JMC | AATacs：基于N端降解机制的全新蛋白降解方法

以PROTACs为代表的靶向蛋白质降解技术在药物研发领域展现了巨大潜力，目前已有超过30种候选药物进入临床试验阶段。尽管这种技术已经实现在多种致病靶标上的应用，但用于构建这种技术的降解信号和E3连接酶种类依然有限。目前，VHL和CRBN是被广泛应用于PROTACs设计中的两种E3连接酶。因此，探索新的蛋白质降解信号成为当前的紧迫需求。

2024年8月8日，南方科技大学饶海教授团队在《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为“Distinct Amino Acid-Based PROTACs Target Oncogenic Kinases for Degradation in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC)”的论文。该研究开发了一种基于三种氨基酸（脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸）的新型PROTACs（称为AATacs），并成功利用AATacs在非小细胞肺癌中降解了致癌蛋白激酶EML4-ALK和EGFR-L858R/T790M。

N-末端蛋白质降解途径是上世纪80年代发现的一种由泛素介导的降解方式，早期研究发现N-末端的精氨酸和组氨酸等氨基酸能够被UBR家族E3连接酶识别，是主要的降解信号。最近的研究证实，甘氨酸和脯氨酸也能作为N-末端降解信号，被CRL2家族的E3连接酶ZYG11B或ZER1以及GID4识别。因此，作者设计了以Brigatinib为靶蛋白配体，利用甘氨酸、脯氨酸和赖氨酸作为N-末端降解信号，开发了一类能够降解ALK和EGFR的AATacs。

首先，研究人员以脯氨酸为N-末端降解信号，探讨了合适的Linker长度。结果发现，以4个PEG单元为Linker的Pro-PEG3-BA降解效率最高。然后，研究人员将脯氨酸替换为甘氨酸和赖氨酸，设计了一系列AATacs。此外，还设计了一个阴性对照Orn-PEG3-BA，其中的鸟氨酸无法触发N-末端降解信号。

实验结果显示，在1 μM以上浓度时，几种基于脯氨酸的AATacs都能在H3122细胞中显著降解EML4-ALK。此外，这些化合物在H1975细胞中也能降解EGFR L858R/T790M。综合比较，Pro-PEG3-BA的降解效率最高。通过全蛋白质组学分析，发现Pro-PEG3-BA具有较好的选择性，主要降解ALK蛋白。

进一步评估显示，Pro-PEG3-BA、Lys-PEG3-BA和Gly-PEG3-BA在H3122细胞中的半数降解浓度（DC50）在0.42-1.32 μM之间，最大降解能力（Dmax）超过90%。然而，这些化合物对EGFR L858R/T790M的降解效果较差，DC50在13.5-20.2 μM之间，Dmax在43-69%之间。

为了探究AATacs的作用机制，研究人员在蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹处理的H3122和H1975细胞中进行实验。结果表明，MG132部分抑制了Pro-PEG3-BA对EML4-ALK和EGFR L858R/T790M的降解，证明AATacs作用于蛋白酶体。通过GID4敲除的细胞实验发现，Pro-PEG3-BA降解能力丧失，同样ZYG11B敲除细胞中，Gly-PEG3-BA降解能力明显降低。

在小鼠模型中，Pro-PEG3-BA的药代动力学（PK）属性显示其具有较好的生物利用度，能够显著降低肿瘤组织中的ALK蛋白水平。

综上所述，该研究通过脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸作为降解信号，成功构建了一系列基于N-末端降解途径的新型AATacs，系统研究了其在肿瘤细胞降解致癌蛋白的效率和机制，并初步评估了其治疗非小细胞肺癌的潜力。这一研究拓展了当前蛋白质降解技术中有限的E3连接酶和降解信号种类，为构建新型蛋白质降解技术提供了新思路。