Sodium Thiosulfate

中文摘要 目的   探索84消毒剂对乙型脑炎病毒的灭活效果并建立检测方法。 方法   依据2002年国家卫生健康委员会发布的《消毒技术规范》，采用悬液定量法，在实验室代表性材料（玻璃、彩钢、聚氯乙烯、不锈钢）表面进行消毒剂-病毒相互作用，通过中和鉴定实验确定合适的中和剂，建立检测方法检测病毒活性，并对检测结果进行评价。 结果   常温下，中和剂卵磷脂（10 g/L）、吐温 80（10 g/L）及其中和产物均导致宿主细胞（原代金黄地鼠肾细胞）死亡；中和剂硫代硫酸钠（1 g/L）及其中和产物对宿主细胞无毒性，对细胞生长无影响，对乙型脑炎病毒毒力无影响。故选择硫代硫酸钠（1 g/L）作为中和剂。用84消毒剂对乙型脑炎病毒进行病毒灭活实验，用硫代硫酸钠（1 g/L）中和后，用噬斑法对该混合物进行检测，未检测到乙型脑炎病毒。 结论   有效氯含量为800 mg/L的84消毒剂与乙型脑炎病毒反应5 min后即可有效灭活病毒，灭活效果达到预期。 正文 流行性乙型脑炎（乙脑）病毒呈球状，是具包膜且包膜表面有血凝素的单链RNA病毒，为嗜神经性病毒，通过虫媒传播。乙脑也称日本脑炎，是经蚊虫叮咬感染乙脑病毒而引起的中枢神经系统性疾病，也是目前亚洲已知发病人数最多的病毒性脑炎。乙脑病毒可造成永久性神经损伤，给公共卫生和社会造成沉重负担。化学消毒方法将化学物质或化学混合物应用于无生命表面或材料上，以灭活生物因子或将其数量减少到安全水平，使用消毒剂通常是表面去污的首选方法。84消毒剂属含氯消毒剂，有效成分为次氯酸钠，具有毒性低、消毒效率高等优点，其分子小、不带电荷，能侵入细胞内与蛋白质发生氧化作用或破坏细胞内磷酸脱氢酶，从而发挥消毒作用，在控制病原微生物污染和传播等方面有着重要作用。含氯消毒剂的消毒效果主要取决于其有效氯浓度和作用时间，只有当二者达到一定量时才能有效灭活病原体。本研究拟使用84消毒剂通过浸泡法灭活乙脑病毒，检测实验用84消毒剂（有效氯含量800 mg/L）对乙脑病毒的灭活效果，并对该消毒剂灭活病毒的能力进行验证性评价。 1 材料与方法 1.1 材料 病毒悬液由成都生物制品研究所有限责任公司（成都公司）病毒性疫苗生产科室制备。实验用病毒为乙脑病毒SA14-14-2减毒株，宿主细胞为BHK-21原代金黄地鼠肾细胞，均由成都公司提供。经培养后收取的病毒液，即单一收获液，存储于DW-86L338J-80 ℃超低温冰箱（青岛海尔生物医疗股份有限公司）。本研究各项操作均在ESCO classⅡ生物安全二级实验室生物安全柜（新加坡ESCO生命科学公司）中进行。 消毒剂：实验用84消毒剂购自成都金山化学试剂有限公司，自行配制为有效氯含量800 mg/L的消毒剂，除菌过滤后备用。 载体材料：选择实验室装修代表性材料作为试验载体，包括塑料——聚氯乙烯板（用途：地板、密封条、塑料容器部件等）；玻璃——玻璃板（用途：观察窗、容器）；彩钢——彩钢板（用途：天花板、墙面等）；金属——不锈钢板（用途：工作台面、罐装设备），将4种载体切割为5 cm×5 cm大小备用。 主要试剂：新生牛血清、PBS购自美国ThermoFisher Scientific公司，硫代硫酸钠购自国药集团化学试剂有限公司，甲基纤维素购自美国Sigma公司，MEM培养基购自美国HyClone公司，碳酸氢钠购自河北华晨药业集团有限公司，卵磷脂购自上海麦克林生化科技股份有限公司。BHK-21生长液：体积分数10%新生牛血清、2%碳酸氢钠、5%MEM、除菌注射用水；病毒稀释液：5% MEM、2%碳酸氢钠、除菌注射用水；覆盖物：1%甲基纤维素、10%新生牛血清、5% MEM、2%碳酸氢钠、除菌注射用水；中和剂：1 g/L硫代硫酸钠、10 g/L卵磷脂、10 g/L 吐温80，均由PBS配制而成，并使用0.22 μm滤头过滤除菌。 1.2 实验方法 消毒剂应在发生溢洒后使用，或在已知或怀疑已发生污染的地方使用。在发生溢洒情况时，实验人员首先考虑使用消毒剂将生物因子灭活。基于成都公司相关指南文件拟定的操作规程，本研究采用悬液定量法，在实验室常见4种材质（见1.1）表面滴加病毒液以及84消毒剂，相互作用后收集混合液，检测混合液中的病毒含量。 1.2.1　中和剂鉴定实验 1.2.1.1　细胞毒性实验　由于噬斑法系统误差小、重复性好、结果客观可靠，可避免实验人员主观判定造成的系统误差，因此采用噬斑法测定病毒滴度，使用BHK-21作为检测细胞。 体外细胞毒性实验采用直接接触实验，按形态学方法评定细胞损伤。在实验前首先确认实验所用中和剂及中和产物是否对该细胞产生毒性。根据中和剂相关验证方案，确定中和剂及中和剂使用量，选取消毒剂∶中和剂（体积比）=1∶50、1∶25进行验证。将BHK-21接种至细胞板，培养2~3 d待长成单层细胞后，按照表1分组进行实验，各溶液与生长液体积比为1∶3，1~5 d内观察细胞状态，并记录细胞形态、生长情况。 1.2.1.2　病毒毒力影响实验　实验前，首先应确认1.2.1.1项筛选出的中和剂及中和产物（中和剂+消毒剂）是否对病毒毒性产生影响。 各实验组（表2）按病毒∶各溶液（体积比）=1∶100混合均匀，作用10 min后用病毒稀释液作10倍系列稀释。吸取样液200 μL，接种于单层细胞培养板，于（37±1） ℃、（4.5±0.5）%CO2培养箱中培养，5 d后染色计数，计算病毒滴度。每组实验重复3次。 1.2.2　载体表面病毒回收实验 绝大多数病毒的吸附可分为非特异性吸附和特异性吸附。前者为病毒依靠静电作用与宿主细胞接触而结合，后者为病毒表面蛋白质作为抗原与宿主细胞膜上相应的受体特异性识别并结合。本实验模拟病毒溢洒在固体表面的情况，部分病毒可能通过静电力附着在固体表面，故通过反复吹吸将病毒从载体表面冲洗至容器。回收率指标直接决定检测结果可靠性，测定回收后的病毒滴度是否与阳性对照存在差异，并基于此验证消毒剂对病毒的灭活能力。 具体操作：分别取乙脑病毒单一收获液200 μL滴加于4种载体表面，0、5、30 min后，使用移液器将载体上的病毒液充分吹打至含有病毒稀释液的容器中，采用噬斑法测定病毒滴度。并计算病毒回收率。回收率=测定病毒滴度/原始病毒滴度×100%。 1.2.3　病毒灭活实验 将有效氯含量为800 mg/L的84消毒剂与乙脑病毒混合后，加入1.2.1.1项筛选出的中和剂，作用一定时间后用噬斑法测定混合病毒液滴度。 实验组1：于4种载体表面分别滴加乙脑病毒单一收获液20 μL，再按照体积比1∶100分别滴加消毒剂2 mL，继续作用5、10、15 min。按消毒剂∶中和剂=1∶25分别滴加中和剂50 mL，将混合液从载体上洗脱，浸泡10 min，得到病毒-消毒剂-中和剂混合液，检测各混合液中病毒滴度对数值。 实验组2（阳性对照组）：将乙脑病毒单一收获液20 μL加至50 mL稀释液中，混匀后测定病毒滴度。 实验组3（阴性对照组）：将稀释液接种于BHK-21单层细胞板中，检测病毒滴度。 实验组4：取实验组1、2、3中的混合液进行细胞盲传实验，共进行3次盲传。显微镜下观察细胞生长状态，分别观察并记录细胞病变情况。 2 结果 2.1 中和剂鉴定实验 2.1.1　细胞毒性实验　按照细胞毒性形态学定性分级，分级大于2级则被认为有细胞毒性作用。以硫代硫酸钠为中和剂的实验组1、2、3中，细胞长势正常；分别以卵磷脂、吐温80为中和剂的实验组4、5、6和7、8、9中，细胞完全被破坏；实验组10（阳性对照组）细胞完全被破坏；实验组11（阴性对照组）细胞生长正常。结果见表3。结果表明，以1 g/L硫代硫酸钠作为中和剂对细胞生长无影响，其对应的中和产物（消毒剂∶中和剂体积比为1∶50或1∶25）均对细胞生长无影响。本研究选择1 g/L硫代硫酸钠作为84消毒剂的中和剂，用量选取消毒剂∶中和剂体积比为1∶25。 2.1.2　病毒毒力影响实验　结果显示，实验组1中含消毒剂，与病毒混合作用后未检测出病毒，实验组5（阴性对照）中亦未检测到病毒。实验组2、3中，中和剂（硫代硫酸钠）、中和产物（消毒剂+硫代硫酸钠）与乙脑病毒混合作用后的病毒滴度在7.35~7.45 lgPFU/mL，实验组4（阳性对照）的病毒滴度在7.44~7.52 lgPFU/mL。对测定结果进行单因素方差分析，P值＞0.05，说明中和剂及中和产物与病毒作用后的滴度与阳性对照的滴度间差异无统计学意义，中和剂和中和产物不会影响病毒毒性且中和剂有效。结果见表4。 2.2 载体病毒回收实验 从4种载体表面收集的病毒液在3个不同时间点（0、5、30 min）的回收率在96.05%~100%，符合病毒感染性滴度回收率在80%~120%的要求，检测结果有效可靠，回收实验成立。结果见表5。 2.3 病毒灭活实验 通过噬斑法检测混合液中的病毒滴度，结果显示，消毒剂与病毒混合后再加入中和剂进行中和，4种不同载体洗脱液中均不含乙脑病毒；阳性对照稀释液与病毒混合液中，3次实验结果分别为7.45、7.51和7.41 lgPFU/mL，平均滴度为7.46 lgPFU/mL。阴性对照未检测出乙脑病毒。 在细胞盲传实验中，仅阳性对照出现细胞病变效应，阴性对照及各载体上洗脱的混合液均未出现细胞病变情况，盲传结果为阴性，表明上述混合液中均无乙脑病毒存在。 3 讨论 在实验、生产过程中，对化学消毒剂采取有效和准确的消毒效果评价，是保证消毒效果和消毒质量控制的前提，而在消毒剂消毒效果评价研究中，有效去除残留消毒剂是关键。对于残留消毒剂的去除，主要分为化学中和法及物理法。物理法是通过稀释过滤及超速离心的方法将消毒剂与微生物样本分离。化学中和法主要是利用化学试剂间的拮抗作用将消毒剂中和，消除其对实验中微生物的持续杀灭和抑制作用，操作简便、结果可靠，是目前使用最多的方法。 通常情况下，乙脑病毒对热抵抗力弱，56 ℃、30 min可被灭活，实验室灭活乙脑病毒通常采用高压、煮沸方法。由于生产过程中若发生病毒漏洒等实验室安全问题，热灭活法不适用，因此需要采取消毒剂灭活的方法。在病毒灭活验证实验中，由于大多数消毒剂、中和剂对细胞的毒性较强，在以细胞为介质检测病毒滴度时，可能会产生不真实结果，因此对中和剂的选择要求较高，不仅要能有效终止消毒剂的残留毒性，同时该中和剂对实验细胞和病毒的生长均不可有不良影响。基于此，成分单一、浓度适宜的中和剂成为首选。本研究选用了3种常用中和剂，研究发现，卵磷脂（10 g/L）及吐温 80（10 g/L）及其与消毒剂作用形成的中和产物均对细胞生长有一定影响，最终确定使用硫代硫酸钠（1 g/L）作为中和剂。 本研究结果显示，在实验室常见载体表面，有效氯含量为800 mg/L的84消毒剂在与乙脑病毒作用5 min后即可将病毒灭活。在此基础上，本研究对该消毒剂的终末消毒效果进行了评价，并建立了准确有效的消毒效果评价方法，为乙脑病毒的灭活效果检测提供了方法参考，为确保消毒场所（对象）的病毒清除、防止病毒传播奠定理论基础。 作者 曾兰义1  罗辉艳2  彭维1  江虹霞1  廖海棠1  马玉晓1  罗明杰1  刘菊1 1成都生物制品研究所有限责任公司质量检定室，成都  610023；2四川省疫苗工程技术研究中心，成都  610023 通信作者：刘菊， Email：liuju_1969@163.com 引用本文：曾兰义, 罗辉艳, 彭维, 等. 84消毒剂对乙型脑炎病毒灭活效果评价 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(4): 266-270.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241107-00072 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

精彩内容 近日，吉斯美（武汉）制药的甲氨蝶呤注射液获批，成为重庆药友制药旗下今年第22个上市的新品。公司还有38个高端仿制药报产在审，1类新药YP01001胶囊在去年年底完成了I期临床，研发成果逐渐进入丰收期。2024年在中国三大终端六大市场，重庆药友制药有13个产品销售额超过1亿元，2025上半年挺进6个热销品类TOP20集团（二级）之列，市场优势明显。目前，公司已过评产品升至97个，9个“光脚产品”将冲击第十一批集采。 今年已有22个新品获批，过评产品达97个 近几年，重庆药友制药及旗下北京吉洛华制药、湖南洞庭药业、吉斯美(武汉)制药、四川合信药业、重庆吉斯瑞制药等明星药企全力出击，新品不断涌现，截至9月16日，公司在2025年已累计有22个新品获批，数量接近去年全年（24个）。 表1：重庆药友制药2025年以来获批的新产品（按亚类统计） 来源：米内网中国申报进度（MED）数据库 22个新品涉及11个亚类，其中2025年6月获批的多巴丝肼片是公司首款抗帕金森氏病药，2024年在中国三大终端六大市场（统计范围见文末）抗帕金森氏病药的销售额规模涨至36亿元左右。 此外，2025年至今，重庆药友制药还有6个“老产品”通过了一致性评价，包括了亚叶酸钙注射液、注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠、美索巴莫注射液、阿普唑仑片、硫酸阿托品注射液和注射用头孢他啶。截至2025年9月16日，重庆药友制药及子公司已过评（含视同过评）的产品数量升至97个。 在2019年9月的联盟地区集采中，公司的苯磺酸氨氯地平片和草酸艾司西酞普兰片顺利中标，开启了重庆药友制药的“集采奋战”之路，第二批国采（2020年1月）中标了盐酸克林霉素胶囊和吲达帕胺片，第三批国采（2020年8月）中标了富马酸喹硫平片和盐酸美金刚片，第四批国采（2021年2月）中标了甲苯磺酸索拉非尼片和盐酸度洛西汀肠溶胶囊，第五批国采（2021年6月）中标了阿法骨化醇片，第七批国采（2022年7月）中标了注射用头孢美唑钠和注射用头孢米诺钠，第九批国采（2023年11月）中标了雷贝拉唑钠肠溶片，第十批国采（2024年12月）中标了阿司匹林肠溶片、氯化钾颗粒、注射用拉氧头孢钠。 表2：重庆药友制药将参与第十一批集采的产品 来源：上海阳光医药采购网、米内网格局数据库 第十一批集采迫在眉睫，重庆药友制药有9个产品进入了本轮集采名单，2024年在中国三大终端六大市场，贝前列素钠片、多巴丝肼片、普伐他汀钠片、注射用头孢唑肟钠均为超10亿大品种。 重庆药友制药的阿仑膦酸钠片、贝前列素钠片、马来酸氟伏沙明片、普伐他汀钠片、注射用头孢唑肟钠、注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸是2024年获批的新品，阿戈美拉汀片和多巴丝肼片是2025年获批新品，公司的“老产品”美索巴莫注射液目前市场份额并不高，9个“光脚产品”若顺利中标，有望借集采之力迎来新的爆发期。 手握13个过亿产品，领跑4个百亿品类 米内网数据显示，截至目前重庆药友制药及子公司已获批的药品制剂超过260个（按现有批文统计），2024年在中国三大终端六大市场，公司有13个产品销售额超过1亿元，成绩亮眼。 表3：重庆药友制药2024年在中国三大终端六大市场销售额超过1亿元的产品 来源：米内网格局数据库 独家产品谷胱甘肽片用于慢性乙肝的保肝治疗，在中国三大终端六大市场该产品2021-2022年的销售额达到了7亿元水平，2023-2024年下滑至6亿元左右，2025上半年大涨19.08%，全年有望重回7亿元级别。 独家产品盐酸依匹斯汀胶囊适用于成人所患的过敏性鼻炎、荨麻疹、湿疹、皮炎、皮肤瘙痒症、痒疹、伴有瘙痒的寻常性银屑病及过敏性支气管哮喘的防治。在中国三大终端六大市场该产品2021年起保持高速增长态势，2022年突破2亿元，2024年涨至接近2.5亿元，2025上半年增长率高达11.17%。 图1：盐酸依匹斯汀胶囊的销售情况（单位：万元） 来源：米内网格局数据库 值得注意的是，公司的左氧氟沙星氯化钠注射液2023-2025上半年在中国三大终端六大市场连续增长了38.88%、2.55%、48.17%，潜力正在持续爆发。 2025上半年在中国三大终端六大市场，重庆药友制药挺进了6个亚类市场TOP20集团（二级，下同），市场领军优势明显。 全身用抗组胺药2024年的销售规模为65亿元左右。重庆药友制药在2019年排在TOP6集团，公司该类药物在2021年起持续正增长，2025上半年集团排名升上TOP4。独家产品盐酸依匹斯汀胶囊是公司最畅销的全身用抗组胺药。 胆、肝疾病治疗药（化+生）2024年的销售规模超过180亿元，2025上半年重庆药友制药排在TOP5集团，增长率为14.45%。公司在该类药物市场的畅销产品包括了谷胱甘肽片、注射用谷胱甘肽、注射用二氯醋酸二异丙胺葡萄糖酸钠、肌苷片。 精神安定药2024年的销售规模超过150亿元，2025上半年重庆药友制药排在TOP8集团，增长率为6.11%。公司在该类药物市场的畅销产品包括了富马酸喹硫平片、劳拉西泮片、氟哌啶醇注射液、氯氮平片、阿普唑仑片等。 中成药清热解毒用药2024年的销售规模超过310亿元，2025上半年重庆药友制药排在TOP17集团，公司在该类药物市场的拳头产品是注射用炎琥宁。 精神兴奋药2024年的销售规模超过160亿元。重庆药友制药在2019年排在TOP33集团，公司该类药物在2020-2022年持续暴涨，2024年再次迎来正增长，2025上半年集团排名TOP19。公司在该类药物市场的畅销产品包括了草酸艾司西酞普兰片、盐酸度洛西汀肠溶胶囊、盐酸美金刚片、盐酸阿米替林片等。 其它所有治疗用药品（化+生）2024年的销售规模超过68亿元，2025上半年重庆药友制药排在TOP20集团。公司在该类药物市场的畅销产品包括了硫代硫酸钠注射液、盐酸纳洛酮注射液、注射用盐酸纳洛酮、亚硝酸钠注射液。 此外，2025上半年在中国三大终端六大市场，重庆药友制药还是维生素类市场TOP22集团，是全身用抗细菌药市场TOP24集团，是全身用抗病毒药市场TOP25集团。 38个仿制药新品冲刺上市，1类新药稳步推进 9月16-17日，重庆药友制药分别提交了碘比醇注射液、瑞格列奈片的4类仿制上市申请获得承办，截至目前，公司累计有38个仿制药新品报产在审，涉及9个大类（21个亚类）。 表4：重庆药友制药报产在审的新品 来源：米内网中国申报进度（MED）数据库 目前公司在全身用抗真菌药、造影剂、其它肌肉-骨骼系统疾病用药、关节和肌肉痛的局部用药4个亚类市场暂未有产品获批，后续有望开拓新市场。 2024年在中国三大终端六大市场，造影剂（化+生）的销售规模超过150亿元，2025上半年继续保持正增长。重庆药友制药已布局了碘佛醇注射液、碘克沙醇注射液、碘普罗胺注射液、碘美普尔注射液、碘比醇注射液5款造影剂，分别为该市场TOP1、TOP2、TOP4、TOP5、TOP12产品。 此外，布瑞哌唑片和诺西那生钠注射液目前仅有原研药上市销售，重庆药友制药将参与上述两个产品的国内首仿争夺。 图2：YP01001胶囊的临床进度 来源：米内网中国临床试验数据库 重庆药友制药的YP01001胶囊在2021年获得临床批件，2024年12月完成了晚期实体瘤（甲状腺癌和其他实体瘤）I期临床。 9月15日，国家药监局发布药品获批信息，子公司吉斯美(武汉)制药的甲氨蝶呤注射液成功获批，成为了公司第28款抗肿瘤药。2024年在中国三大终端六大市场，公司的抗肿瘤药销售规模在1.4亿元左右。公司还有7个抗肿瘤药新品报产在审，待1类新药YP01001胶囊正式上市，公司在该类药物市场的竞争力有望大幅提升，未来可期。 资料来源：米内网数据库、国家药监局官网 注：米内网《中国三大终端六大市场药品竞争格局》，统计范围：城市公立医院和县级公立医院、城市社区中心和乡镇卫生院、城市实体药店和网上药店，不含民营医院、私人诊所、村卫生室，不含县乡村药店；上述销售额以产品在终端的平均零售价计算。数据统计截至9月16日，欢迎指正！ 免责声明：本文仅作医药信息传播分享，并不构成投资或决策建议。本文为原创稿件，转载文章或引用数据请注明来源和作者，否则将追究侵权责任。投稿及报料请发邮件到872470254@qq.com稿件要求详询米内微信首页菜单栏商务及内容合作可联系QQ：412539092 【分享、点赞、在看】点一点不失联哦