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罗氏制药介绍及公司历史 罗氏（Roche）成立于1896年，总部位于瑞士巴塞尔，是全球领先的制药公司和体外诊断的领导者，领先的工业化生产原研药的企业之一。 F. Hofmann-La Roche & Co于1896年10月1日在瑞士巴塞尔成立。创始人弗里兹·霍夫曼 (Fritz Hoffmann)，在创立罗氏之前，创立了F.Hofmann-La Roche & Co.。创立罗氏时福里兹霍夫曼才28岁。 药剂师Carl Schaerges，罗氏首个研究负责人，和化学家Emil C. Barell一起证明了甲状腺提取物中碘的存在。推出了罗氏的第一个专利和在杂志上出版的研究论文。Aiodin的推出标志着罗氏最早的一系列甲状腺制剂。罗氏推出了由Hoffmann， Traub & Co.最初开发的伤口杀菌剂Airol。 1897年至1914年期间，罗氏制药实现了国际化扩张。1914年时，罗氏在米兰、纽约、圣匹兹堡、伦敦均设立了办公室。 罗氏制药于1898年推出了Sirolin，为非处方止咳糖浆，包含活性成分Thiocol，此橙色的止咳糖浆在未来超过60年仍风靡市场。 1920年，Markus Guggenheim发表了关于生物氨基酸的论文，氨基酸、多肽、蛋白质、强心苷、维生素、荷尔蒙均为罗氏制药内部研发的物质。1927年，Guggenheim开始研究维生素B1，从米糠中提取研究，其研究为罗氏未来维生素B1的开发奠定了基础。 1920年，罗氏引进Allonal，推出首个化学合成的镇痛催眠制剂。 1928年至1944年，罗氏基于其维生素的生产，使得公司经历了前所未有的增长，公司实现了向美国市场的扩张。Tadeusz Reichstein为罗氏提供了维生素C的合成方法，首次生产了50kg维生素C。首个维生素C产品Redoxon随即推出。罗氏陆续成为维生素A，B1，B2，E和K1的供应商。直到1938年，罗氏的主要产品包括Benerva（维生素B1）、Nestrovit（多种维生素）、Beflavin（维生素B2）以及Ephynal（维生素E）。 1945年至1964年期间，罗氏不断扩张其研发工作，试图多样化其产品。1945年，罗氏成立了Pantene Corporation以及附属化妆品公司。19世纪50年代中期，镇静安定药引入临床使用。罗氏开发了Librium（氯氮卓，利勃龙），苯二氮卓类药物。1962年，罗氏推出了首个抗肿瘤药物，氟尿嘧啶，奠定了罗氏在化疗药物领域的基础。1963年，罗氏推出了Valium（地西泮，即安定） 1968年，罗氏成立诊断部门，进入新的领域，除了开发新的诊断测试和自动化分析仪以外，还包括成立服务实验室，为医院以及一些医生诊所提供临床分析。 1974年，罗氏的抗帕金森药Madopar获得了Galien奖。 1980年，罗氏分子生物学研究所分离纯化了干扰素α，罗氏Nutley和基因泰克，就生产基因工程产品达成合作协议。 1982年，罗氏推出了Rocephin，头孢菌素类抗生素，1987年，Rocephin的销售收入超过了罗氏其他产品。诊断部门推出了Cobas Bio/Mira 生物化学分析仪器。Roferon-A，罗氏的首个基因工程药物上市。 1991年，罗氏自Cetus Corporation收购了PCR的市场化权利，可在数分钟内检测基因物质。 20世纪90年代，罗氏推出了系列的抗癌药物，包括Herceptin，用于转移性乳腺癌，为阻断HER2作用的人源单抗。MabThera延长了白血病患者的无进展生存期。1999年，推出了Invirase，首个HIV蛋白酶抑制剂，获得了Galien奖。推出了Valcyte和Fuzeon，首个用于HIV的融合抑制剂。Fuzeon阻断病毒进入人类免疫细胞，阻止HIV复制。 20世纪90年代中期，罗氏诊断部门推出了系列的产品，包括Cobas Integra，临床化学和免疫化学分析仪；Cobas Amplicor，基于PCR技术的分析仪；Accutrend和Accu-Chek，用于糖尿病管理和无痛检测的分析仪器。 1999年，罗氏推出Tamiflu（奥司他韦），属于神经氨酸酶类药物，用于预防和治疗流感。 1994年，罗氏收购了Syntex Corporation，强化了其在国际和美国市场的地位。 1998年，罗氏收购了德国宝灵曼公司Boehringer Mannheim，成为体外诊断领域的全球领导者及糖尿病护理领域的大型企业。1991年，收购了Nicholas，非处方药生产商，强化了罗氏OTC领域的发展，Nicholas构成了罗氏消费健康部分的一部分。 罗氏分别于1999年、2002年剥离了香水与香精业务及维生素与精细化学品业务，以进一步发展和专注于公司的制药和诊断部门。 2004年，罗氏成为世界首个在中国上海张江高科技园区建立研发中心的国际医药公司。 2002年，罗氏和中外制药结成联盟，在日本建立一家研究驱动型制药公司。新公司名为日本中外制药株式会社Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.，是由罗氏日本与中外制药合并而成。该公司专注于处方药业务，并在生物技术方面具有优势。 Avastin是首个用于治疗转移性结直肠癌的药物。2004年推出，通过阻止新血管的形成发挥抗癌作用。Tarceva主要通过抑制酪氨酸激酶发挥作用，酪氨酸激酶属于人表皮生长因子受体的一部分，作为癌症形成和生长的重要信号通路。 2005年，罗氏收购了GlycArt Biotechnology，专注于抗体领域研究。2007年和2008年分别收购了BioVeris，扩张了公司免疫化学检测业务，收购了NimbleGen，获得了DNA微阵列，在制药领域广泛用于开发和研究的工具。收购了454 Life Sciences，获得了未来测序产品，2008年收购了Ventana  Inc.，获得基于组织器官的诊断技术。 继1990年收购基因泰克60%的股份后，罗氏于2009年收购其剩余股份，两大制药巨头正式合并。 2009年在美国等地区推出了Actemra/RoActemra，为人源抗-IL-6受体抗体，用于成人类风湿关节炎。2009年，推出了cobas 8000诊断系统，模块组件可以通过多种方式组合，形成多种测试产品线。 2011年，罗氏推出了Zelboraf，主要用于BRAF V600突变的皮肤癌，此产品和相关基因检测BRAF V600突变同时推出。罗氏还推出了HPV测试用于检测宫颈癌。 2012年和2013年，罗氏推出了系列创新抗肿瘤药物，包括Erivedge，新的信号通路抑制剂，用于基底细胞癌；Gazyva用于慢性淋巴细胞白血病；Perjeta和Kadcyla，为罗氏开发的首批抗体偶联药物，用于HER2阳性乳腺癌。罗氏同时还推出了多个创新检测，包括CINtec Plus全自动化的基于细胞的宫颈癌筛查细胞学测试等。 2018年，罗氏收购了临床数据处理领域的领导者Flatiron Health，以及拥有全球最大的癌症基因组数据库之一的基因组分析专家Foundation Medicine。这些收购让罗氏进一步了解精准医疗，使罗氏更加接近个体化医疗的承诺。 2019年，罗氏收购了总部位于费城的Spark Therapeutics公司，该公司成立的目的是挑战遗传疾病的必然性。两家公司携手合作，将进一步加深对人类基因组和基因异常的了解，针对遗传疾病的根本原因，为特定遗传疾病患者开发出量身定制的突破性疗法。 2021年，罗氏收购了GenMark Diagnostics, Inc以及TIB Molbiol Group，丰富了公司的诊断业务。 2023年，罗氏收购了Telavant Holdings, Inc，获得了其3期靶向TL1A炎症性肠病管线。 2024年1月26日，完成Carmot Therapeutics, Inc.的收购，获得用于肥胖和糖尿病的3个临床阶段管线以及临床前管线，收购价格29亿美元，以及4亿美元的或有付款安排。2024年7月26日，完成对LumiraDx Limited子公司的收购，获得多种诊断模块，收购价4亿美元。2024年7月26日，完成对AntlerA Therapeutics, Inc.的收购，获得了眼科临床前Wnt激动剂抗体，首付款2亿美元。2024年3月20日，与Lonza Group AG签署协议，将其Vacaville工厂、质量和仓储设施以12亿美元转让给Lonza。2024年收购了Regor Pharmaceuticals下一代CDK抑制剂，用于乳腺癌的管线资产。 2025年1月8日，罗氏制药收购了Poseida Therapeutics, Inc.100%股权。交易价格10亿美元，加上里程碑付款总计约15亿美元，通过收购，罗氏获得了Poseida的临床前和临床阶段的CAR-T疗法管线。 罗氏制药2025年主要动向 2025年罗氏制药实现总营业收入633.56亿瑞士法郎，相比去年增长1.54%。其中，制药部门实现销售收入476.69亿瑞士法郎，占总营业收入的75%；诊断部门实现138.47亿瑞士法郎，占总营业收入的22%，合作授权等收入为18.40亿瑞士法郎，占总营业收入的3%。 重要产品近期专利到期及各市场首个仿制药推出情况如下表。MabThera/Rituxan已于2017年市场上推出首仿产品。Herceptin于2018年市场上推出首仿产品，Avastin于2019年中市场上推出首仿产品。Esbriet和Lucentis均于2022年市场上推出首仿产品。Actemra/RoActemra于2023年市场上推出首仿产品。Xolair和Perjeta专利将于2025年到期，预计市场将于2026年推出首仿产品。仿制品种的推出将使得相应产品的销售收入出现明显下降。 罗氏制药2025年主要动向 罗氏制药在2025年的国际审批动态如下： 罗氏制药在2025年发生的合作授权及收并购交易如下表，2025年达成与Zealand Pharma关于petrelintide的合作，petrelintide为胰淀素类似物，开发用于减重。罗氏也达成了与Broad Clinical Labs关于下一代测序技术的合作。收并购交易包括对Poseida Therapeutics和对89bio, Inc.的收购，收购Poseida获得了异体细胞疗法用于实体瘤，收购89bio, Inc.获得了pegozafermin，开发用于脂肪肝。 罗氏制药总体营业收入情况 罗氏制药的营业收入情况如下图所示。罗氏制药在2001年至2025年期间有制药、诊断和维生素及精细化工部门。2025年营收达633.56亿瑞士法郎。2003年完成了维生素和精细化工部门的剥离。2002年罗氏日本公司与日本中外制药合并，1990年收购基因泰克的60%，2009年收购了基因泰克全部股份。制药部门在2001年至2025年期间营业收入占总营业收入的比例为64%~77%。 罗氏制药分类销售收入情况 根据2001年至2025年的年报披露的药品品种营收数据，罗氏制药各分类药品的销售收入如下图，未单独披露销售收入的品种数据归入其他。从图中可见，有披露数据的药品销售收入之和占据整个制药部门销售收入的68%~96%。前期肿瘤、免疫、血液和抗病毒药物为主要品类，后期肿瘤药物逐年增长，至2020年又逐步下降，神经及罕见病药物逐年增长，2019年以后，肿瘤、神经、免疫、罕见病、眼科、血液为主要品类。 披露的药品销售收入情况 根据每年罗氏制药披露的单品销售收入情况整理的各品种销售收入变迁见下图。可见，罗氏制药在2020年前的大品种包括Herceptin、Mabthera/Rituxan、Avastin，这三大品种较长时间为罗氏药品销售收入的三驾马车，另外还有CellCept、NeoRecormon、Tamflu、Lucentis等品种。在2010年开始，新品种逐步推出，随着销量的增长，以及三驾马车由于竞争的原因销售收入逐渐减少，近年来，新品种Ocrevus、Hemlibra、Vabysmo、Tecentriq、Perjeta、Actemra、Xolair、Kadcyla、Phesgo等已替代了三驾马车成为罗氏制药的主要品种。 罗氏制药2025年分类销售收入情况 根据2025年披露的各药品销售收入数据，将各药品分类，未披露销售收入数据的药品全部归入其他类。各分类的销售收入如下图所示。 罗氏制药的制药部门2025年实现销售收入476.69亿瑞士法郎，包括肿瘤、神经、免疫、罕见病、眼科、血液及其他几个品类。肿瘤品类销售收入占制药部门总收入的39%，仍为第一大品类。 罗氏制药2025年各品种销售收入如下表。前10大品种销售收入占制药部门全部销售收入约72%。之前的三驾马车，Herceptin、Mabthera/Rituxan和Avastin销售收入已退出罗氏销售收入前十大品种之列。 披露的肿瘤药品销售收入情况 根据每年罗氏制药披露的销售收入数据整理的罗氏肿瘤药物各单品销售收入变迁情况见下图。 根据每年罗氏制药披露的销售收入数据整理，罗氏肿瘤药物有披露销售数据的有以上16个品种，罗氏肿瘤药物2025年实现销售收入188.21亿瑞士法郎，占制药部门全部销售收入的39%。 从品种推出的最早年限进行划分，2005年以前推出的品种包括：Herceptin（赫赛汀，曲妥珠单抗），1998年获批、 Mabthera/Rituxan（美罗华，利妥昔单抗），1997年获批、Avastin（安维汀，贝伐珠单抗），2004年获批、Tarceva（特罗凯，厄罗替尼），2004年获批、Xeloda（希罗达，卡培他滨），1998年获批、以及Furtulon（去氧氟尿苷）。 赫赛汀、美罗华和安维汀为罗氏2020年前销售收入的三驾马车。赫赛汀为最早1998年上市的HER2单抗，针对乳腺癌，2017年达到峰值销售额70亿瑞士法郎，由于2018年之后陆续出现生物仿制药，销售收入迅速下滑。2025年销售收入已下滑至约10亿瑞士法郎。美罗华为最早1997年上市的CD20单抗，针对淋巴瘤，2017年达到峰值销售额74亿瑞士法郎，由于2017年之后陆续出现生物仿制药，销售收入迅速下滑。2025年销售收入已下滑至约13亿瑞士法郎。安维汀为最早2004年上市的EGFR单抗，针对多种实体瘤，2018年达到峰值销售额71亿瑞士法郎，由于2019年之后陆续出现生物仿制药，销售收入迅速下滑。2025年销售收入已下滑至约10亿瑞士法郎。这三个品种在21世纪10年代期间为罗氏制药贡献了大部分收入，三个品种高于50亿瑞士法郎销售收入的年份保持了超过十年，2020年3个品种各自的销售收入才开始低于50亿瑞士法郎。 希罗达和特罗凯为比较老的小分子药。希罗达和特罗凯的销售生命周期均比较平缓，峰值销售额在2012年和2013年，分别为15亿瑞士法郎和13亿瑞士法郎。希罗达为抗代谢药，用于结直肠癌、胃癌、乳腺癌等实体瘤。特罗凯为EGFR小分子抑制剂，用于非小细胞肺癌、胰腺癌等实体瘤。2025年两个品种的销售收入已跌至前二十几个品种之外，因此罗氏制药未予披露这两个品种2025年的销售收入。 其余品种均为2010年以后上市的药物，自上市以来销售收入增长较快的品种包括：Perjeta（帕捷特，帕妥珠单抗）、Tecentriq（泰圣奇，阿替利珠单抗）、Kadcyla（赫赛莱，恩美曲妥珠单抗）、Alcensa（安圣莎，阿来替尼）、Phesgo（赫双妥，帕妥珠单抗+曲妥珠单抗）、 Polivy（优罗华，维泊妥珠单抗）以及 Gazyva/Gazyvaro（伽罗华，奥妥珠单抗） 。 帕捷特为最早2012年上市的HER2单抗，针对乳腺癌，其在2022年峰值销售额为41亿瑞士法郎，预计2026年出现仿制药。泰圣奇为最早2016年上市的PD-L1单抗，针对多种实体瘤，销售收入连年增长，2023年销售收入达38亿瑞士法郎。赫赛莱为最早2013年上市的HER2与DM1连接的ADC药物，2022年峰值销售额达21亿瑞士法郎，可能还有一定的增长潜力。安圣莎为最早2015年上市的小分子ALK酪氨酸激酶抑制剂，2025年销售收入约16亿瑞士法郎。赫双妥为帕妥珠和曲妥珠单抗的复方制剂，2020年获批上市，有一定的增长潜力，2025年销售收入约24亿瑞士法郎。 优罗华为CD79b与MMAE的ADC药物，2019年上市，2025年销售收入增至约15亿瑞士法郎。伽罗华为CD20单抗，2013年上市，2025年销售收入增至约10亿瑞士法郎，两者均用于血癌。 最近新上市的品种Columvi（高罗华，格菲妥单抗），为CD20/CD3双抗，用于弥漫性大B细胞淋巴瘤，2023年获批，2025年销售收入约3亿瑞士法郎。 另外还包括2个不太出彩的品种，Erivedge（维莫德吉），为Hedgehog信号通路阻断剂，用于晚期基底细胞癌，2012年获批。Zelboraf（佐博伏，维莫非尼），为BRAF抑制剂，用于黑色素瘤，2011年获批。 综上可见，肿瘤品类的销售收入由于三驾马车的推出，繁荣了十年之久，2017年以后开始出现下滑趋势。随后罗氏制药推出的系列新品，虽然未能挽回肿瘤品类的销售收入下降颓势，但也为肿瘤品类提供了有力的支撑。目前Phesgo（赫双妥）、Polivy（优罗华）、Gazyva/Gazyvaro（佳罗华）均处于快速增长阶段。 披露的神经/免疫/罕见病药品销售收入情况 根据每年罗氏制药披露的销售收入数据整理的神经/免疫/罕见病各单品销售收入变迁情况见下图。 根据每年罗氏制药披露的销售收入数据，罗氏神经/免疫/罕见病药物有披露销售数据的有15个品种。其中，神经品类有7个品种，2025年实现销售收入约95亿瑞士法郎，占制药部门总销售收入的20%。免疫品类有6个品种，2025年实现销售收入约64亿瑞士法郎，占制药部门总销售收入的13%。罕见病品类有2个品种，2025年实现销售收入约51亿瑞士法郎，占制药部门总销售收入的11%。 神经品类包括： Ocrevus（奥瑞利珠单抗） 、Evrysdi（艾满欣，利司扑兰）、Madopar（左旋多巴/苄丝肼）、Enspryng（安适平，萨特利珠单抗）、Lexotan（溴西泮）、Dormicum/Versed（咪达唑仑）以及Rivotril（氯硝西泮）。左旋多巴/苄丝肼、溴西泮、咪达唑仑、氯硝西泮均是耳熟能详的老药。左旋多巴/苄丝肼用于帕金森病，属于多巴胺补充剂和外周脱羧酶抑制剂的联合制剂。溴西泮用于焦虑、紧张，通过强化γ-氨基丁酸抑制性神经递质作用而发挥疗效。咪达唑仑属于麻醉镇静药，氯硝西泮属于抗癫痫药。 神经类药物处于增长阶段的药物奥瑞利珠单抗的表现比较亮眼，为针对多发性硬化症的CD20单抗，2017年获批，自上市以来销售收入逐年增长，2025年销售收入约70亿瑞士法郎，是罗氏又一个销售收入超过50亿瑞士法郎的大品种。销售收入还有上涨的空间。艾满欣为2020年获批的品种，为脊髓性肌萎缩症的运动神经元2（SMN2）剪接修饰子，为靶向mRNA的小分子药物，2025年销售收入约18亿瑞士法郎，未来还有很大的增长空间。安适平为2020年获批的IL-6单抗，用于抗水通道蛋白-4抗体阳性的视神经脊髓炎谱系障碍，2025年销售收入约4亿瑞士法郎。 免疫类品种包括： Actemra/RoActemra（雅美罗，托珠单抗）、Xolair（茁乐，奥马珠单抗）、Pulmozyme（阿法脱氧核糖核酸酶）、CellCept（骁悉，吗替麦考酚酯）、Neutrogin（来格司亭）以及Neupogen（非格司亭）。来格司亭和非格司亭属于重组人粒细胞集落刺激因子，用于中性粒细胞减少症。吗替麦考酚酯（骁悉）为用于移植排斥反应的老药，1995年获批，2008年达峰值销售额约21亿瑞士法郎。阿法脱氧核糖核酸酶也是用于肺囊性纤维化的老药，1993年获批，2019年峰值销售额约7.5亿瑞士法郎。 免疫类品种处于增长阶段的品种雅美罗，为针对类风湿等免疫疾病的IL-6单抗，2009年获批，2021年达峰值销售额36亿瑞士法郎，2023年有生物仿制药获批，销售已有明显下降，未来还将受到一定影响。茁乐为2003年获批的IgE单抗，用于过敏性哮喘、荨麻疹、鼻炎等，上市以来销售收入一直处于上升阶段，2025年实现销售收入约31亿瑞士法郎，销售生命周期平缓且较长，预计2026年会推出生物仿制药。 罕见病类品种包括：Hemlibra（舒友立乐，艾美赛珠单抗）和Elevidys，舒友立乐为针对血友病A的因子IXa和因子X的人源单抗，2017年上市以来销售收入迅猛增长，2025年销售收入约48亿瑞士法郎，还有上涨的空间。Elevidys是2023年推出的新品，用于杜氏肌营养不良症，为腺相关病毒载体的基因疗法，2025年销售收入约3亿瑞士法郎。 综上，神经和罕见病品类均为近年来新开发的品类，由于奥瑞丽珠单抗、舒友立乐等大单品的推出使得其销售收入近年来连年上升，未来仍有很大的增长空间。免疫品类虽为罗氏的传统品类，雅美罗、茁乐的推出也推动了销售收入的迅速增长。 披露的眼科/血液/抗病毒药品销售收入情况 根据每年罗氏制药披露的销售收入数据整理的眼科/血液/抗病毒单品销售收入变迁情况见下图。 根据每年罗氏制药披露的销售收入数据整理，罗氏眼科/血液/抗病毒类有披露销售数据的药物有14个品种。眼科包括2个品种，2025年销售收入约41亿瑞士法郎，占制药部门销售收入的9%。血液品类包含3个品种，2025年销售收入约15亿瑞士法郎，占制药部门销售收入的3%。抗病毒品类包含9个品种。 眼科品种主要包括： Vabysmo（罗视佳，法瑞西单抗）和Lucentis（诺适得，雷珠单抗）。诺适得为针对眼科疾病的血管内皮生长因子A（VEGF-A）单抗，2006年获批上市，销售收入稳步增长，至2019年达峰值销售额约18亿瑞士法郎。诺适得仿制药已于2022年推出。罗视佳为针对眼科疾病的血管内皮生长因子A（VEGF-A）和血管生成素2（Ang-2）单抗，2022年刚获批上市，上市后销售收入迅猛增长，2025年销售收入约41亿瑞士法郎，未来有很大增长潜力。 血液类品种包括： Activase, TNKase（阿替普酶、替奈普酶）、 Mircera（美信罗，甲氧聚二醇重组人促血红素）以及NeoRecormon，Epogin（罗克曼，倍他依泊汀）。这三种均为较老的药物。Activase, TNKase（阿替普酶、替奈普酶）自2000年上市后销售收入增长缓慢，但近年来销售收入快速增长，2019年达到峰值销售额13亿瑞士法郎。为重组人组织型纤溶酶原激活物，用于心肌梗死等。罗克曼为人促红细胞生成素，用于贫血。1997年获批上市，2005年达峰值销售额23亿瑞士法郎。美信罗为修饰的促血红素，也用于贫血，为NeoRecormon，Epogin下一代产品，2007年获批上市，销售收入增长缓慢，2019年达峰值销售额6亿瑞士法郎。 抗病毒类品种包括： Ronapreve（卡西瑞单抗+伊德单抗）、Cymevene/Cytovene, Valcyte（万赛维，更昔洛韦，缬更昔洛韦）、 Tamiflu（达菲，奥司他韦）、 Pegasys（派罗欣，聚乙二醇干扰素α-2a）、Copegus（利巴韦林）、Pegasys+Copegus、Viracept（甲磺酸奈非那韦）、Roferon-A（干扰素α-2a）以及Invirase, Fortovase（沙奎那韦）。除Ronapreve以外，均为上市多年的老药。万赛维用于巨细胞病毒感染，最早1989年获批，2014年峰值销售额为7.3亿瑞士法郎。达菲为1999年上市的抗流感病毒药物，随着两次流感爆发销售收入经历了剧增又骤降的过程，2009年达峰值销售额32亿瑞士法郎，属于抗病毒药中销售收入很高的品种。派罗欣为聚乙二醇干扰素α-2a很早便在市场上推出，用于乙肝、丙肝等病毒性感染，2009年峰值销售额约17亿瑞士法郎。Roferon-A为派罗欣的上一代产品，干扰素α-2a。利巴韦林为鸟苷类似物，用于丙肝流行性出血热等，可以和派罗欣共同使用，2002年获批。甲磺酸奈非那韦和沙奎那韦均用于HIV感染，均为1997年获批品种。 抗病毒类品种中最近推出的Ronapreve为用于治疗新冠病毒感染药物，2021年获批，2022年峰值销售额约17亿瑞士法郎，随着新冠病毒感染的退潮，此药物销售收入最近也迅速降低。2024年销售收入仅约300万瑞士法郎。 总体来看，罗氏制药的眼科品种在推出诺适得后销售收入逐年增长，但近年来已销售收入迅速下滑，随后又推出了新产品罗视佳，继承了眼科药品的销售增长趋势，未来仍有很大的增长空间。罗氏的血液类以及抗病毒类均为较老的品类，未来增长不明显。 披露的其他药品销售收入情况 根据每年罗氏制药披露的销售收入数据整理的其他各单品销售收入变迁情况见下图。 根据每年罗氏制药披露的销售收入数据整理，罗氏其他有披露销售数据药物有12个品种。其他类药品基本均为已上市多年的老药。 呼吸系统药物Esbriet（吡非尼酮），为2011年上市的小分子药物，针对特发性纤维化疾病，上市后销售收入平缓增长，2019年达峰值销售额11亿瑞士法郎。吡非尼酮已于2022年推出仿制药。 抗菌药包括老药Rocephin（罗氏芬，头孢曲松），为1984年获批上市，销售收入一度达到几十亿瑞士法郎，目前我们选取的研究期间里，自2001年开始罗氏芬的销售生命周期已经进入了下降区间，仿制药也已经推出，2001年销售收入也还比较高，达17亿瑞士法郎。 内分泌类品种包括：Nutropin, Protropin（生长激素）以及Evista（雷洛昔芬）。罗氏生长激素产品于1993年获批，在研究期间里，2006年达峰值销售额约5亿瑞士法郎。雷洛昔芬为雌激素受体调节剂，用于抑制乳腺上皮和子宫内膜增生，预防骨丢失，1997年获批。 骨科品种包括：Bonviva/Boniva（邦罗力，伊班膦酸）以及Rocaltrol（罗盖全，骨化三醇）。邦罗力于2003年上市，用于绝经后骨质疏松，2008年峰值销售额达11亿瑞士法郎。罗盖全可激活维生素D受体，增加肠道对钙的吸收，用于骨质疏松，1978年获批。 心血管代谢类品种包括：Xenical（赛尼可，奥利司他）、Dilatrend（卡维地洛）、Inhibace（西拉普利）以及Torem（托拉塞米）。奥利司他阻断胃肠道脂肪酶，用于体重管理，1998年获批。卡维地洛为β受体拮抗剂，用于心衰、高血压及心绞痛等，西拉普利为血管紧张素转换酶抑制剂，用于高血压。托拉塞米为袢利尿剂，用于高血压。 消化系统药物包括：Kytril（格拉司琼），为5-HT3受体拮抗剂，用于放化疗引起的恶心和呕吐，1993年获批，研究期间于2005年达峰值销售额约5亿瑞士法郎。 皮肤科药物包括Roaccutane/Accutane（异维A酸），用于重度痤疮，1982年获批。 其他还有很多老药，在我们的研究期间里，销售生命周期已经进入尾声。 罗氏制药2025年各单品销售收入增长情况 2025年相比2024年罗氏制药部门各药物单品销售收入变动情况如下表。可见销售收入增长金额贡献最大的品种为Phesgo，相比2024年，销售收入增加了7亿瑞士法郎，为2020年新推出的帕妥珠单抗+曲妥珠单抗双联制剂，未来还有很大增长空间。Xolair在2025年销售收入增长了约6亿瑞士法郎，为2003年推出，目前仍处于增长阶段。Polivy、Ocrevus、Hemlibra销售收入依次增长了约3亿瑞士法郎。Perjeta的销售收入在2025年降低了约6.5亿瑞斯和法郎，于2022年销售收入达峰。Herceptin销售收入下降了约3.5亿瑞士法郎，Avastin下降了约3亿瑞士法郎。 总体来看，2025年罗氏制药部门的销售收入相比2024年增长了约15亿瑞士法郎，实现3.24%的增长。总体来看，三驾马车仿制药竞争导致的销量下降风险已充分释放。Xolair、Perjeta预计2026年推出仿制药，可能对销售收入有一定的影响，但近年来其他新品种的增长一定程度上应该可以抵御仿制药带来的销售收入下滑。 总结 根据每年罗氏制药披露的销售收入数据整理，罗氏有披露销售收入数据的这57个品种，抗癌药是罗氏制药产品组合的重头戏。不论是21世纪10年代的三架马车（美罗华、赫赛汀及安维汀），以及近期新推出的帕捷特、泰圣奇、赫赛莱、安圣莎等，销售收入的表现均较好，且未来也有很大的增长潜力。但近年来，由于三驾马车的生物仿制药的陆续推出，销售收入呈现明显的下滑，虽然新品种已经开始接棒三驾马车，但也未能达到之前三驾马车的辉煌业绩，因此，新品的推出仍未能挽回肿瘤品类销售收入的下降颓势。但随着新品的逐步发力，可以再行观察其未来情况。 神经药物（如奥瑞利珠单抗）、免疫类药物（雅美罗）、血友病（舒友立乐）及眼科药物（诺适得、罗视佳）是近年来新开发的增长较快的品种，未来有很大的潜力。2017年上市的奥瑞利珠单抗2025年销售额已经超过70亿瑞士法郎。2017年上市的舒友立乐2025年销售额超过47亿瑞士法郎。但雅美罗由于仿制药的出现对销售收入的侵袭，峰值销售额未超过40亿瑞士法郎。诺适得上市较早（2006年），但罗视佳是最近推出接替的新品，在2025年销售收入约41亿瑞士法郎，还有很大的增长空间。可见罗氏制药的未来增长很大程度上集中在神经、血友病及眼科品类。 罗氏制药的抗病毒药近年来发展稍缓慢，除了推出新冠感染药物以外，抗感染品种的销售收入在逐年收缩。 从大趋势上看，罗氏制药这二十几年来完成了从2000年以前的化学小分子药物，向生物大分子、抗体药物的转型。这也主要得益于对日本中外制药以及基因泰克的收购。两家公司在生物制剂上有了迅猛的发展，尤其是日本中外制药，在并入罗氏后，在单抗、双抗药物的发现和开发方面有了快速的成长。借助于两家公司的技术，罗氏制药的产品组合也很早就转向了抗体生物大分子药物。未来还将在生物大分子、抗体等抗癌药方面继续发力。近年来由于重要品种纷纷受到仿制药的冲击，销售收入有所下降，但新推出的品种销售放量，一定程度上应该可以抵御仿制药的冲击。 罗氏制药2001年至2025年主要品种全球销售收入数据可见B站（阿司匹林投研）小店及T宝（阿司匹林投研），加入知识星球（阿司匹林投研）还可获得本文的可编辑图表excel文件

免费医学论文下载-乳腺细胞中GRHL2的机制性解离及PR转录共调控 玛琳·T·阿茨，安娜·诺丁，克劳迪奥·坎图，安东尼乌斯·L·范·博克斯特尔，蕾妮·范·阿梅隆根 发布日期：2026年3月17日 摘要 基因表达由复杂的转录网络控制，其中转录因子及其对应的增强子整合发育和环境信号。孕酮受体（PR）是一种激素激活的转录因子，对乳房发育和生理至关重要，但它如何与染色质及谱系特异性辅因子相互作用尚不清楚。通过无偏的方法，我们鉴定了上皮转录因子颗粒头样2（GRHL2）是激素响应性乳腺癌细胞PR活性的关键共调控因子。我们表明GRHL2与PR的相互作用与孕激素无关。在孕激素刺激下，GRHL2和PR都会被招募到目标基因的远端增强子元件。此外，结合GRHL2和PR的元件通过染色质环路进行空间连接，调控共享靶点。这些发现揭示了一种此前未被发现的机制，即GRHL2和PR通过染色质结合和三维基因组结构修饰协调基因调控，使GRHL2成为类固醇激素受体功能的关键调节因子。 作者简介 基因表达受到调控网络的严格控制，其中转录因子整合了发育和环境信号。激素是这类信号中的重要类别。在乳腺组织中，孕酮激素对正常发育和功能至关重要。孕酮结合其受体——孕酮受体，这是一种调节孕酮响应基因活性的DNA结合蛋白。然而，孕酮受体是否以及如何与谱系特异性辅因子协同调控基因表达，至今仍未完全明了。本研究中，我们确认GRHL2是激素响应型乳腺癌细胞孕酮受体的关键共调控因子。我们发现，这两种蛋白即使在没有激素刺激的情况下也会相互作用。在孕酮暴露时，这两种蛋白都会被招募到调控共享目标基因的调控区。重要的是，我们证明这些调控区域通过长距离DNA环路物理连接，实现基因表达协调。我们的发现共同为激素驱动的基因调控提供了新的见解，并强调GRHL2是乳腺细胞中孕酮受体功能的重要贡献者。 数据 Table 1Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Table 1Fig 1Fig 2Fig 3 引用： Aarts MT， Nordin A， Cantù C， van Boxtel AL， van Amerongen R （2026） 乳腺细胞中GRHL2的机理性解离及PR转录共调控。PLoS Genet 22（3）： e1012088。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088 编辑： 莫妮卡·P·科莱亚科沃，美国哈佛医学院 收到： 2025年12月10日;接受： 2026年3月9日;发布日期： 2026年3月17日 版权所有： © 2026 Aarts 等。这是一篇开放获取文章，根据知识共享署名许可协议（Creative CC Attribution License）发布，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是必须注明原作者和来源。 数据可用性： 所有相关数据均包含在手稿及其支持信息文件中。原始数据可通过开放科学框架获取，时间为 https://osf.io/9uqsw。 资金来源： RvA感谢荷兰科学研究组织（OCENW）的资助。KLEIN.169 + NWO ALW VIDI 864.13.002。CC感谢Cancerfonden（21 1572 Pj和24 3487 Pj 01 H）、瑞典研究理事会、Vetenskapsrådet（2021–03075和2023-01898）、Additional Ventures（SVRF2021-1048003）、林雪平大学、Joanna Cocozzas基金会的支持。CC是Wallenberg分子医学（WCMM）和SciLifeLab的会士，并获得Knut和Alice Wallenberg基金会的慷慨资助。MTA感谢对Claudio Cantù实验室进行CUT&RUN实验的研究访问的资金支持，资金来自Landelijk Netwerk voor Vrouwelijke Hoogleraren（LNVH，2024/2025年女性生物学进步基金）和Genootschap ter bevordering van Natuur-， Genees- en Heelkunde。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决策或手稿准备中没有参与。 利益冲突： 作者们宣称不存在竞争利益。 简介 基因表达受到复杂的转录网络严格调控，其中DNA结合转录因子（TFs）起着核心作用。这些网络通过整合细胞内在的发育线索和外在环境信号，决定基因何时何地表达[1]。TFs结合调控DNA元件中不同的基序，调节转录输出[2–4]。TFs不单独作用，而是以组合组装形式工作，并加入额外的转录因子、辅因子和染色质重塑因子。这种分层调控结构确保不同基因表达项目以细胞类型和情境特异性方式执行，使得专门化的细胞身份在整个发育过程中出现，并在成年组织中得到忠实维护[5,6]。 类固醇激素受体是一类独特的转录因子，其特点是作为配体激活受体和基因表达的直接调节者。与许多具有固定性DNA结合活性的转录因子不同，类固醇受体功能由特定激素的存在外在调控。配体结合后，这些受体在细胞核中积累，并动态地与染色质上的激素反应元件结合，调控转录程序[7]。 这一类受体包括雌激素受体（ER），它具有独特的DNA结合基序，以及3-酮类固醇受体，它们共享共识序列：孕酮受体（PR）、矿物皮质激素受体（MR）、糖皮质激素受体（GR）和雄激素受体（AR）。ER和PR由卵巢激素激活，是产后乳腺组织发育的关键调控因子[8–10]。在该组织中，它们几乎完全在一类腔内细胞中表达，称为成熟腔内细胞或激素感知细胞。鉴于ER在激素依赖性乳腺癌中的作用（及其靶向性），大多数注意力都集中在解决ER的信号机制上。PR信号的分子机制尚不完全明了，但它调控了多条细胞内在和副分泌信号通路。这些通路促进局部增殖和基底膜重构[11]，进而支持妊娠期间导管的生长、侧支和肺泡生成[10]。因此，PR对乳腺发育和生理至关重要，抗孕激素也被积极从乳腺癌预防和治疗的角度探讨[12]。 类固醇受体如ER和PR并非孤立作用，而是在涉及额外相关蛋白的复杂调控网络中发挥作用。其中，先锋因子（一类能够调节染色质可及性）的转录因子[13]，越来越被认可为类固醇受体活性的关键协调控因子，尤其是在激素依赖性癌症中[14]。例如，ER与FOXA1和GATA3等先驱因子合作，促进其目标基因的转录激活[15–20]。相比之下，公关在类似互动中的程度仍不十分理解。Grainyhead-like 2（GRHL2）最近被认为是激素受体阳性癌症（包括乳腺癌）中的潜在先驱因子[21]。然而，迄今为止几乎所有研究都聚焦于GRHL2在内质网和雌激素信号传导中的作用，其在PR和孕激素介导调控中的作用尚未深入探讨[22–26]。 本研究中，我们鉴定并剖析PR与GRHL2（GRHL蛋白家族成员）之间的功能转录相互作用。该家族包括三种进化保守的先驱转录因子（GRHL1、GRHL2和GRHL3），在上皮细胞中发挥重要作用[27,28]。它们共享高度保守的DNA结合结构域，并表现出显著的结构同源性[29,30]。尽管有这些相似之处，GRHL家族成员展现出独特的时空表达模式，并执行独特的上皮转录程序，支撑其特定的生物功能。 本文结合基因组学、转录组学和蛋白质组学方法，首次对人类乳腺癌细胞中PR和GRHL2的协调转录活性进行了机理性剖析。我们表明PR和GRHL2可以独立于孕酮相互作用，并且在孕酮刺激下常常共占增强子元素。此外，GRHL2 是调控一组 PR 靶基因所必需的。染色质环路分析进一步揭示了共享（即同一DNA元素）和不同（即线性分离的DNA元素）PR和GRHL2结合事件如何在三维染色质空间中长距离收敛，调控共同靶点。我们的发现共同揭示了由GRHL2和三维基因组结构塑造的新PR基因调控层。 选举结果 GRHL2与PR以孕酮无关的方式物理相互作用 为了在无偏载人机中鉴定GRHL2的核相互作用体，我们在T47DS细胞中进行了内源蛋白（RIME）快速免疫沉淀质谱（RIME）[31]（图1A）。在剥离血清、非激素刺激条件下，我们鉴定出2352个GRHL2相关蛋白，包括若干此前报道的核相互作用物，如FOXA1 [18]、KMT2C/D （MLL3/4） [32]、GRHL1 [27,33]（图1B）。在这2352个相互作用体中，共有103个被标记为转录因子或染色质关联/修饰蛋白，基于Panther分类系统[34]。我们通过MaxQuant蛋白识别分数对这些蛋白质进行了排名，以识别并突出高置信度候选者（图1C）。有趣的是，得分最高的几个相互作用体，如CTBP1、MTA2、SMARCC2、SMARCD2、CHD3和PHF6，都参与染色质可及性和重塑，这符合GRHL2作为染色质可及性先驱因子和调节因子的既定功能[28]（见图1C）。 缩略图 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 图1。 对GRHL2相关蛋白的RIME分析显示，GRHL2-PR的相互作用与孕酮无关。 A）内源性蛋白快速免疫沉淀质谱（RIME）[31]方案的示意概述，该方案用于识别激素耗竭和孕激素处理条件下的GRHL2相互作用体。B）火山图，展示激素耗竭条件下GRHL2 RIME与IgG对照组的结果。每个灰色点代表质谱中识别的单一蛋白质。灰色虚线表示Log2FC（-3,3）和-Log10（p值）截止值（0.05）。共有2352种蛋白质符合这些标准，因此被鉴定为GRHL2相互作用物。红色高亮点为一些此前报道的GRHL2互助体示例[18,27,32,33,35]。C）根据Panther分类系统，呈现103个GRHL2相互作用体，作为转录因子或染色质关联/修饰蛋白过滤的词云[34]。蛋白质名称的大小和颜色代表基于MaxQuant蛋白识别得分（Andromeda分数和）对已识别相互作用的置信度，反映了蛋白质检测的相对置信度。D）在激素耗竭及PR激动剂R5020刺激条件下4小时1 nM相互作用的共免疫沉淀法西墨迹验证。西部印迹显示GRHL2和PR，A和B异构体，输入蛋白和免疫沉淀样本。E）火山图，展示GRHL2 RIME在激素耗竭与4小时1 nM R5020治疗条件下的结果。每个灰色点代表质谱中识别的单一蛋白质。灰色虚线表示Log2FC（-3,3）和-Log10（p值）截断值（0.01）。只有2个蛋白（1个缺失，1个增加）符合这些标准，并被鉴定为高置信度的孕酮依赖性GRHL2相互作用物。蓝色高亮点表示失去GRHL2的蛋白质，红色高亮点表示获得GRHL2结合的蛋白质。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.g001 出乎意料的是，PR成为这些剥离血清条件下最强健的GRHL2相互作用体之一，表明两者之间存在激素独立关联（见图1B-C）。我们通过在激素剥离载体处理和激素剥离的R5020（PR激动剂）处理的T47DS细胞中共同免疫沉淀验证了该相互作用，确认GRHL2–PR相互作用未受孕激素刺激影响（见图1D）。有趣的是，我们发现GRHL2主要结合PR的全长且转录活性的同工型PR-B，但不结合PR-A（见图1D）。 由于GRHL2-PR相互作用不依赖于孕酮的存在，我们想知道孕酮是否以及如何改变GRHL2的相互作用组。因此，我们在合成孕激素R5020处理4小时后，也在T47DS细胞中进行了GRHL2 RIME检测（见图1E）。与未治疗状态的比较显示，仅有少量相互作用受影响。仅有一种蛋白TAB2在孕激素刺激下与GRHL2的相互作用丧失。相反，同样只有一种蛋白CCNB1仅在激素存在时被招募（见图1E）。这些差异性相互作用蛋白未被归类为转录因子或染色质调控因子，迄今文献中尚无与孕酮或PR直接相关性的报道，尽管两者都被认为与乳腺癌有关[36,37]。由于GRHL2-PR相互作用本身尚未被功能性表征，我们后续分析将重点放在这一潜在的转录伙伴关系上。 GRHL2和PR DNA结合的全局定位揭示了增强子位点的共占性 为确定GRHL2与PR的相互作用是否发生在共享基因组位点，我们重新分析了T47D细胞中两份此前已发布的CHIP-seq数据集，分别针对GRHL2[23]和PR[38]。值得注意的是，GRHL2数据集是在剥离血清条件下生成的，因此代表了雌激素和孕激素耗尽条件下GRHL2的结合。PR数据集同样在剥离血清条件下生成，但这里细胞同时被1 nM R5020刺激。在本次分析中，我们识别出46,746个PR峰和28,925个GRHL2峰。其中6,335个位点重叠，占PR的13.5%，GRHL2结合事件总数的21.9%（见图2A）。图2B展示了这样一个GRHL2-PR共享区域的例子。通过热图可视化PR和GRHL2结合在仅PR、仅GRHL2和GRHL2-PR重叠位点的结合，显示最强的PR和GRHL2信号集中在重叠区域，尽管部分GRHL2信号也在最强PR峰被检测到，反之亦然（见图2C-D）。GRHL2和PR信号在定义的重叠峰之外共存的观察表明，它们的功能协作很可能超出了我们分析中严格阈值化的位点（图2C-D）。对PR和GRHL2 ChIP-seq峰的基因组注释显示，PR（~66%）和GRHL2（~57%）位点，包括重叠的PR-GRHL2（~61%）位点，都位于远端基因间或内含子区域的增强子处（见图2E）。值得注意的是，GRHL2-PR重叠区域对应于R5020刺激条件下由H3K27ac标记的活性增强子（见图2F）。GRHL2峰比含PR峰更频繁地位于转录起始位点（TSS）以内（约占所有GRHL2峰的25%，GRHL2-PR共享位点的~17%）<（见图2E）。此外，根据ATAC-seq（图2G）确定，GRHL2–PR重叠区域比仅PR或仅GRHL2的染色质更常与可及染色质相关（图2G）。一致地，siRNA介导的GRHL2敲低改变了GRHL2–PR共享位点的染色质可及性，表明GRHL2有助于维持这些区域的可及性（见图2G）。基序分析确认PR和GRHL2基序在单独峰和重叠峰中均有强烈富集（S1A图）。此外，PR或GRHL2结合区以及GRHL2-PR重叠区被富集为FOXA1基序。此外，TEAD基序在GRHL2结合区（包括GRHL2-PR重叠位点）中特异性富集。这表明FOXA1和TEAD在乳腺组织中作用于与GRHL2和PR相似的调控区域（S1A见图）。 缩略图 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 图2。 GRHL2和PR在基因组中共同结合调控区域。 A）维恩图，显示未处理的GRHL2[23]芯片序列与1 nM R5020刺激PR[38]ChIP-seq峰的重叠。如果峰重叠至少1个碱基对，则视为重叠。B）两个PR峰和GRHL2峰重叠的代表性例子。数据在IGV浏览器中进行可视化[39]。NT = 未治疗。C）热图显示未处理的GRHL2结合ChIP-seq信号[23]和1 nM R5020在仅PR、仅GRHL2和GRHL2-PR共占的基因组区域刺激PR[38]。D）信号强度图，显示GRHL2[23]和1 nM R5020在仅PR、仅GRHL2和GRHL2-PR共占基因组位点的累计ChIP-seq信号[38]。E）所有PR、所有GRHL2或GRHL2-PR共享峰的基因组注释，均由ChIPseeker进行[40,41]。位点被注释为5'UTR、先驱子、第一外显子、其他外显子、第一内含子、其他内含子、3'UTR内含子、远端基因间区及下游。推动器区域分为三个子类别，定义为：< TSS的1 kb、1-2 kb的TSS或2-3 kb。F）信号强度图，显示H3K27ac在仅PR、仅GRHL2和GRHL2-PR共占基因组位点30分钟内，R5020刺激T47D细胞的累计ChIP-seq信号[42]。G）信号强度图，显示siControl和siGRHL2 T47D细胞在仅PR、仅GRHL2和GRHL2-PR共占基因组位点的累计未处理ATAC信号[43]。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.g002 接着我们询问孕酮是否以及如何调节GRHL2染色质结合。为深入了解此类结合动态，我们在激素缺乏T47DS细胞中，在未刺激和孕激素刺激条件下对GRHL2和PR进行了CUT&RUN分析。在无激素刺激且血清剥离条件下，我们鉴定出7,039个GRHL2峰，而在4小时R5020处理后识别出5,520个GRHL2峰（见图3A）。其中只有713个地点重叠。此外，R5020刺激下GRHL2信号显著增强，表明GRHL2染色质结合在R5020刺激下既重新分布又增强（见图3A）。这种效应不太可能仅仅通过GRHL2蛋白水平的增加来完全解释，因为4小时的R5020处理仅略微提升了GRHL2蛋白水平，最多增加了20%（且统计学上无显著意义）（S2A-B图）。对于PR，我们在R5020刺激4小时后识别出3033个峰值。重叠GRHL2和PR峰显示，GRHL2和PR结合位点仅在R5020处理条件下重叠（158位点，图3B，S1B-S1C）。 对这些位点的基序分析确认了PR和GRHL2基序的富集，如预期（图3C）。鉴于PR和GRHL2在孕酮存在和缺失时均生化相互作用（图1），这表明PR的活化促进GRHL2对孕酮反应性染色质元件的招募。 缩略图 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 图3。 CUT&RUN揭示黄体酮刺激后的GRHL2重分布。 A）显示CUT&RUN GRHL2信号在未处理且4小时1 nM R5020刺激条件下的状态，分布于激素耗竭状态（GRHL2缺失）、激素枯竭和R5020刺激条件下结合GRHL2（GRHL2保守）或GRHL2结合于R5020刺激条件下（GRHL2增益）的站点。B）热图显示GRHL2在未处理且4小时1 nM刺激条件下的CUT&RUN信号，以及仅PR时GRHL2和4小时1 nM R5020刺激条件下的PR信号，GRHL2在R5020刺激条件下结合，GRHL2在R5020刺激与PR共占CUT&RUN峰值时表现。C）通过HOMER基序分析确定，所有未处理的GRHL2峰、所有R5020处理的GRHL2峰、所有R5020处理的PR CUT&RUN峰，以及所有GRHL2处理后的R5020和PR共占CUT&RUN峰中富集的前5个转录因子基序[44]。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.g003 将我们的CUT&RUN信号绘制在图2中识别的GRHL2结合峰和GRHL2-PR共享ChIP-seq峰上，也证实了这些位置GRHL2结合依赖性的增加（S1D图）。在未处理条件下观测到的CUT&RUN GRHL2信号虽然强度有所降低，但也与GRHL2结合和GRHL2–PR共享的ChIP-seq峰有大量重叠。值得注意的是，我们在R5020刺激条件下的PR切断和运行信号不仅在PR束缚和GRHL2-PR共享ChIP-seq峰处富集，也在仅GRHL2的ChIP-seq峰处得到浓缩。这些综合观察表明，出于某种原因，T47DS中R5020刺激的GRHL2切断与运行状态与此前报告的T47D未刺激GRHL2 ChIP-seq数据相呼应。 综合来看，PR和GRHL2可以独立结合DNA，但也可能在增强子区域重叠。此外，在孕激素刺激下，GRHL2染色质结合会被强化和重新分布。这支持了PR和GRHL2协同协同进行激素依赖转录调控的模型。 GRHL2和PR共同调控参与乳腺发育的部分基因 接下来，我们试图识别由GRHL2和PR调控的转录程序。为此，我们通过稳定的shRNA介导敲低GRHL2（S2A-B图）生成了T47DS细胞，并对野生型和GRHL2敲低T47DS细胞进行了RNA测序，分别用R5020进行4小时或R502024小时处理。主成分分析（PCA）显示，97%的基因表达变异由R5020刺激（PC1）或GRHL2敲低（PC2）解释，证实了对实验条件的强健转录反应（S2C见图）。为识别直接且持续的GRHL2与PR共调基因，我们基于三项标准进行了严格筛选：1）R5020处理4小时后基因表达差异，2）R5020处理24小时后基因表达差异显著，3）GRHL2耗竭后R5020转录反应显著改变（见图4A）).应用这些标准，我们识别出298个同时受PR和GRHL2调控的基因（见图4B）。基因本体富集分析识别出参与信号转导和细胞过程的基因，以及包括腺体发育在内的若干发育过程（见图4C）。我们验证了qRT-PCR对选定目标基因（包括GRHL2本身、IGFBP5和TGFB2）的表达变化（见图4D）。这些结果共同揭示了大量基因由GRHL2和PR共同调控，证实了它们在激素响应型乳腺癌细胞中的共调作用。 缩略图 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 图4。 GRHL2和PR共同调控参与乳腺发育的靶基因。 A）野生型（WT）T47DS细胞及shRNA介导的GRHL2基因降（shGRHL2）T47DS细胞，在1 nM R5020刺激24小时后，体体RNA测序过程的概览，以及选择GRHL2和PR共调基因的标准。B）对WT和shGRHL2 T47DS细胞的体量RNA测序数据进行热图，该细胞被1 nM R5020刺激，持续4小时或24小时。热图显示了根据（A）中列出的标准选择的298个基因的无监督聚类和表达变化。表达式值以n=3次重复时的z分数表示。NT = 未治疗的剥离血清状态，T = 处理过的状态。C）点阵图，显示对298个选定的GRHL2和PR共调基因进行Go项富集分析。富集分析和图生成使用Clusterprofiler完成[49]。D）qRT-PCR数据条形图，显示WT或shGRHL2 T47DS细胞中，1 nM R5020处理4小时后GRHL2、IGFBP5和TGFB2的平均相对表达。参考基因：YWHAZ。数据点：n=2/3个生物复制体的个别值，以平均重叠变化为对照标准化。P值采用双因子方差分析计算，随后进行未校正费舍尔最低显著差异检验。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.g004 我们进行了首次探索性分析，以评估由GRHL2和PR共调控的298个基因的潜在临床相关性。为此，通过cBioPortal下载了METABRIC（乳腺癌分子分类国际联盟）队列的临床和转录组数据，该队列包含1980个原发性乳腺肿瘤[45–48]。其中940个肿瘤被归类为PR阴性，1,040个被归类为PR阳性。事实上，分配的PR状态与PGR mRNA表达水平对应（S3A见图）。值得注意的是，PR阴性和PR阳性肿瘤之间的GRHL2表达无差异（S3B图）。 随后，我们计算了GRHL2/PR综合特征评分，并根据中位数将肿瘤分为高特征组和低特征组。Kaplan–Meier分析显示，高特征表达患者的总体生存率显著降低（见S3C图），并经多变量Cox回归（调整年龄和肿瘤分期）证实了这一关联（HR = 1.055,95% CI 1.030–1.080，p = 1.1 × 10 ⁻ ⁵）。 反直觉的是，PR阳性肿瘤的特征评分显著低于PR阴性肿瘤（S3D图）。由于低签名评分与生存率提升相关，我们使用多变量Cox模型及交互项测试了签名的预后影响是否因PR状态而异。相互作用无显著性（HR = 1.038,95% CI 0.976–1.103，p = 0.24），表明较高的特征表达与PR阳性和PR阴性肿瘤的较差结局相关。 由此我们初步得出结论，虽然GRHL2/PR特征与较差预后有关，但这与PR状态无关。然而，重要的是要注意，本分析属于探索性质。原发肿瘤的功能性PR信号难以直接评估，细胞系模型可能无法完全重现肿瘤生物学。因此，还需要进一步验证和分层分析，以进一步评估乳腺癌患者PR/GRHL2评分的预后价值。 染色质环连接GRHL2和PR位点与远端目标基因 尽管我们对三维基因组组织的理解取得了重大进展，但功能上将增强子与其目标基因连接仍具挑战性[50]。在大多数研究中，增强子被分配到最近的基因，尽管实际上33–73%的增强子并不一定调控其最近的基因[51–53]。这很重要，因为PR以及许多其他转录因子经常与距离其真实相关TSSs在30 kb到1 Mb之间的远端增强子结合[54,55]。高分辨率染色质构象捕捉技术——如Hi-C、5C、ChIA-PET和HiChIP——能够识别对转录调控至关重要的长程染色质相互作用[50]。 基于此，我们试图物理连接基因组中的GRHL2和PR位点（由ChIP-seq，见图2）与它们调控的基因（由RNA-seq识别，见图4）。我们推断，如果GRHL2或PR位点参与特定基因的调控，它应当环路到该基因的TSSs。为验证该假设，我们使用了之前发表的PR HiChIP数据集，该数据集使用T47D细胞获得[38]。HiChIP是Hi-C的延伸，通过富集由感兴趣的转录因子或组蛋白修饰结合的DNA相互作用，捕捉蛋白质特异性染色质环。每个染色质环包含两个锚点，分别位于两端，代表通过三维染色质环路被带到接近的相互作用DNA区域。PR HiChIP在R5020刺激30分钟后，捕获了7,076个无刺激PR染色质环，以及9,591个在一个或两个锚点处发生PR染色质环（图5A）。其中仅有987个环重叠，显示PR介导染色质在R5020刺激后30分钟内发生显著重连（图5A）。 缩略图 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 图5。 对HiChIP、ChIP-seq和RNA-seq的整合分析揭示了功能性的GRHL2–PR环。 A）维恩图，显示未处理（T0）条件下PR HiChIP环路与30分钟10 nM R5020处理状态（T30）之间的重叠情况。数据重绘（即Zaurin等人[38]B）的被调用环数，甜甜圈图显示了GRHL2和PR调控基因的转录起始位点（TSS）比例，这些位置与先前发表的PR HiChIP锚点重叠[38]。在通过RNA-seq识别的298个GRHL2和PR调控基因中，有79个基因具有与HiChIP锚点重叠的TSS。剩余219个基因的TSS与HiChIP锚点不重叠。C）通过染色质环路可视化GRHL2和PR峰如何汇聚ARF6基因启动子，显示PR ChIP-seq [38]峰、GRHL2 ChIP-se序列[23]峰和PR HiChIP环[38]，直接锚定于GRHL2/PR调控的TSS。锚点按GRHL2和PR占用率着色，如右下角图例所示，没有GRHL2、PR ChIP-seq信号或带注释TSS的锚点被定义为“其他”。基因TSS用灰色条高亮显示。数据在IGV浏览器中进行可视化[39]。D）甜甜圈图，展示了HiChIP[38]锚点占用率，分类为与GRHL2峰值、PR峰值、TSS或这三者的组合重叠。包含的292个锚点（146个环中每个两个）与79个GRHL2的TSS和PR调控基因相关，这些基因与HiChIP[38]锚点重叠。E） 定义为与GRHL2、PR、GRHL2 + PR ChIP-seq峰或其他在146个选定HiChIP [38]环路对对面锚点重叠的锚点频率的可视化表示。这121个环路被选中至少有一个锚点具有PR ChIP-seq峰值。线条的颜色和粗细代表出现频率。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.g005 接下来，我们将PR HiChIP数据与GRHL2及PR ChIP-seq和RNA-seq数据整合。这里，我们使用了之前发布的 ChIP-seq 数据，而非新生成的 CUT&RUN 数据集，因为 HiChIP 在方法论上与 ChIP 更为相似，因此更有可能有效整合。首先，我们从RNA-seq分析中提取了全部298个GRHL2-PR共调控基因，评估其TSS是否与至少一个HiChIP环的锚点重叠。通过该方法，我们鉴定出79个基因在转录上受GRHL2和PR调控，且在其TSS附近或附近也拥有PR HiChIP环锚点（图5B）。我们共识别出146条直接连接79个GRHL2和PR调控基因的环路（图5B-5C）。这些环路长度可达500kb，大多数跨度为50–100kb（S4A见图）。随后我们想知道GRHL2和PR是否能在这146个环的锚点被探测到。因此，我们对GRHL2和PR ChIP-seq数据进行了比对，以评估它们在每个锚点的占用情况。对于所有146个环路，我们根据是否存在GRHL2和/或PR ChIP-seq峰和/或TSS对相关的292个锚点进行了分类（见图5C，5D）。 在注释锚点中，26%在GRHL2和PR之间共享（~相较整个ChIP-seq数据集富集为两倍，见图2B），其中14%位于或接近TSS。 另有29%仅含有PR峰，其中15%位于或靠近TSS，11%仅含有GRHL2峰，其中2%位于或接近TSS（见图5D）。值得注意的是，21%的环锚属于“其他”类别，意味着它们缺少GRHL2、PR或TSS注释（见图5D）。我们假设这些锚点可能被参与GRHL2和PR靶基因联合调控的其他转录调控因子占据。为探讨这一可能性，我们专门在这些位点进行了基序富集分析（S4B图）。该分析未发现此前与乳房有特异关联的转录因子。然而，我们观察到STAT3的显著富集，这一因子在GRHL2 RIME中也被观察到（图1C），表明STAT因子可能参与GRHL2和PR发挥功能的三维调控情境（S4B图）。 为进一步探讨GRHL2与PR在基因调控中的协同功能，我们分析了它们在PR HiChIP环对向锚点的占有情况（见图5E）。这里，我们只包含了至少在两个锚点中有一个有PR ChIP-seq峰值的环路，因此总共选择了121个环路。其中，~56%至少含有一个锚点同时含有GRHL2和PR ChIP-seq峰，表明GRHL2-PR介导基因调控最常见的方式可能是GRHL2和PR与至少一个调控元件的共结合（见图5E）。尽管如此，GRHL2与PR占有的其他组合也被观察到，表明不同结合GRHL2和PR的元件可以通过三维染色质结构趋同，共同调控基因表达（见图5E，S4C）。 此外，一些PR、GRHL2或GRHL2-PR重叠的峰不仅与基因启动子建立了直接连接，还与额外的GRHL2和PR（以及其他转录因子）结合位点相互作用（S4C见图）。 GRHL2和PR转录共调的整合模型 CTCF和内腭介导的环路已被广泛认可为促进长程增强子-启动子相互作用的关键机制[56]。在我们的RIME中，我们发现GRHL2与多个Cohesin复合组分及相关调控因子相关（S5A图）。此外，公开的CTCF [42]和RAD21 [42]在未处理和30分钟R5020处理条件下的ChIP-seq数据集显示，虽然CTCF结合相对稳定，但RAD21与染色质结合在R5020处理后高度富集（S5B-C 图）。由于TAD边界在R5020存在与否下相对稳定[57]，我们假设部分GRHL2/PR/TSS相互作用由CTCF/Cohesin介导的环路介导，从而在GRHL2–PR增强子与其靶启动子之间的空间接近度中起作用。我们推测，在孕酮存在的情况下，RAD21/Cohesin复合物可能与GRHL2一起被招募到染色质中。 综合所有数据，我们提出了一个由GRHL2和PR共调控基因的模型，在缺乏激素刺激的情况下，GRHL2和PR已存在于细胞核内，并能够物理相互作用（见图6，左侧）。在此条件下，PR基本不结合其基因组靶位点，而GRHL2则与不一定与GRHL2和PR共调控靶基因相关的区域结合，然而，它很可能已经动态且在更低水平上与共享的GRHL2/PR位点结合（图6，左侧）。大多数由任一或两项因子结合的基因组靶点和调控元件尚未接近其各自目标基因的启动子（见图6，左侧）。在孕酮存在或实验环境中，R5020刺激时，核内GRHL2和PR的水平会微妙上升，转录活性PR被招募到GRHL2/PR共享且仅PR结合位点。同时，在孕激素刺激下，GRHL2染色质结合会被强化和重组。 缩略图 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 图6。 一个展示GRHL2–PR共调控目标基因转录调控的模型。 GRHL2和PR在特定共调控目标基因的调控机制模型。在缺乏激素（左图）的情况下，GRHL2和PR形成一个复合体，GRHL2动态结合于与GRHL2-PR目标基因无关的区域，同时在更低水平下，PR大多不结合染色质。因此，GRHL2和PR不与其靶引导子相互作用。孕酮刺激（右侧）会触发GRHL2和PR被增强子招募，并形成CTCF/内聚蛋白依赖性和独立染色质环路，将由GRHL2、PR或辅因子共结合或单独结合的远端元件与其目标基因连接起来。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.g006 除了相互结合外，GRHL2和PR还与多种协同因子结合。这导致局部GRHL2和PR浓度极高，这得益于CTCF/Cohesin依赖性和-非依赖性环路，将远端增强子与靶向启动子连接（图6，右）。虽然超过一半的PR环增强子至少在一个锚点上被GRHL2和PR共结合，但不同的GRHL2或PR结合元素也会在启动子上收敛（见图6右侧）。此外，多个增强子位点——由GRHL2和/或PR及其他转录辅因子结合——通过直接或间接环路与基因启动子紧密结合，从而高效转录参与孕激素驱动乳腺组织发育和生理的基因（图6，右侧）。 讨论 本研究为先驱转录因子GRHL2与类固醇激素受体PR协调转录调控提供了机制框架。通过整合T47D和T47DS细胞在未刺激和R5020刺激条件下的蛋白质组学、转录组学和基因组分析，我们提出了一个GRHL2和PR共调控靶基因的模型，在缺乏激素的情况下，GRHL2和PR形成一个预组装的核复合体，并与其他染色质修饰因子相关（见图1A-D和图6， 左）。在孕酮刺激下，GRHL2和PR在特定增强子处富集，启动激素依赖性的染色质环路，使远端调控元件（或由GRHL2和PR共结合，或由任一因子单独结合）与其目标基因启动子接触，激活对乳腺发育和生理至关重要的转录程序（图6，右侧）).因此，虽然整体核GRHL2蛋白相互作用组在激素刺激下未发生重大变化（见图1E），但这些发现揭示了一种动态的激素响应调控结构，使乳腺细胞基因表达能够精确时空调控。 利用RIME和共免疫沉淀法，我们鉴定PR在血清脱离条件下是GRHL2的孕酮非依赖性相互作用物。虽然RIME涉及有利于染色质相关蛋白的核富集步骤，但免疫沉淀作用于核裂解液，因此同时捕获染色质结合和可溶性核复合物。因此，在没有配体的情况下观察到的PR–GRHL2相互作用，很可能反映了未稳定结合染色质的核复合物。这与已知配体对稳定PR-DNA结合的要求一致。我们提出PR和GRHL2可能在核质内形成预先存在的复合物，这些复合物在配体刺激下能迅速与染色质结合。与此观点一致，R5020处理后GRHL2结合增强并重新分布，表明预形成的PR–GRHL2复合物可能促进GRHL2快速招募到孕激素响应的基因组区。 GRHL2-PR的相互作用也出现在一项对MCF7和T47D细胞进行PR RIME的研究中[35]，但这里显示为孕激素依赖性。尽管两项研究均检测到PR与GRHL2之间的相互作用，但我们的发现在激素依赖性上存在差异。最可能的解释是穆罕默德等人。[35]采用了一种未治疗的状态，涉及含有内源性雌激素和孕酮的全血清培养基，并能模拟生理激素刺激。相比之下，我们的非刺激样本是在剥离血清条件下获得的。此前研究显示，GRHL2可与其他激素受体结合，即内质网[23,25,58]和AR[59]。具体来说，GRHL2增强了内质网和抗逆体依赖的结合及转录活性[25,59]。在前列腺癌细胞中，GRHL2本身是一个AR靶基因[59]，类似于我们观察到GRHL2在乳腺癌细胞中是PR靶点[60]。由于GRHL2在雌激素、雄激素和孕酮信号通路中发挥作用，在多个激素受体同时表达和活跃的细胞中，GRHL2的结合可能具有动态分布。控制这种分布的机制尚不清楚。值得注意的是，我们发现在T47DS细胞中，且在缺乏雌激素和孕酮的情况下，GRHL2优先与PR结合，且这种相互作用在孕激素刺激下得以维持或可能增强。结合上述研究观察，我们假设在雌激素存在下，无论是单独存在还是与低水平孕酮同时存在，GRHL2可能更倾向于与内质网结合而非PR。这共同引发了关于GRHL2的DNA结合活性和相互作用组在激素波动条件下如何调控，以及这种调节如何促进激素响应细胞的转录程序的重要问题。 本研究仅简要探讨了哪些额外的转录因子可能参与GRHL2–PR介导的基因调控。尽管如此，我们在PR-、GRHL2-和GRHL2-共享结合位点的RIME和基序分析中，仍鉴定出若干转录因子及其家族。例如，FOXA1在GRHL2、PR和GRHL2–PR共享区域的全基因组分析中，成为富集最强的基序之一（S1A图），同时也是我们PR CUT&RUN数据中富集基序中的典型，这与其在成熟腔体内的核心作用一致[43,61–63]。有趣的是，FOXA1的耗竭被报道会增加增强子位点的PR结合[64]，表明FOXA1在某些情况下可能与PR竞争增强子占有率。综合来看，这些观察表明，虽然GRHL2和FOXA1在某些环境下可能合作，但GRHL2与PR的协调活性很可能在很大程度上独立于FOXA1发生。同样，在我们的RIME分析中检测到了GATA3和TRPS1，且在ChIP-seq数据中，GATA基序在仅PR、仅GRHL2和GRHL2–PR共享区域中得到丰富。鉴于GATA3与内质网表达和功能相关[19,20]，它可能在协调内质网/PR活性方面扮演类似GRHL2的角色。最后，STAT1、STAT3和STAT6被鉴定为GRHL2的相互作用体，且在ChIP-seq数据中，STAT结合基序在仅PRs、仅GRHL2及GRHL2-PR重叠位点富集。IL/STAT 信号此前已被关联于内质网和 PR 通路[65,66]，但据我们所知，本研究是首个将 GRHL2 与 STAT 信号联系起来的证据，值得进一步探讨其潜在的功能相互作用。 我们的CUT&RUN分析显示，当孕酮存在时，GRHL2染色质结合会重新分布并增加。此前未曾报道，但这与GRHL2作为直接PR靶点[60]以及先前研究显示雌激素治疗能促进全基因组GRHL2结合增加[58]相符。有趣的是，我们发现R5020处理后检测到的GRHL2 CUT&RUN峰（未治疗条件下检测不到）与非激素刺激条件下ChIP-seq识别的GRHL2位点重叠（S1D见图）。这种差异可能由原始ChIP-seq实验中残留的激素活性或方法学差异解释：与ChIP-seq不同，CUT&RUN不涉及交联，因此更可能捕获稳定的DNA-蛋白质相互作用。短暂、较弱或间接的相互作用，如动态转录因子如GRHL2和PR，可能只有在稳定（如激素治疗）后才能通过CUT&RUN检测到，而ChIP-seq则可能更容易捕捉这些相互作用。这些方法学和生物学差异也可能解释为何我们的CUT&RUN数据中识别出的GRHL2和PR峰数量比重新分析的ChIP-seq数据集少近两个数量级（见图3B与图2B）。 归根结底，确定单个增强子的精确功能并准确将其与目标基因连接仍具挑战性。这一困难主要源于增强子的位置，它们通常距离其调控的基因相当远，同时它们能够绕过附近和夹杂的基因。尽管如此，绘制增强子与靶基因关系对于理解增强子在正常生物学和疾病中的功能至关重要。在缺乏单独实验验证的情况下，基于染色质构象的方法目前是预测增强子-启动子相互作用的最有效方法。因此，我们利用PR HiChIP数据将GRHL2和/或PR位点与其目标基因连接起来。虽然这种方法比将峰值分配到最近基因更能提供更高的目标分配置信度，但也存在局限性。值得注意的是，我们使用的PR HiChIP数据集是在孕激素刺激后的早期时间点（即30分钟）生成的。虽然这使得最早的GRHL2–PR共调靶点被识别，但额外的时间点将捕捉更广泛的相互作用动态范围，增加可分配靶点数量，并为PR介导的增强子-启动子环路的时间动态提供见解。此外，由于该数据集以PR为中心，它无法捕捉那些不直接涉及PR但可能收敛于相同启动子的GRHL2介导染色质环。因此，我们可能低估了GRHL2调控影响的范围以及GRHL2–PR共调控靶基因的整体分布。然而，分开PR和GRHL2 HiChIP数据集也不理想，因为它们无法直接检测PR和GRHL2重叠锚点。遗憾的是，目前尚未开发出测量两种转录因子蛋白质导向基因组结构的方法。 总之，本研究通过整合基因组学、转录组学和蛋白质组学数据，拓展了我们对乳腺上皮中孕酮信号调控景观的认识。我们发现了GRHL2与PR之间此前未被发现的合作关系，通过动态染色质结合和三维基因组组织协调激素响应基因表达。我们的模型假设，在缺乏激素的情况下，GRHL2和PR会形成复合物，但在这种条件下，它们并不能稳定地结合染色质。孕激素刺激招募GRHL2-PR复合物到增强子，随后形成染色质环，将远端元素与目标基因启动子连接起来。GRHL2、PR或辅因子的共结合或个体结合随后激活关键转录程序。该模型为理解GRHL2–PR介导的基因调控提供了广泛的框架。然而，我们发现每个目标基因最终都由一组独特的远端元素单独或联合结合，这些因子由GRHL2、PR及其他转录因子结合，这些因子环路到其启动子。我们的综合分析强调了这些调控相互作用的复杂性和基因特异性，展示了仅仅两个转录因子相互作用即可产生的复杂性。 研究的局限性 虽然我们的多组学方法提供了激素无关性物理相互作用的证据，支持GRHL2和PR在孕激素刺激下的协调增强子占有，但仍需承认若干局限性。首先，尽管我们展示了PR与GRHL2的共居、染色质环路以及协调转录调控，但GRHL2调节PR依赖增强子活性的具体分子机制仍未解决。特别是GRHL2究竟主要作为先驱因子、共调控因子的支架，还是参与环状形成的结构成分，以及GRHL2是否影响PR结合动力学，需要进一步的机制分析。其次，大部分分析是在T47D（S）细胞中进行的，这些细胞过度表达PR。尽管该细胞系是极少数对PR反应的细胞系之一，能够受控地探究GRHL2/PR的交叉调控，但它并未反映内源性化学计量或生理调控。因此，进一步验证我们在其他细胞系和乳腺（癌症）模型中的发现，对于评估所提出调控机制的普遍性和生物学相关性将非常重要。第三，由于目前只有一种功能良好的GRHL2抗体可用，该抗体被用于所有实验，包括RIME、Western blots和CUT&RUN分析，以及我们重新分析的之前生成的ChIP-seq数据集。尽管经过精心筛选并广泛使用，我们未能通过替代的GRHL2抗体确认数据，也无法正式排除与GRHL1的交叉反应性。最后，仅在mRNA水平评估了GRHL2/PR共调控基因的功能验证。虽然转录组变化稳健且可重复，但由于技术限制，包括缺乏合适的抗体，无法对关键靶点如IGFBP5和TGFB2进行蛋白质级验证。因此，转录变化在蛋白质丰度和下游细胞表型变化中的影响程度仍有待确定。 材料与方法 细胞培养 人类T47DS乳腺癌细胞（由荷兰乌得勒支胡布雷希特研究所Stieneke van den Brink博士慷慨捐赠）和HEK293TN细胞（System Biosciences，#LV900A-1）常规培养在含有GlutaMAX（Gibco，#11584516）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM），并补充10%胎儿牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，#11573397）。细胞每3-4天以1：10比例分割，并常规检测支原体。处理后，T47DS细胞在含GlutaMAX（Gibco，#11584516）的DMEM中培养，辅以5%活性炭剥离胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，#A3382101）24小时，随后在指示时间内刺激1 nM R5020（Perkin Elmer，#NLP004005MG），同样在剥离血清条件下进行。 T47DS GRHL2 敲击线的生成 为产生慢病毒，5× 10⁶ HEK293TN细胞种子于10厘米的培养皿中。次日，细胞被转染3微克包装载体pCMVDR8.2（Addgene，#8455）、3微克RSV-rev（Addgene，#12253）、3微克VSV-G（Addgene，#12259）和8微克pLKO.1 GRHL2 shRNA载体（RNAi联盟，TRCN0000015812;阿姆斯特丹联合卫理公会Peter Stroeken慷慨赠送）。24小时后，培养基进行更新。转染后48小时采集病毒上清液，通过0.45微米滤纸过滤，并以1：2比例稀释。T47DS细胞在聚苯（1：2,000;默克米利普尔，#TR-1003-G）存在下被病毒上清液感染。孵育24小时后，细胞被切割并用普罗霉素（1 μg/mL，Thermo Fisher Scientific，#A1113803）选拔，以产生稳定的GRHL2敲低系。 内源性蛋白快速IP-质谱（RIME） RIME分析按照Mohammed等人之前描述的方式进行[31]。简要，6x107每种条件下，T47DS 通过向培养基中加入甲醛（Thermo Fisher Scientific， #28908）至最终浓度为1%，交联8分钟。反应通过将甘氨酸加入至最终浓度0.1 M来淬火。细胞被用冰冷的PBS洗涤两次，辅以蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，#P8340,1：500），并通过刮除板块收集。随后通过离心法将细胞沉淀为2,000克，浸泡3分钟，浸泡在4°C，并使用溶解缓冲液LB1（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5,140 mM NaCl，1 mM EDTA，10%（vol/vol）甘油，0.5%（vol/vol）天然-40,0.25%（vol/vol）Triton X-100）。随后在4°C旋转5分钟时，再次对LB2进行裂解（10 mM Tris-HCL（pH 8.0）、200 mM NaCl、1 mM EDTA和0.5 mM EGTA）。 随后将样品重新悬浮于LB3中（10 mM 三盐酸（pH 8.0）、100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、0.1%（重量/体积）脱氧胆酸钠和0.5%（体积/体积）N-月烯酸盐），并分成三根独立的Eppendorf管，在Bioruptor pico中进行超声波处理。（Diagenode）在4°C下使用30秒的开关循环，持续10个周期。再次将超声波样本合并，加入Triton X-100至最终1%体积，并通过离心清除裂解液。与此同时，Dynabeads（蛋白A、Invitrogen、#10001D）在含有5 mg/ml BSA的PBS中洗涤了四次。在室温下，将5 μg GRHL2抗体（Sigma Aldrich，#HPA004820）和IgG（Santa Cruz，#sc-2027X，作为阴性对照）结合在PBS/BSA溶液中，在室温下共轭1小时。通过超声核裂解液与抗体共轭的珠子混合，并在4°C下旋转培养过夜。次日，用RIPA缓冲液（50 mM HEPES（pH 7.6）、1 mM EDTA、0.7%（重量/体积）脱氧胆酸钠、1%（体积/体积）NP-40和0.5百万LiCl）洗涤，共洗涤十次。对于每个实验条件，三个独立处理的样本被并行处理，代表用于评估可重复性的重复样本。 此后，阿姆斯特丹大学斯瓦默丹生命科学研究所生物分子质谱实验室负责处理和分析。简而言之，输入样本的处理方式如Hughes等人[67]所述。蛋白质浓度通过Pierce BCA蛋白质检测法（Thermo Fisher Scientific， #23227）定量，按照制造商的方案进行，所有样品均一次性还原并烷基化。根据Mohammed等人[31]，拉下样品被珠状消化。肽样品使用Ultimate 3000 RSLCnano UHPLC系统（德国格默林根Thermo Fisher Scientific）与TIMS-TOF Pro质谱仪（德国不来梅布鲁克）进行分析。原始数据使用MaxQuant（版本2.6.2.0）处理，胰蛋白酶/P被指定为消化酶，允许最多遗漏两个切割。半胱氨酸的氨甲酰甲基化被设定为固定修饰，甲硫氨酸的氧化则为可变修饰。光谱与人类单蛋白蛋白组数据库进行了检索。MaxQuant IBAQ输出值用于Perseus（版本2.1.3.0）进行下游分析。潜在污染物、仅通过携带一个或多个修饰氨基酸的肽鉴定的蛋白质，以及从诱饵序列中识别出的蛋白质被过滤掉。取值采用Log2变换，且每个实验组缺失一个值的行被丢弃。其他NaN值被从正态分布中替换，三次技术重复实验利用两样本学生t检验和基于置换的假发现率（FDR）修正以识别多重测试中不同条件间表达的蛋白质。采用了FDR<0.05的显著阈值。诱饵蛋白GRHL2具有2折叠富集为3.3且为-Log10（padj）2.2。原始和处理后的RIME数据通过以下渠道公开：https://osf.io/9uqsw/。 共免疫沉淀 在T47DS细胞中共免疫沉淀GRHL2，利用约3个×10⁸细胞完成。细胞在皿上直接用含有蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，#P8340,1：500）清洗一次，然后通过刮擦采集。颗粒化细胞被重新悬浮在溶解缓冲液中（50 mM 三盐酸（pH 7.40）、5 mM EDTA、0.25% Triton X-100、10% 甘油、100 mM NaCl）中，并在4°C下培养30分钟，并轻柔旋转。裂解液通过离心法在2000×克、4°C下20分钟清除。 上清液的一小块被保留为整个裂解液控制的输入。剩余裂解液在4°C下与5 μg GRHL2抗体（Sigma-Aldrich，#HPA004820）轮流孵育。次日早晨，加入50微升预平衡的Dynabeads蛋白A（Invitrogen，#10001D），并在4°C下旋转样品1小时。 珠子用裂解缓冲液洗涤三次，结合蛋白通过在洗脱缓冲液中煮沸（50%裂解缓冲液，50%Laemmli缓冲液;Sigma-Aldrich，#38733）在95°C下持续5分钟。随后通过西部印迹分析了洗脱后的蛋白质。 西部污点 西方印迹法如前所述进行[68]。简而言之，一半的免疫沉淀或输入样本被装入10%的SDS-PAG凝胶上。蛋白质通过转印涡轮转移系统（Bio-Rad）转移到0.2微米的硝化纤维素膜上，并用1：1稀释的TBS和Odyssey阻断缓冲液封闭（LI-COR Biosciences， #927–50100）。膜在4°C下过夜孵育，稀释原级抗体于阻断缓冲液中，补充0.1% Tween-20：抗PR（1：1,000，Thermo Fisher Scientific，#MA5–16393，识别PR-A和PR-B）和抗GRHL2（1：2,000，Sigma-Aldrich，#HPA004820）。次日，膜在补充0.1% Tween-20的TBS中洗涤，并在RT下与稀释1：20,000的次级抗体及0.1% Tween-20在TBS中孵育1小时：IRDye 680LT（LI-COR，#926–68022）或IRDye 800CW（LI-COR，#926–32211）。信号检测使用奥德赛Fc成像系统（LI-COR生物科学）完成。 RNA分离、文库制备及RNA测序分析 RNA的分离、处理和RNA测序分析均如前所述[69]。总之，70万个T47DS WT或GRHL2敲低细胞（稳定shRNA）被植入含有DMEM + GlutaMAX（Gibco，#11584516）的6孔板中，并辅以5%含炭的胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，#A3382101 年）。电镀后24小时，培养基进行更新，细胞再用1 nM R5020或乙醇（载体对照）处理24小时。按照制造商说明，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，编号#74104）并进行柱上DNA酶消化（Qiagen，RNase-Free DNase Set，编号#79254）进行RNA分离。 为文库制备，使用NEBNext Poly（A）mRNA磁分离模块（新英格兰生物实验室）对1微克总RNA进行了poly（A）选择。RNA测序文库使用NEBNext Ultra II定向RNA文库制备套件和NEBNext多重寡核（Dual Index 引物对;新英格兰生物实验室），遵循制造商的规范。使用配备安捷伦D1000屏幕磁带的2200 TapeStation系统（安捷伦科技）评估了图书馆规模分布。定量工作使用NEBNext库定量套件，在QuantStudio 3实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上完成。库通过NextSeq 500/550高输出套件v2.5（75周期）在NextSeq 550系统（Illumina）上进行序列（75位元对应单端）。所有图书馆的准备和测序均由阿姆斯特丹大学斯瓦默丹生命科学研究所（Swammerdam Institute for Life Sciences）荷兰基因组服务与支持提供者MAD负责。 原始的FASTQ文件在银河服务器上处理。质量控制使用MultiQC [70]进行，随后用Trimmomatic[71]通过策划的适配器列表对过度代表序列进行裁剪。通过HISAT2对截断读序列比对到人类参考基因组（GRCh38.p14）[72]。映射质量通过SAMtools统计评估，并用MultiQC总结。读取计数使用HTSeq计数[73]获得，并在RStudio（版本2023.06.1）中使用DESeq2进行差异基因表达分析[74]。这些数据已以编号GSE291778存放于NCBI GEO。通过 https://osf.io/9uqsw/ 以下网站，298个GRHL2和PR共调控基因，以及79个由GRHL2和PR转录调控且在其TSS附近拥有PR HiChIP环锚点的基因的Log2fold变异列表。通过Clusterprofiler R包的enrichGO（）函数对选定的PR和GRHL2调控基因进行Go项富集[49]。 RNA分离与qRT-PCR RNA分离和qRT-PCR的操作如前所述[68]。简而言之，按照制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen，#15596018）从T47DS细胞中提取了总RNA。分离的RNA被RQ1 DNase（Promega，#M6101）处理以去除基因组DNA污染。cDNA合成采用SuperScript IV逆转录酶（Invitrogen，#18090200）和随机六聚体（Invitrogen，#N8080127），并加入了RiboLock RNase抑制剂（ThermoFisher，#EO0328）。所得的cDNA样本在qRT-PCR前被稀释了10倍。定量实时PCR使用5台HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix Plus（ROX）（Solis Biodyne，#08-24-00008）在QuantStudio 3实时PCR系统上完成。引物序列列于表1。相对表达水平采用ΔΔCt方法计算，并归一化至YWHAZ[75]及未处理对照样本。 缩略图 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 表1。 用于qRT-PCR的引物。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.t001 CUT&RUN 低容积尿素（LoV-U） CUT&RUN LoV-U 的执行方式如 Zambanini 等人所述。[76]，并进行了以下修改。每个样本约采集50万个T47DS细胞，使用0.25%胰蛋白酶，并在核提取缓冲液中洗涤三次细胞（20 mM HEPES-KOH（pH 8.2）、10 mM KCl、0.5 mM spermidine、0.05% IGEPAL、20% 甘油和罗氏完全蛋白酶抑制剂无EDTA）中分离细胞核。核颗粒被速冻在异丙基腔室中，并以–80°C储存，等待进一步加工。核被解冻，在核提取缓冲液中洗涤一次，随后结合于平衡的磁性ConA琼脂糖珠（抗体在线，#ABIN6952467）。培养后，核珠复合物在洗涤缓冲液（20 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.5 mM spermidine和罗氏完全蛋白酶抑制剂 EDTA-Free，0.025% 地微素）中洗涤5分钟，然后转移到PCR管中。加入抗体（抗PR（1：100，细胞信号，#8757S）、抗GRHL2抗体（1：100，Sigma-Aldrich，#HPA004820）或兔IgG同型对照（1：100，Invitrogen，#100500C））加入洗涤缓冲液中，并在4°C旋转器上隔夜孵育。次日，样品用洗涤液洗涤五次，然后重新悬浮于pAG-MN缓冲液（含120 ng/样品pAG-MN）中，并在旋转器上以4°C培养30分钟。经过五次洗涤后，消化启动，将珠子重新悬浮在补充2 mM CaCl₂的洗涤缓冲液中，并在室温下培养5分钟，随后在4°C下再培养25分钟。 通过添加250 mM EDTA/EGTA混合物，该反应被阻止。通过加入5 M NaCl并在37°C下孵育30分钟，开始释放片段。收集上清液后，将小珠重新悬浮于1个×尿素缓冲液中（100 mM NaCl，2 mM EDTA，2 mM EGTA，0.5% IGEPAL，8.5M 尿素），进行第二次释放步骤。在室温下30分钟后，尿素释放液与初始上清液结合。样品先用SDS和蛋白酶K处理，随后进行酚：氯仿：异戊醇萃取和乙醇沉淀。文库在Illumina NextSeq 550平台上采用36碱基对序端读段测序，深度为每样本500万至1500万次。 CUT&RUN 数据分析 读取质量通过fastQC评估[77]。读取序列通过bbmap bbdud [78]裁剪，以去除适配器和多重[AT]、[G]和[C]重复序列。读段与hg38基因组配对，配对了蝴蝶结2[79]，选项为：–local –very-sensitive local – no-unal –no-mixed -no-discordant –phred33 –dovetail -I 0 -X 500。使用Samtools套件[80]来移除重复和错误配对的读取。Bedtools [81] 用于从 bam 文件中移除映射到 CUT&RUN hg38 嫌疑人列表 [82] 的读取。床图是利用Bedtools genomecov的配对端模式创建的。峰值通过MACS2[83]进行调用，针对窄峰的IgG对照，选项为-f BAMPE和-p 1e-3。CUT&RUN数据已以GSE307203号存入NCBI GEO。 ChIP-seq数据集的再分析 来自PR [38]的原始ChIP-seq数据文件（Control;SRX11374768，并处理了1 nM R5020;SRX11374766）和GRHL2[23]（两个复制体;SRX5350536，SRX5350537）数据集从SRA服务器下载。读取质量使用fastqc[77]（版本0.11.9）评估，随后用Trimmomatic修剪过代表序列适配器和PCR引物[84]。修剪后，读组与hg38基因组与蝴蝶结[79]比对，选项为：局部、极敏感、局部、无一元、无混合、无不和谐、燕尾榫、-I、0、-X500。Samtools [80] 用于将 sam 文件转换为 bam 文件，修复配对错误的配对，并删除重复文件。Bedtools [81] 用于移除映射到 hg38 黑名单区域的读段[85]。可用片段的最终读取计数是从过滤和去重的 bam 文件中确定的。床图是用Bedtools genomecov的配对端模式创建的。在 IGV 中观察到床抓 [39]。为了峰值调用、可视化和信号图，复制的bam文件与SAMtools合并为单一文件。峰值通过MACS2[83]调用，狭窄峰值则有-f BAMPE和-p 1e-3。deepTools [86] 用于将 bam 文件转换为规范化的 BigWig 文件（bamCoverage 使用 -RPGC 选项和 -e 扩展读取至片段长度）。大人物被用IGV形象化;图中显示的轨迹是两个生物复制（GRHL2）或单次复制（PR）合并，归一化为每个基因组覆盖的读段数，并按因子进行尺度化。 下游分析 对于ChIP-seq和CUT&RUN信号强度，均使用deepTools生成了热图和信号剖面[86]。峰值重叠使用床工具计算[81]，要求至少1碱基对重叠。维恩图使用Venndiagram R软件包创建，基因组注释则使用ChIPseeker [40,41] R软件包完成。使用HOMER[44]进行了基序丰富分析，选项为-size 200和-mask。处理了来自R5020刺激T47D细胞的PR HiChIP数据（Zaurin等人）。[38]，GEO注册号：GSM5425945）以.bedpe格式下载，并与549个通过RNA-seq调控的PR和GRHL2基因的TSS区域重叠[81]。选择含有HiChIP锚点的TSS区域进行进一步分析。从ChIPatlas检索了R5020刺激的H3K27ac [42]（SRX22674023）、RAD21[42]（SRX22674036）和CTCF [42]（SRX22674025）的峰值调用ChIP-seq数据集，以及siControl（SRX23397061）和siGRHL2（SRX23397063）的ATAC-seq数据集[43][43]。 临床数据分析 原发性乳腺肿瘤的基因表达和临床数据通过cBioPortal从METABRIC（乳腺癌分子分类国际联盟）队列获取 [45–48]。去除了无基因注释的探针，对于具有多个探针的基因，保留了样本间变异最大的探针。合并了样本和患者层面的临床数据。仅纳入了同时具有临床和表达数据的肿瘤，最终数据集为1,980名患者，用于生存分析。由GRHL2和PR共调控的298个基因（如图4所示）合并为基因签名，使用Hacksig [88]R软件包计算每个肿瘤特征的综合特征评分。上调和下调基因分别评分并合并得出总特征评分。评分在患者间标准化（z评分），高特征组和低特征组以中位数为界限定义。PGR GRHL2的表达水平从表达矩阵中提取用于下游分析，并绘制箱形图比较PR阳性和PR阴性肿瘤间的基因和特征表达。统计显著性通过Wilcoxon秩和检验进行评估。存活数据使用Survival [89,90]和Survminer [91] R软件进行分析。在全队列中，针对高特征与低特征肿瘤生成了Kaplan–Meier生存曲线。存活差异通过对数秩检验进行评估。使用多变量Cox比例风险回归模型评估GRHL2/PR特征评分与总体生存期之间的关联，并调整诊断年龄和肿瘤分期。还测试了交互模型，以评估特征在PR阳性和PR阴性肿瘤间的预后影响是否存在差异。 支持信息 通过CUT&RUN识别的R5020诱导GRHL2结合位点与GRHL2 ChIP-seq序列匹配。 显示1/5：pgen.1012088.s001.tif 跳转到图分享导航 抱歉我们无法加载您的数据。 1 / 5 下载 图格分享 第一季 图。 通过CUT&RUN识别的R5020诱导GRHL2结合位点与GRHL2 ChIP-seq序列匹配。 A）通过HOMER基序分析确定的所有1 nM R5020刺激PR峰、所有未处理的GRHL2峰或GRHL2-PR共享峰中，前五个被确定富集的转录因子基序[44]。B）维恩图，显示4小时1纳米R5050刺激的GRHL2与PR切割与运行峰值的重叠。如果峰重叠至少1个碱基对，则视为重叠。C）两个PR和GRHL2重叠的CUT&RUN峰的代表性例子。数据在IGV浏览器中进行可视化[39]。NT = 未治疗。D）热图显示PR R5020处理后与GRHL2在未处理及4小时1 nM刺激条件下，PR R5020与GRHL2在仅PR、仅GRHL2和GRHL2-PR共享ChIP-seq峰的CUT&RUN信号。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.s001 （TIF） 第二季 图。 验证直接GRHL2-PR靶基因。 A）对野生型（WT）和shRNA介导的GRHL2敲低（shGRHL2）T47DS细胞进行Western blot，刺激1 nM R5020，持续4小时。展示了三个独立的生物复制体。ACTIN被用作加载控制。B）条形图，显示（A）中西部印迹中GRHL2蛋白在ACTIN上的相对表达。个体数值在未处理的WT（对照）上进行归一化。数据点：n=3个生物复制的个体值，表现为均值折叠变化，归一化为对照。P值采用双因子方差分析计算，随后进行未纠正费舍尔最低显著差异检验。C）对未处理（NT）或用1 nM R5020刺激24小时的WT和shGRHL2 T47DS细胞中，所有在整体RNA序列中表达的基因进行主成分分析（PCA）。每个点代表一个复制品;每个组包含 n = 3 个复制体。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.s002 （TIF） 第三季 图。 高GRHL2/PR调控的基因表达与乳腺癌患者的总体生存率降低有关。 A-B）箱型图显示了PGR （A） 和GRHL2 （B） mRNA表达（log2归一化）在METABRIC队列中按PR状态分层分布。单个肿瘤以抖动点表示。C）基于中位GRHL2/PR特征评分，将METABRIC肿瘤分层为高特征组和低特征组进行Kaplan–Meier分析。高特征表达（红色）患者整体生存率显著较低表现（蓝色）差（对数秩检验，P < 0.001）。D）显示METABRIC队列中GRHL2/PR特征评分按PR状态分层分布的箱型图。单个肿瘤以抖动点表示。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.s003 （TIF） 第四季，图。 GRHL2或PR结合增强子可以通过三维染色质环路收敛，共同调控基因表达。 A）146个PR HiChIP[38]环的环径分布密度图，这些环直接连接由RNA-seq确定的GRHL2/PR调控TSS。环路大小以千基（kb）表示。B）选择被认定为富集于不存在GRHL2峰、PR峰或调控TSS锚点的转录因子基序，被定义为“其他”。使用HOMER进行了基序富集分析[44]。C）可视化显示单个非重叠的GRHL2和PR峰，以及通过染色质环路收敛到一个PR峰的ARID5B启动子，显示PR ChIP-seq [38]峰、GRHL2 ChIP-seq [23]峰和PR HiChIP环[38]。灰色条线突出显示ARID5B TSS。橙色条纹突出了PR和GRHL2的各个峰值。数据在IGV浏览器中进行可视化[39]。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.s004 （TIF） S5图。 GRHL2与内聚复合体成员相互作用。 A）火山图，展示激素耗竭条件下GRHL2 RIME与IgG对照组的结果。每个灰点表示质谱中识别的单一蛋白质。灰色虚线表示Log2FC（-3,3）和-Log10（p值）截断值（0.05）2,325个通过这些标准的蛋白质，被鉴定为GRHL2相互作用物。红色高亮点表示已知的内聚蛋白亚基，即与GRHL2显著相互作用的负荷和释放因子。B-C）维恩图显示T47D细胞中未处理与30分钟R5020处理的CTCFChIP-seq峰[42]（B）或未处理与30分钟R5020处理的RAD21 ChIP-seq峰[42]（C）之间的重叠情况。对ChIP-Atlas数据（即称为峰值）的重新分析。如果峰重叠至少1个碱基对，则视为重叠。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1012088.s005 （TIF） 致谢 我们感谢阿姆斯特丹大学斯瓦默丹生命科学研究所生物分子质谱实验室的Gertjan Kramer及其他成员在质谱分析方面的支持。我们还感谢Selina van Leeuwen及MAD：荷兰基因组学服务与支持机构、阿姆斯特丹大学斯瓦默丹生命科学研究所的其他成员，提供测序服务。感谢发育、干细胞与癌症生物学（DSCCB）组的同事以及斯瓦默丹生命科学研究所细胞与系统生物学主题的其他同事，在项目期间给予了富有成效的讨论和反馈。我们要感谢坎图实验室所有成员在我们CUT&RUN实验中的指导。我们特别感谢我们的实习硕士生Jeltje Rommens，他在识别GRHL2和PR调控基因方面提供了初步分析和工作流程设置。 参考文献 1.克莱姆SL、希波尼Z、格林利夫WJ。染色质可及性与调控表观基因组。国家牧师热内。2019;20(4):207–20.PMID：30675018 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 2.Ravasi T、Suzuki H、Cannistraci CV、片山S、Bajic VB、Tan K等。小鼠与人类组合转录调控图谱。细胞。2010;140(5):744–52.PMID：20211142 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 3.费多罗娃 E， Zink D. 核结构与基因调控。生物物理学报。2008;1783(11):2174–84.PMID：18718493 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 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