Human papillomavirus vaccine [types 16, 18](GlaxoSmithKline Plc)

摘要：你可能想不到，我们接种的新冠疫苗、对抗癌症的免疫疗法，背后可能藏着 “昆虫的功劳”。昆虫细胞系作为一种神奇的 “生物工厂”，既能高效生产重组蛋白，又能完成复杂的蛋白修饰，还能大幅降低制药成本。本文从昆虫细胞培养的百年发展史说起，拆解它的制药原理、技术突破和实际应用，带大家认识这个生物制药界的 “低调王者”，看看小小的昆虫细胞如何撑起疫苗、抗癌药等多种生物制品的生产重任。 一、百年探索：昆虫细胞如何从实验室走向制药厂？ 昆虫细胞培养的故事，要从 100 多年前说起。1907 年，科学家哈里森成功在体外培养出动物细胞，开启了细胞培养的新时代。1915 年，戈德施密特首次将这种技术用到昆虫身上，成功培养出天蚕蛾的精子细胞，不过当时只能存活三周。 早期的昆虫细胞培养困难重重，没有合适的培养基、容易被细菌污染，根本无法长期存活。直到 1956 年，怀亚特研发出一种复杂的合成培养基，包含 20 多种氨基酸、无机盐和糖类，才让家蚕细胞得以正常生长分裂。真正的转折点出现在 1962 年，托马斯・格雷丝用 “粗放培养法”，意外获得了首个能连续传代的昆虫细胞系，还优化出至今仍在使用的培养基。 之后的几十年里，科学家们陆续开发出多种实用的昆虫细胞系。1977 年诞生的 Sf21 细胞系，因容易被病毒感染、增殖速度快，成为生产重组蛋白的 “主力军”；1983 年衍生出的 Sf9 细胞系，稳定性更优；1992 年发现的 High Five™细胞系，蛋白产量比 Sf9 还高 2 倍。如今，全球已建立超过 1500 种连续昆虫细胞系，其中 90% 都来自鳞翅目和双翅目昆虫。 图1 昆虫细胞培养发展里程碑二、核心技术：昆虫细胞如何 “变身” 蛋白生产机？ 昆虫细胞之所以能成为生物制药的核心工具，关键靠两种主流技术：杆状病毒表达载体系统（BEVS）和无病毒质粒转染系统。 BEVS 是目前最常用的技术，简单说就是 “借病毒送基因”。科学家把需要生产的蛋白基因（比如新冠病毒的刺突蛋白基因）插入杆状病毒，再用这种病毒感染昆虫细胞。病毒会带着目标基因进入细胞，利用细胞的 “生产设备” 大量合成目标蛋白。这种技术的优点很突出：杆状病毒对人类无害，生产的蛋白活性高，还能轻松放大规模。 为了提高效率，科学家还优化出 Bac-to-Bac 技术，把病毒载体的构建转移到大肠杆菌中完成，大幅缩短了制备时间。后来又开发出 flashBAC™、BestBac™等系统，通过删除病毒的无用基因，进一步提高蛋白产量，简化纯化流程。 无病毒质粒转染系统则更直接，跳过病毒载体，直接把含目标基因的质粒转入昆虫细胞。这种方法不用经历病毒感染步骤，蛋白纯化更简单，还能建立稳定的细胞系长期生产。不过它的蛋白表达量通常比 BEVS 低，更适合实验室研究或小批量生产。 图 2 重组蛋白生产系统对比 （图中 A 为基于 BEVS 的经典 Bac-to-Bac 系统，B 为无病毒质粒转染系统，B1 为稳定单克隆细胞系构建流程，清晰展示两种技术的生产步骤及时长差异） 值得一提的是，昆虫细胞还能生产病毒样颗粒（VLPs）—— 这种颗粒长得像病毒，却没有病毒的遗传物质，不会致病，是疫苗研发的 “黄金选择”。它能激发强烈的免疫反应，尤其适合应对流感、新冠这类变异快的病毒。三、技术升级：让昆虫细胞 “生产” 出更优质的蛋白 虽然昆虫细胞优势明显，但早期也有短板：比如蛋白的糖基化修饰和人类细胞有差异，可能影响药效；病毒感染后细胞会裂解，产生大量杂质，增加纯化难度。为了解决这些问题，科学家们做了不少技术升级。1. 优化蛋白修饰：让昆虫蛋白更 “像人” 糖基化是蛋白发挥功能的关键修饰。昆虫细胞生产的蛋白糖链比较简单，而人类蛋白的糖链更复杂。通过糖工程技术，科学家给昆虫细胞转入人类的糖基转移酶基因，让它能合成和人类细胞类似的糖链。如今，经过改造的 SfSWT 系列细胞系，已经能生产出接近人类蛋白的糖基化修饰产物。2. 延长细胞寿命：提高蛋白产量 病毒感染后，昆虫细胞会很快凋亡，限制了蛋白产量。科学家通过转入抗凋亡基因（比如 P35 基因、vankyrin 基因），或者沉默促凋亡基因（比如 caspase-1 基因），让细胞在感染后能存活更久，蛋白产量最高能提升 26 倍。3. 快速检测：缩短生产周期 传统的病毒滴度检测需要一周时间，影响生产效率。科学家开发出 Sf9-ET、Sf9-QE 等工程细胞系，这些细胞被病毒感染后会发出荧光，通过荧光就能快速判断病毒浓度，检测时间缩短到 3 天。4. 适应性进化：让细胞更 “抗压” 通过适应性实验室进化（ALE） 技术，让昆虫细胞在特定环境（比如高 pH、低温）下长期培养，筛选出适应性更强的细胞系。比如在 pH7.0-7.2 的环境中培养 Sf21 细胞，得到的 SfBasic 细胞系，生产基孔肯雅病毒样颗粒的产量提升了 11 倍；在 22℃低温下培养的细胞系，HIV 病毒样颗粒产量最高能增加 26 倍。 图 3 昆虫细胞优化策略汇总四、实际应用：昆虫细胞生产的药物就在我们身边 经过几十年的发展，昆虫细胞系已经实现了规模化应用，生产出多种获批的疫苗和药物，涵盖人类医疗和兽医领域。表1 已上市的昆虫细胞来源药物 其中最知名的就是新冠疫苗 Nuvaxovid®，它采用 Sf9 细胞系生产新冠病毒刺突蛋白，再组装成纳米颗粒疫苗，因技术成熟、安全性高，获得了多个国家的紧急使用授权。还有预防宫颈癌的 Cervarix™疫苗，利用昆虫细胞生产人乳头瘤病毒（HPV）的病毒样颗粒，已在全球广泛使用。 图4 Nuvaxovid 疫苗生产流程  除了新冠疫苗，预防宫颈癌的Cervarix™疫苗也是昆虫细胞的 “代表作”—— 它利用昆虫细胞生产人乳头瘤病毒（HPV）的 L1 衣壳蛋白，这些蛋白会自动组装成病毒样颗粒，接种后能精准激发针对 HPV16、18 型的免疫保护，这两种亚型正是导致宫颈癌的主要 “元凶”。 在兽医领域，昆虫细胞的贡献也不小。比如预防猪圆环病毒病的 Porcilis® PCV 疫苗，用昆虫细胞生产 PCV2 病毒的 ORF2 蛋白，制成的疫苗能有效降低猪群的发病率，帮养殖户减少经济损失；还有古典猪瘟疫苗 Porcilis Pesti®，同样靠昆虫细胞生产 E2 蛋白，在全球养猪业广泛使用。 除此之外，还有多款基于昆虫细胞的药物正在临床试验中，涵盖流感、埃博拉、寨卡病毒等传染病，以及疟疾、艾滋病等重大疾病，未来应用前景十分广阔。表2 临床试验中的昆虫细胞来源疫苗 五、未来展望：昆虫细胞的 “进化” 之路 目前，昆虫细胞系已经成为生物制药的重要平台，全球重组蛋白市场中，10% 的产品都来自昆虫细胞，这个市场规模预计到 2030 年将达到 55.8 亿美元。但它仍有进步空间：比如部分细胞系可能携带潜在病毒，需要进一步优化；大规模生产的成本还有下降空间；糖基化修饰还能更接近人类细胞。 未来，随着CRISPR/Cas9 基因编辑技术的深入应用，科学家有望精准改造昆虫细胞的基因，让它能生产出更复杂的蛋白；无病毒生产系统的效率会不断提升，逐步实现工业化应用；甚至可能利用昆虫幼虫作为 “活体工厂”，进一步降低生产成本。 从 100 多年前的初步尝试，到如今成为疫苗、抗癌药的核心生产工具，昆虫细胞系的发展堪称生物制药的 “逆袭之路”。这个藏在实验室里的 “昆虫工厂”，正在用科技的力量，为人类健康带来更多可能。相信在不久的将来，会有更多基于昆虫细胞的创新药物问世，守护我们的健康。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

基于合成生物学的疫苗生产设计是生物工艺行业一个充满希望的新兴领域。合成生物学作为一种疫苗设计手段，得到了基于生物基础的设计和生产策略的进一步支持。本文，我们将详细介绍各种有助于有效疫苗生产的合成生物学策略。合成设计的基于mRNA的疫苗可能成为针对各种现有疾病和新出现的流行病的有效疫苗，从而有助于制定有效的预防策略。基于合成mRNA的疫苗可以递送精心设计的RNA片段，这些片段将指导体内细胞产生一种模拟目标病毒部分特征的蛋白质，并在真正的病毒感染时让免疫系统做好攻击准备。基于合成生物学的疫苗生产策略有助于缩短通过常规程序进行疫苗开发和生产所需的时间。我们将回顾一些已深入研究的案例，并阐述当前的实践、新兴趋势和未来技术。此外，本文还将讨论围绕基于合成生物学的疫苗开发的最新进展、局限性、安全性和伦理争议。 引言：合成生物学用于疫苗生产 疫苗是指任何能够触发宿主系统产生抗体的成分，从而产生针对一种或多种疾病的免疫力。疫苗的使用控制了疫苗可预防疾病的传播。天花和脊髓灰质炎在全球范围内被根除，这要归功于疫苗和有效的疫苗接种策略。然而，仍有许多可预防的传染病尚无疫苗可用。了解人类免疫系统和疫苗技术的进步或许可以解决这些问题。找到病原体的正确抗原是疫苗研发的关键第一步。各种探索性研究和计算方法有助于识别潜在的候选疫苗（PVC）。合成生物学就是这样一个有前景的先进疫苗开发和生产领域。 合成生物学在疫苗设计和生产的诸多方面都大有可为。合成生物学的最初目标之一也是开发标准、可靠且预期的机制，将遗传成分组装到其他系统中，以消除生物实验繁琐且不可预测的结果。部件开发使得基于生物的组件、工具或系统开发的合理工程和设计成为可能，这反过来又促进了用于药物递送和临床应用的合成遗传回路的构建和测试。合成生物学可以使基本通过采用设计-构建-测试-学习 (DBTL) 循环，为疫苗的设计、工程和可持续生产提供工具。合成生物学的进步目前正在呈指数级增长，机器学习算法正在使用 DBTL 循环中的数据进行训练，这是当代工程的一个决定性特征。用于构建合成电路的灵活“即插即用”方法的出现进一步支持了这些开发特定产品的努力。2019 年在不同地理位置启动的全球生物制造联盟设施旨在支持和促进开发先进的研究设施并在这些设施之间共享最佳实践。通过DBTL试验进行基于生物制造厂的学习、资源和知识共享以及专业基础设施，可能进一步促进合成疫苗的开发。因此，基于合成生物学的创新和资源可以支持针对我们目前尚无疫苗或疫苗价格昂贵的各种疾病的合成疫苗的开发。这将对改善医疗保健和疫苗的可持续生产产生积极影响（图1）。 图1 .候选疫苗开发的合成生物学设计-构建-测试-学习 (DBTL) 循环。 最近的SARS Cov-19 疫情表明，在短时间内开发有效疫苗和大规模生产的需求日益迫切。合成生物学在多方面为近期的疫情应对做出了贡献，对未来的疫情防范至关重要。基于合成生物学的方法和 Biofoundry 支持的创新可以更好地应对新出现的疫情。疫苗生产商需要新的生产策略，以便在短时间内获得许可，从而以高效且经济的方式快速应对疾病爆发。利用 Biofoundry 可以实现疫苗的合理分配。基于 Biofoundry 的疫苗生产可以使疫苗生产接近“护理点”，并减少依赖物理冷链的疫苗运输。此类策略不会不仅提供运输解决方案，以取代对基于冷链的疫苗运输行业的依赖，而且还将根据各自生物工厂的人口统计实现可持续的疫苗开发和生产。 计算方法有助于 (i) 找到潜在疫苗开发的正确抗原，(ii) 在分子水平上模拟宿主-病原体相互作用以理解免疫反应，(iii) 模拟对治疗和疫苗接种的免疫反应，以及 (iv) 开发详细的疾病图谱，这可能进一步帮助理解各种疫苗的作用机制。整体系统级免疫学研究有助于理解导致多种细胞状态的多种基于信号通路的相互作用以及形成免疫反应的多种细胞间相互作用。将传统免疫学与现代组学分析技术相结合，可以促进疫苗发现和宿主内多层次免疫反应的进步。以人类免疫学计划联盟 (HIPC) 为基础，对感染、治疗和接种疫苗前后免疫系统进行完整分析，有望为各种感染开发有效、安全的疫苗。Tsang等人对流感疫苗的免疫系统反应进行了此类研究。在最近的 COVID-19 大流行中，在系统水平上研究了不同类型疫苗 (mRNA 和腺病毒载体疫苗) 在每剂疫苗接种后的效果。本研究探讨了每剂疫苗后的先天免疫反应和体液免疫反应，以了解免疫原性和反应原性。高通量技术、复杂的建模和基于机器学习的方法补充了传统的免疫学研究，有助于了解免疫系统的动态。通过组学技术比较不同疫苗对不同反应的共性和差异性，可以开发免疫特征数据资源。系统方法还可以通过收集和分析为评估合成疫苗的免疫反应而进行的高通量实验中产生的大规模数据，从而有助于快速评估疫苗的有效性。许多疫苗的反应评估类似，包括最近的 COVID-19 疫苗。合成生物学扩展了这些发现，基于生物制造回路和生物体的合理工程开发各种产品。 对病原体的免疫反应有助于疫苗的开发。要使免疫反应成功，先天性和适应性免疫子系统都必须发挥作用。此外，免疫接种要成功，需要产生效应细胞和记忆细胞，以长期激活适应性系统的体液和细胞介导臂。疫苗接种的最大益处是减少了严重疾病的发病率和死亡率，而这些疾病对儿童的影响尤为严重。据估计，疫苗每年在全球范围内挽救3.86亿生命年、9600万伤残调整生命年（DALY）和约600万人死亡。人体免疫系统在解剖学上分布广泛且高度相关。基于各种数据集和文献挖掘开发的疾病图谱可能有助于识别潜在的候选疫苗。合成疫苗的开发。有研究对HIV 感染的免疫反应建立了数学模型，探索了 T 细胞反应的分子机制激活。有数学模型可以预测疫苗接种剂量和时间表、宿主-病原体相互作用以及病毒感染的宿主免疫反应。因此，计算预测和基于系统生物学的模型有助于开发合成疫苗并调整其时间表和剂量。 处理最近的 COVID-19 大流行的经验和对未来大流行的预测表明，所有国家，无论是低收入国家还是高收入国家，都必须做好大流行防范。经济地生产疫苗对于满足这些未来需求是必要的。在大流行情况下，全球每个人都需要疫苗。集中式疫苗生产设施是资本密集型的。在全球范围内，政府和制药行业在疫苗研究、生产、采购和疫苗接种上投入了大量资金。可靠的、价格合理的疫苗对所有利益相关者都至关重要。可持续疫苗生产旨在在经济的生产环境中提供稳定的疫苗。 世界经济论坛 (WEF) 已认可合成生物学作为新兴技术之一的重要性，并成立了合成生物学全球未来理事会。该理事会的重要目标之一是团结各方利益相关方，推动可持续实践，促进资源的均衡利用。因此，基于合成生物学的工具和方法可以支持可持续疫苗的研发。 疫苗、生产实践和合成疫苗开发范围 有几种不同类型的疫苗可用，包括灭活疫苗、减毒活疫苗、信使RNA (mRNA) 疫苗、亚单位、重组、多糖和结合疫苗、类毒素疫苗和病毒载体疫苗。非病毒疫苗技术，如病毒样颗粒 (VLP)、DNA/RNA 疫苗和纳米颗粒疫苗是预防多种疾病的新兴创新技术。与活疫苗类似，基因疫苗也具有在病毒感染期间通过宿主免疫系统呈递抗原的能力。当编码特定抗原的基因序列被递送到宿主体内时，就会引发适当的免疫反应。这有助于宿主预防疾病的出现。 针对高突变率和高抗原多样性的病毒，开发传统疫苗极具挑战性。合成生物学等新兴技术使得合理设计疫苗成为可能，使其具有更广泛的免疫原性，并提高稳定性和安全性。 灭活疫苗 灭活疫苗会破坏致病细菌。通常，灭活疫苗不能提供像活疫苗那样强的免疫力（保护）。因此，可能需要一段时间内接种多剂疫苗（加强针）来维持对疾病的免疫力。使用灭活疫苗，您可以预防甲型流感、肝炎、脊髓灰质炎和狂犬病。合成生物学方法已用于设计和生产针对反刍动物蓝舌病毒的灭活疫苗（一种含有已失去致病能力但可以引发免疫反应的灭活微生物的疫苗）。这是在工业环境中开发和验证的，可用于大规模生产。如果已知病毒基因基因组序列，则可以使用类似的平台来开发任何疫苗。 基于mRNA的疫苗 已知 mRNA 疫苗对许多病毒性疾病有效，包括腮腺炎、麻疹、风疹、黄热病和某些肿瘤类型。mRNA 疫苗在免疫后会释放 mRNA，而 mRNA 会制造病毒蛋白来引发免疫反应。它们经过专门设计，可产生精确的抗原来对抗目标病毒。有可能通过可扩展的无细胞和无鸡胚工艺在小型实验室中生产它们。无细胞系统可以更容易地在线监控产品、一步纯化产品以及检索 DNA、RNA 或蛋白质。 基于 mRNA 的疫苗生产应该能够支持针对多个目标的快速生产，同时最大程度地缩短适应新兴工艺和制剂的时间。体外转录（IVT）mRNA 疫苗的药物生产被观察到快速而稳定。已建立的工艺可用于生产任何mRNA 序列。图 2描述了此类基于IVT mRNA 的疫苗的一般结构。它在结构上类似于天然 mRNA（图 2），并将蛋白质翻译到细胞质中。通过几乎无限的衍生物组合，可以优化 mRNA 技术。有算法可以设计优化的基于 mRNA 的疫苗。设计空间巨大（例如，SARS-CoV-2 Spike 蛋白约有 10,632 个候选蛋白），并针对结构稳定性和密码子使用情况开发稳定的疫苗。基于Biofoundry 的自动化流程允许探索组合并测试其有效性。 图2 .体外转录mRNA疫苗的总体结构。5 ′帽和3′poly A UTR区两侧的ORF编码区可以编码宿主系统中特定的目的基因。 体外转录mRNA疫苗（IVT mRNA）可开发为复制型（编码抗原以及扩增重组mRNA的RNA复制酶）和非复制型（仅编码抗原）疫苗。非复制型合成mRNA疫苗已获批准，并以极低剂量（30-100 μg）用于有效遏制COVID-19大流行。类似技术已用于特定抗肿瘤疫苗的开发和临床试验。IVT mRNA疫苗可被细胞内外的RNases降解，并且观察到它们不会影响宿主基因组；因此，它们通常被认为是安全的。 当前可用的基于 mRNA 的疫苗平台和基于 mRNA 的疫苗开发已成为多年研究的主题。各种基于合成 mRNA 的疫苗的历史和开发已在其他地方进行了详细讨论。与传统疫苗接种相比，mRNA 疫苗具有许多优势，例如生产时间更快、更具成本效益，并且由于没有活病毒而没有疾病传播给接种者的危险。mRNA 疫苗可在宿主系统内引发细胞和体液免疫。在 COVID-19 紧急情况下，验证了基于 mRNA 的疫苗的短期生产和使用。开发了一种基于合成 mRNA 的SARS Co-V2 疫苗，其免疫原性得到改善。对体外合成的序列优化的合成 mRNA（1273 mRNA）进行纯化并包装在脂质纳米颗粒中，并分析其有效性。许多获准紧急使用的疫苗和许多处于不同程度临床试验中的疫苗都是基于 RNA 的疫苗。大多数此类疫苗都会产生略微修饰的 SARS-CoV-2 刺突蛋白，该蛋白在病毒内的原始形式可使病毒进入人体宿主。 DNA疫苗 DNA 疫苗涉及将编码抗原的特定质粒 DNA直接引入宿主以诱导免疫反应。Hoare等人对大流行情况下的DNA 疫苗生产进行了分析。DNA 疫苗技术经历了无数技术进步，并成为最有前途的疫苗技术之一。合成 DNA (SynDNA) 平台是一种简单、快速开发、温度稳定且可一致生产的新工具。它们直接针对病原体序列进行设计和优化，从而允许灵活合成、快速临床前测试和更大规模的临床试验。据观察，它们表现出针对病原体宿主系统的细胞和体液反应。近期新冠疫情期间，采用改进的无针电穿孔技术或传统佐剂的DNA疫苗均为细胞疫苗，并被批准在紧急情况下限制使用。一种合成的、针对SARS-CoV-2 S蛋白的DNA候选疫苗在初步研究中显示出令人鼓舞的结果，能够诱导功能性抗体并引发T细胞免疫反应。本研究利用高度表征的质粒pGX0001，并采用即插即用的合成生物学技术。用于开发基于靶抗原的合成 DNA 构建体的技术。类似的方法已被用于开发针对 MERS-CoV 刺突 (S) 抗原的合成 DNA 疫苗，该疫苗在对恒河猴进行的初步皮内 2 剂试验中被证明是有效的。有相当多的针对各种病毒性疾病和抗原特异性肿瘤治疗的基于SynD DNA 的 NA 疫苗正处于临床试验的不同阶段。因此，合成生物学技术为 DNA 疫苗提供了新的前景。 基于表位的疫苗 基于表位的疫苗，也称为基于肽的疫苗，是一种针对病原体特定表位或抗原决定簇的疫苗。表位是抗原的一部分，可被免疫系统（通常是抗体或T细胞）识别和结合。基于表位的疫苗旨在通过向免疫系统呈递特定表位来诱导免疫反应，而不是使用整个病原体或灭活形式的病原体。这些疫苗可以使用含有特定目标表位的合成肽或重组蛋白来制备。基于表位的疫苗具有以下优势：(1) 精准靶向：通过专注于特定表位，这些疫苗可以触发高度靶向的免疫反应，该反应针对特定病原体或病原体的特定区域。(2) 安全性：基于表位的疫苗可能比传统免疫接种更安全，因为它们可以排除可选的或潜在有害的病原体成分。 (3) 定制化：基于表位的疫苗可实现设计和定制灵活性。为了生产能够引发所需免疫反应的疫苗，研究人员可能会选择并混合多个表位。 (4) 疾病特异性：基于表位的疫苗有可能针对某种病原体产生高度特异性的免疫反应，从而可能降低脱靶后果的风险。这是因为它们可以定制以针对与特定病原体相关的特定表位。基于表位的疫苗面临的一些挑战包括：基于表位的疫苗开发可能很困难，因为必须仔细选择和识别相关表位。这些疫苗可能还需要佐剂或特定递送方法来增加其免疫原性和有效性。 多表位肿瘤疫苗主要通过基于计算机的生物信息学方法开发。多表位肿瘤疫苗开发的一般步骤如下：（1）肿瘤相关抗原（TAA）的鉴定：第一步是确定 TAA 是否由肿瘤细胞独特表达。可以使用多种技术来完成此操作，包括基因组分析、转录组分析、蛋白质组学研究和列出已知 TAA 的数据库。（2）表位预测和选择：为了预测检测到的 TAA 中的可能表位，使用计算算法和工具。这些工具分析抗原序列并考虑 MHC 分子结合亲和力、抗原处理和呈递等方面。根据保守性、免疫原性和对肿瘤细胞的特异性等标准，进一步选择预期的表位。 （3）表位优化：为了提高免疫原性和稳定性，所选表位可能会进行额外的改变或优化。为了增强其向免疫细胞的呈递，这可能包括缩短、插入佐剂序列或与其他免疫刺激成分融合。（4）构建多表位疫苗：通过组合选定的表位制成多表位疫苗构建体。为了保持表位的结构完整性并有助于有效的免疫识别，可以在它们之间添加接头或间隔物。（5）添加免疫佐剂：免疫佐剂是添加到疫苗中以增强免疫反应的化学物质。可以将特定的佐剂添加到多表位肿瘤疫苗中以增强表位呈递和识别，激活免疫细胞并促进有效的抗肿瘤反应。（6）计算机验证和优化：研究开发的多表位疫苗构建体的计算稳定性、抗原性和与免疫受体的潜在相互作用。该过程有助于改进疫苗设计和预测功效。 （7）实验验证：疫苗构建体可以通过合成生物学方法创建，并在计算机模拟设计完成后，在临床前或临床环境中进行评估，以确定其安全性、免疫原性和治疗效果。实验验证采用动物实验，最终进行人体临床试验。 还有基于深度学习的方法用于设计 SARS-CoV-2 的多表位疫苗，这些疫苗包含来自 B 细胞、细胞毒性 T 淋巴细胞和辅助性 T 淋巴细胞的表位。多表位肿瘤疫苗可以通过计算机模拟设计，这有许多好处，包括能够测试大量可能的表位、改变疫苗结构以及基于计算分析优化设计。然而，值得注意的是，实验验证对于确认所设计疫苗的有效性和安全性至关重要。多表位肿瘤疫苗的计算机模拟设计领域正在迅速发展，新的计算工具、算法和实验方法不断改进设计和开发过程。研究人员仍在研究和改进用于设计多表位肿瘤疫苗的计算机模拟方法，他们将计算技术与免疫学专业知识和实验验证相结合，以创造出有效的免疫治疗肿瘤疗法。合成生物学方法可以支持定制基于多表位的疗法。 噬菌体疫苗 噬菌体疫苗是通过在免疫基因组噬菌体表面表达多个抗原拷贝而开发的。它们也称为噬菌体展示疫苗，可分为三类：噬菌体展示抗原、噬菌体 DNA 和混合噬菌体 DNA 疫苗。提出了一种噬菌体铸造框架，用于开发基于噬菌体的治疗方法，治疗导致抗生素耐药性的 ma2.5.ny 细菌病原体。类似的基于噬菌体的疫苗生产策略将有助于可持续的生物经济生产和预防各种传染病。基于噬菌体的疫苗可诱导细胞和体液反应，以促进最佳免疫反应。美国食品药品监督管理局 (FDA) 已批准首个噬菌体试验，用于治疗耐药性金黄色葡萄球菌感染。基于噬菌体的疫苗，辅以合成生物学方法，似乎是大规模可持续疫苗开发的一种有希望的方法。 病毒载体疫苗 病毒载体疫苗或病毒样颗粒 (VLP) 是非传染性工程病毒结构，与没有遗传物质的天然病毒非常相似。VLP 有两组，分别是囊膜和无囊膜。VLP 经过重组工程改造，具有没有病毒基因组的天然病毒的免疫保护特性。这提高了对传统减毒疫苗相关感染的安全性，传统减毒疫苗在接种疫苗后可能会被激活引起感染。然而，其中一些并不能完全激活免疫系统。许多病毒的结构蛋白可以自组装产生VLP。VLP可以设计为安全地呈递异源抗原。流感病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒和引起普通感冒的腺病毒均已被用作载体。VLP在体内和体外均可合成。此类疫苗的生产时间较短，可在12-14周内开发完成。病毒载体疫苗技术已被用于开发多种商业疫苗，以对抗轮状病毒、疟疾、流感、结核病、埃博拉病毒、寨卡病毒和艾滋病毒。基于 VLP 的方法已用于开发针对 COVID-19 的疫苗。 合成生物学使得对 VLP 的组成和组装进行更精确和可预测的控制成为可能。对于合成设计的疫苗生产回路，可以以理想的方式设计和控制抗原和佐剂的生产。许多基于合成生物学的设计工具可用于筛选具有高免疫遗传潜力的病原体特异性抗原，并合理地设计它们以用于基于 VLP 的疫苗生产。一种合理设计的“即插即用”系统，其中来自噬菌体 AP205 的 VLP 与 SpyCatcher 蛋白基因融合，可识别与疾病特异性抗原相关的 SpyTag。当通过 SpyCatcher 测试时，含有疟疾抗原的 VLP仅需一次免疫即可诱导适当的抗体反应。因此，可以通过多种不同的方式对 VLP 进行合成设计，以实现有效、安全和稳定的疫苗生产。 重组亚单位疫苗 重组亚单位疫苗是一种利用源自病原体的特定蛋白质亚单位或片段来刺激免疫反应的疫苗。这类疫苗包含少量通过异源表达系统产生的明确定义的成分。通常，将诱导特定免疫反应的抗原或成分插入细菌或酵母表达系统中，以合成生产这些成分，然后组装成疫苗。亚单位疫苗不含任何活体成分；因此，它被认为非常安全。这些亚单位是通过重组 DNA 技术生产的，其中将编码所需蛋白质亚单位的基因插入合适的表达系统，例如细菌、酵母或哺乳动物细胞，以产生大量的蛋白质亚单位。 重组亚单位疫苗的一些优点包括： 1.靶向免疫反应：重组亚单位疫苗旨在针对特定抗原或疾病亚单位产生靶向免疫反应。这些抗原的选择经过精心考量，以准确反映病原体触发保护性免疫反应所需的基本要素。 2.安全性：由于重组亚单位疫苗不含活的或灭活的病原体，因此被认为是安全的。它们仅通过呈现相关成分或抗原来降低传播病原体疾病的风险。 3.减少副作用：重组亚单位疫苗可以通过去除病原体的非必要成分来减少全病原体疫苗经常出现的负面反应或副作用的可能性。 利用成熟的重组DNA技术，可以大批量生产重组亚单位疫苗，并保证其一致性和质量控制。这种可放大性有利于大规模疫苗接种活动和对新发传染病的快速响应。为了增强免疫反应，可以在重组亚单位疫苗中添加佐剂。佐剂有助于刺激免疫系统，延长免疫反应，并提高疫苗的有效性。 合成生物学在重组亚单位疫苗的开发和进步中发挥着重要作用。合成生物学将生物学、工程学和计算机科学相结合，以设计和构建具有所需功能的新型生物系统或组件。以下是合成生物学如何促进重组亚单位疫苗的开发。 1.基因合成：合成生物学能够合成编码特定抗原或蛋白质成分的基因。这使得设计和生产难以从天然来源获取的亚单位成为可能。 2.蛋白质工程：合成生物学技术可用于改变蛋白质亚单位的结构、稳定性、免疫原性或靶向性。这些改变可以提高疫苗的效力并定制免疫反应。 3.表达系统优化：重组亚单位在宿主生物体中的表达系统优化可以通过合成生物学方法实现。为了最大限度地提高蛋白质产量，这需要对基因回路、启动子序列和其他调控元件进行微调。 4.亚单位设计和选择：重组疫苗亚单位的选择基于病原体的主要抗原或能够触发保护性免疫反应的成分。亚单位的设计可以借鉴合成生物学方法，最大限度地提高其免疫原性、稳定性和抗原特性。 5.生产方法：表达系统，例如细菌、酵母或哺乳动物细胞，常用于生产重组亚单位疫苗。合成生物学方法可以通过微调遗传元素、优化代谢途径或设计细胞机制来优化这些生产系统，以提高蛋白质表达和产量。 6.蛋白质修饰与偶联：合成生物学方法可以更轻松地修饰和偶联亚单位，从而增强其特性或疫苗的效力。此外，还包括翻译后修饰，例如糖基化或磷酸化，这些修饰可能会影响抗原性和免疫识别。亚单位还可以与载体分子或佐剂偶联，以增强其免疫原性或将其导向特定的免疫细胞。 7.递送系统：合成生物学在重组亚单位疫苗递送系统的设计和开发中发挥着重要作用。这涉及设计病毒载体、脂质纳米颗粒或其他递送平台，以有效地将亚单位递送至免疫系统，增强其被抗原呈递细胞的吸收，并促进其向免疫细胞呈递。 8.合理的疫苗设计：合成生物学通过整合计算模型、生物信息学和实验数据，实现了重组亚单位疫苗的合理设计。这种方法使研究人员能够设计出诱导特异性免疫反应、针对特定病原体或菌株的疫苗，并优化疫苗配方以提高有效性和安全性。 9.平台技术：基于合成生物学方法的重组亚单位疫苗可以作为一种平台技术。一旦建立了生产系统和表达载体，该平台即可轻松适应不同病原体或菌株的亚单位生产。这种灵活性使得快速开发针对新发传染病或现有病原体新变种的疫苗成为可能。 10.联合疫苗：合成生物学方法可以促进联合疫苗的开发，即将来自不同病原体的多个亚单位组合成单一疫苗制剂。这可以同时对多种疾病进行免疫接种，减少所需的疫苗接种次数，并提高疫苗覆盖率。 合成生物学领域的不断进步，为重组亚单位疫苗的研发提供了新的方法和技术。这些策略可能带来诸多优势，例如更佳的安全性、更高的疫苗效力，以及对新发传染病或不断变化的病原体做出快速反应的能力。因此，合成生物学方法可以进一步支持亚单位疫苗的研发。 所有这些不同类型的疫苗都存在不同程度的生产复杂性，这些复杂性可以通过合成生物学支持的可持续生产实践来克服。疫苗特异性抗体反应的追踪是后期开发和毒理学研究的一部分。系统性研究有助于追踪在多个层面（B 细胞、T 细胞）引发的免疫反应。系统方法可以通过系统地收集和分析数据来协助临床试验。在所有这些不同类型的疫苗生产中，合成生物学都有助于优化生产，而这正是许多研究工作的主题。 疫苗的免疫刺激作用 疫苗接种的目的是刺激免疫系统并针对特定病原体或疾病产生免疫反应。疫苗的免疫刺激作用体现在多个层面，并影响许多不同的免疫系统器官。以下列出了一些疫苗的主要免疫刺激作用。 1.启动适应性免疫反应：疫苗旨在将特定抗原引入免疫系统，这些抗原通常来自病原体或病原体成分。这些抗原可以是核酸、肽、蛋白质或多糖。疫苗通过将这些抗原递送至免疫细胞（例如树突状细胞等抗原呈递细胞 (APC)）来触发适应性免疫反应。这需要激活T细胞（可以识别并清除受感染的细胞）以及B细胞（产生抗体）。 2.抗原特异性抗体的产生：抗原特异性抗体的产生，通常称为体液免疫反应，受疫苗刺激。B 细胞产生称为抗体的蛋白质，这些蛋白质可以结合并中和感染，阻止感染进入细胞并降低其在体内扩散的能力。疫苗可以使人体产生某些抗体，这些抗体旨在识别和攻击疫苗中的抗原。 3.诱导细胞免疫反应：除了产生抗体外，疫苗还能引发细胞免疫反应，尤其是由T细胞介导的免疫反应。T细胞可以直接识别并摧毁受感染的细胞，或为其他免疫细胞提供帮助。疫苗可以产生针对疫苗中抗原的特异性T细胞反应，使免疫系统能够识别并清除被目标病原体感染的细胞。 4.记忆免疫反应：免疫记忆的形成是疫苗接种的一大优势。疫苗接种刺激免疫系统产生记忆T细胞和B细胞。这些记忆细胞能够在再次接触病毒时产生快速有效的免疫反应，因为它们“记住”了疫苗接种期间呈现的特定抗原。这种免疫记忆有助于解释免疫接种如何提供终生防御。 5.激活先天免疫系统：先天免疫系统是人体抵御感染的第一道防线，疫苗也可以刺激其发挥作用。疫苗成分（例如佐剂或疫苗载体）可以激活先天免疫细胞，包括巨噬细胞和自然杀伤细胞。这种激活可以加速适应性免疫细胞的发育，并改善整体免疫反应。 6.细胞因子释放与免疫调节：疫苗可以诱导各种细胞因子的释放，这些细胞因子是调节免疫反应的信号分子。细胞因子有助于协调和调节免疫细胞的活动，从而有助于疫苗引发的免疫反应得到适当的激活和调节。 7.群体免疫：疫苗可以通过使相当一部分人口获得免疫力，从而产生群体免疫，有时也称为社区免疫。当足够多的人口对某种疾病产生免疫力时，就会发生这种情况，从而限制整体传播，并保护其他未接种疫苗或免疫系统较弱的人群。 务必记住，疫苗的免疫刺激作用可能会根据特定的疫苗类型、剂型以及其旨在预防的疾病或病原体而变化。为了保证疫苗的有效性、安全性以及引发所需免疫反应的能力，疫苗必须经过全面的测试和审查流程。疫苗的免疫原性和保护效力需要通过临床前试验来确定。有效的合成疫苗设计很大程度上依赖于系统基于生物学的数据分析、分子特征和预测的可能靶点。针对各种疾病，疫苗刺激产生的抗原特异性抗体是通过基于 ELISA 的活性滴度或阈值估计来确定的。疫苗非常有效，但免疫反应可能因人而异，并且没有一种疫苗是 100% 有效或没有副作用的。 合成疫苗设计——Biofoundary 疫苗设计和生产过程受多种因素驱动，包括提高效力、质量、耐受性、安全性、易操作性和生产成本。有许多不同类型的疫苗可针对各种病原体。每种疫苗的目的都是指导免疫系统如何对抗特定病原体及其可能引起的有害疾病。在研发疫苗时，科学家会考虑宿主免疫系统对特定病原体的反应、疫苗与免疫系统其他部分的相互作用/交叉反应、最有效的疫苗接种方法或技术，以及将接种疫苗的人群。 有效的疫苗包含三个组成部分：(i) 促进适应性免疫反应的抗原；(ii) 与抗原协同增强免疫反应的佐剂；(iii) 将抗原和佐剂递送至正确位置和时间的递送系统。经典的减毒活疫苗包含所有这些组成部分，以在宿主体内诱导针对病原体的特异性免疫。然而，由于减毒疫苗研发的局限性及其安全性，其他类型的疫苗，包括灭活疫苗、死疫苗和纯化重组亚单位疫苗，受到了广泛推崇。这些方法的生产过程是经济密集型的、资源依赖性的（例如：鸡胚可用性）、劳动密集型的和耗时的，这导致了对可能支持更快速生产的新型疫苗技术的探索以及先进的生产策略。 合成生物学方法的系统化工作流程可能有利于疫苗生产。近期成立的基于全球生物铸造联盟(GBA) 的自动化机器人高通量设施可用于根据需要研制新疫苗，以满足全球疫苗需求。此类能力建设基础设施使研究人员能够探索基于人工智能方法的大规模基因设计。许多软件工具支持电路设计。各种生物设计自动化 (BDA) 工具可实现高通量生物工厂中 DBTL 循环的工程和设计自动化。表 1提供了此类 BDA 软件工具的详细列表。显然，这种计算机合成生物学工具包正在呈指数级增长。其中一些工具还有助于优化整个流程和生产能力。除了这些工具之外，社群开发的数据标准（例如合成生物学开放语言（SBOL））能够捕获机器可处理的、本体支持的表示，以支持知识转移和共享。Biofoundary促进学术界和强劲生产业的研究，以打破转化工程研究和大规模生产的局限性。GBA 年度会议协调利益相关者之间的全球互动，并允许分享 DBTL 周期的最佳实践和相关开发的技术。GBA 工作组也确保可持续性。 因此，基于Biofoundary的研究和生产实践可以协助未来疫苗的开发、生产和分销。 高效疫苗生产细胞工厂的设计与构建 疫苗生产传统上涉及在哺乳动物细胞培养、禽类和昆虫组织培养中培养候选疫苗病毒。疫苗有各种不同的类型，包括活疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗和部分纯化的生物体成分。重组 DNA 技术彻底改变了病毒疫苗的生产。用于生产抗体和抗体片段的哺乳动物细胞在生物工艺和规模放大方面存在一些缺点，导致工艺时间长、成本高。杆状病毒表达载体系统（HEVS）平台因其在疫苗生产过程中的安全性和可放大性而成为各种商业疫苗的成熟生产商。 除了这些传统的疫苗生产方法外，基于合成生物学的疫苗生产替代策略在过去 20 年中也发展势头强劲。基于核酸的疫苗生产和 VLP 疫苗生产利用先进的基于合成电路工程的疫苗生产。基于合成生物学的各种疫苗生产策略可以提高产量。无细胞系统是合成工程疫苗的首选方法。 设计和生产策略运用示例 传统的疫苗生产需要大量的资金投入到研究和疫苗生产中。一些疫苗，如活疫苗、流感疫苗和重组疫苗，采用过时的技术生产，具有更苛刻的生产工艺和下游工艺要求。疫苗生产商希望采用新的生产策略，以高效、经济的产品快速应对疾病爆发。基于合成生物学的Biofoundaries提出的更小、更高效的基于先进技术的生产方法是传统疫苗生产方法的绝佳替代方案。图3显示了基于合成生物学的疫苗生产策略的假设概述。它涉及许多细微的过程，从合成电路开发到实验室测试、中试规模生产系统到进一步开发大规模生产系统，以及上下游工艺，直到产品可供进一步使用或进行临床试验。此外，还提议减少设施中的疫苗生产数量，以尽量减少冷链操作的使用。 图 3 .基于合成生物学的合成疫苗生产概述，利用工程电路进行小规模和大规模生产实践。 工业化疫苗示例 德国公司CureVac正在开发一种名为“ RNA打印机”的便携式移动装置，用于生产RNA疫苗。这种端到端自动化生产解决方案旨在实现基于RNA的疫苗和疗法的快速生产。多种第二代 COVID-19 候选疫苗和流感疫苗正处于临床前和临床试验的不同阶段。目前已有多种合成的、体外衍生的 mRNA 疫苗可用于治疗 COVID。Macugen（OSI Pharmaceuticals）和 Onpattro（Alnylam Pharmaceuticals, Inc.）均以极低剂量给药。 Gardasil、Cervarix、Hecolin 和Porcilis PCV 是一些基于 VLP 的市售疫苗。无细胞合成（CFS）系统可以作为生产病毒和噬菌体部件的平台。CFS 是一项新兴技术，可以促进疫苗的可持续发展。基于 CFS 的大肠杆菌乙肝核心蛋白被用于开发自组装 VLP。与传统的基于重组 DNA 的技术相比，基于 CFS 生产VLP 以开发疫苗和药物是一种有效的方法。基于无细胞偶联转录和翻译（TXTL）的工具包被用于完整合成噬菌体 T7，而不会丢失信息。 疫苗的研发通常需要数十年时间，然而，当时的技术使得埃博拉和新冠肺炎疫苗的研发在一年内就完成了。因此，它彻底改变了疫苗研发和生产领域。历史上，批量疫苗生产主要采用四个平台，即灭活病原体疫苗、重组亚单位疫苗、结合疫苗和减毒病毒疫苗。近期，COVID-19 大流行改变了事实上的单一疫苗平台，并为开发和测试 RNA、DNA 疫苗以及合成和病毒载体疫苗提供了机会。这些疫苗中有几种在经过不同阶段的临床试验后获准紧急使用。辉瑞和 BioNTech 生产的历史上第一种在 COVID-19 期间紧急使用的疫苗也是一种装载在脂质囊泡中的 RNA 疫苗。同样，Moderna 开发的另一种基于 RNA 的疫苗是美国 FDA 批准的第二种疫苗。阿斯利康生产的 COVID-19 疫苗是一种基于病毒载体的疫苗，携带编码 SARS-CoV-2 刺突蛋白的遗传物质。疫苗生产的合成方法有助于加速临床前试验、临床试验以及工业生产的快速规模放大。自 2002 年 SARS 疫情以来，全球基础设施的建设以及更完善的全球协调机制，为近期 COVID-19 疫苗的生产和分发做出了贡献。因此，许多疫苗在设计或生产过程中都采用了合成生物学方法。 产业可持续性 为了实现联合国可持续发展目标 (SDG)，全球各行各业都在推广基于生物经济的可持续实践。生物制药和医疗领域对可持续生产的需求日益增加。为了实现更清洁、更环保的实践，必须将生物经济的各个部门联系起来。监管机构正在通过实施国家生物经济战略推动可持续生产。合成生物学方法及其在生物技术领域新兴的基于生物铸造的实践可能成为可持续生产疫苗以满足基于生物经济的法规的赋能技术之一。 基于生物经济的疫苗可持续生产设施是通过发展中国家疫苗生产商网络 (DCVMN) 实施的，该网络是由医疗保健组织者和疫苗生产商组成的无党派公共医疗保健联盟。DCVMN 是扩大 COVID-19 疫苗生产和公平获取的关键参与者。它确保疫苗创新者和生产商合作并分享他们的生产方法。虽然生产行业要求生产的定量精度，但基于合成生物学的 DBTL 方法将有助于生物基行业实现这一目标。 挑战与局限性 虽然许多技术进步为持续发展带来了希望，但也带来了挑战和局限性。在合成生物学疫苗生产所展现的这些充满希望的进步中，仍隐藏着许多未解之谜。合成生物学尚未开发出完善的针对各种疫苗的生产流程。许多基于合成生物学的疫苗尚未建立免疫反应研究，其非特异性效应也尚未确定。疫苗研发面临的一些重要挑战在于如何应对群体遗传多样性，以及针对不断进化的病毒开发疫苗，以快速应对新出现的疫情爆发情况。在活跃的疫情爆发期间开发的疫苗的有效性和安全性临床试验存在局限性。 基于 mRNA 的疫苗生产面临的一些关键挑战和局限性包括缺乏对作用方式、优化序列、稳定性和载体系统优化的全面了解。不断进化的大流行病毒的抗原差异是开发特定疫苗的一大担忧。安全性、质量和克服监管准则以及生产成本的增加也是传统生产实践面临的长期挑战。缺乏关于宿主对病毒传播或疫苗的反应的数据是有效疾病管理和疫苗接种策略的限制因素之一。在疾病传播和疫苗试验期间进行系统性研究有助于获取免疫反应数据，从而进一步促进疫苗研发。工对各种基于合成生物学的疫苗进行临床试验的需求日益增加。 总结 疫苗是彻底改变全球健康的关键生物制品。随着技术的进步，疫苗的设计和生产也在不断发展。基于合成生物学的疫苗是疫苗开发领域极具前景的新兴技术，因为它们比传统的疫苗生产方法具有显著优势。合成设计的mRNA疫苗有望成为针对各种现有疾病和新出现的流行病的有效疫苗，并有望在未来制定有效的预防策略。合成疫苗的出现或将消除对操作难度较高的冷链集中生产和配送的需求。基于生物工厂的合成疫苗生产或将支持基于人口统计学特征的疫苗设计和生产。因此，本地生产和配送的有益效应可能带来积极的进展。安全风险可能需要持续监测，以决定采取适当的措施。在早期发展阶段，我们面临着诸多挑战，但技术进步、未来需求以及公众对公共卫生的关注将推动创新。基于合成生物学的生物生产工艺或将改变未来的医疗保健行业。 原文：S.B. Gottumukkala, P.Malakar, A.Palanisamy, Role of synthetic biology to build a sustainable vaccine industry. Bioreactor Design Concepts for Viral Vaccine Production, 2024.