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一、 引言：荧光影像引导手术的临床需求与技术概述 外科手术干预目前仍是治疗大多数实体瘤的基石。然而，过去几十年来，即便有快速的术中组织病理学评估，肿瘤阳性手术切缘的总体发生率仍停滞在15%至60%之间。头颈癌、脑癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和胃肠道癌等多种癌症的局部复发率增加和不良预后均与阳性切缘相关。 近年来，在精准外科理念的驱动下，荧光对比剂在手术领域的术中应用取得了显著进展。术中荧光分子成像通过为外科医生提供可见的荧光图像，在手术中发挥引导作用。在临床应用中，荧光对比剂能够清晰勾勒肿瘤边界，具有高识别能力和实时引导能力。此外，它们还能定位淋巴结转移、检测微小转移病灶并在术中识别关键解剖结构，从而降低附带损伤的风险。 一种理想的手术引导技术应具备无辐射、高灵敏度、良好分辨率、可调视野和快速成像的特点。增强荧光的组织穿透能力和分子探针的靶向能力，对于提供更全面的肿瘤相关数据至关重要。此外，筛选和识别其他肿瘤生物标志物及其相应的靶向分子数据，对于提高分子成像的特异性至关重要。最后，研究和利用生物相容性和成像性能更优的多种近红外荧光染料，对于设计用于术中导航的合成探针至关重要。开发新型、高效、安全的荧光对比剂是当前药物研发的关键方向。 二、 基于小分子的对比剂2.1 吲哚菁绿（ICG）影像引导肿瘤手术 ICG是目前最普遍的近红外荧光成像剂，已获FDA批准用于体内使用。其机制依赖于肿瘤细胞与正常细胞代谢率的差异，从而能够准确识别癌组织并界定肿瘤边界和手术切除范围。ICG目前用于多种肿瘤的术中导航和切除，包括乳腺癌、结直肠癌和肝细胞癌。 在肝胆外科中，ICG被广泛应用于术中识别肝胆管结构。Swijnenburg等人使用ICG介导的荧光对结直肠癌肝转移灶进行成像，因为此类转移灶术后切缘难以达到且常被漏诊。Zhou等人验证了ICG引导肝癌肺转移灶完全切除的能力，ICG可显示肺转移灶并检测到难以通过辅助检查区分的小肿瘤。Ishizawa等人的研究显示，在机器人辅助肝切除术中，几乎所有肝肿瘤患者的肝脏表面在ICG作用下均发出荧光，这为外科医生在切除肝肿瘤时确定阴性切缘提供了极好的基础。 在乳腺癌手术中，ICG的应用也展现出潜力。Tong等人的研究表明，ICG引导的乳腺肿瘤切除术是一种良好的方法，无论肿瘤位置深浅，均能增强术中的荧光信号，术后结果显示乳腺肿瘤几乎被完全切除。此外，ICG还能可视化肿瘤的淋巴引流，这对于确定手术切除范围至关重要。Baiocchi等人的研究证实，ICG引导的淋巴结清扫术效果良好，可作为辅助手段。 2.2 基于Cysview（5-ALA）的影像引导肿瘤手术 5-ALA是一种常用于光动力疗法的光敏剂。其在体内代谢为PpIX，由于肿瘤内铁螯合酶活性低，导致PpIX在近红外蓝/紫光激发下发出与正常组织不同的红色荧光。 5-ALA长期以来用于神经外科手术中靶向神经系统肿瘤。Andreana等人对人胶质瘤组织进行了5-ALA标记的宏观荧光寿命成像，获得了白光和胶质瘤荧光图像。Marcua等人不仅监测了5-ALA代谢产生的PpIX荧光，还监测了肿瘤的时间分辨NADPH荧光，这不仅能区分神经肿瘤和正常脑组织，还能同时监测体内肿瘤微环境的变化。Kon等人探索了5-ALA荧光成像在术中识别小型隐匿性肝肿瘤中的作用，对肝细胞癌患者实现了100%的诊断特异性。Widhalm等人报道了使用5-ALA对脊髓室管膜瘤进行术中荧光成像，在保留良好神经功能的同时，实现了肿瘤的几乎完全切除。 2.3 基于异硫氰酸荧光素（FITC）的影像引导肿瘤手术 FITC是一种众所周知的荧光素衍生物，但其吸收峰与生物组织中血红蛋白的吸收峰相似，常导致周围组织自发荧光的干扰，降低了其在肿瘤中的荧光成像性能。 在神经外科中，FLS常用于高级别胶质瘤的术中成像和最大程度切除。Parkinson等人使用低剂量荧光素进行荧光成像，并将其与MRI进行比较，结果证实了其应用优势和可行性，在胶质瘤手术中表现出高特异性和灵敏度，且无副作用。Mou等人研究了FLS在髓母细胞瘤手术中的应用，FLS荧光在原发和转移病灶中均明显，且无相关副作用。Romanski等人证明，对各类良性神经上皮脑肿瘤患者施用高剂量荧光素钠，可使这些肿瘤在手术中呈现黄绿色，增强了术中可见度。三、 基于抗体的靶向对比剂3.1 抗表皮生长因子受体（EGFR）影像引导肿瘤手术 EGFR是ErbB跨膜酪氨酸激酶受体家族的成员，在多种实体瘤中过表达。利用这一特点，可构建基于抗体的靶向荧光剂，实现肿瘤特异性荧光成像。 Sheng等人合成了一个靶向肿瘤EGFR的荧光探针，他们用环境敏感的小分子荧光团丹磺酰氯和硝基苯并恶二唑取代吉非替尼的吗啉基团，得到了具有开关机制的EGFR荧光分子探针，在活细胞荧光成像和异种移植瘤的体内成像中表现出色。Witjes等人将西妥昔单抗与荧光团连接，用于解决口腔鳞癌手术切缘不足的问题，术后统计学阳性切缘的灵敏度高达100%。Kumar等人将西妥昔单抗与IRDye 800CW耦合，在临床前模型中实现了荧光成像，与强度为基础的连续波荧光成像相比，荧光寿命成像能提供显著的肿瘤对比度增强。Kumar等人还证实了帕尼单抗-IRDye800CW在头颈癌患者中成像肿瘤细胞、建立术中切除边缘的可行性。 3.2 抗CD47影像引导肿瘤手术 CD47是一种在多种细胞表面表达的蛋白，作为“自我标记”信号，癌细胞利用CD47逃避免疫系统的识别和破坏。CD47靶向成像剂可以识别并结合癌细胞上的CD47，从而定位癌组织并指导治疗干预或手术。 Liao等人将抗CD47抗体与FITC或Qdot 625连接，用于活体膀胱癌患者的内镜成像，在检测原位癌、肿瘤切除床残留癌等方面表现出极高的特异性和灵敏度。Yang等人使用连接Alexa Fluor 790的抗CD47荧光探针，验证了抗CD47成像尿路上皮癌的可能性。他们进一步证明，CD47靶向近红外分子也可用于下尿路肿瘤，ICG-抗CD47在离体膀胱肿瘤中对不同类型膀胱肿瘤的特异性达到100%。 3.3 抗人表皮生长因子受体2（HER2）影像引导肿瘤手术 HER2在多种癌症中高表达，其胞外域的可及性使其成为靶向递送抗肿瘤药物和成像剂的理想靶点。 Dai等人报道了一种HER2抗体缀合的近红外发射MnCuInS/ZnS量子点封装牛血清白蛋白纳米探针，用于HER2阳性乳腺癌细胞的精准靶向成像。Belloli等人提出并评估了一种多功能二氧化硅纳米颗粒系统，可作为单光子发射CT成像放射性示踪剂和化疗药物载体。Allard-Vannier等人开发了超顺磁性氧化铁纳米颗粒-Cy-PEG-scFv纳米系统，在体外对乳腺癌细胞表面过表达的HER2具有高亲和力，能在体内实现HER2阳性肿瘤的选择性MRI标记。Evdokiou等人研究了结合HER2 Affibody-IR700Dye和曲妥珠单抗-IR700Dye缀合物的近红外光免疫疗法，该组合能增强近红外光免疫疗法对抗HER2阳性乳腺癌细胞的效果。Gao等人基于不可逆的HER1/HER2双抑制剂阿法替尼，设计合成了底物竞争性（可逆）近红外荧光分子Cy3-AFTN和Cy5-AFTN，在活细胞和肿瘤异种移植瘤成像方面展现出潜力。 四、 自组装对比剂 自组装材料是指结构单元（分子、纳米材料等）自发形成有序结构。其在生物医学领域逐渐发展并受到广泛关注，被引入肿瘤检测和治疗的多个方面。4.1 体外自组装对比剂 4.1.1 聚合物纳米颗粒影像引导肿瘤手术 许多纳米材料可在进入肿瘤前自发聚集成聚合物，形成胶束、空心囊泡和纤维等纳米结构。Jin等人利用聚合物纳米平台，将阿霉素（DOX）与聚集诱导发光（AIE）发色团四苯基乙烯（TPE）耦合并包裹在聚合物胶束内，用于成像和杀伤肿瘤。合成的PMPC-hyd-TPE胶束具有良好的生理稳定性和较低的蛋白吸附，在后续研究中显示出高效的肿瘤蓄积和释放能力。Wang等人将分子TAP与靶向TPE和PD-L1的肽KYNETWRSED结合，在溶液中形成超分子自组装肽基纳米纤维结构，实现了AIE分子在肿瘤部位的增强富集和肿瘤的长期成像。 4.1.2 脂质体纳米颗粒影像引导肿瘤手术 脂质体是首个成功应用于临床的纳米药物递送平台，其成分通常为两亲性磷脂和胆固醇，可作为载体制备荧光材料，具有生物相容性、可降解性、组织靶向性和在病灶部位有效停留时间延长等优点。 Sheng等人使用生物相容性良好的脂质体作为载体，封装了三种花青素染料（ICG、IR780和FD1080）。该脂质体封装策略显著提高了亮度，并在兔模型中进行图像引导肿瘤手术验证，改善了近红外二区荧光成像效果。Liu等人使用肿瘤靶向内化RGD（iRGD）肽修饰，构建了诊断治疗平台iLIPICG，使用iRGD-PEG-DSPE作为脂质载体封装ICG，提高了ICG的稳定性，使得小鼠肿瘤在24小时后仍保持高荧光强度，可用于光热疗法和监测喉癌的光疗效果。Zou等人开发了一种基于碳酸氢铵脂质体载体的肿瘤触发荧光成像靶向材料，在肿瘤酸性微环境中，PEG5000脱落，封装的ICG发挥其监测、治疗、成像和光热治疗能力，同时脂质体在高温下分解并释放化疗药物DOX以实现抗肿瘤功效。 4.1.3 无机纳米颗粒影像引导肿瘤手术 无机成像纳米材料是指成像和其他组分连接形成无机材料的成像剂。其优势在于可利用无机材料的特性实现药物的靶向递送和控释缓释。 Srivastava等人利用金纳米颗粒（AuNPs）并将其与石墨烯量子点共载到脂质体上形成多功能脂质体，在近红外光（750 nm）下实现了肿瘤的高精度检测和治疗。作为发光材料，镧系金属-有机框架（LnMOFs）在生物成像等领域展现出应用前景。Meng等人开发了多功能诊断平台EuMOF@ZIF/AP-PEG，为了克服其在溶剂和离子环境中的快速降解，通过电荷吸附机制在其表面密集组装沸石咪唑酯框架（ZIF）结构起到保护作用，该设计利用LnMOFs的铕增强荧光使荷瘤小鼠体内的肿瘤发出强烈的红色荧光，并能显著抑制肿瘤细胞生长。 4.2 体内响应性和自组装对比剂 4.2.1 pH触发体内自组装 由于肿瘤细胞的快速生长，能量代谢从有氧呼吸转向糖酵解（Warburg效应），导致肿瘤微环境呈弱酸性。这种pH差异足以设计在多个方向上响应pH的纳米材料。 Hest等人合成了肽-卟啉缀合物（PWG），利用甘氨酸的羧基作为酸敏感单元与疏水卟啉核连接。在肿瘤区域的弱酸性环境中，PWG发生质子化，促进材料内部氢键形成和自组装，形成有序的纳米纤维结构，显示出清晰的长期荧光和小鼠体内的高靶向特异性。Wang等人开发了一个响应酸性肿瘤微环境的近红外二区窗口治疗和监测平台，利用近红外二区分子PT-3作为核心通过酯化形成组装体，在肿瘤酸性微环境中酯键断裂，荧光分子PT-3释放并组装成微米级颗粒，实现长期肿瘤监测。Tang等人将注意力转向晶体结构，开发了具有Au(I)-二硫化物复合物单晶结构的纳米片（NSs），在肿瘤溶酶体的酸性微环境中，半胱氨酸残基质子化，导致从单晶结构向多晶纳米结构转变，实现肿瘤的长期追踪。 4.2.2 酶触发体内自组装 多种酶（如MMP-2/9、FAP-α、ALP、组织蛋白酶B、caspase 3等）在肿瘤区域过表达，这些高表达的酶为设计具有各种酶响应的纳米材料提供了条件。 ALP响应： Tan等人设计了具有近红外特性的ALP荧光探针NALP，首次应用于活裸鼠肿瘤组织和异种移植瘤中ALP的荧光成像。Yoon等人生成了AIEgen探针（DQM-ALP）成像ALP活性，该探针能有效区分离体和体内肿瘤与正常组织。Chen等人将ICG端对端掺杂到响应ALP刺激形成的纳米纤维结构中产生J-聚集体，形成了高效、特异的肿瘤诊断方法。Cai等人使用香豆素染料（Cou）设计荧光探针区分正常和肿瘤细胞。Ye等人合成了近红外FL/PET双模探针P-CyFF-68Ga，在荧光和PET肿瘤检测方面表现突出。 组织蛋白酶B响应： Liu等人开发了一种用于增强肿瘤光声成像的肽，组织蛋白酶B响应片段GFLG在肿瘤微环境中被切割，促进卟啉基声敏剂purpurin 18（P18）的其余部分原位组装成J型聚集体，不仅延长了荧光片段在肿瘤组织内的停留时间，还诱导声敏剂产生更多ROS。Hai等人开发了两种肿瘤特异性组织蛋白酶B响应的FL/PA探针，使用Val-Cit和Gly-Phe-Leu-Gly两种组织蛋白酶B响应片段，在肿瘤细胞溶酶体中过表达的组织蛋白酶B切割后释放被笼蔽的HCy荧光基团，实现早期癌症的特异性FL/PA成像。Yoon等人将两个花青素片段（CyA和CyB）通过组织蛋白酶B激活肽（Glyph-Leu-Gly）连接，在肿瘤内被组织蛋白酶B切割后失去FRET效应而产生强近红外荧光。 Caspase 3/7响应： Rao设计了caspase敏感的纳米聚集基荧光探针（C-SNAF），具有近红外光谱特性，并通过缩合化学发生刺激自组装，可用于有效监测体内肿瘤的治疗反应。Wang等人设计了一个在肿瘤部位具有高穿透性和持续发光、对肝肾组织毒性低的TCASS系统，通过将近红外发光元件Cy与肿瘤识别序列AVPIAQK和caspase 3响应片段DEVD连接，设计自组装纤维超结构，在肿瘤部位实现连续聚集和发光。Hai等人报道了荧光探针Bio-DEVD-HCy，其caspase 3响应片段在到达肿瘤部位时被切割，取消了半花青素染料（HCy）的氨基笼蔽，激活了探针的分子内电荷转移效应，实现肿瘤部位的持续发光和肿瘤凋亡监测。Song等人利用AIEgens的良好光稳定性和高亮度，设计了肿瘤特异性荧光探针AuNNP@DEVD-INT20，AIE分子（INT20）与caspase 3响应肽DEVD连接，在肿瘤内高caspase 3水平响应下，INT20释放并激活形成发光聚集体。 4.2.3 氧化还原触发体内自组装 肿瘤微环境中的氧化还原失衡是另一个重要的生理特征。肿瘤细胞通常表现出谷胱甘肽（GSH）水平升高和活性氧（ROS）水平升高，这为设计氧化还原响应性纳米材料提供了机会。 谷胱甘肽（GSH）响应： 肿瘤细胞内的GSH浓度（2-10 mM）远高于细胞外环境（2-20 μM），这种浓度梯度可用于触发纳米材料的解组装或组装。研究人员设计了含有二硫键的肽基材料，在肿瘤细胞内高GSH环境下，二硫键被还原断裂，释放出疏水片段并发生自组装。例如，将ICG通过二硫键连接到亲水性聚合物上，形成前药纳米颗粒，在肿瘤细胞内GSH作用下释放ICG并形成J-聚集体，实现肿瘤特异性成像和光热治疗。 活性氧（ROS）响应： 肿瘤细胞由于代谢异常和线粒体功能障碍，产生大量ROS（如H2O2、O2•-、•OH）。研究人员利用这一特性设计了ROS响应性探针。例如，将含有硫醚或硼酸酯基团的ROS响应性连接子与荧光染料连接，在肿瘤区域高ROS环境下，连接子被氧化断裂，释放荧光染料并发生聚集诱导发光。这种策略不仅提高了探针的特异性，还增强了荧光信号强度。4.2.4 其他刺激响应性自组装 除了pH、酶和氧化还原响应外，其他肿瘤微环境特征也被用于设计响应性自组装材料： 缺氧响应： 肿瘤区域由于血管生成异常和快速增殖，常处于缺氧状态。研究人员设计了含有硝基咪唑或醌类基团的缺氧响应性探针，在缺氧环境下被还原酶还原，释放荧光染料并发生自组装。例如，将硝基咪唑与近红外染料连接，在肿瘤缺氧区域被还原后，染料释放并形成纳米聚集体，实现缺氧肿瘤的特异性成像。 温度响应： 利用肿瘤区域的温度略高于正常组织（约1-2°C），设计了温敏性聚合物材料。这些材料在体温下呈溶解状态，在肿瘤区域轻微升温后发生相变并自组装成纳米颗粒，实现肿瘤特异性富集和成像。五、 多模态成像对比剂 为了克服单一成像模式的局限性，研究人员开发了多模态成像对比剂，将荧光成像与其他成像技术（如MRI、CT、PET、光声成像等）相结合，提供更全面的诊断信息。5.1 荧光/MRI双模态对比剂 荧光成像具有高灵敏度和实时性，而MRI具有高空间分辨率和深层组织穿透能力。将两者结合可实现优势互补。例如，将超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）与近红外荧光染料（如Cy5.5、ICG）共轭，形成双模态探针。SPIONs提供T2加权MRI对比度增强，而荧光染料提供近红外荧光信号。这种探针可用于术前MRI引导肿瘤定位和术中荧光导航肿瘤切除。5.2 荧光/CT双模态对比剂 CT成像具有高空间分辨率和快速成像速度，但灵敏度较低。将CT对比剂（如金纳米颗粒、碘基对比剂）与荧光染料结合，可在术前通过CT精确定位肿瘤，术中通过荧光成像实时导航切除。例如，金纳米颗粒具有高X射线吸收系数和表面等离子体共振特性，可同时用于CT成像和光热治疗。5.3 荧光/PET双模态对比剂 PET成像具有极高的灵敏度（可达皮摩尔水平），但空间分辨率较低。将PET放射性核素（如18F、64Cu、68Ga）与荧光染料结合，可在术前通过PET精确定位微小转移灶，术中通过荧光成像实时导航切除。例如，将18F标记的靶向肽与近红外荧光染料连接，形成双模态探针，用于肿瘤的早期诊断和术中导航。5.4 荧光/光声双模态对比剂 光声成像结合了光学成像的高对比度和超声成像的深层穿透能力。将荧光染料与光声对比剂结合，可在同一激发波长下同时获得荧光和光声信号。例如，ICG不仅具有近红外荧光特性，还具有良好的光声性能，可作为双模态对比剂。此外，一些AIEgens（聚集诱导发光分子）也具有优异的光声性能，可用于荧光/光声双模态成像。六、 临床转化与应用前景6.1 临床转化现状 目前，已有多种荧光对比剂进入临床试验阶段。ICG是首个获得FDA批准的近红外荧光成像剂，已广泛应用于肝胆外科、乳腺外科、结直肠外科等领域的术中导航。5-ALA（Cysview）也已获得FDA批准用于神经外科胶质瘤的术中荧光成像。此外，多种靶向荧光探针（如抗EGFR、抗HER2、抗CD47等）正在进行临床试验，显示出良好的安全性和有效性。6.2 技术挑战与解决方案 尽管荧光影像引导手术技术取得了显著进展，但仍面临一些技术挑战： 穿透深度限制： 近红外一区（NIR-I，700-900 nm）的组织穿透深度通常为1-2 cm，限制了其在深部肿瘤中的应用。近红外二区（NIR-II，1000-1700 nm）成像具有更深的组织穿透能力（可达5-10 cm）和更高的信噪比，是未来的发展方向。开发NIR-II荧光染料和成像设备是当前的研究热点。 特异性不足： 许多荧光对比剂在肿瘤区域的富集依赖于增强的渗透和滞留效应（EPR效应），但EPR效应在人类肿瘤中存在较大异质性。提高探针的靶向特异性是关键。通过设计靶向配体（如抗体、肽、小分子）修饰的探针，可提高肿瘤特异性富集。 毒性问题： 一些纳米材料（如量子点、金纳米颗粒）的长期毒性尚不明确，限制了其临床转化。开发生物相容性好、可降解的纳米材料是必要的。例如，基于脂质体、聚合物、多肽的自组装材料具有良好的生物相容性和可降解性。 标准化问题： 不同设备、不同操作者之间的成像结果存在差异，需要建立标准化的成像协议和定量分析方法。开发自动化的图像分析软件和标准化的荧光强度校准方法有助于提高结果的可重复性。6.3 未来发展方向 个性化精准医疗： 基于肿瘤分子分型的个性化荧光探针是未来的发展方向。例如，针对HER2阳性乳腺癌、EGFR突变肺癌等特定分子亚型，开发相应的靶向荧光探针，实现精准诊断和个体化治疗。 诊疗一体化： 将诊断和治疗功能整合到同一探针中，实现"诊疗一体化"。例如，将荧光成像剂与化疗药物、光敏剂、免疫调节剂等结合，在成像的同时实现治疗，提高治疗效果并减少副作用。 人工智能辅助： 利用人工智能技术分析荧光图像，自动识别肿瘤边界、评估切除边缘、预测预后，提高手术的精准度和效率。深度学习算法在医学图像分析中的应用已显示出巨大潜力。 多中心临床试验： 开展大规模、多中心临床试验，验证新型荧光对比剂的安全性和有效性，推动其临床转化。国际合作和多中心研究有助于加速技术推广和应用。七、 结论 荧光影像引导手术技术通过为外科医生提供实时、高对比度的肿瘤可视化，显著提高了手术的精准度和安全性。基于小分子的对比剂（如ICG、5-ALA）已广泛应用于临床，基于抗体的靶向对比剂和自组装对比剂展现出巨大的应用潜力。多模态成像对比剂将荧光成像与其他成像技术相结合，提供了更全面的诊断信息。 尽管仍面临穿透深度、特异性、毒性和标准化等挑战，但随着新型荧光染料、靶向策略和成像设备的不断发展，荧光影像引导手术技术将在肿瘤精准外科中发挥越来越重要的作用。未来，个性化精准医疗、诊疗一体化和人工智能辅助等方向将推动该技术的进一步发展和临床转化，为肿瘤患者带来更好的治疗效果和生活质量。