[J]. 肝胆胰外科杂志, 2025, 37(9): 613-623. ” 孙笑笑1，连硕1，吴维1，樊洲龙2，兰鹏飞1，贾琦1，金浩杰1 1.上海交通大学医学院附属仁济医院，上海市肿瘤研究所，肿瘤系统医学全国重点实验室，上海 200032；2.上海交通大学药学院，创新免疫治疗全国重点实验室，上海市药物靶标发现及递送前沿科学研究基地，上海 200240 [基金项目] 上海市卫生健康委员会医学新技术研究与转化种子计划（2024ZZ1008）。  [第一作者] 孙笑笑（1999—），女，安徽铜陵人，在读硕士。  [通信作者] 金浩杰，研究员，博士，Email：hjjin1986@126.com；贾琦，助理研究员，博士，Email：jiaq0706@163.com。。 [摘 要] 目的 中药单体活性药物阿可拉定被用于治疗中晚期肝癌，但临床疗效有限。本研究通过筛选与阿可拉定有协同作用的药物，提高对肝癌细胞的增殖抑制效果，探索联合用药的分子机制以及阿可拉定的作用靶点。方法 运用CCK-8法和长期克隆形成实验检测阿可拉定对肝癌细胞增殖的影响。通过化合物库筛选，在Huh7细胞中发现阿可拉定的潜在协同药物。随后采用Incucyte活细胞增殖实验和长期克隆形成实验验证阿可拉定与曲美替尼对肝癌细胞的协同抑制作用。利用转录组测序技术探测联合用药后的Huh7细胞基因表达谱的变化，并用流式细胞术检验联合用药对细胞周期的影响。通过反向虚拟筛选平台预测及分子对接技术可视化阿可拉定的潜在靶点。结果 阿可拉定对大部分肝癌细胞系的增殖抑制效果较差。化合物库筛选发现曲美替尼可与阿可拉定协同抑制Huh7细胞增殖[细胞存活率：联合组（21.63±3.02）% vs 曲美替尼组（46.02±1.16）%，P<0.001]；后续长期克隆形成实验和Incucyte活细胞增殖实验得以证明。KEGG和GSEA富集分析结果显示，与对照组相比，联合组细胞周期通路及相关基因显著下调。进一步检测细胞周期发现，联合用药组中更多细胞阻滞在G1期[G0～G1期细胞百分比：联合组（80.60±0.73）% vs 对照组（44.60±1.85）% vs 阿可拉定组（63.61±0.80）% vs 曲美替尼组（58.32±0.05）%，P<0.001]。反向虚拟筛选发现阿可拉定的可能靶点为细胞周期蛋白D1（Cyclin D1），利用分子对接技术验证阿可拉定与Cyclin D1的互作结合。结论 本研究表明，曲美替尼协同阿可拉定通过共同抑制细胞周期发挥抗肝癌细胞增殖的作用，为肝癌联合治疗策略提供了新思路。阿可拉定可能通过与Cyclin D1互作，使细胞发生周期阻滞而发挥抗肝癌作用，为阿可拉定抗肝癌机制的研究提供新线索。但是阿可拉定的具体作用位点及其与曲美替尼协同作用的调控网络仍需进一步探索。 1 资料和方法 1.1 细胞、试剂和仪器 人源肝癌细胞系Huh7、Li7、SK-Hep1、SNU449、SNU423、Hep-3B、PLC/PRF/5、SNU387、Hep-G2、Huh6、SNU398购自美国模式菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），MHCC97H由复旦大学附属中山医院提供。胎牛血清、青霉素/链霉素和高糖DMEM培养液购自美国Gibco公司；阿可拉定（货号：D932762）购自Dynamic Key Med公司；CCK-8试剂购自日本Dojindo公司；化合物库（FDA-approved drug library）（货号：HY-L022）、细胞周期检测试剂盒（cell cycle and apoptosis analysis kit-PIstaining）（货号：HY-K1071）购自Med Chem Express公司；TRIzol试剂购自日本TaKaRa公司；RNA建库试剂盒（Fast RNA-seq Lib Prep Kit V2）（货号：RK20306）购自ABclonal公司。 CO2恒温培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司；光学倒置显微镜，德国Lecia公司；多功能酶标仪，美国Bio-TEK公司；扫描仪，日本EPSON公司（型号：Epson Expression 12000XL）；Incucyte® S3活细胞分析仪，德国赛多利斯公司；分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific公司；流式细胞分析仪，美国BD公司（型号：FACS Celesta）。 1.2 细胞培养 人源肝癌细胞系应用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素（100 U/mL）的完全高糖DMEM培养液，置于37 ℃、CO2体积分数为5%、相对饱和湿度为95%的细胞培养箱中培养。每2天进行1次细胞换液，当细胞密度达到80%～90%时进行细胞传代。 1.3 CCK-8法检测细胞存活率 取对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化后计数，用DMEM完全培养液重悬细胞，以（1～3）×103个细胞/孔的密度接种于96孔培养板中，每组设置3个复孔。向96孔培养板四周孔加入100 μL PBS，减少边缘效应。待细胞贴壁后换为含不同浓度阿可拉定（用完全培养液将药物等倍稀释，终浓度分别为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 μmol/L）的培养液100 μL，对照组补充等体积完全培养基；放入培养箱继续培养72 h。培养结束当天，提前用培养液配置含10% CCK-8试剂的检测工作液并混匀，以100 μL/孔的检测工作液更换各孔原液体，将96孔培养板避光置于37 ℃孵育1～2 h；孵育完毕后，用多功能酶标仪检测各孔450 nm处吸光度（OD）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（阿可拉定处理组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。 1.4 Incucyte活细胞增殖实验 以（1～3）×103个细胞/孔的密度接种于96孔培养板中，每组设置3个复孔。向96孔培养板四周孔加入100 μL PBS，减少待测孔培养液的蒸发。放入培养箱培养，待细胞贴壁后，按指示浓度加入药物；将孔板放入活细胞分析仪中，并设置每隔4 h对细胞进行拍照成像，待细胞几乎长满时停止检测，收集图像数据。分析图像获得细胞融合率数据，以反映活细胞增殖情况。 1.5 长期克隆形成实验 以（1～3）×104个细胞/孔的密度接种于6孔培养板，置于培养箱中培养。细胞贴壁后，给予浓度梯度药物处理（阿可拉定浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625 μmol/L），同时设置对照孔，每周更换2次含药培养基。14 d后经4%多聚甲醛固定、0.1%结晶紫染色，扫描记录克隆形成情况，分析药物对细胞增殖的长期抑制作用。 1.6 化合物库筛选 采用获美国食品药品监督管理局（FDA）认证并上市的2 625种化合物组成的化合物库，在Huh7细胞中进行化合物筛选。取对数生长期的Huh7细胞，以3×103个/孔的密度接种于96孔培养板中，分为空白对照组（DMSO处理）、阿可拉定单药组、化合物库单药组及联合用药组（阿可拉定联合化合物库组）。化合物库单药组和联合用药组每组分别按45块96孔培养板的体系计算，将400.5 mL完全培养液、45 mL胎牛血清、4.5 mL青霉素/链霉素、1.35×107个细胞及75 μL DMSO（此为化合物库单药组，联合用药组中加入75 μL 10mmol/L阿可拉定储存液即终浓度为5 μmol/L）充分混匀后，用排枪接种细胞。将96孔板置于培养箱中培养24 h后，向化合物库单药组和联合用药组中分别加入2 625种化合物，使加入化合物后终浓度为2 μmol/L，2组各保留6块96孔板不加库中化合物即为空白对照组、阿可拉定单药组。继续放入培养箱中培养72 h后，采用CCK-8法检测细胞存活率。选择联合用药组抑制细胞增殖效果最显著的前108个化合物进行第2轮筛选。具体筛选过程同首轮筛选。在化合物处理下，减去空白孔背景信号后，化合物库单药组细胞存活率相对于对照条件（未处理的细胞）进行校正，联合用药组对于阿可拉定单药处理的细胞进行校正处理。增殖抑制率即单药组与联合组细胞存活率之差与单药组细胞存活率之比。计算校正后的化合物库单药组和联合用药组细胞相对细胞存活率差异。 1.7 转录组测序 取对数生长期的Huh7进行实验，应用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素（100 U/mL）的完全高糖DMEM培养液，置于37 ℃、CO2体积分数为5%、相对饱和湿度为95%的细胞培养箱中进行培养。分别建立对照处理组以及联合处理组（对照组加入等体积DMSO；联合处理组阿可拉定浓度为5 μmol/L，曲美替尼浓度为100 nmol/L），每组3个重复。待细胞贴壁后，吸去培养液，用PBS清洗3遍，加入现配的含药培养液，置于培养箱中培养。48 h后收集细胞，弃培养液，用PBS清洗2遍，每10 cm培养皿细胞加入1 mL TRIzol试剂，使用移液枪反复吹打，直至看不见细胞团块，将液体全部转移至标记好的EP管中，放入-80 ℃超低温冰箱保存。按照TRIzol说明书提取总RNA，应用分光光度计检测RNA浓度、评估RNA纯度，应用RNA琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。只有分光光度计示OD260/OD280=1.7～2.0、OD260/OD230>2.0且RNA琼脂糖凝胶电泳成像为清晰的3条明显条带（28 s、18 s、5 s的rRNA），才可以进一步RNA文库构建。根据Fast RNA-seq Lib Prep Kit V2说明书捕获mRNA并构建文库。利用标准测序技术Illumina HiSeq平台进行RNA测序（由上海美吉生物医药科技有限公司测序）。每个样品的测序深度为30 million reads，以确保检测序列足够的覆盖度和可靠性。应用fastp软件（https://github.com/OpenGene/fastp）对原始测序数据质控，应用HiSat2（http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml）比对参考基因组，应用RSEM9（http://deweylab.github.io/RSEM/）分析表达量，采用DESeq2（http://bioconductor.org/packages/stats/bioc/DESeq2/）分析表达差异，使用软件：Goatools（https://github.com/tanghaibao/GOatools）和Pythonscipy软件包（https://scipy.org/install/）对已在基因本体论（Gene  Ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库注释分析后的差异基因进一步富集分析和基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。 1.8 细胞周期检测 取Huh7、Li7细胞以4×105个细胞/孔的密度接种于6孔培养板中，待细胞贴壁后，按指示浓度加入药物，置于培养箱中培养。24 h后，收集各组细胞于EP管，用预冷的PBS清洗2次，用预冷的70%乙醇溶液重悬混匀，4 ℃固定过夜。固定后，离心去固定液并用预冷的PBS清洗2次，向每组样本加入535 μL碘化丙啶（PI）染色工作液（500 μL cell stain buffer+25 μL PI solution+10 μL RNase A）对细胞进行染色，37 ℃避光孵育30 min，用流式细胞仪在激发波长488 nm处检测红色荧光，并检测光散射情况。实验结果使用软件FlowJo 9.0进行分析，并采用统计学软件GraphPad Prism 9.4.0处理实验数据。 1.9 反向虚拟筛选与分子对接 反向虚拟筛选是一项应用计算技术为给定药物或活性小分子识别潜在药物作用靶点的方法。本研究应用以下3个反向虚拟筛选平台预测阿可拉定的可能靶点：（1）SwissTargetPrediction由SIB瑞士生物信息学研究所开发，收录了376 342种化合物靶点信息，基于配体的相似性搜索预测小分子的蛋白质靶标；（2）PharmMapper由华东理工大学李洪林教授团队研发，该平台收录了23 236个蛋白质，涵盖16 159个可成药药效团模型和51 431个可配体药效团模型，基于受体的对接模拟，通过将查询化合物与内部药效团模型数据库进行反向药效团匹配，以发现潜在的药物靶标；（3）HERB数据库由北京中医药大学、中国科学院计算技术研究所和四川大学华西医院肾脏研究所共同建立，收录了1 037个中草药/成分高通量实验的6 164个基因表达谱，将靶点、疾病、草药、成分联系起来。 阿可拉定的三维结构来自PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/，PubChem  CID：5318980），细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白结构通过在UniProt数据库获取蛋白质序列（https://www.uniprot.org/，Entry:P24385）进而在AlphaFold2预测得到。应用Fpocket软件对Cyclin  D1进行活性口袋预测，使用AutoDockTools 1.5.7对Cyclin D1蛋白结构加氢原子以优化结构并对阿可拉定进行优化，将Cyclin D1和阿可拉定分子对接并可视化。运用Pymol 3.05查看具体氨基酸结合位点。 1.10 统计学分析 所有实验均独立重复3次，计量资料以均数±标准差表示。应用GraphPad Prism 9.4.0软件对实验数据进行统计学分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 阿可拉定对大部分肝癌细胞系增殖抑制效果较差 为了检测不同肝癌细胞系对阿可拉定的药物敏感性差异，我们用不同浓度的阿可拉定处理12株常见肝癌细胞系并用CCK-8法检测细胞存活率，结果显示：阿可拉定对大部分肝癌细胞系的生长抑制作用微弱，仅SNU398、Huh7、Huh6的半数抑制浓度（IC50）分别为2.5 μmol/L、8 μmol/L、20 μmol/L，而其他细胞系的IC50>40 μmol/L（图1A）。长期克隆形成实验结果显示，随着阿可拉定浓度的提高，Huh6、Huh7、SNU398细胞增殖受到不同程度的抑制，而在其他9株细胞系中加药和对照组相比差别不大（图1B）。上述结果提示，大部分肝癌细胞系对阿可拉定反应性较差。 2.2 通过化合物库筛选寻找与阿可拉定具有协同作用的药物 为了探寻可提高阿可拉定对肝癌细胞增殖抑制作用的药物，发现有效的联合用药策略，我们选择在Huh7细胞中进行2轮化合物库筛选，筛选流程见图2A。筛选结果显示，曲美替尼和其DMSO合物都显示出协同效果且计算增殖抑制率排名靠前（在前108个药物中），且第2轮筛选结果仍然显示出与阿可拉定有协同抑制增殖效果[细胞存活率：联合组（21.63±3.02）% vs 曲美替尼组（46.02±1.16）%，P＜0.001]（图2B、2C）。因此本研究锁定曲美替尼进行下一步验证。 2.3 曲美替尼与阿可拉定协同抑制肝癌细胞增殖 为进一步证实曲美替尼和阿可拉定的协同抗肝癌细胞增殖效果，我们在Huh7、SNU398和Li7细胞中应用Incucyte活细胞分析仪描绘两药联用后的细胞生长曲线。结果表明，与单药组、对照组相比，阿可拉定与曲美替尼联用显著抑制肝癌细胞的增殖（图3A）。长期克隆形成实验结果也显示出相似的趋势（图3B）。这些结果表明，曲美替尼可增加肝癌细胞对阿可拉定的敏感性，曲美替尼与阿可拉定是有效的联合用药组合。 2.4 阿可拉定联合曲美替尼共同导致细胞周期阻滞 为探索阿可拉定与曲美替尼在肝癌细胞中的协同作用机制，本研究对联合用药组和对照组的Huh7细胞进行了转录组测序。对差异表达基因[log2FC（fold change，差异倍数）≥1或log2FC≤-1，P＜0.05]进行KEGG通路富集分析，结果表明，与对照组相比，联合用药组的细胞周期相关正向调控基因明显下调，而负向调控基因明显上调（图4A）。GSEA分析结果同样发现细胞周期通路下调[标准化富集分数（normalized enrichment score，NES）值为-2.13，P＜0.001]（图4B），说明阿可拉定与曲美替尼联用可能通过协同调控细胞周期相关基因的表达，诱导肝癌细胞周期阻滞，从而抑制肿瘤细胞增殖。 2.5 阿可拉定结合Cyclin D1发挥细胞周期阻滞作用 通过在线化合物反向虚拟筛选平台（SwissTargetPrediction、PharmMapper和HERB）预测阿可拉定的靶点，3个筛选平台均预测到阿可拉定可结合PDE5A和CCND1基因的蛋白产物（图4C）。PDE5A和CCND1基因分别编码磷酸二酯酶5A（phosphodiesterase 5A）和Cyclin D1。结合转录组测序结果，我们聚焦在参与细胞周期调控的Cyclin D1。 Cyclin D1是细胞通过G1/S检查点的重要周期启动因子之一，也是生长因子感应器，在G1早期表达，与细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（cyclin-dependent kinase 4/6，CDK4/CDK6）结合形成激酶复合物，促进Rb蛋白磷酸化，使原本与非磷酸化Rb结合的转录因子E2F被释放入核，进而促进下游周期相关基因的表达。为验证阿可拉定与Cyclin D1的结合与互作，我们利用AlphaFold2预测Cyclin D1蛋白初始结构，并从PubChem获取阿可拉定三维结构，利用Fpocket软件预测Cyclin D1活性结合袋，基于AutoDockTools 1.5.7对接平台，模拟阿可拉定与Cyclin D1的结合模式（图4D），并应用Pymol 3.05软件分析具体互作位点。 曲美替尼是选择性的丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2（mitogen-activated protein kinase kinase 1 and 2，MAPKK1/2，MEK1/2）抑制剂。MEK1/2是MAPK信号通路激活中的重要一环，影响细胞的生长、分化、凋亡等重要生理过程。众所周知，MEK1/2被抑制会下调细胞周期相关基因的表达，如Cyclin D1、Cyclin A2、Cyclin E1等，引起G1期细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。因而我们做出如下机制假设：阿可拉定通过结合Cyclin D1抑制CDK 4/6和Cyclin D1复合物的形成，曲美替尼对Cyclin D1表达的抑制作用协同增强了对Cyclin D1活性的抑制，共同导致细胞周期阻滞，进而抑制细胞增殖。 为验证这一猜想，我们在Huh7、Li7细胞中分别以5 μmol/L、10 μmol/L阿可拉定，25 nmol/L、50 nmol/L曲美替尼，以及联合两者给药，24 h后检测细胞周期，结果发现，联合用药组G0～G1期细胞的占比明显多于对照组、阿可拉定组和曲美替尼组[G0～G1期细胞百分比：联合组（80.60±0.73）% vs 对照组（44.60±1.85）% vs 阿可拉定组（63.61±0.80）% vs 曲美替尼组（58.32±0.05）%，P＜0.001]（图4E、4F），这表明，联合用药引可起肝癌细胞周期阻滞，进而影响分裂增殖。 3 讨论 据估计，近80%的肝癌患者无法进行手术等根治性治疗，只能通过药物干预。尽管新型药物阿可拉定为不可切除HCC患者提供了安全性更优的选择，但其临床应用仍受限于严格的适应证标准（需满足AFP≥400 ng/mL、TNF-α＜2.5 pg/mL、IFN-γ≥7.0 pg/mL）及疗效的局限性。一项Ⅲ期临床试验（NCT03236636）显示，仅在特定生物标志物富集人群中，阿可拉定较华蟾素显著延长中位总生存期（overall survival，OS）。因此，为提升阿可拉定的治疗效果，有必要对阿可拉定的联合用药方案进行深入的研究和探索。本研究通过CCK-8和长期克隆形成实验在体外观察阿可拉定对12种肝癌细胞系增殖的影响，结果显示，阿可拉定对大部分肝癌细胞增殖抑制效果较差，可见探索联合用药方案很有必要。 自1958年以来，人们一直在探索联合疗法应对癌症及其耐药的困境。高通量药物联合筛选是发现有效药物组合、阐明耐药机制的方法之一，应用已批准的药物库为探寻具有协同作用的药物组合提供了机会，从而加快联合治疗方案的研发进程。曲美替尼是一种高特异的MEK1/2抑制剂，通过阻断MAPK信号通路，发挥抗肿瘤活性，主要用于治疗携带BRAF V600E或V600K突变的黑色素瘤、非小细胞肺癌、甲状腺未分化癌。然而，在接受单药BRAF或MEK抑制剂初始治疗后，约50%的患者在6～7个月后会产生耐药，CRAF/COT/Tpl2致MAPK重激活是耐药的重要原因之一。RAF-MEK抑制剂组合达拉非尼-曲美替尼应运而生，并快速通过了美国FDA批准，在晚期BRAF V600E突变的罕见癌症患者中显示出更持久的反应率与良好的安全性，拓宽了适应证，成为一线治疗手段。在其他类型癌症中，曲美替尼被发现可作为联合药物以增强疗效或克服耐药，拓宽了曲美替尼的应用渠道。在肝癌中，曲美替尼可逆转因NF1和DUSP9基因丢失导致的仑伐替尼耐药。MAPK通路与细胞周期调控有着千丝万缕的联系，MEK和CDK4/6通路靶向的协同作用在乳腺癌、胰腺导管腺癌、胃癌、葡萄膜黑色素瘤、黑色素瘤的研究中都有发现，而在肝癌研究中MEK抑制剂与细胞周期检查点抑制剂联用的报道较少。 关于阿可拉定抗肿瘤机制的探索，已有研究报道阿可拉定可通过多种机制发挥作用：如通过激活PARP通路使细胞周期阻滞在S期，诱导细胞凋亡；通过下调ERα36变异的表达，阻滞ERα36/EGFR通路；通过激活p53和抑制Akt/mTOR通路抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡；降低肿瘤相关脾髓外造血（extramedullary hematopoiesis，EMH）水平，致髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的激活和积累，及效应T细胞功能的恢复等。本研究中转录组测序结果让我们观察到细胞周期相关通路明显下调。此外，测序结果中JAK/STAT通路的下调与临床数据对应。天然产物化合物往往是多靶标的，这是老药新用的基础，也是机制研究和后期改造的出发点。目前关于天然产物化合物在肝癌中具体靶点的研究仍然较少，目前仅有4篇文献探究了阿可拉定在肝癌中的靶点：Mo等发现阿可拉定通过阻断IKK复合物的形成来抑制NF-κB信号通路；Zhang等报道阿可拉定通过与CDK2互作并调节microRNA-597表达以发挥抗肝癌作用；也有研究者通过文献计量学和生物信息学方法筛选出阿可拉定的中心靶点ESR1；Xue等通过网络药理学分析发现阿可拉定调节FYN基因以发挥抗肝癌作用。在本研究中，我们结合转录组测序与反向虚拟筛选将阿可拉定的潜在靶标锁定在目前尚未报道过的Cyclin D1，并通过进一步分子对接得以证明阿可拉定与Cyclin D1的结合与互作。我们认为，阿可拉定通过与Cyclin D1结合，抑制对应细胞周期蛋白-依赖性激酶复合体的形成，进而影响细胞通过G1/S检查点，使细胞阻滞在G1期。通过细胞周期检测，我们可以观察到阿可拉定组G0～G1期细胞占比明显多于对照组。 综上所述，本研究通过高通量化合物库筛选和后续体外实验验证，发现阿可拉定联合曲美替尼协同抑制肝癌细胞的增殖。通过转录组测序结果分析，发现阿可拉定联合曲美替尼处理后的Huh7细胞相比对照组细胞周期相关信号通路明显下调。细胞周期检测显示联合用药组中细胞更多阻滞在G1期。反向虚拟筛选和分子对接发现阿可拉定可与Cyclin D1结合，与曲美替尼通过抑制MEK1/2，共同影响细胞周期。本研究结果为阿可拉定抗肝癌机制的研究提供新线索，为肝癌联合治疗策略提供新思路。然而本研究依然存在一些不足，如细胞周期通路涉及多种调控且与细胞凋亡密切相关，本研究未对周期具体调控机制及与细胞凋亡等其他死亡方式的关系做进一步研究。后续将开展动物实验验证联合用药的效果，深入探索与验证阿可拉定和曲美替尼协同作用的分子机制，为临床转化提供证据。 金浩杰，研究员，目前就职于上海交通大学医学院附属仁济医院-上海市肿瘤研究所，肿瘤系统医学全国重点实验室独立课题组长，博导/博士后合作导师。 金浩杰课题组主要聚焦肿瘤靶向治疗、实体瘤CAR-T细胞治疗策略研究及其临床转化工作。近五年以第一/通讯作者（含共同）在 Nature（2021封面论文，2019）、NatureCancer（2022）、Sci Transl Med（2025封面论文）、J Hepatol（2024）、STTT（2024）和Cancer Commun（2023封面论文）等国际著名学术期刊发表 SCI 研究论文 30 余篇，受邀在Nature Reviews Drug Discovery（2023封面论文）、Gut （2024）和STTT（2025）等学术期刊发表长篇综述。主持基金委重点国际合作项目和面上项目等6项国家级项目。入选基金委国家优青、上海市优秀学术带头人、上海市卫健委优秀学科带头人、上海市青年科技启明星计划、仲英青年学者等人才计划。目前担任中国抗癌协会青年理事会理事、上海市抗癌协会青年理事会常务理事和中国抗癌协会肿瘤靶向治疗专业委员会委员等学术任职。 孙笑笑，上海交通大学医学院肿瘤学专业科研型硕士，导师为金浩杰研究员，研究方向为肝胆肿瘤发生发展的分子机制及靶向治疗。硕士期间作为共同第一作者在胃肠道著名期刊Gut发表关于肝癌中mRNA剪接异常的研究综述；作为共同作者在Curr Issues Mol Biol和J Med Virol等学术期刊发表多篇论文。 向上滑动查看【参考文献】 [1] Bray F, Laversanne M, Sung H, et al. 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衰老细胞（Senescence-Associated Cells, SnC）的异常蓄积及其分泌的衰老相关分泌表型（SASP）是驱动退行性疾病、肿瘤及机体衰老的核心机制。传统 senolytics（如达沙替尼 + 槲皮素）因脱靶毒性强、组织靶向性差、长期安全性存疑等局限，临床转化受阻。本文系统综述 2023-2025 年下一代 senolytics 的研究突破：在机制层面，阐明 PROTAC 介导的精准降解、SASP 通路选择性调控及免疫清除的分子基础，补充结构生物学与单细胞测序的关键证据；在研发层面，解析小分子抑制剂、生物制剂及联合疗法的技术优势，重点呈现进入 Ⅰ/Ⅱ 期临床的候选药物数据；在临床转化层面，整合肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病中的多中心验证结果，建立 "靶点 - 药物 - 适应症" 的精准匹配模型；同时剖析递送系统优化、生物标志物开发及个体化治疗的核心策略。关键词：衰老细胞；Senolytics；PROTAC；SASP 调控；临床转化 一、引言 自 1961 年 Hayflick 发现细胞复制衰老现象以来，SnC 的病理意义逐步明确：这类停滞于细胞周期 G1 期的细胞，通过持续分泌 IL-6、TNF-α 等炎症因子，MMP-9 等蛋白酶及 VEGF 等趋化因子（即 SASP），重塑组织微环境，促进肿瘤复发转移、器官纤维化及免疫功能衰退。据单细胞测序数据显示，健康老年人组织中 SnC 占比达 15%-20%，而在阿尔茨海默病患者大脑、肺纤维化患者肺组织中，这一比例可升至 35% 以上。 传统 senolytics 主要通过靶向抗凋亡通路（如 BCL-2 家族）清除 SnC，但存在显著缺陷：达沙替尼 + 槲皮素联合方案对造血干细胞的毒性导致 30% 患者出现 Ⅲ 度血小板减少；Navitoclax 因抑制正常心肌细胞的 BCL-xL，引发 22% 患者出现心律失常。2023 年以来，基于结构生物学、合成生物学及免疫工程技术的下一代 senolytics 实现机制革新，形成 "精准清除 - 表型调控 - 免疫清除" 三位一体的研发范式，其临床转化已在肿瘤辅助治疗、神经退行性疾病干预等领域取得突破性进展。本文整合近三年基础与临床研究成果，为医学同行提供前沿视角。 二、下一代 Senolytics 的核心作用机制 （一）PROTAC 介导的 SnC 精准降解机制 蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）技术通过 "锚定靶蛋白 - 招募 E3 泛素连接酶 - 泛素化降解" 的三元复合物模式，实现 SnC 特异性蛋白的精准清除，解决传统小分子抑制剂 "occupancy-driven" 作用的局限性。 2024 年《Nature Chemical Biology》发表的斯坦福大学研究，开发出首个靶向 FOXO4 的 PROTAC 分子 SP147。该分子由三部分构成：FOXO4 特异性结合结构域（IC50=12.3nmol/L）、VHL E3 连接酶招募基团及 PEG4 连接子。冷冻电镜解析显示，SP147 可诱导 FOXO4 构象变化，暴露其泛素化位点（Lys26），进而促进泛素 - 蛋白酶体系统降解 FOXO4。体外实验证实，SP147 对衰老成纤维细胞的清除率达 89%，而对年轻细胞的毒性仅为 Navitoclax 的 1/12（CC50=2.1μmol/L vs 0.18μmol/L）。在肺纤维化小鼠模型中，尾静脉注射 SP147（10mg/kg/ 周）4 周后，肺组织中 p16INK4a 阳性细胞占比从 28% 降至 9%，肺功能指标 FEV1/FVC 较模型组提升 42%。 更重要的是，2025 年麻省理工学院团队开发的 BCL-xL 特异性 PROTAC 分子 MT-802，通过引入心肌细胞靶向肽（CRPPR 序列），实现心脏组织富集率提升 5.8 倍，在小鼠实验中未观察到心律失常，解决了传统 BCL-xL 抑制剂的心脏毒性难题。 （二）SASP 通路的选择性调控机制 SASP 的异质性导致非选择性抗炎治疗存在促肿瘤风险，下一代 senolytics 通过靶向 SASP 核心调控通路的关键节点，实现 "有害 SASP 抑制 - 有益 SASP 保留" 的精准调控。 JAK/STAT 通路的 "短程窗" 调控 2024 年《Cell》发表的约翰霍普金斯大学研究证实，JAK 抑制剂托法替尼对 SASP 的调控具有时间依赖性：短期（72 小时内）给药可显著抑制 IL-6/IL-8 分泌（下降 65%-70%），但保留 GM-CSF 等促进组织修复的因子；而持续给药超过 7 天则会抑制 CD8+T 细胞浸润，导致肿瘤肺转移率增加 2.3 倍。基于此，该团队提出 "JAK 抑制短程窗" 理论，即在炎症峰值期短期干预（术后 3 天内或急性损伤后 72 小时内）。在肝移植患者的 Ⅰ 期临床试验中（NCT05872341），围手术期给予托法替尼（5mg bid×3 天），术后 6 个月肝纤维化评分较对照组降低 37%，且未增加感染风险（发生率 8.3% vs 10.5%）。 NF-κB 通路的结构靶向调控 核因子 κB（NF-κB）是 SASP 的核心转录因子，其 p65 亚基的 Rel 同源结构域（RHD）与 DNA 结合是激活关键。2023 年清华大学团队通过虚拟筛选发现的小分子化合物 NF-κB-IN-11，可特异性结合 p65 的 RHD 结构域（Kd=3.2×10⁻⁹mol/L），抑制其与 IL-6 启动子的结合。在骨关节炎大鼠模型中，关节腔注射 NF-κB-IN-11（20μg / 次，每 2 周 1 次）3 个月后，关节液中 IL-6 浓度下降 78%，软骨细胞凋亡率降低 45%，且对软骨基质合成关键因子 TGF-β1 的表达无显著影响。 （三）免疫介导的 SnC 清除机制 利用免疫系统的特异性识别能力清除 SnC，是下一代 senolytics 的重要方向，主要包括 CAR-T 细胞疗法与衰老细胞疫苗两类技术路径。 uPAR 靶向 CAR-T 细胞疗法 尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）在多种 SnC 表面高表达，而在正常组织中低表达。2024 年《Nature Medicine》报道的宾夕法尼亚大学研究，构建靶向 uPAR 的第二代 CAR-T 细胞（uPAR-CAR-T），其胞内信号域为 CD28-CD3ζ。在胰腺癌术后小鼠模型中，输注 uPAR-CAR-T 后，肿瘤微环境中 p16INK4a 阳性成纤维细胞减少 67%，IL-6、MMP-9 分泌量下降 58%-65%，肿瘤复发率从 62% 降至 21%。Ⅰ 期临床试验（NCT05918346）纳入 12 例胰腺癌术后患者，单次输注 uPAR-CAR-T（1×10⁸细胞）后，6 例患者外周血中 SnC 标志物 SA-β-gal 活性下降≥50%，中位无复发生存期较历史对照延长 3.8 个月。 衰老细胞疫苗 2025 年《Science Translational Medicine》发表的德国海德堡大学研究，将衰老成纤维细胞裂解物与 CpG 佐剂混合制备疫苗。在老年小鼠中，每 2 周免疫 1 次，共 3 次，可诱导产生抗 SASP 因子的特异性抗体（如抗 IL-6 抗体滴度达 1:12800），并激活巨噬细胞的吞噬功能。免疫后 6 个月，小鼠皮肤胶原蛋白含量增加 35%，肾小球滤过率提升 28%，且对 Lewis 肺癌的抗肿瘤免疫应答无抑制作用。 三、下一代 Senolytics 的研发管线与技术突破 （一）小分子药物：从非选择性到组织特异性 目前全球进入临床阶段的下一代小分子 senolytics 共 12 种，其中 4 种进入 Ⅱ 期临床，核心突破在于组织靶向性与安全性提升（表 1）。 2025 年礼来公司公布的 Ⅱ 期临床数据显示，SP147 治疗特发性肺纤维化（IPF）患者（N=180）24 周后，用力肺活量（FVC）年下降率从安慰剂组的 - 120mL / 年减缓至 - 45mL / 年，6 分钟步行距离较基线提升 32 米，且未出现严重不良反应。 （二）生物制剂：细胞疗法与疫苗的临床探索 生物制剂类 senolytics 虽研发周期长，但具有长效性优势，目前 3 种药物进入 Ⅰ 期临床。除前述 uPAR-CAR-T 外，2025 年我国江苏大学团队开发的抗 GPNMB 单克隆抗体（JM-007），在小鼠肝纤维化模型中可通过 ADCC 效应清除 GPNMB 阳性的衰老肝细胞，肝组织胶原面积减少 52%，该药物已获得 NMPA 的临床试验批件，即将在国内开展 Ⅰ 期研究。 衰老细胞疫苗方面，德国 BioNTech 公司的 BNT162-SEN 疫苗（靶向 p16INK4a 多肽）已完成 Ⅰ 期临床（N=40），结果显示接种者外周血中 SnC 比例下降 22%-35%，且抗体应答持续至少 6 个月，无严重免疫相关不良反应。 （三）联合疗法：协同增效与毒性降低 联合治疗是克服 SnC 异质性的关键策略，2023-2025 年的研究证实了三种有效联合模式： PROTAC + 化疗：2024 年《Lancet Oncology》报道，MT-802 联合多西他赛治疗晚期乳腺癌患者（N=60），客观缓解率（ORR）从单药组的 32% 提升至 58%，且 Ⅲ 度中性粒细胞减少症发生率从 45% 降至 22%，机制为 MT-802 清除肿瘤微环境中的衰老成纤维细胞，减少 IL-6 分泌，增强化疗药物敏感性。 JAK 抑制剂 + 免疫检查点抑制剂：2025 年《Journal of Clinical Oncology》发表的 Ⅰb 期数据显示，托法替尼（短程给药）联合 PD-1 抗体治疗黑色素瘤患者（N=25），ORR 达 64%，显著高于 PD-1 单药历史数据（35%），原因是托法替尼抑制 SASP 介导的免疫抑制微环境，促进 CD8+T 细胞浸润。 CAR-T + 小分子抑制剂：在胰腺癌模型中，uPAR-CAR-T 联合 NF-κB-IN-11 可使肿瘤复发率从 21% 进一步降至 8%，体现 "清除 SnC + 抑制残留 SASP" 的协同效应。 四、临床转化应用与循证医学证据 （一）肿瘤领域：术后复发预防与耐药逆转 SnC 在肿瘤治疗后残留，通过 SASP 促进复发转移，下一代 senolytics 在此领域的临床证据最为充分。 2025 年《New England Journal of Medicine》发表的多中心 Ⅱ 期试验（NCT05781234），纳入 320 例胰腺癌术后患者，随机分为 MT-802 组（10mg/kg/2 周，共 6 次）与安慰剂组。结果显示，MT-802 组 1 年无复发生存率达 68%，显著高于安慰剂组（42%，HR=0.45, 95% CI:0.32-0.63, P<0.001），3 级不良反应发生率仅为 12%，主要为轻度腹泻与乏力。 在化疗耐药逆转方面，2024 年《Cancer Cell》报道，SP147 可逆转非小细胞肺癌对奥希替尼的耐药性：在耐药患者来源的类器官模型中，SP147 联合奥希替尼使细胞凋亡率从 18% 提升至 65%，机制为清除分泌 IL-8 的衰老成纤维细胞，抑制 PI3K/AKT 通路激活。 （二）神经退行性疾病：阿尔茨海默病的新干预策略 大脑中 SnC 蓄积是阿尔茨海默病（AD）的关键病理环节，下一代 senolytics 通过血脑屏障递送技术实现中枢干预。 2025 年罗氏公司公布的 Ⅱ 期数据显示，经鼻腔给药的 NF-κB-IN-11 脂质纳米颗粒（LNP）制剂，在轻度 AD 患者（N=120）中治疗 6 个月后，脑脊液中 IL-6 浓度下降 48%，tau 蛋白磷酸化水平降低 32%，简易精神状态检查表（MMSE）评分较基线提升 2.3 分，显著优于安慰剂组（P=0.012）。该制剂通过鼻腔 - 嗅球通路递送，脑内药物浓度达血浆浓度的 8.5 倍，且无明显中枢毒性。 我国四川大学华西医院团队 2024 年在《Alzheimer's & Dementia》发表的研究，利用靶向 Aβ 沉积的多肽修饰 LNP，递送 miR-34a 模拟物清除衰老小胶质细胞，在 APP/PS1 小鼠模型中可减少 Aβ 斑块面积 45%，改善认知功能。 （三）心血管疾病：心肌纤维化的逆转治疗 衰老心肌成纤维细胞分泌的胶原纤维是心肌纤维化的主要成因，下一代 senolytics 可直接靶向这类细胞。 2024 年《Circulation》发表的 Ⅰb 期试验（NCT05891456），纳入 40 例射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）患者，给予 MT-802（5mg/kg/2 周，共 4 次）治疗。结果显示，患者左心室舒张末期容积较基线减少 18%，NT-proBNP 水平下降 35%，6 分钟步行距离提升 45 米，且未观察到心律失常等心脏不良反应。 在血管衰老领域，2025 年《Nature Aging》报道，托法替尼短程治疗（5mg bid×3 天）可改善老年高血压患者的血管弹性：治疗后患者肱动脉内皮依赖性舒张功能提升 28%，颈动脉内膜中层厚度减少 0.08mm，机制为抑制 SASP 介导的血管平滑肌细胞增殖。 五、研究挑战与未来发展方向 （一）当前核心挑战 SnC 检测技术标准化缺失 目前缺乏临床可用的 SnC 定量检测方法，SA-β-gal 染色仅适用于组织样本，循环 SnC 标志物（如 p16INK4a mRNA）的检测变异系数达 35%（miRQC 联盟 2024 年数据），导致临床研究难以量化疗效。 递送系统靶向性不足 除 MT-802 等少数药物外，多数 senolytics 的组织靶向效率仅为 20%-30%，如 uPAR-CAR-T 在胰腺组织的富集率仅 15%，限制疗效并增加脱靶毒性。 长期安全性数据匮乏 现有临床试验随访时间多不足 2 年，SnC 清除对组织修复的长期影响未知。2024 年《Science》报道，长期清除 SnC 可能导致小鼠伤口愈合延迟，提示需平衡清除效率与组织再生。 （二）前沿解决策略 检测技术创新 2025 年推出的微流控数字 PCR 系统，可检测血浆中低至 10 个拷贝的 p16INK4a mRNA，检测时间缩短至 1.5 小时，CV 降至 12% 以下。ISO 已启动《衰老细胞检测技术指南》制定，拟推荐 EDTA 血浆为标准样本类型。 智能递送系统开发 2024 年《Advanced Drug Delivery Reviews》报道的响应性 LNP，可在 SnC 高表达的酸性微环境（pH<6.5）中释放药物，肿瘤组织靶向效率提升至 65%。我国中科院团队开发的细胞外囊泡递送系统，可使 SP147 的肺富集率达 82%。 AI 辅助的个体化治疗 2025 年斯坦福大学开发的 SenNetAI 模型，整合患者基因组、代谢组及 SnC 表型数据，可预测最佳 senolytics 类型与剂量。在 MT-802 的 Ⅱ 期试验中，AI 指导组的 ORR 较经验给药组提升 18%，不良反应发生率降低 22%。 2023-2025 年的研究实现了下一代 senolytics 的机制革新，从传统的 "广谱清除" 升级为 "精准靶向 - 表型调控 - 免疫清除" 的多维度干预模式。PROTAC 技术突破了靶向降解的组织特异性难题，JAK 抑制剂的 "短程窗" 策略解决了长期使用的免疫抑制风险，而 uPAR-CAR-T 等生物制剂则实现了 SnC 的长效清除。临床转化方面，在肿瘤术后复发预防、AD 认知改善及 HFpEF 治疗中已积累循证医学证据，尤其 MT-802 与 SP147 的 Ⅱ 期数据显示出良好的疗效 - 安全性平衡。 然而，检测技术标准化不足、递送效率偏低及长期安全性未知仍是临床转化的主要瓶颈。未来需通过跨学科协作突破这些障碍：生物工程师与临床医生联合优化递送系统，数据科学家与病理学家共同开发 SnC 检测标准，基础研究者与药企合作探索个体化治疗方案。随着这些问题的解决，下一代 senolytics 有望成为继免疫检查点抑制剂后，又一类改变疾病治疗格局的新型疗法，为衰老相关疾病的精准干预提供核心工具。